CN102766656A - 一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，该方法利用甘蔗渣作为唯一碳源配制廉价的培养基，选取高产的纤维素酶产生菌和微生物絮凝剂产生菌，通过耦合两株菌的发酵工艺，实现了纤维素酶和微生物絮凝剂的高产量，拓展了甘蔗渣资源化利用的途径。与直接利用纤维素酶糖化甘蔗渣生产微生物絮凝剂相比，本发明既省去了纤维素酶的提纯过程，同时有效利用了木霉发酵后的剩余底物产絮凝剂，提高了原料的利用率也减少了废水排放，所产生的酶和絮凝剂具有生物可降解性和环境友好性，不会产生二次污染。本发明的发酵方法简便，容易控制，有利于规模化生产。

Description

一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法

技术领域

本发明涉及甘蔗渣的资源化利用技术领域，具体涉及一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法。

背景技术

甘蔗是全世界种植面积最广阔的农作物之一，主要用于制糖和制酒，其榨汁后产生大量的甘蔗渣，据估算全球每年约2亿吨甘蔗渣需处理。甘蔗渣是一种含高碳高能的生物质，主要由20%~30%的木质素、40%~45%纤维素以及30%~35%半纤维素以及少量的灰分和其它物质组成。与秸秆等农业废弃物相比，甘蔗渣中的半纤维素和纤维素均为由木糖、葡萄糖等单糖组成的大分子聚合物，使得甘蔗渣更有开发价值。目前甘蔗渣利用率不高，除部分被用于粉碎还田、发酵制沼气、焚烧发电、生产乙醇外，其余大部分则被丢弃，造成了资源的浪费、环境的污染及其处理压力的增大。如何提高蔗渣这种生物质废弃物的高值化利用度已经成为世界各国关注的重点。

絮凝剂被广泛地应用于给水、废水处理、食品生产和发酵等行业中，是工业用水、生活用水、废水处理、城市污泥脱水等过程中用量最大的一类药剂。但传统絮凝剂的制备需要消耗大量物质资源，在使用过程中常常会产生二次污染，而利用微生物技术制备絮凝剂则可以实现废弃物资源化，对生产设备和污染物处理设施无损害，对环境无二次污染，对人类健康和环境保护具有重要的现实意义。虽然目前对微生物絮凝剂的研究比较多，但是可应用于实际生产的产品很少，其主要原因为培养成本较高，因此利用废弃物做替代培养基生产絮凝剂，降低其生产成本是推动微生物絮凝剂产业化应用的重要途径。

生产成本是微生物絮凝剂实际应用的关键因素，采用废弃物作为替代培养基培养微生物絮凝剂产生菌是降低生产成本的有效途径。目前，国内外相关研究采用的替代培养基主要以含碳、氮、磷等有机物较丰富的液体为主，如乳品废水、糖蜜废水、淀粉废水、啤酒废水、酱油废液、豆腐废水、味精废水、生活污水、鱼粉废水、垃圾渗滤液、花朵的提取液、制氢黑液等。但这些廉价制备材料均存在一些问题，如食品加工废水的成分和浓度变化较大，其中不同批次的酱油生产废水COD_Cr浓度相差可达10万mg/L，致使现有研究尚未找到可推广的培养基配方与制备工艺。部分食品加工废水色度高、营养成分不均衡、含有抑制高效微生物絮凝剂产生菌生长的发酵代谢产物，从而导致微生物絮凝剂产量较低。因此，寻找廉价易得、易产业化的培养材料尤其重要。

蔗渣中的半纤维素和纤维素均为由葡萄糖、木糖、甘露糖和***糖等单糖组成的大分子聚合物，经过物理、化学、生物等方法处理后能够使得葡萄糖小分子以及其它单糖从甘蔗渣中被释放出来。物理方法主要是粉碎，微波处理和蒸汽爆碎，成本高，产率低。化学方法分为酸或酶的水解催化作用。酸法水解一般需要耐酸，耐热，耐压的特殊设备，易产生副产物，影响后续发酵。酶法水解具有设备简单，反应条件温和，原料糖化得率高，副产物少以及不污染环境等优点，但所用的纤维素酶价格高。而利用能分解纤维素的一类菌（如木霉、曲霉和青霉等）发酵，是纤维素糖化工艺发展的方向。该法具有反应条件温和、不产生污染物质、易于控制。但是反应周期长、效率低等缺点影响了微生物处理纤维素材料的广泛应用。

本发明直接以甘蔗渣为基质，通过异步发酵实现了甘蔗渣糖化和微生物絮凝剂生产的耦合，为降低微生物絮凝剂的生产成本提供了技术基础，这将对微生物絮凝剂的产业化应用和拓展农业废弃物的资源化利用途径具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法。本发明选取高产的纤维素酶产生菌和微生物絮凝剂产生菌，通过耦合两株菌的发酵工艺，充分利用甘蔗渣配制廉价的培养基，发酵过程简单，容易控制，可大大降低絮凝剂的生产成本。本发明的目的通过以下技术方案来实现。

