CN103789341B - 一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法 - Google Patents
一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103789341B CN103789341B CN201410033944.9A CN201410033944A CN103789341B CN 103789341 B CN103789341 B CN 103789341B CN 201410033944 A CN201410033944 A CN 201410033944A CN 103789341 B CN103789341 B CN 103789341B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pgk1p
- primer
- enzyme
- plasmid
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，涉及用DNA重组技术制备微生物，是一种运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，构建异丁醇产量高的酿酒酵母菌株的方法，步骤是：第一步，过量表达酿酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWF1基因质粒的构建；第二步，高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103的构建。本发明方法克服了现有技术存在的产异丁醇酿酒酵母细胞中由于过量表达ILV2、ILV3和ILV5基因导致从丙酮酸到2-酮异戊酸中辅酶NADPH/NADP+的不平衡等因素而制约异丁醇产量进一步提高的缺陷。
Description
技术领域
本发明的技术方案涉及用DNA重组技术制备微生物，具体地说是一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法。
背景技术
异丁醇具有较小的挥发性、腐蚀性、较高的辛烷值和能量密度，且易于储存和运输，是一种新型的具有巨大市场潜力的生物燃料。酿酒酵母由于其对异丁醇的耐受性较好、具有利用纤维素水解物的优势和自身具有合成异丁醇的优势基因的优势，可以作为生产异丁醇的优势宿主菌株。
现有技术中，产异丁醇酿酒酵母细胞中由于过量表达ILV2、ILV3和ILV5基因导致从丙酮酸到2-酮异戊酸中辅酶NADPH/NADP+的不平衡，制约了异丁醇产量进一步的提高，这些缺陷在图6中显示出来。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，是一种运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，构建异丁醇产量高的酿酒酵母菌株的方法，克服了现有技术存在的产异丁醇酿酒酵母细胞中由于过量表达ILV2、ILV3和ILV5基因导致从丙酮酸到2-酮异戊酸中辅酶NADPH/NADP+的不平衡等因素而制约异丁醇产量进一步提高的缺陷。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，宿主菌为酿酒酵母菌，同时转入过量表达ILV2、ILV3、ILV5、ZWF1基因的质粒YEplac195-PGK1p-ILV2、YEplac181-PGK1p-ILV3和YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5，其具体步骤是：
第一步，过量表达酿酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWF1基因质粒的构建
(1.1)酵母W303-1A染色体的制备：将酵母菌W303-1A接种于5mL的YPD培养基中，在30℃振培过夜得培养液，将该培养液分装到2个1.5mL的离心管中，用离心机转速为12000rpm离心30s，取上清，加0.5mL水重悬，枪头反复抽吸以分散菌体沉淀，然后用离心机转速为12000rpm离心30s，收集菌体，于每支离心管中加入200μL破菌缓冲液重悬细胞，再于每支离心管中加入200μL体积的玻璃珠和pH>7的200μL酚/氯仿液体，用6000rpm的速度振荡4min，再加200μL缓冲液TE，快速振荡，用离心机转速为12000rpm离心5min，取上清，重复酚抽提至无中间沉淀相，然后加入1mL无水乙醇，颠倒混匀，用离心机转速为12000rpm离心3min，弃上清，沉淀用0.4mLTE缓冲液溶解,然后加3μL的1mg/mL的RNA酶混合，于37℃温育5min，再加入10μL的4mol/L的NaAc溶液及1mL的无水乙醇，颠倒混匀，于室温下离心机转速为12000rpm离心3min，弃上清，干燥沉淀DNA，再用100μL的TE缓冲液溶解，得到酵母W303-1A染色体；
(1.2)质粒YEplac195-PGK1p、YEplac181-PGK1p和YEplac112-PGK1p的构建
扩增PGK1promoter基因：根据酵母W303-1A染色体上PGK1基因序列设计引物，酶切点为BamHⅠ的引物PGK1promoter-U的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGGATCCAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，酶切点为SalⅠ的引物PGK1promoter-D的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG3’；PCR反应体系为：酶切点为BamHⅠ的引物PGK1promoter-U和酶切点为SalⅠ的PGK1promoter-D各为1μL、200μM的dNTP为4μL、10×聚合酶缓冲液为5μL、酵母W303-1A染色体为模板0.5μL、双蒸水38.25μL和聚合酶0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，得到PCR扩增产物PGK1promoter基因；将YEplac195、YEplac181、YEplac112和扩增的PGK1promotor基因分别用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ消化，消化体系为：DNA5μL，SalⅠ和BamHⅠ为各0.25μL，10×酶缓冲液2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac195、YEplac181、YEplac112和PGK1promotor基因的连接：在三个1.5mL离心管中分别加入YEplac195、YEplac181和YEplac112各0.5μL～1μL，再分别加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、PGK1promotor基因片段8μL，最后分别加无菌水至20μL总体积，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac195-PGK1p、YEplac181-PGK1p和YEplac112-PGK1p质粒；
(1.3)质粒YEplac195-PGK1p-ILV2的构建
