CN103048464A - 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备方法；所述检测试剂盒由彼此独立的试剂I和试剂Ⅱ组成；试剂I的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；本发明试剂盒的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合，有效避免了NGAL/MMP-9复合物对检测结果的影响，具有特异性强，灵敏度高，线性范围广，稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及脂质运载蛋白含量检测试剂盒，尤其涉及一种人体内中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)含量的检测试剂盒及其制备方法，本发明进一步涉及该检测试剂盒在检测人体内NGAL含量的使用方法，属于人体内NGAL含量的检测领域。
背景技术
近年研究发现，脂质运载蛋白家族中的一个新成员——中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)，与急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)及各种原因引起的慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)密切相关，是预测AKI的一个新型标记物，同时也是监测CKD进展和肾功能损害的生物学指标。
NGAL是脂质运载蛋白家族的成员之一，于1993年由Kjeldsen等在人类中性粒细胞中发现和分离出来，它的大鼠、小鼠种间同源基因分别为α2微球相关蛋白和24p3蛋白。在生物体内NGAL有分子量为25kDa、自身聚合46kDa同源二聚体或与MMP-9聚合形成135kDa异源二聚体三种存在方式。NGAL具有由8条β折叠相互作用而形成的β自折叠桶结构，其底部内侧的疏水核可以结合并转运亲脂性配体，这一结构特点决定了NGAL的生物活性。在β-折叠桶封闭端的β4-β5间有游离的巯基(Cys87)，这为NGAL结合MMP-9前体奠定了结构基础。目前认为NGAL蛋白能运输介导炎症反应的一些亲脂性分子，如血小板活化因子(PAF)、白三烯B4(LTB4)和脂多糖(LPS)等；调节MMP-9活性，并可能参与清除炎症介质，调节免疫反应，抑制细 胞凋亡以及肿瘤的发生发展、浸润转移等过程。NGAL还通过与含铁的铁载体结合，形成NGAL-铁载体-铁复合物，参与肾脏的发生、发展及修复过程。在正常的生理状态下，除了中性粒细胞以外，NGAL在人类很多组织如支气管、胃、小肠、胰腺、肾脏等的上皮细胞中有低水平表达。而在病理状态下，这些组织的上皮细胞则有大量NGAL表达，特别是在损伤的近端肾小管上皮细胞中。
在寻找AKI早期诊断标记物的研究中，人们发现NGAL是一个很好的预测及诊断指标。有学者在急性缺血再灌注和顺铂诱导的AKI小鼠模型中，发现在损伤发生数小时之内即可检测到NGAL的表达明显增高。美国Cincinnati儿童中心的研究发现，在接受心脏分流术的71例儿童患者中，其中20例术后发生急性肾功能衰竭的患儿术后2h尿NGAL水平即明显升高，而其血肌酐的升高则发生在术后1-3d，提示尿NGAL是缺血性肾损伤的一个早期、敏感指标。后来不少类似的研究均得到同样的结论，即AKI时血、尿NGAL水平均升高，尿NGAL水平升高更为显著。并且NGAL升高较早期肾脏损伤的其他指标如肾脏损伤分子(kidney injury molecular1,KIM-1)、Cyr61(cystein richprotein61)、β2-微球蛋白等出现得要早。同时，NGAL水平与肾脏损伤程度呈正相关，血和尿NGAL可作为诊断AKI早期、敏感、特异性的早期生物学标记物，并在一定程度上可以反映AKI严重程度及判断预后。
目前NGAL的检测方法有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blotting、化学发光法以及胶乳免疫比浊法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大；放射免疫法存在着环境污染问题；Western-blotting操作复杂，测定精密度低；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定化学发光检测仪，这些原因导致其应用范围较小；胶乳免疫比浊法也是测定人血浆或尿液中NGAL浓度的常用方法，它与上述其他几种方法相比较，存在操作简单、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应用范围广等显著的特点。因此，胶乳免疫比浊法有着极大的研究价值， 但是目前市场上的胶乳免疫比浊法检测试剂盒存在着检测不到NGAL/MMP-9复合物、抗干扰能力差、特异性低、试剂稳定性不好或检测线性范围窄等问题，有待改进。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒；
本发明的目的之二是提供一种制备所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，由彼此独立的试剂I和试剂Ⅱ组成；所述试剂I的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；所述试剂Ⅱ的组分包括：包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；其中，所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合。
优选的，本发明中所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体通过亲和层析方法筛选得到；优选的，所述的筛选方法包括：
(1)MMP-9亲和层析柱的制备将MMP-9蛋白与压积CNBr-Sepharose4B混合，依次经过交联、清洗、封闭残留的活化基团、再次清洗、装柱、平衡，得到MMP-9亲和层析柱；
(2)MMP-9/NGAL复合物亲和层析柱的制备：将蛋白NGAL溶液过MMP-9亲和层析柱；然后用磷酸缓冲液洗脱多余的NGAL蛋白；
(3)亲和层析：将NGAL抗体溶液通过所制备的亲和层析柱，去除非特异性吸 附后进行解吸，分段收集解吸液，充分透析掉解吸液中的TB，真空冷冻干燥，即得。
其中，步骤(1)中CNBr-Sepharose4B与5-7mg蛋白MMP-9按照每毫升压积CNBr-Sepharose4B与5-7mg蛋白MMP-9的比例进行混合；步骤(1)中所述的封闭方式加等质量的0.1mol/L乙醇胺-HCl4℃摇动1小时。
优选的，步骤(2)中将蛋白NGAL配制成2mg/mL的溶液，用NGAL蛋白溶液以1mL/min的流速过MMP-9亲和层析柱；然后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液以1mL/min的流速洗脱多余的NGAL蛋白；
优选的，步骤(3)中将NGAL抗体浓度调整至600ug/mL，以6mL/小时流速通过所制备的亲和层析柱、再依次用1mol/L NaCl-TB、0.5％NP-40-TB、TB和双蒸水清洗以去除非特异性吸附；然后用3mol/L KSCN6mL/小时进行解吸；紫外检测分段收集解吸液。
本发明所述包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备方法包括：
(1)制备羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液：称取粒径为105-145nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入磷酸盐缓冲液分散，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺和硫代NHS，室温下搅拌反应；离心弃上清，再用磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳，得到羧化改性聚苯乙烯胶乳；