一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，包括如下步骤：

（1）配制培养基：配制的培养基中碳源用量为10~50g/L，氮源用量为1~5g/L，KH₂PO₄用量1~5 g/L，MgSO₄用量0.1~0.5 g/L，其余为自来水；所述碳源为甘蔗渣；

（2）发酵：在发酵罐中加入步骤（1）中所配制的培养基，利用高压蒸汽加热罐体，使得罐压维持在0.1~0.11MPa之间进行灭菌，利用冷却水和搅拌冷却使发酵罐冷却至发酵温度23~35℃，调节搅拌速率为100~300r·minP^-1（优选130 r·minP^-1），控制空气流量为80~150mL·minP^-1P（优选100 mL·minP^-1）并维持罐压0.015~0.025 MPa（优选0.02MPa）后，接入占培养基体积1%~5%的新鲜木霉孢子液，孢子液的吸光度A=0.6，接种培养24~48h；此发酵过程中发酵时间非常关键，培养时间短生物量低，甘蔗渣糖化效率不高；培养时间过长木霉的分泌物和底物的水解产物使得发酵液的成分复杂，某些因子会影响后续的微生物产絮凝剂。因此，木霉的发酵条件和絮凝剂的生产条件要耦合。

（3）絮凝剂生产：将步骤（2）发酵液调节至 pH 4~6，灭菌后冷却至室温，调节搅拌速率为100～300 r·minP^-1P（优选130r·minP^-1P），控制空气流量为80~150mL·minP^-1P（优选100 mL·minP^-1）并维持罐压0.015~0.025 MPa（优选0.02MPa）后，以0.05~0.25g/L接种量接种微生物絮凝剂产生菌发酵温度25~37℃，发酵时间36~72h；收集培养液，用纱布将菌体过滤除去，得到具有絮凝活性的发酵液，用400NTU的高岭土悬浮液测定其絮凝活性。

进一步优化的，于步骤（3）还包括用400NTU的高岭土悬浮液测定具有絮凝活性的发酵液的絮凝活性。

进一步优化的，步骤（3）中微生物絮凝剂产生菌的接种为菌丝接种。

进一步优化的，步骤（2）和步骤（3）中发酵过程中均采用底层曝气加搅拌控制溶解氧的溶解氧饱和度为30~80%。

进一步优化的，步骤（1）所述碳源为粉碎后的甘蔗渣。所述氮源为NaNO₃、(NH₄)SO₄、NH₄NO₃、Ca(NO₃)₂和尿素。 

进一步优化的，步骤（1）所述培养基的pH值为3~7。 

上述培养基中，所选氮源价格便宜，且用量少；使用自来水配制可以补充微生物生长的一些微量因子且较其他纯水便宜易得。总之，上述培养基配方简单，所选取的均是廉价易得的原料，大大降低了微生物培养的成本，适宜于大规模的工业化生产。

进一步优化的，步骤（2）中，培养基的加液量为发酵罐体积的一半，所述高压蒸汽为0.4MPa高压蒸汽，所述灭菌为罐体温度维持在120℃灭菌30min；步骤（3）中所述灭菌为110℃灭菌20min，所述微生物絮凝剂产生菌用量以湿重计，含水率为87%。

进一步优化的，步骤（2）所述木霉为里氏木霉（Trichoderma reesei）、康氏木霉（Trichoderma Koningii）、绿色木霉（Trichoderma viride）中的一种。

进一步优化的，步骤（3）得到具有絮凝活性的发酵液的絮凝率为80～90％，絮凝剂含量为1.05~1.40g/L。

上述利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法中，絮凝剂产量测定方法为：取25mL的发酵液以1：2的体积比加入4℃无水乙醇，在4℃避光静置24h后，4℃下6000r·minP^-1P，离心10min，对沉淀物用相同浓度的乙醇洗涤2次后，60℃烘干至恒重，测定其质量。

本发明和现有技术相比，具有如下优点和效果：

（1）本发明采用的发酵培养基以甘蔗渣作为唯一碳源，只添加了少量氮源和微量元素，大大降低了絮凝剂的生产成本。

（2）本发明所采用的工艺实现了甘蔗渣糖化工艺和微生物絮凝剂生产工艺的耦合，发酵时间短，大大降低了动力消耗，节约了生产成本。与直接利用纤维素酶糖化甘蔗渣生产微生物絮凝剂相比，既省去了纤维素酶的提纯过程，同时有效利用了木霉发酵后的剩余底物产絮凝剂，提高了原料的利用率也减少了废水排放。

（3）本发明的发酵方法简便，容易控制，有利于规模化生产。

（4）本发明所产生的酶和絮凝剂具有生物可降解性和环境友好性，不会产生二次污染。

（5）本发明同时实现了纤维素酶和微生物絮凝剂的高产量，拓展了甘蔗渣资源化利用的途径。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式和保护范围不限于此。

