CN109161507A - 一种高产l-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用 - Google Patents

一种高产l-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，公开了一种高产L‑鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用。该谷氨酸棒杆菌的分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)jp‑07092，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.15856。利用该菌株发酵生产L‑鸟氨酸，具有成本低、发酵周期短、单位时间产量高、后续提纯工艺简单等优点，更适于工业化推广。

Description

一种高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)是目前发酵工业中一种非常重要的生产菌种，已经广泛应用于多种氨基酸及其相关衍生物的生产，其主要的产品包括L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-谷氨酰胺等。谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)发酵生产氨基酸是一个好氧过程，产生大量的生物质菌体。谷氨酸棒杆菌生长迅速、培养条件简单、耐受性强、发酵条件成熟。所以，谷氨酸棒杆菌已经成为实验室和工业中运用的模式菌株。
L-鸟氨酸在生物体内主要参与尿素循环，对氨态氮的排出有重要作用。近年来，L-鸟氨酸在医药和食品行业均有广泛用途。在医药工业，L-鸟氨酸除了主要用于保肝、护肝及治疗高血氨症外，还可用于外伤和烧伤的恢复；在食品行业，L-鸟氨酸既有保健减肥的功效又能提高机体免疫力，是健美者和运动员的理想营养补剂。L-鸟氨酸的多功能保健作用不断引起人们的关注，其市场需求日益剧增。但L-鸟氨酸的生产较为困难，目前L-鸟氨酸的生产主要有酶法和发酵法。酶法是精氨酸在精氨酸酶的作用下，转化生成L-鸟氨酸。此法虽然产品纯度高，但精氨酸和精氨酸酶都难于获得，导致生产成本过高。而发酵法则简单易行，特别适合工业化生产。
在现有的谷氨酸棒杆菌发酵生产L-鸟氨酸的技术当中，专利号为2010102862368，菌株编号为CGMCC No.3663的谷氨酸棒杆菌在发酵过程中葡萄糖添加量60g/L时，L-鸟氨酸产量为38.5g/L，葡萄糖添加量为180g/L时，L-鸟氨酸产量为45g/L。这个结果可以看出来该菌株在低葡萄糖浓度时高产，在高葡萄糖浓度时产量并不同比上升，单位时间内L-鸟氨酸的产量不佳，并不利于产业化大量产出。所以我们需要一株可以在葡萄糖添加量增加的同时，L-鸟氨酸的产量可以有相应的提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌，该谷氨酸棒杆菌的L-鸟氨酸产量高，可以为工业上提高L鸟氨酸的产量带来效益。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌，所述菌株的分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)jp-07092，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.15856。
所述高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-鸟氨酸中的应用。
所述的应用，将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)jp-07092活化，在25～58℃下好氧发酵42～72h；其中，好氧发酵培养基含有：碳源80～120g/L，氮源50～90g/L，无机盐0～10g/L，适量水，pH5.5～8.0。
其中，所述的碳源为葡萄糖；所述的氮源为硫酸铵；所述的无机盐为镁盐、钾盐、锰盐、钙盐、硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐中的任意一种或几种的组合。
进一步，该培养基还可以添加维生素、精氨酸。
所述的应用，将谷氨酸棒杆菌jp-07092活化后，在30℃下好氧发酵65h，在发酵阶段通气比1.5v/vm、搅拌220r/min；
其中，所述的好氧发酵培养基含有：葡萄糖80～140g/L，(NH4)2SO4 50～90g/L，K2HPO4·3H2O 1～3g/L，KH2PO4 1～4g/L，MgSO4·7H2O 0.2～2g/L,CaCO3 10～40g/L,适量水，pH6～8，发酵过程中通过流加氨水来稳定pH。
所述的应用，该培养基优化为：葡萄糖120g/L，(NH4)2SO4 80g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，MnSO4·H2O 200mg/L，FeSO4·7H2O 200mg/L，精氨酸200mg/L，ZnCl2 1mg/L，CuSO4 0.2mg/L，生物素0.1g/L，维生素B1 0.2mg/L，CaCO3 30g/L，适量水，pH 7.0。
用于所述谷氨酸棒杆菌高产L-鸟氨酸的培养基，该培养基为好氧发酵培养基含有：葡萄糖80～140g/L，(NH4)2SO4 50～90g/L，K2HPO4·3H2O 1～3g/L，KH2PO41～4g/L，MgSO4·7H2O 0.2～2g/L,CaCO3 10～40g/L,适量水，pH6～8。
所述的培养基，该培养基优化为：葡萄糖120g/L，(NH4)2SO4 80g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，MnSO4·H2O 200mg/L，FeSO4·7H2O 200mg/L，精氨酸200mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，生物素0.1g/L，维生素B1 0.2mg/L，CaCO3 30g/L，适量水，pH 7.0。
具体地说，
一种高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌(corynbacteriumglutamicum)jp-07092，已于2018年6月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.15856。
所述菌株是通过如下方法筛选得到的：从国家菌种保藏中心CGMCC购入经过冻干保存的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032粉剂，将菌株活化后通过离子束诱变筛选一株高产L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌，再以筛选获得的高产L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌经过离子束诱变获得一株L-精氨酸缺陷型的谷氨酸棒杆菌。对于离子束诱变筛选一株高产L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌方法如下，利用液态LB培养基对谷氨酸棒杆菌ATCC 13032进行基础培养，30℃培养12h，将培养好的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌液按照10倍稀释法稀释至细胞数为109/mL，取菌液0.1mL均匀涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为(95、140、185、230、275)×2.6×1013N+/cm2，N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用1mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，培养基中添加了精氨酸甲基酯抗性，30℃倒置培养1d，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出菌落生长速度快且产L-精氨酸最高的菌株，在未经发酵优化情况下，L-精氨酸产量为18g/L，命名其为Best-1。
使用Best-1为出发菌株，仍然通过离子束诱变的方法从Best-1中筛选L-精氨酸缺陷型菌株。诱变方法与上述相同，用液态LB培养基对Best-1进行基础培养，30℃培养12h，将培养好的Best-1菌液按照10倍稀释法稀释至细胞数为109/mL，取菌液0.1mL均匀涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为(95、140、185、230、275)×2.6×1013N+/cm2，N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用1mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板基本培养基和含有L-精氨酸的培养基，基本培养基(g/L)：葡萄糖5，(NH4)2SO4 3，K2HPO4 0.2，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.5，NaH2PO4 0.2，L-精氨酸培养基是在基本培养基中添加L-精氨酸150mg/L，找出在基本培养基中不生长，在L-精氨酸培养基中可以生长的菌株，其则为精氨酸缺陷型菌。在精氨酸缺陷型菌株中挑选出鸟氨酸高产菌，筛选培养基为(g/L)：葡萄糖25，(NH4)2SO4 15，K2HPO4 1，KH2PO4 0.5，MgSO4 2.5，NaH2PO4 0.5，CaCO3 10，pH 7.0。将筛选出的较高产菌株分离纯化后得到的高产L-鸟氨酸菌株，经发酵优化，添加葡萄糖120g/L，(NH4)2SO4 80g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O·0.25g/L，KH2PO4 1g/L，MnSO4·H2O 200mg/L，FeSO4·7H2O 200mg/L，精氨酸200mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，生物素0.1g/L，维生素B1 0.2mg/L，CaCO3 30g/L，L-鸟氨酸产量可以达到45g/L。命名其为谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092。
所述谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092的培养条件为：
菌种采用好氧培养的方式，用于培养该菌株的碳源可以是葡萄糖；用于培养该菌株的氮源可以硫酸铵。该菌株生长的最佳温度范围为25-58℃，pH范围5-9，最佳pH范围为6-8。在菌株培养过程中还可添加磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁等无机盐类。
用筛选获得的高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌进行30次左右的传代培养，摇瓶发酵测其生长和L-鸟氨酸产量，发现在传代30次以后，菌株仍然有较好的遗传稳定性。
所述谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092的生理形态特征为：谷氨酸棒杆菌，在LB平板上生长旺盛，明显观察到单菌落着色均匀，且呈现圆形或球状，颜色呈米白色。菌落表面光滑，米白色或呈微黄色。
所述的谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092在液体发酵生产L-鸟氨酸中的应用。包括如下步骤：
1)种子培养：从活化的平板上取一环菌接入液体种子培养基中，25-58℃培养12h；
2)取步骤1)的种子液接入液体培养基中进行发酵培养，接种量为3.5％，培养温度为25℃～58℃，液体发酵。
步骤1)中所述液体种子培养基包括如下质量百分比的组分：碳源10～60g/L，氮源15～35g/L，无机盐0～2g/L，适量水，pH 5.5～8.0。其中所述碳源选自葡萄糖；所述氮源为硫酸铵，所述无机盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁中的至少一种。
步骤2)中的液体培养基包括如下质量百分比的组分：碳源80～120g/L，氮源50～90g/L，无机盐0～10g/L，适量水，pH5.5～8.0。
最优选的生产方式为：将菌株活化后，在25～58℃下好氧发酵30-78h，装液量为30mL发酵液/500mL三角瓶，转速为220r/min。
通过对发酵培养基进行优化，谷氨酸棒杆菌jp-07092的发酵培养基为：添加葡萄糖120g/L，(NH4)2SO4 80g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，KH2PO4 1g/L，MnSO4·H2O 200mg/L，FeSO4·7H2O 200mg/L，精氨酸200mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，生物素0.1g/L，维生素B1 0.2mg/L，CaCO3 30g/L，pH 7.0。110℃，15min灭菌。
本发明的有益效果：
本发明与现有技术相比具有如下优势：
与现有的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.3663相比，本发明的谷氨酸杆菌具有很高的代谢活力，通过减少发酵周期的时间，将发酵周期缩短至65h，并且在葡萄糖添加量为120g/L时L-鸟氨酸产量可以达到45g/L，在工业上大大减少了昂贵的葡萄糖的使用。该菌株发酵过程中采用的是硫酸铵作为唯一氮源，替代了传统以酵母膏、牛肉膏等有机氮源，为工业生产降低了成本，对于后期副产物的处理也带来了很大的方便。下表为本专利中采用的谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092与现有的产L-鸟氨酸的发酵优势对比。
由上表可知，与别的菌株相比，谷氨酸棒杆菌jp-07092在低糖培养基中(葡萄糖120g/L)，就可以达到45g/L的产量。而且谷氨酸棒杆菌jp-07092使用硫酸铵为唯一氮源，对比其余菌株减少了氮源的使用。其中酵母膏单价为30元/kg，硫酸铵单价为1.2元/kg，所以使用硫酸铵为氮源大大降低了生产成本。并且谷氨酸棒杆菌jp-07092的发酵周期缩短了，缩短了将近10％，使得在一定的时间内增加了发酵批次，提高L-鸟氨酸总产量。在同等鸟氨酸产量的情况下本发明谷氨酸棒杆菌所需的碳源氮源等的用量都比较少。
与传统的谷氨酸棒杆菌发酵相比，该菌株发酵过程中采用的是硫酸铵作为唯一氮源，替代了传统以酵母膏、牛肉膏等有机氮源，不仅为工业生产降低了成本，并且避免了采用有机氮源为培养基成分在发酵结束后期会产生许多难以处理的副产物，相比之下硫酸铵成分单一，不会出现此类问题。
总的来说，采用本发明提供的菌株在特定的优化发酵工艺下，与传统的谷氨酸棒杆菌相比，具有成本低、发酵周期短、单位时间产量高、后续提纯工艺简单等优点，更适于工业化推广。
菌株保藏信息：
本发明采用的菌株的分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)jp-07092，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC，地址：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.15856，保藏日期为2018年6月4日。
具体实施方式
通过下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书说所详细描述的本发明。本发明提及的未给出具体配制过程的培养基按微生物学实验常用培养基配制。
实施例1谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)Best-1的诱变筛选
国家菌种保藏中心购入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，利用液态LB培养基进行基础培养，30℃培养1天之后，同时测定生物量和L-精氨酸、L-鸟氨酸的产量，液态LB种子培养基中培养。将培养好的谷氨酸棒杆菌的菌液按10倍稀释法稀释至细胞数为109/mL，取菌液0.1mL均匀涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为(95、140、185、230、275)×2.6×1013N+/cm2，N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用1mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，培养基中添加了精氨酸甲基酯抗性，30℃倒置培养1d，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出菌落生长速度快且产L-精氨酸最高的菌株，在未经发酵优化情况下，L-精氨酸产量为18g/L，命名其为Best-1。
实施例2谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092的诱变筛选
使用Best-1为出发菌株，利用液态LB培养基进行基础培养，30℃培养1天之后，同时测定生物量和L-精氨酸、L-鸟氨酸的产量，液态LB种子培养基中培养。将培养好的谷氨酸棒杆菌的菌液按10倍稀释法稀释至细胞数为109/mL，取菌液0.1mL均匀涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为(95、140、185、230、275)×2.6×1013N+/cm2，N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用1mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，平板培养基(g/L):葡萄糖5，(NH4)2SO4 3，K2HPO4 0.2，KH2PO4 0.2，MgSO40.5，NaH2PO4 0.2，除上述基本培养基以外，需设置空白组合对照组，空白组为以上基本培养基培养，对照组在基本培养基中添加L-精氨酸150mg/L，找出在空白组中不长，在对照组中可以生长的菌株，其则为精氨酸缺陷型菌。在精氨酸缺陷型菌株中挑选出鸟氨酸高产菌，筛选培养基为(g/L)：葡萄糖25，(NH4)2SO4 15，K2HPO4 1，KH2PO4 0.5，MgSO4 2.5，NaH2PO4 0.5，CaCO3 10，pH 7.0。最终筛选获得一株鸟氨酸高产菌，命名其为谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092。
实施例3谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092的培养及生理学特征
菌种采用好氧培养的方式。用于培养该菌株的碳源可以是葡萄糖；用于培养该菌株的氮源为硫酸铵。该菌株生长的最佳温度为25-50℃，pH范围5-9，最佳pH范围为6-8。在菌株培养过程中还可添加磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁等无机盐类。
所述谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092的生理形态特征为：
谷氨酸棒杆菌，在LB平板上生长旺盛，明显观察到单菌落着色均匀，且呈现圆形或球状，颜色呈米白色。菌落表面光滑，米白色或呈微黄色。
实施例4谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092发酵产L-鸟氨酸
谷氨酸棒杆菌(corynbacterium glutamicum)jp-07092发酵
发酵培养基：经发酵优化，葡萄糖120g/L，(NH4)2SO4 80g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，KH2PO4 1g/L，MnSO4·H2O 200mg/L，FeSO4·7H2O 200mg/L，精氨酸200mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，生物素0.1g/L，维生素B1 0.2mg/L，CaCO3 30g/L，pH7.0。发酵过程中通过流加氨水稳定pH。用谷氨酸棒杆菌种子培养基培养谷氨酸棒杆菌jp-07092在30℃，200r/min条件下培养12h之后接入已经灭菌的5L发酵罐中进行培养，其中发酵罐装液量为3L，培养条件：30℃、通气比1.5v/vm、搅拌转速为220r/min。发酵过程中使用硫酸铵为唯一氮源，发酵周期为65h，发酵结束L-鸟氨酸产量可以达到45g/L。
由于培养基不采用有机氮源，副产物少，后续提纯工艺相对简单。对于发酵结束后的发酵液需要进行L-鸟氨酸的提取纯化。提纯方法为膜过滤，首先将发酵结束的发酵液进行分装离心，离心条件为7000r/min、离心10min。离心后留上清，将上清通过膜过滤的方法除去培养基中成分比如未完全消耗的葡萄糖、氮源、其他杂质以及残留菌体等。选用分子量为500KD的陶瓷膜，过滤条件为pH为2.5，操作压力差为0.24MPa，操作温度为58℃。获得过滤液后，再进行阳离子交换树脂吸附，L-鸟氨酸的上柱浓度为45g/L，上柱流量10mL/min，洗脱剂为0.5mol/L的氨水。对洗脱液进行脱色和结晶，脱色液浓度为450g/L，结晶温度采用20℃，搅拌转速为200rpm，结晶6h后可以获得纯度高达98.7％的L-鸟氨酸结晶。

Claims (8)

1.一种高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌，所述菌株的分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)jp-07092，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.15856。
2.权利要求1所述高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-鸟氨酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)jp-07092活化，在25～58℃下好氧发酵42～72h；其中，好氧发酵培养基含有：碳源80～120g/L，氮源50～90g/L，无机盐0～10g/L，适量水，pH5.5～8.0。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖；所述的氮源为硫酸铵；所述的无机盐为镁盐、钾盐、锰盐、钙盐、硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐中的任意一种或几种的组合。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将谷氨酸棒杆菌jp-07092活化后，在30℃下好氧发酵65h，在发酵阶段通气比1.5v/vm、搅拌220r/min；
其中，所述的好氧发酵培养基含有：葡萄糖80～140g/L，(NH4)2SO4 50～90g/L，K2HPO4·3H2O 1～3g/L，KH2PO4 1～4g/L，MgSO4·7H2O 0.2～2g/L,CaCO3 10～40g/L,适量水，pH6～8，发酵过程中通过流加氨水来稳定pH。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该培养基优化为：葡萄糖120g/L，(NH4)2SO480g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，MnSO4·H2O 200mg/L，FeSO4·7H2O 200mg/L，精氨酸200mg/L，ZnCl2 1mg/L，CuSO4 0.2mg/L，生物素0.1g/L，维生素B1 0.2mg/L，CaCO3 30g/L，适量水，pH 7.0。
7.用于权利要求1所述谷氨酸棒杆菌高产L-鸟氨酸的培养基，其特征在于该培养基为好氧发酵培养基含有：葡萄糖80～140g/L，(NH4)2SO4 50～90g/L，K2HPO4·3H2O 1～3g/L，KH2PO41～4g/L，MgSO4·7H2O 0.2～2g/L,CaCO3 10～40g/L，适量水，pH6～8。
8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，该培养基优化为：葡萄糖120g/L，(NH4)2SO4 80g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，MnSO4·H2O 200mg/L，FeSO4·7H2O 200mg/L，精氨酸200mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，生物素0.1g/L，维生素B1 0.2mg/L，CaCO3 30g/L，适量水，pH 7.0。
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