根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV2ORF-U的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGTCGACATGATCAGACAATCTACGCT3’,引物ILV2ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCCTGCAGCGTTTAGCTGGCTCCTGATG3’；PCR反应体系为：引物ILV2ORF-U和ILV2ORF-D各为1μL,200μM的dNTP为4μL,10×聚合酶缓冲液为5μL,酿酒酵母W303-1A染色体为模板0.5μL,双蒸水为38.25μL,聚合酶为0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，得到PCR扩增产物ILV2ORF基因；将YEplac195-PGK1p和扩增的ILV2ORF基因片段分别用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，用SalⅠ和PstⅠ各0.25μL，10×酶缓冲液为2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因片段的加入量分别为0.5μL～8μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物，取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac195-PGK1p-ILV2；
(1.4)质粒YEplac181-PGK1p-ILV3的构建
根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV3ORF-U的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGTCGACATGGGCTTGTTAACGAAAGT3’,引物ILV3ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCCTGCAGGTAGAGGTGGCTTCGTCGTA3’；PCR反应体系为：引物ILV3ORF-U和ILV3ORF-D各为1μL,200μM的dNTP为4μL,10×聚合酶缓冲液为5μL,酿酒酵母W303-1A染色体为模板0.5μL,双蒸水为38.25μL,聚合酶为0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，得到PCR扩增产物ILV3ORF基因；将YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因片段分别用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，SalⅠ和PstⅠ各0.25μL，10×酶缓冲液2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因片段的加入量分别为0.5μL～8μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac181-PGK1p-ILV3；
(1.5)质粒YEplac112-PGK1p-ILV5的构建
根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV5ORF-U的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGTCGACATGTTGAGAACTCAAGCCGC3’,引物ILV5ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCCTGCAGACGTGACTTGACGAGTTG5’；PCR反应体系为：引物ILV5ORF-U和ILV5ORF-D各为1μL,200μM的dNTP为4μL,10×聚合酶缓冲液为5μL，酿酒酵母W303-1A染色体为模板0.5μL,双蒸水为38.25μL,聚合酶为0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，得到PCR扩增产物ILV5ORF基因；将YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因片段用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，SalⅠ和PstⅠ各为0.25μL，10×酶缓冲液为2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因片段的加入量分别为0.5μL～8μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac112-PGK1p-ILV5；
(1.6)质粒YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5的构建
酶切点为SalⅠ/XbaⅠ的质粒YIplac211-PGK1p的构建：扩增PGK1promoter基因：根据酿酒酵母W303-1A染色体上PGK1基因序列设计引物,酶切点为SalⅠ的引物PGK1promoter-U的寡核苷酸序列为5’GGGCCCGTCGACAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，酶切点为XbaⅠ的引物PGK1promoter-D的寡核苷酸序列为5’GGGCCCTCTAGATGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG3’；用酿酒酵母W303-1A染色体为模板，用酶切点为SalⅠ的引物PGK1promoter-U和酶切点为XbaⅠ的PGK1promoter-D做PCR，得到PCR扩增产物PGK1promoter基因片段；将YIplac211和PGK1promotor基因用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ在37℃条件下消化10min后失活；用T4连接酶将YIplac211和PGK1promotor在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到酶切点为SalⅠ/XbaⅠ的YIplac211-PGK1p；扩增ZWF1-ORF基因：根据酿酒酵母W303-1A染色体上ZWF1基因序列设计引物，引物ZWF1ORF-U的寡核苷酸序列为5’GGGCCCTCTAGAATGAGTGAAGGCCCCGTCAA3’,引物ZWF1ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’；用酿酒酵母W303-1A染色体为模板，用引物ZWF1ORF-U和引物ZWF1ORF-D做PCR，得到PCR扩增产物ZWF1-ORF基因片段；将YIplac211-PGK1p和ZWF1ORF基因片段用XbaⅠ和BamHⅠ在37℃条件下消化10min后失活；用T4连接酶将YIplac211-PGK1p和ZWF1ORF基因片在16℃条件下连接1～2h，把10μL连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证得到质粒YIplac211-PGK1p-ZWF1；以质粒YIplac211-PGK1p-ZWF1为模板，用引物序列为5’GGGCCCGGATCCAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’的酶切点为BamHⅠ的PGK1promoter-U和序列为5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’的ZWF1ORF-D做PCR，得到两端都含有BamHⅠ酶切位点的PCR产物，将此PCR产物和质粒YEplac112-PGK1p-ILV5同时用BamHⅠ消化10min后失活，用T4连接酶将两片段在16℃条件下连接1～2h得到连接产物,取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到质粒YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5；
第二步，高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103的构建