实施例1

配制发酵培养基浓度为20g/L甘蔗渣，1.6g/L (NH₄)₂SO₄，2g/L KH₂PO₄，0.1 g/L MgSO₄，灭菌后pH6.0，接种1%绿色木霉孢子液，30℃下培养48h。将发酵液调节至pH5.5后110℃灭菌20min，然后冷却至室温，接种酱油曲霉菌丝（接种量0.05g/L），溶解氧的饱和度维持在32~51%，发酵温度30℃，发酵时间50h，。收集培养液，用纱布滤去菌体，得到具有絮凝活性的发酵液，取1ml该发酵液投加到100ml高岭土悬液（400NTU）测定其絮凝率为83%。另取25ml发酵液测定其絮凝剂含量为1.25g/L。

实施例2

配制发酵培养基浓度为30g/L甘蔗渣，2.0g/L (NH₄)₂SO₄，2.5g/L KH₂PO₄，0.1 g/L MgSO₄，灭菌后pH6.0，接种1%绿色木霉孢子液，30℃下培养40h。将发酵液调节至pH6后110℃灭菌20min，然后冷却至室温，接种酱油曲霉菌丝（接种量0.10g/L），溶解氧的饱和度维持在35~48%，发酵温度32℃，发酵时间50h。收集培养液，用纱布滤去菌体，得到具有絮凝活性的发酵液，取1ml该发酵液投加到100ml高岭土悬液（400NTU）测定其絮凝率为85%。另取25ml发酵液测定其絮凝剂含量为1.30g/L。

实施例3

配制发酵培养基浓度为25g/L甘蔗渣，1.8g/L (NH₄)₂SO₄，2.1g/L KH₂PO₄，0.2 g/L MgSO₄，灭菌后pH6.0，接种1%绿色木霉孢子液，32℃下培养48h。将发酵液调节至pH5后110℃灭菌20min，然后冷却至室温，接种酱油曲霉菌丝（接种量0.15g/L），溶解氧的饱和度维持在30~46%，发酵温度35℃，发酵时间48h。收集培养液，用纱布滤去菌体，得到具有絮凝活性的发酵液，取1ml该发酵液投加到100ml高岭土悬液（400NTU）测定其絮凝率为86%。另取25ml发酵液测定其絮凝剂含量为1.35g/L。

实施例4

配制发酵培养基浓度为20g/L甘蔗渣，1.6g/L (NH₄)₂SO₄，2g/L KH₂PO₄，0.1 g/L MgSO₄，灭菌后pH6.0，接种1%绿色木霉孢子液，30℃下培养48h。得到的发酵液过滤去除菌体，4000rpm离心10min，取得的发酵液测得CMC酶活值为1.35U，还原糖含量为0.26g/L 。 

Claims (10)

1.一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）配制培养基：配制的培养基中碳源用量为10~50g/L，氮源用量为1~5g/L，KH₂PO₄用量1~5 g/L，MgSO₄用量0.1~0.5 g/L，其余为自来水；所述碳源为甘蔗渣；

（2）发酵：在发酵罐中加入步骤（1）中所配制的培养基，利用高压蒸汽加热罐体，使得罐压维持在0.1~0.11MPa之间进行灭菌，利用冷却水和搅拌冷却使发酵罐冷却至发酵温度23~35℃，调节搅拌速率为100~300r·minP^-1，控制空气流量为80~150mL·minP^-1P并维持罐压0.015~0.025 MPa后，接入占培养基体积1%~5%的新鲜木霉孢子液，孢子液的吸光度A=0.6，接种培养24~48h；

（3）絮凝剂生产：将步骤（2）发酵液调节至 pH 4~6，灭菌后冷却至室温，调节搅拌速率为100～300 r·minP^-1P，控制空气流量为80~150mL·minP^-1P并维持罐压0.015~0.025 MPa后，以0.05~0.25g/L接种量接种微生物絮凝剂产生菌发酵温度25~37℃，发酵时间36~72h；收集培养液，用纱布将菌体过滤除去，得到具有絮凝活性的发酵液。

2.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤（3）还包括用400NTU的高岭土悬浮液测定具有絮凝活性的发酵液的絮凝活性。

3.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤（3）中微生物絮凝剂产生菌的接种为菌丝接种。

4.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤（2）和步骤（3）中发酵过程中均采用底层曝气加搅拌控制溶解氧饱和度为30~80%。

5.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤（1）所述碳源为粉碎后的甘蔗渣。

6.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤（1）所述氮源为NaNO₃、(NH₄)SO₄、NH₄NO₃、Ca(NO₃)₂和尿素。

7.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤（1）所述培养基的pH值为3~7。

8.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤（2）中，培养基的加液量为发酵罐体积的一半，所述高压蒸汽为0.4MPa高压蒸汽，所述灭菌为罐体温度维持在120℃灭菌30min；步骤（3）中所述灭菌为110℃灭菌20min，所述微生物絮凝剂产生菌用量以湿重计，含水率为87%。

9.根据权利要求1～8任一项所述的一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤（2）所述木霉为里氏木霉、康氏木霉、绿色木霉中的一种。

10.根据权利要求9所述的一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤（3）得到具有絮凝活性的发酵液的絮凝率为80～90％，絮凝剂含量为1.05~1.40g/L。