(2)NGAL抗体溶液的制备：将筛选得到的既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合的NGAL单克隆抗体或多克隆抗体用去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；
(3)包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：步骤(2)所制备的抗体溶液用磷酸缓冲液稀释后加入羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，在室温下搅拌反应，终止反应后，离心弃上清，洗涤沉淀，即得。
本发明中所述的的胶乳颗粒为粒径为105-145nm的中等粒径的胶乳颗粒，采 用该粒径范围内的胶乳颗粒既可以解决小粒径胶乳检测灵敏度不够的问题，还可以解决大粒径胶乳检测线性范围小的问题，同时还可以避免大粒径胶乳在长时间存放过程中下沉导致的产品稳定性不好的问题。而且采用一种粒径的胶乳颗粒制备检测试剂盒减少了试剂盒生产过程中的工序，即节省了成本又避免了过多工序对产品品质的影响。
为了达到更好的检测效果，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-100g，表面活性剂0.5-20mL，促凝剂2-50g，防腐剂0.02-1mL，稳定剂1-60g，阻断剂1-10mL，螯合剂0.05-5g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被NGAL抗体的胶乳颗粒0.1-10g，生物缓冲剂1-100g，螯合剂0.1-10g，表面活性剂0.05-3mL，防腐剂0.02-1mL，助悬剂5-50mL，封闭剂5-50g，稳定剂50-150g，余量为水。
进一步优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂7-20g，表面活性剂1-10mL，促凝剂10-30g，防腐剂0.1-0.5mL，稳定剂5-15g，阻断剂3-6mL，螯合剂0.1-1g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被NGAL抗体的胶乳颗粒0.5-5g，生物缓冲剂5-30g，螯合剂0.5-4g，表面活性剂0.5-2mL，防腐剂0.1-0.5mL，助悬剂10-40mL，封闭剂7-15g，稳定剂80-120g，余量为水。
最优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂12g，表面活性剂4mL，促凝剂15g，防腐剂0.25mL，稳定剂10g，阻断剂5mL，螯合剂0.4g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被NGAL抗体的胶乳颗粒1.7g，生物缓冲剂11g，螯合剂2g，表面活性剂1.5mL，防腐剂0.25mL，助悬剂20mL，封闭剂10g，稳定剂100g，余量为水。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂是能够用于维持一定PH值的各种生物缓冲剂，例如可以是三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-***啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸(POPSO)、3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)等各种常用生物缓冲液，为了达到更好的检测效果，试剂Ⅰ中所述的生物缓冲剂优选为三羟甲基氨基甲烷(Tris)，试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂优选为3-(N-吗啉)丙磺酸。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的表面活性剂主要起到促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散及提高检测的精密度，达到减少样本浊度对测定结果的影响的目的；因此，现有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的表面活性剂，例如，吐温20、吐温40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等。本发明的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的表面活性剂优选为曲拉通X-100。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明；本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的防腐剂优选为Proclin-300，该产品毒性小，使用剂量小，杀菌谱广。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的稳定剂，主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。常用的稳定剂为糖类、醇类、蛋白类以及一些氨基酸等，本发明中的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的稳定剂优选为蔗糖。
试剂Ⅰ中的促凝剂可以促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围。本发明检测试剂盒中的促凝剂优选为PEG-6000或PEG-8000。
试剂Ⅰ中的阻断剂可以有效避免非特异性反应对检测结果的干扰。检测试剂盒 中常见的干扰因素有以下两类：异嗜性抗体干扰、类风湿因子干扰。本发明优选的阻断剂为类风湿因子阻断剂。部分类风湿关节炎、各种胶原***病、肝病以及多种慢性疾病病人体内会出现的一类自身抗体，可与自身IgG分子的Fc段抗原决定簇起反应，该类抗体被称为类风湿因子。
试剂Ⅰ及试剂Ⅱ中的螯合剂能够络合检测样本中的金属离子，以减少金属离子造成的干扰；因此，能够络合金属离子的各种螯合剂均能够适用，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等，本发明试剂Ⅱ优选乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)为螯合剂。
试剂Ⅱ中的助悬剂可以帮助胶乳颗粒维持一个很好的分散状态，防止胶乳颗粒下沉影响检测试剂盒的品质及开瓶稳定性，常用的助悬剂有乙二醇、丙三醇、乳糖和麦芽糖等，本发明试剂Ⅱ优选乙二醇作为助悬剂。
试剂Ⅱ中的封闭剂的作用是为了与胶乳颗粒中游离的-COOH位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成不良影响，本发明试剂Ⅱ中优选BSA蛋白作为封闭剂。
本发明检测试剂盒中所用到的每种组分均能通过商业途径从生物试剂公司或医药公司购买得到。
本发明的另外一个目的是提供一种制备所述检测NGAL试剂盒的方法，包括：
(1)制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(2)制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