将第一步中构建的质粒YEplac195-PGK1p-ILV2、YEplac181-PGK1p-ILV3和YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5共同转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-uracil/Tryptophan/Leucine固体培养基上培养2～3天后，筛选同时带有这三个质粒的转化子,构建得到高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103，即MATaleu2-3,112ura3-1trp1-92his3-11,15ade2-1can1-100YEplac195-PGK1p-ILV2YEplac181-PGK1p-ILV3YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5。
大量实验证明：经上述方法一定能构建出一种高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103。
上述一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，所用的原料物均是公知的并从商购获得，其中：
大肠杆菌E.coliTop10购自北京天根生化科技有限公司。
宿主菌酿酒酵母菌为酿酒酵母菌株W303-1A(MATaleu2-3,112ura3-1trp1-92his3-11,15ade2-1can1-100(ThomasandRothstein,1989))。
质粒YIplac211、YEplac195、YEplac181：YEplac112购自北京天根生化科技有限公司。
引物来自北京奥科鼎盛生物科技有限公司。
担体DNA(Single-strandedDNA)来自Sigma-Aldrich公司。
PEG400为50％PEG80％(v/v)、10xTE(pH7.5)10％和10x乙酸锂贮存液10％
LB(Luria-Bertani)液体培养基：1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl，用NAOH调pH＝7.5，于121℃下灭菌15min，冷却至室温加入氨苄青霉素，至终浓度为1g氨苄青霉素/L，得到LB液体培养基。
LB固体培养基：在调好pH值为7.5的LB液体培养基中加入1.5％的琼脂粉，于121℃下灭菌15min，冷却至室温加入氨苄青霉素，至终浓度为1g氨苄青霉素/L，得到LB固体培养基。
YPD液体培养基：1％酵母提取物和2％蛋白胨，在pH自然条件下，于121℃下灭菌15min，再加入单独灭菌的40％葡萄糖至终浓度为2％。
YPD固体培养基：在YPD液体培养基中加入1.5％(w/v)琼脂粉，于121℃下灭菌15min。
完全极限培养基(CM)：0.67％YNB(BactoYeastNitrogenBasewithoutAminoAcids(Difco))和0.83g/LDropoutPower，其中DropoutPower由以下成分构成：腺嘌呤50mg/L、亮氨酸100m/L、精氨酸20mg/L、赖氨酸30mg/L、天冬氨酸100mg/L、甲硫氨酸20mg/L、谷氨酸100mg/L、苯丙氨酸50mg/L、组氨酸100mg/L、丝氨酸150mg/L、异亮氨酸30mg/L、苏氨酸150mg/L、色氨酸100mg/L、酪氨酸30mg/L、尿嘧啶50mg/L、缬氨酸150mg/L。
省却特定的氨基酸成分，可做成选择培养基。液体培养基调节pH为5.6，固体培养基调节pH为6.5，再加入1.5％的琼脂,于121℃灭菌15min。
上述涉及的％，除特别注明的之外，均为质量百分比。
上述一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，所述酿酒酵母细胞的转化方法是：
(1)将平板上的酿酒酵母菌株接入5ml液体YPD中，30℃，200rpm振荡培养过夜；
(2)将担体DNA(2mg/ml)于沸水浴煮5分钟后，置于冰上；
(3)取1.5ml酿酒酵母培养液，13000rpm离心30sec，收集菌体，弃上清；
(4)往离心管中加入360μl的转化混合物，在漩涡分离器上高速振荡混匀。转化混合物的配置如下：
(5)将转化体系42℃水浴20-30分钟；
(6)用离心机转速为13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；
(7)用100μl无菌水重悬菌体，涂布在合适的筛选平板上，30℃温度下培养2～3天。
上述一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，所用的操作工艺是本领域的技术人员所掌握的。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的突出的实质性特点是，运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，构建异丁醇产量高的酿酒酵母菌株。
与现有技术相比，本发明的显著进步是，运用本发明方法所构建的酿酒酵母菌株可解决目前制约异丁醇产量进一步提高的关键技术问题，并且为我国发展生物质异丁醇作为运输动力***燃料提供相关科学依据；本发明方法所构建的酿酒酵母菌株HBGDAL-103，在以初始葡萄糖浓度为4％的发酵实验中，异丁醇得率较对照菌株有大幅度提高,副产物乙醇产量稍有降低，为利用生物质生产异丁醇提供了优良的菌株。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为质粒YEplac195-PGK1p-ILV2的限制性内切酶图谱；
图2为质粒YEplac181-PGK1p-ILV3的限制性内切酶图谱；
图3为质粒YEplac112-PGK1p-ILV5的限制性内切酶图谱；
图4为质粒YIplac211-PGK1p-ZWF1的限制性内切酶图谱；
图5为质粒YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5的限制性内切酶图谱。
图6为现有技术产异丁醇酿酒酵母细胞中表达ILV2、ILV3和ILV5基因导致从丙酮酸到2-酮异戊酸中辅酶NADPH/NADP+的过程示意图(Chenetal.BiotechnologyforBiofuels2011,4:21)。
具体实施方式
图1所示实施例表明了质粒YEplac195-PGK1p-ILV2构建过程中的酶切位点。
图2所示实施例表明了质粒YEplac181-PGK1p-ILV3构建过程中的酶切位点。
图3所示实施例表明了质粒YEplac112-PGK1p-ILV5构建过程中的酶切位点。
图4所示实施例表明了质粒YIplac211-PGK1p-ZWF1构建过程中的酶切位点。
图5所示实施例表明了质粒YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5构建过程中的酶切位点。
图6表明，现有技术中，产异丁醇酿酒酵母细胞中由于过量表达ILV2、ILV3和ILV5基因导致从丙酮酸到2-酮异戊酸中辅酶NADPH/NADP+的不平衡，制约了异丁醇产量进一步的提高(Chenetal.BiotechnologyforBiofuels2011,4:21)。
实施例1
宿主菌为酿酒酵母菌株W303-1A(MATaleu2-3,112ura3-1trp1-92his3-11,15ade2-1can1-100(ThomasandRothstein,1989))，同时转入过量表达ILV2、ILV3、ILV5、ZWF1基因的质粒YEplac195-PGK1p-ILV2、YEplac181-PGK1p-ILV3和YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5，
第一步，过量表达酿酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWF1基因质粒的构建
(1.1)酿酒酵母W303-1A染色体的制备：将酿酒酵母菌W303-1A接种于5mL的YPD培养基中，在30℃振培过夜得培养液，将该培养液分装至2个1.5mL的离心管中，用离心机转速为12000rpm离心30s，取上清，加0.5mL水重悬，枪头反复抽吸以分散菌体沉淀，然后用离心机转速为12000rpm离心30s，收集菌体，于每支离心管中加入200μL破菌缓冲液重悬细胞，再于每支离心管中加入200μL体积的玻璃珠和pH>7的200μL酚/氯仿液体，用6000rpm的速度振荡4min，再加200μL缓冲液TE，快速振荡，离心机转速为12000rpm离心5min，取上清，重复酚抽提至无中间沉淀相，然后加入1mL无水乙醇，颠倒混匀，用离心机转速为12000rpm离心3min，弃上清，沉淀用0.4mLTE缓冲液溶解,然后加3μL的1mg/mL的RNA酶混合，于37℃温育5min，再加入10μL的4mol/L的NaAc溶液及1mL的无水乙醇，颠倒混匀，于室温下离心机转速为12000rpm离心3min，弃上清，干燥沉淀DNA，再用100μL的TE缓冲液溶解，得到酿酒酵母W303-1A染色体；
