CN100497611C

CN100497611C - 一种发酵法制备核酸酶p1的方法

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Publication number: CN100497611C
Application number: CNB2007100639119A
Authority: CN
Inventors: 洪娜; 陈慎; 黎高沃
Original assignee: BEIJING YANJING ZHONGKE BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: BEIJING YANJING ZHONGKE BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2007-02-14
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2027-02-14
Also published as: CN101037681A

Abstract

本发明提供了一种发酵法制备核酸酶P₁的方法，该方法直接使用桔青霉孢子体作为种子，并采用流加补糖的方式进行发酵培养，使得核酸酶P₁的活力大大提高，并且本发明方法不经过一级二级种子培养，大大缩短了生产周期，提高了效率。本发明还将上述获得的酶液用于制备5’-单核苷酸，酶解率达85～90%，核苷酸的产率达到15mg/ml以上。本发明还提供了一种核酸酶P₁的高产菌株桔青霉(Penicillium citrinum)3.2788-Y01，菌种保藏号CGMCC No.1943，该菌株能使核酸酶P₁液的单位酶活提高一倍。

Description

一种发酵法制备核酸酶P1的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生产制备核酸酶P₁的方法。

背景技术

核酸的降解产物——核苷酸及其衍生物在食品、医学、农业、化妆品及生化试剂等领域具有十分广泛的用途(陈陶声，近代工业微生物学上册，上海科技出版社，1979，153～164)，而核酸酶P₁是酶解RNA、DNA成5’-核苷酸的主要用酶。

上个世纪60年代，日本为了开拓味精市场，就开始从降解RNA取得增鲜剂——调味核苷酸(5’-GMP和5’-IMP等)。1957年日本学者国中明等筛选到了一株青霉菌属的桔青霉(Penicillium citrinum)(Agric Biol Chem 25，693(1961))，能分泌出一种胞外酶，具有磷酸二酯酶的功能，酶解RNA生成5’-NMP。把此酶纯化后，发现此酶除能降解RNA外，还能降解DNA，而且还具有切割3’-单核苷酸的磷酸，即3’-磷酸单酯酶的功能，与典型的磷酸二酯酶不同，故把此酶命名为核酸酶P₁，其中P₁是桔青霉的代表符号(Agric Biol Chem 38：785，1974；39：579，1975)。此后，酶解RNA生成5’-NMP都采用桔青霉生产核酸酶P₁。

在国内，1964年上海轻工业研究所和科学院微生物研究所等先后研究了用桔青霉生产核酸酶P₁的方法，随后上海工业微生物研究所用栎曲霉(Aspergillus Fumigatus Fresemius)生产出酶活较高的核酸酶P₁，1974年至1975年，上海食品加工厂采用桔青霉桔青霉3.2788进行固体培养制备出核酸酶P₁，(宁波大学学报10(3)：21～28)。

上个世纪60年代末到70年代初，国内“首都啤酒厂与中科院824任务组”也采用此菌桔青霉3.2788菌株，应用固体培养法生产核酸酶P₁，降解RNA，生成5’-NMP。(核苷酸类物质的生产和应用，科学出版社，1971)

广东江门和华北制药厂曾应用过液体培养法生产核酸酶P₁，但是活力不高，且陈述的都是用菌丝体接种发酵罐，未见用孢子直接接种发酵罐(内部交流，1982)。相对于固体培养法生产核酸酶P₁，液体培养法具备环保的优点。

关于核酸酶P₁降解核酸方面，有一些报道(Agric Biol Chem 38(9)：1555-1561；38(11)：2141～2147 38(4)：785～790 1974)但多是从对底物特异性，作用方式等理论上进行试验和论证；根据这些理论，核酸酶P₁对RNA酶解，应是彻底的；但在工业上应用，对RNA的酶解率仅略高于70％(刘树煌，酶制剂工业，下册P765，科学出版社，1984)。原有生产方法无论用固体和液体培养，酶活力单位都较低，只有100～150单位/毫升，并且发酵周期长，生产成本大。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对上述不足提供一种制备核酸酶P₁的方法；

本发明的另一个目的在于针对上述不足提供一种有高活力的核酸酶P₁液，以提高对核酸的酶解率。

本发明再一个目的是提供一种核酸酶P₁高产菌株。

本发明发酵法生产核酸酶P₁是利用桔青霉的孢子体进行发酵培养，从而大大地缩短了发酵培养的周期，同时P₁酶液的单位酶活得到了提高；在发酵过程中采用分批补料地方式进行添加培养基和葡萄糖，进一步提高了P₁酶的单位酶活。下面是本发明制备核酸酶P₁的具体方法：