本发明的又一目的是提供所述NGAL检测试剂盒检测样品中NGAL含量的检测方法，该方法为两点终点法，包括以下步骤：向2.5μL待检测样本(校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品)中加入120μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5 分钟，再向混合体系中加入30μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
本发明检测试剂盒在现有的NGAL胶乳检测试剂盒的基础上对现有技术和配方进行了改进，克服了现有胶乳检测试剂盒抗干扰性差，消除了NGAL/MMP-9复合物对检测结果的影响；此外，本发明检测试剂盒采用中等粒径的胶乳颗粒为载体制备得到包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体的胶乳颗粒，不仅提高了检测灵敏度，也有效解决了检测线性范围窄以及产品稳定性不够的问题。
本发明检测试剂盒可以克服干扰因子的影响，可以检测到NGAL与MMP-9的复合物，避免NGAL检测结果偏低导致医生的误判；同时本发明检测试剂盒还具有开瓶稳定性好、检测线性范围广、生产成本较低等有点。
图1是本发明检测试剂盒的标准工作曲线。
图2是本发明检测试剂盒的37℃热稳定性试验结果。，
图3是对比NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒37℃热稳定性试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
预备实施例1NGAL抗体的筛选
1、MMP-9亲和层析柱的制备：将蛋白MMP-9(购自R&D公司)与与压积CNBr-Sepharose4B(Pharmacia产品)按5-7mg/mL比例混合，4℃摇动20小时，使其交联。然后用0.1mol/L pH8.0碳酸盐缓冲液清洗3次,再加等量0.1mol/L乙醇胺-HCl 4℃摇动1小时，以封闭残留的活化集团。最后用0.01mol/L Tris-HCl(TB)清洗、装柱、平衡，柱子的容积选用10mL。
2、MMP-9/NGAL复合物亲和层析柱的制备：将蛋白NGAL(购自R&D公司)配制成2mg/mL的溶液，用NGAL蛋白溶液以1mL/min的流速过MMP-9亲和层析柱，蛋白溶液的用量为60mL；然后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液以1mL/min的流速洗脱多余的NGAL蛋白，洗脱液的用量为100mL。
3、亲和层析：NGAL抗体(购自武汉华美生物工程有限公司)，将NGAL抗体浓度调整至600ug/mL，以6mL/小时流速通过步骤2制备的亲和层析柱、依次用1mol/L NaCl-TB、0.5%NP-40-TB、TB和双蒸水清洗，以去除非特异性吸附。然后用3mol/L KSCN6mL/小时进行解吸。紫外检测分段收集解吸液。用透析袋充分透析掉TB，后真空冷冻干燥溶液，既得经筛选的NGAL抗体。
预备实施例2包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备
包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备过程如下：
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：称取1.0g粒径为105nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入100mL0.12M磷酸盐缓冲液(pH7.5)分散，加入40mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应0.5小时，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②NGAL抗体溶液的制备：将250μg预备实施例1所筛选得到的NGAL抗体用0.5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；
③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：取100μL②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌 反应2小时，加入0.2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。
预备实施例3包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备
包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备过程如下：
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：称取1.0g粒径为130nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入100mL0.12M磷酸盐缓冲液(pH7.5)分散，加入40mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应0.5小时，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②NGAL抗体溶液的制备：将250μg预备实施例1所筛选得到的NGAL抗体用0.5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；
③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：取100μL②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入0.2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。
预备实施例4包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备
包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备过程如下：
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：称取1.0g粒径为145nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入100mL0.12M磷酸盐缓冲液(pH7.5)分散，加入40mg1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应0.5小时，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②NGAL抗体溶液的制备：将250μg预备实施例1所筛选得到的NGAL抗体用0.5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；
③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：取100μL②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入0.2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。