(1.2)质粒YEplac195-PGK1p、YEplac181-PGK1p和YEplac112-PGK1p的构建
扩增PGK1promoter基因：根据酵母W303-1A染色体上PGK1基因序列设计引物，酶切点为BamHⅠ的引物PGK1promoter-U的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGGATCCAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，酶切点为SalⅠ的引物PGK1promoter-D的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG3’；PCR反应体系为：酶切点为BamHⅠ的引物PGK1promoter-U和酶切点为SalⅠ的PGK1promoter-D各为1μL、200μM的dNTP为4μL、10×聚合酶缓冲液为5μL、酵母W303-1A染色体为模板0.5μL、双蒸水38.25μL和聚合酶0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，得到PCR扩增产物PGK1promoter基因；将YEplac195、YEplac181、YEplac112和扩增的PGK1promotor基因分别用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ消化，消化体系为：DNA5μL，SalⅠ和BamHⅠ为各0.25μL，10×酶缓冲液2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac195、YEplac181、YEplac112和PGK1promotor基因的连接：在三个1.5mL离心管中分别加入YEplac195、YEplac181和YEplac112各0.5μL～1μL，再分别加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、PGK1promotor基因片段8μL，最后分别加无菌水至20μL总体积，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac195-PGK1p、YEplac181-PGK1p和YEplac112-PGK1p质粒；
(1.3)质粒YEplac195-PGK1p-ILV2的构建
根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV2ORF-U的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGTCGACATGATCAGACAATCTACGCT3’,引物ILV2ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCCTGCAGCGTTTAGCTGGCTCCTGATG3’；PCR反应体系为：引物ILV2ORF-U和ILV2ORF-D各为1μL,200μM的dNTP为4μL,10×聚合酶缓冲液为5μL,酿酒酵母W303-1A染色体为模版0.5μL,双蒸水为38.25μL,聚合酶为0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，得到PCR扩增产物ILV2ORF基因；将YEplac195-PGK1p和扩增的ILV2ORF基因片段分别用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，用SalⅠ和PstⅠ各0.25μL，10×酶缓冲液为2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因片段的加入量分别为0.5μL～8μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物，取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac195-PGK1p-ILV2；
(1.4)质粒YEplac181-PGK1p-ILV3的构建
根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV3ORF-U的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGTCGACATGGGCTTGTTAACGAAAGT3’,引物ILV3ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCCTGCAGGTAGAGGTGGCTTCGTCGTA3’；PCR反应体系为：引物ILV3ORF-U和ILV3ORF-D各为1μL,200μM的dNTP为4μL,10×聚合酶缓冲液为5μL,酿酒酵母W303-1A染色体为模版0.5μL,双蒸水为38.25μL,聚合酶为0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，得到PCR扩增产物ILV3ORF基因；将YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因片段分别用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，SalⅠ和PstⅠ各0.25μL，10×酶缓冲液2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因片段的加入量分别为0.5μL～8μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac181-PGK1p-ILV3；
(1.5)质粒YEplac112-PGK1p-ILV5的构建
根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV5ORF-U的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGTCGACATGTTGAGAACTCAAGCCGC3’,引物ILV5ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCCTGCAGACGTGACTTGACGAGTTG5’；PCR反应体系为：引物ILV5ORF-U和ILV5ORF-D各为1μL,200μM的dNTP为4μL,10×聚合酶缓冲液为5μL，酿酒酵母W303-1A染色体为模版0.5μL,双蒸水为38.25μL,聚合酶为0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，得到PCR扩增产物ILV5ORF基因；将YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因片段用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，SalⅠ和PstⅠ各为0.25μL，10×酶缓冲液为2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因片段的加入量为0.5μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接1h得到连接产物；取10μL连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac112-PGK1p-ILV5；
(1.6)质粒YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5的构建