1、菌种活化

取1环菌接入土豆斜面培养基，28～30℃培养3天为第一代，依此类推，转接3～5代斜面培养基，常规保存备用。

2、扩大培养

用无菌水充分洗涤新鲜的***斜面，得到孢子悬浮液，取0.1～2.0毫升接入配制好的麸皮培养基中，28～30℃培养3天。麸皮孢子计数达到10⁵～10⁹个/克为合格。

3、发酵培养

配制液体培养基，按发酵罐有效容积70～80％装罐；

将步骤2得到的麸皮孢子按0.35～0.6克/升培养基接种到发酵罐，进行发酵培养，发酵培养采用分批补糖的方式进行。

发酵条件控制在pH3.0～6.0，温度28～30℃，罐压0.03～0.1Mpa，通气量0.5～2.0:1，转速100～300转/分钟。

通常发酵大约7小时后进入对数生长期；24小时开始进入产酶期。

发酵大约22～40小时，间隔2～6小时，分批补加液体培养基2～6次，以2吨发酵罐为例，每次补加250L发酵罐培养基所需的干料。

发酵大约30～终止前两小时，间隔2～6小时，分批补加葡萄糖，共补加2～6次，以2吨发酵罐为例，每次5～20公斤。

发酵40～60小时，当pH值和溶氧曲线呈明显上升趋势，分别超过4.5和60％就可以终止发酵。

4、板框过滤

采用板框过滤的方法进行固液分离，获得核酸酶P₁液。

5、核酸酶P₁液的保存

低温冷藏保存。

6、利用上述发酵所得到的核酸酶P₁液用于酶解核糖核酸，酶解率高达85～90％，所得的酶解液中核苷酸的终浓度可达到15mg/ml以上。

本发明还提供了一种核酸酶P₁高产菌株桔青霉(Penicilliumcitrinum)3.2788-Y01，该菌株是从桔青霉3.2788菌株出发，经过高锌离子浓度、亚硝酸钠和紫外线等物理化学复合诱变，并纯化筛选近千株菌得到的，该菌株已于2007年2月8号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1943。

上面所涉及到的培养基配方分别为：

马铃薯斜面培养基：马铃薯(切片)300克，葡萄糖20克，琼脂15克，水1000ml)

麸皮固体培养基:麸皮:水＝1:1.0～1.5

液体发酵培养基∶磷酸盐0.5～5g/L、硫酸镁0.1～1g/L、碳酸钙0.2～2g/L、硫酸锌0.1～0.5g/L、工业蛋白胨1～10g/L、工业葡萄糖1～5g/L。

本发明具有如下优点

1、使用麸皮上培养的孢子直接接种发酵罐，不需要一、二级种子发酵罐发酵培养，减少了设备成本，简化了工艺，发酵周期50小时左右，缩短生产周期约5～6天；另外，若使用菌丝接种，发酵周期为60小时以上，相对而言缩短发酵周期约10小时；

2、采用桔青霉3.2788-Y01菌株发酵，可使核酸酶P₁活力在原菌株的基础上增加200％，达到300单位/毫升；

3、用分批补料发酵代替分批发酵，可使菌体量增加50％，核酸酶P1活力从300单位/毫升提高到500单位/毫升以上。

4、采用桔青霉3.2788-Y01菌株生产的核酸酶P₁液进行酶解，可获得酶解率高达85～90％，核苷酸的浓度可达到15mg/ml以上。

附图说明

图1是本发明的生产工艺流程图。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 制备麸皮孢子

1、菌种活化

取1环菌接入土豆斜面培养基，28～30℃培养3天为第一代，依此类推，转接四代斜面培养基，常规保存备用。

2、扩大培养

用无菌水充分洗涤新鲜的***斜面，得到孢子悬浮液，取0.1～2.0毫升接入配制好的麸皮培养基中，28～30℃培养3天。麸皮孢子计数达到10⁹个/克。

实施例2(2吨发酵罐)