实施例1 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例2 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例3 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例4 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例5 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例6 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例1 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：称取1.0g粒径为100nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入100mL0.12M磷酸盐缓冲液(pH7.5)分散，加入40mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应0.5小时，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②NGAL抗体溶液的制备：将250μg NGAL抗体用0.5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；
③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：取100μL②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入0.2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例2 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：称取1.0g粒径为50nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入100mL0.12M磷酸盐缓冲液(pH7.5)分散，加入40mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应0.5小时，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得 羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②NGAL抗体溶液的制备：将250μg NGAL抗体用0.5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；
③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：取100μL②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入0.2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例3 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：称取1.0g粒径为150nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入100mL0.12M磷酸盐缓冲液(pH7.5)分散，加入40mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应0.5小时，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②NGAL抗体溶液的制备：将250μg NGAL抗体用0.5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；
③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：取100μL②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入0.2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例4 NGAL胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：称取1.0g粒径为500nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入100mL0.12M磷酸盐缓冲液(pH7.5)分散，加入40mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应0.5小时，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②NGAL抗体溶液的制备：将250μg NGAL抗体用0.5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；
③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：取100μL②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入0.2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
试验例1本发明检测试剂盒的标准工作曲线
取浓度为0ng/mL，150ng/mL，600ng/mL，1500ng/mL，3000ng/mL，5000ng/mL的NGAL标准品溶液，用本发明实施例1所制备的NGAL检测试剂盒、对比实施例2制备的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒以及对比实施例4制备的NGAL胶乳检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线，结果见图1。
各NGAL检测试剂盒检测样品中NGAL含量的检测方法，该方法为两点终点法，包括以下步骤：向2.5μL待检测样本(校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品)中加入120μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入30μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相 对应的浓度值即为测定浓度。
由图1的标准工作曲线可见，本发明检测试剂盒的线性范围及灵敏度均优于对比实施例检测试剂盒。
试验例2 本发明检测试剂盒与对比例检测试剂盒高值线性范围试验
用本发明实施例2制备的检测试剂盒与对比实施例3的检测试剂盒对系列稀释后的高值质控品进行检测，分别测定不同稀释倍数时质控品的浓度并计算其线性偏差，试验结果见表1和表2：
表1本发明实施例2检测试剂盒高值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差(%) |
| 0.1 | 940 | 942 | 941.5 | 956.8 | -1.60 |
| 0.2 | 1904 | 1898 | 1901.0 | 1913.6 | -0.66 |
| 0.3 | 2935 | 2924 | 2929.5 | 2870.4 | 2.06 |
| 0.4 | 3801 | 3807 | 3804.0 | 3827.2 | -0.61 |
| 0.5 | 4753 | 4745 | 4749.0 | 4784 | -0.73 |
| 0.6 | 5780 | 5789 | 5784.5 | 5740.8 | 0.76 |
| 0.7 | 6794 | 6785 | 6789.5 | 6697.6 | 1.37 |
| 0.8 | 7601 | 7611 | 7606.0 | 7654.4 | -0.63 |
| 0.9 | 8656 | 8649 | 8652.5 | 8611.2 | 0.48 |
| 1.0 | 9618 | 9627 | 9622.5 | 9568 | 0.57 |
表2对比实施例3检测试剂盒高值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差(%) |
| 0.1 | 569 | 572 | 570.5 | 584.8 | -2.45 |
| 0.2 | 1184 | 1176 | 1180.0 | 1169.6 | 0.89 |
| 0.3 | 1697 | 1684 | 1690.5 | 1754.4 | -3.64 |
| 0.4 | 2298 | 2287 | 2292.5 | 2339.2 | -2.00 |
| 0.5 | 2774 | 2758 | 2766.0 | 2924 | -5.40 |
| 0.6 | 3337 | 3318 | 3327.5 | 3508.8 | -5.17 |
| 0.7 | 3678 | 3664 | 3671.0 | 4093.6 | -10.32 |
| 0.8 | 3787 | 3804 | 3795.5 | 4678.4 | -18.87 |
[0190]
| 0.9 | 3847 | 3840 | 3843.5 | 5263.2 | -26.97 |
| 1.0 | 3894 | 3912 | 3903.0 | 5848 | -33.26 |
由表1和表2中的结果可见，本发明检测试剂盒检测线性范围要明显高于对照检测试剂盒，对比例检测试剂盒在NGAL含量大于4000ng/mL时线性偏差即大于10%，而本发明检测试剂盒在NGAL浓度为9568时线性偏差依然只有0.57%。由此说明本发明检测试剂盒线性范围要远优于常规方法制作的检测试剂盒。
试验例3 本发明检测试剂盒与对比检测试剂盒低值线性范围试验
取本发明实施例2制备的检测试剂盒与对比例3制备的检测试剂盒对系列稀释后的低值质控品进行检测，分别测定不同稀释倍数时质控品的浓度并计算其线性偏差，试验结果见表3和表4：
表3本发明实施例2检测试剂盒低值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差(%) |
| 0.1 | 62.7 | 64.3 | 63.5 | 63.25 | 0.40 |
| 0.2 | 127.3 | 128.0 | 127.65 | 126.5 | 0.91 |
| 0.3 | 190.4 | 191.1 | 190.75 | 189.75 | 0.53 |
| 0.4 | 254.3 | 254.8 | 254.55 | 253 | 0.61 |
| 0.5 | 318.5 | 318.9 | 318.7 | 316.25 | 0.77 |
| 0.6 | 381.2 | 379.2 | 380.2 | 379.5 | 0.18 |
| 0.7 | 445.2 | 445.6 | 445.4 | 442.75 | 0.60 |
| 0.8 | 505.4 | 505.1 | 505.25 | 506 | -0.15 |
| 0.9 | 570.3 | 569.1 | 569.7 | 569.25 | 0.08 |
| 1.0 | 633.1 | 633.9 | 633.5 | 632.5 | 0.16 |
表4对比实施例3检测试剂盒低值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差(%) |
| 0.1 | 69.2 | 68.9 | 69.05 | 73.11 | -5.55 |
| 0.2 | 155.3 | 155.1 | 155.2 | 146.22 | 6.14 |
| 0.3 | 231.3 | 230.9 | 231.1 | 219.33 | 5.37 |
[0198]
| 0.4 | 293.5 | 292.9 | 293.2 | 292.44 | 0.26 |
| 0.5 | 356.8 | 356.7 | 356.75 | 365.55 | -2.41 |
| 0.6 | 426.1 | 425.9 | 426 | 438.66 | -2.89 |
| 0.7 | 523.1 | 523.4 | 523.25 | 511.77 | 2.24 |
| 0.8 | 596.4 | 596.3 | 596.35 | 584.88 | 1.96 |
| 0.9 | 661.7 | 669.2 | 665.45 | 657.99 | 1.13 |
| 1.0 | 741.6 | 743.5 | 742.55 | 731.1 | 1.57 |
由表3和表4中的结果可见，本发明实施例2检测试剂盒检测低值线性范围要明显低于对比例3检测试剂盒，且检测值与理论值的线性偏差较小，说明测值更加准确。
试验例4本发明检测试剂盒及对比例检测试剂盒在检测高浓度NGAL/MMP-9复合物样本时的比较
本试验例所述的尿液样本中NGAL/MMP-9复合物采用Human MMP-9/NGAL Complex Immunoassay(购自R&D Systems,Inc.)进行检测，对尿液样本中MMP-9/NGAL复合物含量高的样本再采用本发明实施例1-3制备的检测试剂盒与对比实施例1-4制备的检测试剂盒分别进行检测(检测结果取平均值)。具体的检测结果的差异见表5：
表5本发明检测试剂盒与对比例检测试剂盒检测结果比较
从表5中可见本发明检测试剂盒检测的NGAL含量要高于对比实施例1-4所制备的检测试剂盒，说明本发明试剂盒可以避免NGAL/MMP-9复合物对检测结果的影响，避免检测结果偏低导致的临床误诊和误判。
试验例5本发明检测试剂盒抗干扰检测试验
在600ng/mL校准品中按表6中所示的类风湿因子的终浓度加入一定量的类风湿因子，再分别用本发明实施例1-3所制备的检测试剂盒和丹麦Bioporto Diagnostics公司生产的NGAL胶乳检测试剂盒对各样本进行检测，考察类风湿因子对各检测试剂盒的影响，结果见下表6。本发明NGAL检测试剂盒测定NGAL含量的方法同试验例1，丹麦Bioporto Diagnostics公司生产的NGAL胶乳检测试剂盒检测NGAL含量的方法参见产品说明书。从表6结果可知本发明检测试剂盒抗类风湿因子的干扰能力要明显优于对照检测试剂盒。
表6NGAL检测试剂盒抗类风湿因子干扰性能比对实验结果
试验例6 本发明检测试剂盒热稳定性试验
将本发明实施例1-6所制备的检测试剂盒与北京九强生物技术股份有限公司NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒，于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，并于不同的处理时间之后分别测定NGAL校准品，记录其ΔA值，并绘制其变化曲线，本发明检测试剂盒的37℃热稳定性试验结果见图2，北京九强生物技术股份有限公司NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒37℃热稳定性试验结果见图3。
从图2及图3的结果可知，本发明检测试剂盒37℃热处理稳定性好，其优良的稳定性决定了其在临床诊断上的广泛应用。
Claims (10)
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，由彼此独立的试剂I和试剂Ⅱ组成；所述试剂I的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；所述试剂Ⅱ的组分包括：包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；其特征在于：所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合。
2.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体通过亲和层析方法筛选得到；优选的，其筛选方法包括：
(1)制备MMP-9亲和层析柱：将MMP-9蛋白与压积CNBr-Sepharose4B混合，依次经过交联、清洗、封闭、再次清洗、装柱、平衡，得到MMP-9亲和层析柱；
(2)制备MMP-9/NGAL复合物亲和层析柱：将蛋白NGAL溶液过MMP-9亲和层析柱；再洗脱多余的NGAL蛋白；
(3)亲和层析：将NGAL抗体溶液通过步骤(1)所制备的亲和层析柱，去除非特异性吸附后进行解吸，分段收集解吸液，透析，冷冻干燥，即得。
3.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备方法包括：
(1)制备羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液：取粒径为105-145nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，用缓冲液分散，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺和硫代NHS，室温下搅拌反应；离心弃上清，再用缓冲液稀释分散沉淀胶乳，得到羧化改性聚苯乙烯胶乳；
(2)NGAL抗体溶液的制备：将筛选得到的既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合的NGAL单克隆抗体或多克隆抗体用去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；
(3)包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：将步骤(2)所制备的抗体溶液用缓冲液稀释后，加入羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，在室温下搅拌反应，终止反应后，离心弃上清，洗涤沉淀，即得。
4.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的表面活性剂为曲拉通X-100；所述的防腐剂为Proclin-300；所述的稳定剂为蔗糖；所述的促凝剂为PEG-6000或PEG-8000；所述的阻断剂为类风湿因子阻断剂；所述的螯合剂为乙二胺四乙酸二钠；所述的助悬剂为乙二醇；所述的封闭剂为牛血清白蛋白。
5.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ中所述的生物缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷，试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂为3-(N-吗啉)丙磺酸。
6.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-100g，表面活性剂0.5-20mL，促凝剂2-50g，防腐剂0.02-1mL，稳定剂1-60g，阻断剂1-10mL，螯合剂0.05-5g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被NGAL抗体的胶乳颗粒0.1-10g，生物缓冲剂1-100g，螯合剂0.1-10g，表面活性剂0.05-3mL，防腐剂0.02-1mL，助悬剂5-50mL，封闭剂5-50g，稳定剂50-150g，余量为水。
7.按照权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂7-20g，表面活性剂1-10mL，促凝剂10-30g，防腐剂0.1-0.5mL，稳定剂5-15g，阻断剂3-6mL，螯合剂0.1-1g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被NGAL抗体的胶乳颗粒0.5-5g，生物缓冲剂5-30g，螯合剂0.5-4g，表面活性剂0.5-2mL，防腐剂0.1-0.5mL，助悬剂10-40mL，封闭剂7-15g，稳定剂80-120g。
8.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂12g，表面活性剂4mL，促凝剂15g，防腐剂0.25mL，稳定剂10g，阻断剂5mL，螯合剂0.4g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被NGAL抗体的胶乳颗粒1.7g，生物缓冲剂11g，螯合剂2g，表面活性剂1.5mL，防腐剂0.25mL，助悬剂20mL，封闭剂10g，稳定剂100g。
9.按照权利要求1-8任何一项的检测试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ的pH值的范围为7.0-8.0，试剂Ⅱ的pH值的范围为6.5-7.5。
10.一种制备权利要求1-8任何一项所述检测试剂盒的方法，包括：(1)制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(2)制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103308681A (zh) * | 2013-06-25 | 2013-09-18 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 胰蛋白酶原-2检测试剂盒及制备方法 |
| CN103513038A (zh) * | 2013-05-16 | 2014-01-15 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 半乳糖凝集素3检测试剂盒及制备方法 |
| CN103529223A (zh) * | 2013-10-17 | 2014-01-22 | 天津中新科炬生物制药有限公司 | 同时检测胱抑素c和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测装置及检测方法 |
| CN103792353A (zh) * | 2013-10-17 | 2014-05-14 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 一种脂蛋白相关磷脂酶a2含量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN104198732A (zh) * | 2014-08-28 | 2014-12-10 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 |
| CN104198723A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-12-10 | 南京普朗医疗设备有限公司 | 一种基于氨基酸间臂的ngal快速检测试剂盒 |
| CN104655843A (zh) * | 2014-05-19 | 2015-05-27 | 宁波普瑞柏生物技术有限公司 | 一种胃癌检测方法、试剂以及其试剂盒 |
| CN104865386A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-26 | 浙江蓝森生物科技有限公司 | 一种人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量定量测定方法、试剂及试剂盒 |
| CN106093387A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定骨源性碱性磷酸酶的试剂盒 |
| CN106093422A (zh) * | 2016-05-31 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的试剂盒 |
| CN106443009A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-22 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法 |
| CN106483297A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-03-08 | 浙江达美生物技术有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂及制备方法 |
| CN106814193A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-06-09 | 美康生物科技股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 |
| CN107525936A (zh) * | 2017-07-21 | 2017-12-29 | 王贤俊 | 一种提升胶乳免疫比浊法中肌钙蛋白抗体稳定性的组合物 |
| CN107991496A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-05-04 | 山东诺安爱迪尔生物工程有限公司 | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
| CN108053866A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-18 | 迈克医疗电子有限公司 | 工作曲线的传递方法、装置、设备和存储介质 |
| WO2018119626A1 (zh) * | 2016-12-27 | 2018-07-05 | 菲鹏生物股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
| CN108535491A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-09-14 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种肌钙蛋白i的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒 |
| CN108548926A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-09-18 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒 |
| CN109001453A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-12-14 | 沈阳百创特生物科技有限公司 | 一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒 |
| CN110133276A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-08-16 | 芜湖森爱驰生物科技有限公司 | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
| CN111624352A (zh) * | 2020-06-04 | 2020-09-04 | 柏荣诊断产品（上海）有限公司 | 一种高准确性尿液中ngal检测试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101566633A (zh) * | 2009-04-17 | 2009-10-28 | 武汉华美生物工程有限公司 | 一种诊断评价或测定癌症并预知所述疾病严重性的方法 |
| CN102072960A (zh) * | 2010-03-29 | 2011-05-25 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 一种样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测方法 |
| WO2011066458A2 (en) * | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Prometheus Laboratories Inc. | Novel genomic biomarkers for irritable bowel syndrome diagnosis |
| US20120034684A1 (en) * | 2010-08-05 | 2012-02-09 | Abbott Point Of Care | Magnetic immunosensor with trench configuration and method of use |
| CN102590524A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-18 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
-
2012
- 2012-10-17 CN CN201210394943.8A patent/CN103048464B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101566633A (zh) * | 2009-04-17 | 2009-10-28 | 武汉华美生物工程有限公司 | 一种诊断评价或测定癌症并预知所述疾病严重性的方法 |
| WO2011066458A2 (en) * | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Prometheus Laboratories Inc. | Novel genomic biomarkers for irritable bowel syndrome diagnosis |
| CN102072960A (zh) * | 2010-03-29 | 2011-05-25 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 一种样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测方法 |
| US20120034684A1 (en) * | 2010-08-05 | 2012-02-09 | Abbott Point Of Care | Magnetic immunosensor with trench configuration and method of use |
| CN102590524A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-18 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
Cited By (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103513038A (zh) * | 2013-05-16 | 2014-01-15 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 半乳糖凝集素3检测试剂盒及制备方法 |
| CN103513038B (zh) * | 2013-05-16 | 2015-06-10 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 半乳糖凝集素3检测试剂盒及制备方法 |
| CN103308681B (zh) * | 2013-06-25 | 2015-07-29 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 胰蛋白酶原-2检测试剂盒及制备方法 |
| CN103308681A (zh) * | 2013-06-25 | 2013-09-18 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 胰蛋白酶原-2检测试剂盒及制备方法 |
| CN103529223A (zh) * | 2013-10-17 | 2014-01-22 | 天津中新科炬生物制药有限公司 | 同时检测胱抑素c和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测装置及检测方法 |
| CN103792353A (zh) * | 2013-10-17 | 2014-05-14 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 一种脂蛋白相关磷脂酶a2含量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN103792353B (zh) * | 2013-10-17 | 2015-07-15 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 一种脂蛋白相关磷脂酶a2含量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN104655843A (zh) * | 2014-05-19 | 2015-05-27 | 宁波普瑞柏生物技术有限公司 | 一种胃癌检测方法、试剂以及其试剂盒 |
| CN104198723A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-12-10 | 南京普朗医疗设备有限公司 | 一种基于氨基酸间臂的ngal快速检测试剂盒 |
| CN104198732A (zh) * | 2014-08-28 | 2014-12-10 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 |
| CN104198732B (zh) * | 2014-08-28 | 2015-08-19 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 |
| CN104865386A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-26 | 浙江蓝森生物科技有限公司 | 一种人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量定量测定方法、试剂及试剂盒 |
| CN106093387A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定骨源性碱性磷酸酶的试剂盒 |
| CN106093422A (zh) * | 2016-05-31 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的试剂盒 |
| CN106443009A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-22 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法 |
| CN106483297A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-03-08 | 浙江达美生物技术有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂及制备方法 |
| CN106814193A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-06-09 | 美康生物科技股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 |
| CN106814193B (zh) * | 2016-12-23 | 2018-11-23 | 美康生物科技股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 |
| WO2018119626A1 (zh) * | 2016-12-27 | 2018-07-05 | 菲鹏生物股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
| CN107525936B (zh) * | 2017-07-21 | 2020-02-07 | 王贤俊 | 一种提升胶乳免疫比浊法中肌钙蛋白抗体稳定性的组合物 |
| CN107525936A (zh) * | 2017-07-21 | 2017-12-29 | 王贤俊 | 一种提升胶乳免疫比浊法中肌钙蛋白抗体稳定性的组合物 |
| CN107991496A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-05-04 | 山东诺安爱迪尔生物工程有限公司 | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
| CN108053866B (zh) * | 2017-12-12 | 2020-09-25 | 迈克医疗电子有限公司 | 工作曲线的传递方法、装置、设备和存储介质 |
| CN108053866A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-18 | 迈克医疗电子有限公司 | 工作曲线的传递方法、装置、设备和存储介质 |
| CN108548926A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-09-18 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒 |
| WO2019179333A1 (zh) * | 2018-03-22 | 2019-09-26 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒 |
| CN108548926B (zh) * | 2018-03-22 | 2019-11-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒 |
| CN108535491A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-09-14 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种肌钙蛋白i的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒 |
| CN109001453A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-12-14 | 沈阳百创特生物科技有限公司 | 一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒 |
| CN110133276A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-08-16 | 芜湖森爱驰生物科技有限公司 | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
| CN111624352A (zh) * | 2020-06-04 | 2020-09-04 | 柏荣诊断产品（上海）有限公司 | 一种高准确性尿液中ngal检测试剂盒 |
| CN111624352B (zh) * | 2020-06-04 | 2023-04-07 | 柏荣诊断产品（上海）有限公司 | 一种高准确性尿液中ngal检测试剂盒 |
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