酶切点为SalⅠ/XbaⅠ的质粒YIplac211-PGK1p的构建：扩增PGK1promoter基因：根据酿酒酵母W303-1A染色体上PGK1基因序列设计引物,酶切点为SalⅠ的引物PGK1promoter-U的寡核苷酸序列为5’GGGCCCGTCGACAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，酶切点为XbaⅠ的引物PGK1promoter-D的寡核苷酸序列为5’GGGCCCTCTAGATGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG3’；用酿酒酵母W303-1A染色体为模板，用酶切点为SalⅠ的引物PGK1promoter-U和酶切点为XbaⅠ的PGK1promoter-D做PCR，得到PCR扩增产物PGK1promoter基因片段；将YIplac211和PGK1promotor基因用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ在37℃条件下消化10min后失活；用T4连接酶将YIplac211和PGK1promotor在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到酶切点为SalⅠ/XbaⅠ的YIplac211-PGK1p；扩增ZWF1-ORF基因：根据酿酒酵母W303-1A染色体上ZWF1基因序列设计引物，引物ZWF1ORF-U的寡核苷酸序列为5’GGGCCCTCTAGAATGAGTGAAGGCCCCGTCAA3’,引物ZWF1ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’；用酿酒酵母W303-1A染色体为模板，用引物ZWF1ORF-U和引物ZWF1ORF-D做PCR，得到PCR扩增产物ZWF1-ORF基因片段；将YIplac211-PGK1p和ZWF1ORF基因片段用XbaⅠ和BamHⅠ在37℃条件下消化10min后失活；用T4连接酶将YIplac211-PGK1p和ZWF1ORF基因片在16℃条件下连接1～2h，把10μL连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证得到质粒YIplac211-PGK1p-ZWF1；以质粒YIplac211-PGK1p-ZWF1为模板，用引物序列为5’GGGCCCGGATCCAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’的酶切点为BamHⅠ的PGK1promoter-U和序列为5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’的ZWF1ORF-D做PCR，得到两端都含有BamHⅠ酶切位点的PCR产物，将此PCR产物和质粒YEplac112-PGK1p-ILV5同时用BamHⅠ消化10min后失活，用T4连接酶将两片段在16℃条件下连接1～2h得到连接产物,取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到质粒YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5；
第二步，高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103的构建
将第一步中构建的质粒YEplac195-PGK1p-ILV2、YEplac181-PGK1p-ILV3和YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5共同转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-uracil/Tryptophan/Leucine固体培养基上培养2天后，筛选同时带有这三个质粒的转化子,构建得到高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103，即ATaleu2-3,112ura3-1trp1-92his3-11,15ade2-1can1-100YEplac195-PGK1p-ILV2YEplac181-PGK1p-ILV3YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5。
第三步，高产异丁醇酿酒酵母菌株的发酵
本实施例制得的酿酒酵母菌株HBGDAL-103的发酵：使用前将制得的高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103接到CM-uracil/Tryptophan/Leucine平板上2次进行活化处理，在CM-uracil/Tryptophan/Leucine液体培养基中发酵,接种量为10～15％,葡萄糖初始浓度为4％，发酵温度为30℃，进行厌氧发酵，pH为5.0，发酵3h，每两小时跟踪测定生物质生成量，每四个小时取样一次，离心后-20℃保存。
利用高效液相色谱HPLC对葡萄糖消耗量、乙醇产量进行测定，利用气相色谱对异丁醇产量进行测定。
通过对酿酒酵母菌株HBGDAL-103进行发酵实验，酿酒酵母菌株HBGDAL-103的异丁醇生得率较出发菌株W303-1A有大幅度提高，乙醇得率稍有降低(见表1)。这对我国减少石油的进口、推动异丁醇代替汽油项目在全国的普及减少汽油对环境的污染游着重要的战略意义和环保意义。
表1.不同酿酒酵母菌株生产的异丁醇和乙醇的得率
表1中所述数据为三次平行实验的平均值。
实施例2
除宿主菌为酿酒酵母菌株选用为工业酿酒酵母菌株之外，其他同实施例1。
上述实施例中所用的原料物均是公知的并从商购获得，所用的操作工艺是本领域的技术人员所掌握的。
实施例3
除用T4连接酶将YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因片段的加入量分别为4μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接1.5h得到连接产物；用T4连接酶将YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因片段的加入量分别为4μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接1.5h得到连接产物；用T4连接酶将YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因片段的加入量分别为4μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接1.5h得到连接产物；用T4连接酶将YIplac211-PGK1p和ZWF1ORF基因片在16℃条件下连接1.5h；使用前将制得的高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103接到CM-uracil/Tryptophan/Leucine平板上3次进行活化处理，在CM-uracil/Tryptophan/Leucine液体培养基中发酵,接种量为12％,葡萄糖初始浓度为4％，发酵温度为30℃，进行厌氧发酵，pH为5.5，发酵24h，每两小时跟踪测定生物质生成量，每四个小时取样一次，离心后-20℃保存之外，其他同实施例1。
实施例4