1、培养基配方∶磷酸盐15Kg、硫酸镁3Kg、碳酸钙3Kg、硫酸锌1.2Kg、工业蛋白胨15Kg、工业葡萄糖9Kg，用水补足至1500L。

2、接种量：900克麸皮孢子(实施例1)；

3、培养温度：29～30℃；

4、培养转速：150rpm～250rpm，当溶氧降至40％以下时，调节转速；

7、通气量：1.5m³/min；

8、罐压：0.05～0.06Mpa；

9、初始pH值：6.0

10、补加培养基：

发酵培养约24.1小时，开始培养基第一次补加250L发酵罐培养基所需的干料；

发酵培养约29.5小时，进行培养基第二次补加250L发酵罐培养基所需的干料；

发酵培养约32小时，进行培养基第三次补加250L发酵罐培养基所需的干料。

11、补加葡萄糖：

发酵培养约34小时，进行第一次补葡萄糖5公斤；

发酵培养约36小时，进行第二次补葡萄糖5公斤；

发酵培养约38小时，进行第三次补葡萄糖5公斤；

发酵培养约43小时，进行第四次补葡萄糖5公斤。

7、终止发酵：

发酵46小时，pH值和溶氧曲线呈明显上升趋势，分别达到4.7和62％。核酸酶P₁活力532单位/毫升，发酵终体积1250升。

8、酶解(8吨罐)

酶解率为90％，核苷酸的终浓度为16.2mg/ml。

实施例3(2吨发酵罐)

1、培养基配方：磷酸盐3Kg、硫酸镁1.3Kg、碳酸钙1.3Kg、硫酸锌1.5Kg、工业蛋白胨30Kg、工业葡萄糖6Kg，用水补足至1500L。

2、接种量：840克麸皮孢子；

3、培养温度：29～30℃；

4、培养转速：150rpm～270rpm，当溶氧降至40％以下时，调节转速；

7、通气量：1.5m³/min；

8、罐压：0.05～0.06Mpa；

9、初始pH值：5.9

10、补加培养基：

发酵培养约23小时，开始培养基第一次补加250L发酵罐培养基所需的干料；

发酵培养约28小时，进行培养基第二次补加250L发酵罐培养基所需的干料；

发酵培养约33小时，进行培养基第三次补加250L发酵罐培养基所需的干料；

发酵培养约36小时，进行培养基第四次补加250L发酵罐培养基所需的干料；

11、补加葡萄糖：

发酵培养约38.5小时，进行第一次补葡萄糖5公斤；

发酵培养约43小时，进行第二次补葡萄糖15公斤。

发酵培养约57小时，进行第三次补葡萄糖5公斤。

11、终止发酵：

发酵59小时，pH值和溶氧曲线呈明显上升趋势，分别达到4.6和60％。核酸酶P₁活力662单位/毫升，发酵终体积1280升。

12、酶解(8吨罐)

酶解率为88％，核苷酸的终浓度为16.1mg/ml。

试验例

1、酶活力的测定：

称取100mg核糖核酸(纯度100％)溶于5毫升水中，即为2％的标准核酸溶液。

钼酸铵-过氯酸试剂：0.25％钼酸铵溶于2.5％过氯酸中。(如配200ml该试剂则在193ml水中加入70％过氯酸7ml和0.5g钼酸铵)

取甲乙两支试管，分别加入2％核酸1ml和0.8ml 0.2M pH5醋酸缓冲液。63℃预热10分钟，然后甲管加入0.2ml酶液。继续保温30分钟。甲乙两管分别加入2ml钼酸铵-过氯酸试剂。乙管补加0.2ml酶液，混匀。冷却放置15分钟后离心。分别取0.1ml上清液加9.9ml无离子水。测OD₂₆₀值。酶活力＝(OD₂₆₀甲-OD₂₆₀乙)×100×酶液稀释倍数

2、5’-单核苷酸的测定：

降解液经处理后，吸上清液0.1微升定容到10毫升。标准在使用前需将标准磷溶液稀释10倍，取试管按下表表1顺序(一二三四五)加样品和试剂，各管凡加毕甲胺试剂后在45℃水浴保温10分钟，再分别加定磷试剂3毫升，继续在45℃保温20分钟，冷却至室温后，以空白作为对照，测OD₆₅₀。同时以标准磷测定结果作为参比定磷值。

甲(氧化)和乙(不氧化)含磷量之差即为5’-核苷酸磷。

表1 5’-单核苷酸的测定

简化为：5’-核苷酸(g)＝(甲-乙)含磷量(mg/ml)×1.097×总体积(L)

31—磷原子量；

340—四种单核苷酸平均分子量；

100—样品稀释倍数。

4、核酸降解率的计算：

Claims

1、一种核酸酶P₁高产菌株桔青霉(Penicillium citrinum)3.2788-Y01保藏号为CGMCC No.1943。

2、一种发酵法制备核酸酶P₁的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的桔青霉孢子体进行发酵培养。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于，采用分批补料的方式进行发酵培养。

4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵前期分批补加培养基，后期分批补加葡萄糖。

5、如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述桔青霉孢子体通过如下方式获得：取桔青霉菌株经活化后，取其孢子制成悬液接种麸皮培养基，28～30℃培养3天。