除用T4连接酶将YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因片段的加入量分别为8μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接2h得到连接产物；用T4连接酶将YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因片段的加入量分别为8μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接2h得到连接产物；用T4连接酶将YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因片段的加入量分别为8μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接2h得到连接产物；用T4连接酶将YIplac211-PGK1p和ZWF1ORF基因片在16℃条件下连接2h；使用前将制得的高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103接到CM-uracil/Tryptophan/Leucine平板上3次进行活化处理，在CM-uracil/Tryptophan/Leucine液体培养基中发酵,接种量为15％,葡萄糖初始浓度为4％，发酵温度为30℃，进行厌氧发酵，pH为6.0，发酵50h，每两小时跟踪测定生物质生成量，每四个小时取样一次，离心后-20℃保存之外，其他同实施例2。
上述实施例中所用的操作工艺是本领域的技术人员所掌握的。
Claims (1)
1.一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，其特征在于：宿主菌为酿酒酵母菌，同时转入过量表达ILV2、ILV3、ILV5、ZWF1基因的质粒YEplac195-PGK1p-ILV2、YEplac181-PGK1p-ILV3和YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5，其具体步骤是：
第一步，过量表达酿酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWF1基因质粒的构建
(1.1)酵母W303-1A染色体的制备：将酵母菌W303-1A接种于5mL的YPD培养基中，在30℃振培过夜得培养液，将该培养液分装到2个1.5mL的离心管中，用离心机转速为12000rpm离心30s，取上清，加0.5mL水重悬，枪头反复抽吸以分散菌体沉淀，然后用离心机转速为12000rpm离心30s，收集菌体，于每支离心管中加入200μL破菌缓冲液重悬细胞，再于每支离心管中加入200μL体积的玻璃珠和pH>7的200μL酚/氯仿液体，用6000rpm的速度振荡4min，再加200μL缓冲液TE，快速振荡，用离心机转速为12000rpm离心5min，取上清，重复酚抽提至无中间沉淀相，然后加入1mL无水乙醇，颠倒混匀，用离心机转速为12000rpm离心3min，弃上清，沉淀用0.4mLTE缓冲液溶解,然后加3μL的1mg/mL的RNA酶混合，于37℃温育5min，再加入10μL的4mol/L的NaAc溶液及1mL的无水乙醇，颠倒混匀，于室温下离心机转速为12000rpm离心3min，弃上清，干燥沉淀DNA，再用100μL的TE缓冲液溶解，得到酵母W303-1A染色体；
(1.2)质粒YEplac195-PGK1p、YEplac181-PGK1p和YEplac112-PGK1p的构建
扩增PGK1promoter基因：根据酵母W303-1A染色体上PGK1基因序列设计引物，酶切点为BamHⅠ的引物PGK1promoter-U的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGGATCCAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，酶切点为SalⅠ的引物PGK1promoter-D的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG3’；PCR反应体系为：酶切点为BamHⅠ的引物PGK1promoter-U和酶切点为SalⅠ的PGK1promoter-D各为1μL、200μM的dNTP为4μL、10×聚合酶缓冲液为5μL、酵母W303-1A染色体为模板0.5μL、双蒸水38.25μL和聚合酶0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，得到PCR扩增产物PGK1promoter基因；将YEplac195、YEplac181、YEplac112和扩增的PGK1promotor基因分别用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ消化，消化体系为：DNA5μL，SalⅠ和BamHⅠ为各0.25μL，10×酶缓冲液2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac195、YEplac181、YEplac112和PGK1promotor基因的连接：在三个1.5mL离心管中分别加入YEplac195、YEplac181和YEplac112各0.5μL～1μL，再分别加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、PGK1promotor基因片段8μL，最后分别加无菌水至20μL总体积，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac195-PGK1p、YEplac181-PGK1p和YEplac112-PGK1p质粒；
(1.3)质粒YEplac195-PGK1p-ILV2的构建
根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV2ORF-U的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGTCGACATGATCAGACAATCTACGCT3’,引物ILV2ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCCTGCAGCGTTTAGCTGGCTCCTGATG3’；PCR反应体系为：引物ILV2ORF-U和ILV2ORF-D各为1μL,200μM的dNTP为4μL,10×聚合酶缓冲液为5μL,酿酒酵母W303-1A染色体为模板0.5μL,双蒸水为38.25μL,聚合酶为0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，得到PCR扩增产物ILV2ORF基因；将YEplac195-PGK1p和扩增的ILV2ORF基因片段分别用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，用SalⅠ和PstⅠ各0.25μL，10×酶缓冲液为2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac195-PGK1p和ILV2ORF基因片段的加入量分别为0.5μL～8μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物，取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac195-PGK1p-ILV2；
(1.4)质粒YEplac181-PGK1p-ILV3的构建
根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV3ORF-U的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGTCGACATGGGCTTGTTAACGAAAGT3’,引物ILV3ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCCTGCAGGTAGAGGTGGCTTCGTCGTA3’；PCR反应体系为：引物ILV3ORF-U和ILV3ORF-D各为1μL,200μM的dNTP为4μL,10×聚合酶缓冲液为5μL,酿酒酵母W303-1A染色体为模板0.5μL,双蒸水为38.25μL,聚合酶为0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，得到PCR扩增产物ILV3ORF基因；将YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因片段分别用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，SalⅠ和PstⅠ各0.25μL，10×酶缓冲液2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac181-PGK1p和ILV3ORF基因片段的加入量分别为0.5μL～8μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac181-PGK1p-ILV3；
(1.5)质粒YEplac112-PGK1p-ILV5的构建
根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV5ORF-U的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGTCGACATGTTGAGAACTCAAGCCGC3’,引物ILV5ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCCTGCAGACGTGACTTGACGAGTTG5’；PCR反应体系为：引物ILV5ORF-U和ILV5ORF-D各为1μL,200μM的dNTP为4μL,10×聚合酶缓冲液为5μL，酿酒酵母W303-1A染色体为模板0.5μL,双蒸水为38.25μL,聚合酶为0.25μL；PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，得到PCR扩增产物ILV5ORF基因；将YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因片段用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，SalⅠ和PstⅠ各为0.25μL，10×酶缓冲液为2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min；用T4连接酶将YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因连接：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplac112-PGK1p和ILV5ORF基因片段的加入量分别为0.5μL～8μL，再加无菌水至总体积为20μL，在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplac112-PGK1p-ILV5；
(1.6)质粒YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5的构建
酶切点为SalⅠ/XbaⅠ的质粒YIplac211-PGK1p的构建：扩增PGK1promoter基因：根据酿酒酵母W303-1A染色体上PGK1基因序列设计引物,酶切点为SalⅠ的引物PGK1promoter-U的寡核苷酸序列为5’GGGCCCGTCGACAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，酶切点为XbaⅠ的引物PGK1promoter-D的寡核苷酸序列为5’GGGCCCTCTAGATGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG3’；用酿酒酵母W303-1A染色体为模板，用酶切点为SalⅠ的引物PGK1promoter-U和酶切点为XbaⅠ的PGK1promoter-D做PCR，得到PCR扩增产物PGK1promoter基因片段；将YIplac211和PGK1promotor基因用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ在37℃条件下消化10min后失活；用T4连接酶将YIplac211和PGK1promotor在16℃条件下连接1～2h得到连接产物；取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到酶切点为SalⅠ/XbaⅠ的YIplac211-PGK1p；扩增ZWF1-ORF基因：根据酿酒酵母W303-1A染色体上ZWF1基因序列设计引物，引物ZWF1ORF-U的寡核苷酸序列为5’GGGCCCTCTAGAATGAGTGAAGGCCCCGTCAA3’,引物ZWF1ORF-D的寡核苷酸序列为：5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’；用酿酒酵母W303-1A染色体为模板，用引物ZWF1ORF-U和引物ZWF1ORF-D做PCR，得到PCR扩增产物ZWF1-ORF基因片段；将YIplac211-PGK1p和ZWF1ORF基因片段用XbaⅠ和BamHⅠ在37℃条件下消化10min后失活；用T4连接酶将YIplac211-PGK1p和ZWF1ORF基因片在16℃条件下连接1～2h，把10μL连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证得到质粒YIplac211-PGK1p-ZWF1；以质粒YIplac211-PGK1p-ZWF1为模板，用引物序列为5’GGGCCCGGATCCAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’的酶切点为BamHⅠ的PGK1promoter-U和序列为5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’的ZWF1ORF-D做PCR，得到两端都含有BamHⅠ酶切位点的PCR产物，将此PCR产物和质粒YEplac112-PGK1p-ILV5同时用BamHⅠ消化10min后失活，用T4连接酶将两片段在16℃条件下连接1～2h得到连接产物,取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到质粒YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5；
第二步，高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103的构建
将第一步中构建的质粒YEplac195-PGK1p-ILV2、YEplac181-PGK1p-ILV3和YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5共同转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-uracil/Tryptophan/Leucine固体培养基上培养2～3天后，筛选同时带有这三个质粒的转化子,构建得到高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103，即MATaleu2-3,112ura3-1trp1-92his3-11,15ade2-1can1-100YEplac195-PGK1p-ILV2YEplac181-PGK1p-ILV3YEplac112-PGK1p-ZWF1-PGK1p-ILV5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410033944.9A CN103789341B (zh) | 2014-01-23 | 2014-01-23 | 一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410033944.9A CN103789341B (zh) | 2014-01-23 | 2014-01-23 | 一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103789341A CN103789341A (zh) | 2014-05-14 |
| CN103789341B true CN103789341B (zh) | 2016-05-18 |
Family
ID=50665397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410033944.9A Active CN103789341B (zh) | 2014-01-23 | 2014-01-23 | 一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103789341B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018189502A1 (en) * | 2017-04-12 | 2018-10-18 | Momentum Bioscience Limited | Detection and delineation of microorganisms using the ilv3 gene |
| CN107236679A (zh) * | 2017-04-27 | 2017-10-10 | 广州弘宝元生物科技有限公司 | 一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株及其构建方法 |
| CN110628804B (zh) * | 2019-06-24 | 2021-04-13 | 河北工业大学 | 一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法 |
| CN110846238A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-28 | 天津科技大学 | 一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其应用 |
| CN110819547A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-21 | 天津科技大学 | 一种过表达羟酸还原异构酶的葡萄汁酵母菌株及其应用 |
| CN110951633A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-04-03 | 天津科技大学 | 一种过表达二羟异戊酸脱水酶的葡萄汁酵母菌株及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1699552A (zh) * | 2005-06-24 | 2005-11-23 | 中国科学院微生物研究所 | 啤酒酵母工程菌及其构建方法 |
| CN1906291A (zh) * | 2004-01-29 | 2007-01-31 | 德古萨股份公司 | 用扩增zwf基因制备L－氨基酸的方法 |
| CN101024838A (zh) * | 2006-02-23 | 2007-08-29 | 三得利株式会社 | 编码乙酰乳酸合成酶的基因及其用途 |
-
2014
- 2014-01-23 CN CN201410033944.9A patent/CN103789341B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1906291A (zh) * | 2004-01-29 | 2007-01-31 | 德古萨股份公司 | 用扩增zwf基因制备L－氨基酸的方法 |
| CN1699552A (zh) * | 2005-06-24 | 2005-11-23 | 中国科学院微生物研究所 | 啤酒酵母工程菌及其构建方法 |
| CN101024838A (zh) * | 2006-02-23 | 2007-08-29 | 三得利株式会社 | 编码乙酰乳酸合成酶的基因及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103789341A (zh) | 2014-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103789341B (zh) | 一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法 | |
| ES2343776B1 (es) | Procedimientos y composiciones para cianobacterias productoras de etanol. | |
| US10584359B2 (en) | Genetically recombinant Saccharomyces cerevisiae for degrading kitchen waste | |
| Tiwari et al. | Bioethanol production from rice bran with optimization of parameters by Bacillus cereus strain McR-3: ‘Fermentation of rice bran for fuel ethanol production’ | |
| Fitzpatrick et al. | Expression of three Trichoderma reesei cellulase genes in Saccharomyces pastorianus for the development of a two‐step process of hydrolysis and fermentation of cellulose | |
| CN110358720B (zh) | 一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用 | |
| CN101631864A (zh) | 使用酵母菌通过丁酰-CoA作为中间体制备丁醇的方法 | |
| CN106119140A (zh) | 一株高耐受酿酒酵母菌株及其构建方法 | |
| CN101983240B (zh) | 凝集性酵母及其制备方法 | |
| Jernigan et al. | Effects of drying and storage on year‐round production of butanol and biodiesel from algal carbohydrates and lipids using algae from water remediation | |
| CN104726355B (zh) | 酿酒酵母孢子表达的(s)‑羰基还原酶ii不对称转化制备(s)‑苯乙二醇的方法 | |
| CN102618479B (zh) | 一种能耐受高浓度丁醇的梭菌及其构建方法与应用 | |
| CN103131720A (zh) | 一种真菌木糖异构酶基因及其应用 | |
| CN105274041B (zh) | 一株重组大肠杆菌及其在生产2-丁醇中的应用 | |
| CN104328061A (zh) | 利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用 | |
| CN102533574A (zh) | 一种低产尿素黄酒酵母工程菌及其构建方法 | |
| CN109234303A (zh) | 一种啤酒酵母中表达苯丙酮酸脱羧酶Aro10的构建方法 | |
| CN103088434B (zh) | 树干毕赤酵母大片段dna基因组文库的构建方法及其应用 | |
| CN102676476B (zh) | 酶活性及热稳定性被提高的葡聚糖酶 | |
| CN101525580B (zh) | 一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母及其构建方法 | |
| CN103820345B (zh) | 一种提高酿酒酵母耐热性的分子调控方法 | |
| CN107988242A (zh) | manY/levF基因片段在生产丁醇中的应用 | |
| CN103509725B (zh) | 一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用 | |
| CN112779174B (zh) | 一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN114075517B (zh) | 马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |