CN1699552A - 啤酒酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种啤酒酵母工程菌及其构建方法。该工程菌，是将γ－谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因导入酿酒酵母YSF－31中，得到的高谷胱甘肽含量低双乙酰含量的菌株；所述γ－谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有70－705bp的选自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ－谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有70－539bp的选自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第1－705位碱基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第2983－3522位碱基的核苷酸序列。该工程菌因双乙酰产生量降低而缩短发酵周期，生产的啤酒保鲜时间明显增长；因增加谷胱甘肽的形成，改善了啤酒的风味，增强了啤酒的抗老化能力。

Description

啤酒酵母工程菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵工业技术领域中的一种啤酒酵母工程菌及其构建方法。
背景技术
啤酒的风味稳定性是啤酒的一个重要的质量指标。由于硫化氢的存在影响啤酒的风味，因此，啤酒需要较长的贮酒时间以除去这些物质从而达到啤酒的风味的成熟。啤酒酵母的代谢流中，硫化氢是谷胱甘肽的上游代谢物，可以通过增强γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶系的活性来降低硫化氢的形成，增加谷胱甘肽的形成，以改善啤酒的风味，增强啤酒的抗老化能力。
双己酰是啤酒中另一个重要的风味物质，但它的口味域值很低(0.1mg/L)。当双己酰的含量达到或超过口味域值时，会产生一种馊饭味，从而破坏了啤酒的风味。双己酰是啤酒酵母合成缬氨酸和亮氨酸的代谢途径的中间产物α-己酰乳酸经非酶途径促氧化形成的。而ILV2基因编码己酰羟酸合成酶，能够把丙酮酸转化为己酰乳酸。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高谷胱甘肽含量低双乙酰含量的啤酒酵母工程菌。
本发明所提供的啤酒酵母工程菌，是将γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因导入酿酒酵母YSF-31(购于中国普通微生物菌种保藏中心，原始编号：CGMCC 2.420)中，得到的高谷胱甘肽含量低双乙酰含量的菌株；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有70-705bp的选自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有70-539bp的选自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第1-705位碱基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第2983-3522位碱基的核苷酸序列。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的氨基酸残基序列的GenBank号为CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank号为X02549；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶编码基因的核苷酸序列的GenBank号为D90220。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第443-705位碱基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第2983-3361位碱基的379bp的核苷酸片段。
为了便于筛选，在导入所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的同时还将铜抗性基因CUP1一同导入酿酒酵母YSF-31；所述铜抗性基因CUP1的核苷酸序列的GenBank号为K02204。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因和铜抗性基因CUP1是通过用KpnI和PstI从重组质粒pICG切下的6.0kb的DNA片段导入酿酒酵母YSF-31；所述重组质粒pICG的物理图谱如图7。
所述啤酒酵母工程菌优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2CGMCC №1377。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377已于2005年05月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1377。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377的细胞为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度30℃。生长最适pH为5.5。其发酵培养基和培养条件与工业用啤酒酵母菌YSF-31(购于中国普通微生物菌种保藏中心，原始编号：CGMCC 2.420)相同。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述啤酒酵母工程菌的方法。
本发明所提供的构建上述啤酒酵母工程菌的方法，是将γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因导入酿酒酵母YSF-31(购于中国普通微生物菌种保藏中心，原始编号：CGMCC 2.420)中，得到的高谷胱甘肽含量低双乙酰含量的菌株即为啤酒酵母工程菌；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有70-705bp的选自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有70-539bp的选自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第1-705位碱基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第2983-3522位碱基的核苷酸序列。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的氨基酸残基序列的GenBank号为CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank号为X02549；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶编码基因的核苷酸序列的GenBank号为D90220。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第443-705位碱基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第2983-3361位碱基的379bp的核苷酸片段。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第443-705位碱基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有自GenBank号为X02549的3′端第2983-3522位碱基的539bp的核苷酸片段。
为了便于筛选，在导入所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的同时还将铜抗性基因CUP1一同导入酿酒酵母YSF-31(购于中国普通微生物菌种保藏中心，原始编号：CGMCC 2.420)；所述铜抗性基因CUP1的核苷酸序列的GenBank号为K02204。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因和铜抗性基因CUP1是通过用KpnI和PstI从重组质粒pICG切下的6.0kb的DNA片段导入酿酒酵母YSF-31(购于中国普通微生物菌种保藏中心，原始编号：CGMCC 2.420)；所述重组质粒pICG的物理图谱如图7。
所述啤酒酵母工程菌优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
来源于非使用工业微生物的基因构建的工程菌是否适于饮用，能否被消费者接受还需要很长时间的实践证明，又因为啤酒酵母本身就含有γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因，所以本发明采用基因自克隆的方式将γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因***到ILV2基因中，构建了ILV2基因被破坏而γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因增加了一个拷贝的工程菌。本发明将传统的育种技术与分子育种技术相结合，首先依据不同工业用啤酒酵母菌种的生理生化特性，通过铜抗性筛选，获得在含有3.0mmol/lCuSO4的YEPD平板上不能生长的工业用啤酒酵母菌YSF-31作为受体菌。然后采用自克隆技术，用KpnI和PstI酶切重组质粒pICG得到一个6.0kb大小的DNA片段。
此片段含来源于酵母菌的铜抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因，两端含有受体菌ILV2基因的5′端和3′端序列。用该DNA片段转化工业啤酒酵母菌YSF-31，该片段和YSF-31基因组上的ILV2发生同源重组，结果铜抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因被整合到染色体上。这样，在重组酵母菌株中，ILV2基因被破坏，而同时铜抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因都增加了一个拷贝。在含有4mmol/l CuSO4的YEPD平板上筛选转化子。通过遗传稳定性实验、及模拟啤酒发酵小型实验、在啤酒厂进行的小试实验和中试发酵实验，获得高谷胱甘肽含量低双乙酰含量的工业啤酒酵母工程菌YSF31(pICG)-2(CGMCC №1377)。与受体菌相比，其生理、生化特性无明显差异；小试和中试发酵实验生产的啤酒的风味也无差异；对发酵设备及条件没有特殊要求，一般啤酒厂的设备和条件均可使用。本发明的啤酒酵母工程菌因双乙酰产生量降低而缩短发酵周期，生产的啤酒保鲜时间明显增长；因增加谷胱甘肽的形成，改善了啤酒的风味，增强了啤酒的抗老化能力。
附图说明
图1为CUP1基因的PCR产物的电泳图
图2为重组质粒pMCUP和pYCUP的构建过程示意图
图3为质粒pMCUP的酶切验证图谱
图4为转化子YS58(pYCUP)的营养缺陷型筛选
图5为转化子YS58(pYCUP)的铜抗性筛选
图6为质粒pICG的构建过程示意图
图7为质粒pICG的酶切验证图谱
图8为铜抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因整合到YSF-31基因组上的示意图
图9为用引物ILV2-1和CUP1-P2进行受体和转化子的PCR分析电泳图谱
图10为摇瓶发酵实验中受体菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的谷胱甘肽含量和双乙酰含量的比较
图11为百升发酵实验中受体菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的双乙酰含量检测
图12为百升发酵实验中受体菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的糖度检测结果
图13为两吨发酵实验中受体菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的谷胱甘肽含量和双乙酰含量的比较
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、构建啤酒酵母工程菌-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
一、含有谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因和铜抗性基因CUP1的表达载体pICG的构建
1、工业用啤酒酵母菌的铜抗性测定
工业用啤酒酵母菌对铜的抗性普遍偏低，因此，可以依据铜抗性的提高有效筛选酵母转化子，铜抗性被普遍用作工业用啤酒酵母的选择标记。通过铜抗性测定，大部分工业用啤酒菌在含有2.5mmol/l CuSO4的YEPD平板上不能生长，测定筛选到YSF-31、YSF-35和YSF-41(购于中国普通微生物菌种保藏中心，原始编号分别为：CGMCC 2.420、CGMCC 2.412、CGMCC 2.241)三株酵母在含有3.0mmol/lCuSO4的YEPD平板上不能生长，确定用YSF-31作为下一步转化实验的受体菌。
2、铜抗性基因CUP1的PCR扩增
根据文献报导的CUP1的基因序列(CUP1基因序列的GenBank号为K02204)设计CUP1基因克隆的PCR引物：
P1：5′-CCA AGATCTCGCTATACGTGCATATGTTC-3′
P2：5′-CGA GTCGACATCTGTTGTACTATCCGCTT-3′
划线部分分别是BglII和SalI酶切位点，PCR反应以P1、P2为引物，以YSF-31的基因组DNA为模板，在50μl PCR反应混合液中含25μl Taq酶Mix，12.5μmol/l引物各2μL，模板10μl，加无菌水11μl调整至50μl。条件为94℃，变性5min，循环参数：94℃变性40s；56℃退火1min；72℃延伸2min；30个循环；72℃延伸15min使产物延伸完全。将得到的PCR产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，得到一条约1.1kb的特异性条带，其大小与预期相当。图1中，泳道M为DNA分子量标准sppI DNA/EcoRI(8576，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，718，710，492，359bp)，泳道1为CUP1的PCR产物。回收该约1.1kb的DNA片段，克隆至pGEM-T载体，进行测序，结果表明扩增得到的CUP1具有GenBank Access No.K02204的自5′端第1098-2189位碱基的核苷酸序列。
3、重组质粒pYCUP的构建
PCR片段经低熔点胶回收直接与经HincII酶切的质粒pBluescriptM13(宝生物工程(大连)有限公司)连接，构成质粒pMCUP。用KpnI和SalI酶切质粒pMCUP得到CUP1片段，然后与用KpnI和SalI酶切的线性质粒YEp352(Hill JE，Meyers AM，Koemer TJ，Tzagoloff A.Yeast/E.coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast，1993，9：163-167.)连接，得到质粒pYCUP(图2)。并利用EcoRI，SacI，KpnI和XbaI进行单酶切验证pMCUP，结果如图3所示，pMCUP经EcoRI酶切后，得到4060bp的DNA片段(泳道2)；pMCUP经SacI酶切后，得到4060bp的DNA片段(泳道3)；pMCUP经KpnI酶切后，得到4060bp的DNA片段(泳道4)；pMCUP经XbaI酶切后，得到3200bp片段和660bp的DNA片段(泳道5)。酶切验证结果表明pMCUP的结构正确。图3中，1为DNA分子量标准sppI DNA/EcoRI(8576，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，718，710，)。
用穿梭质粒pYCUP通过完整酵母转化法(Adams A.Gottschling DE，Kaiser CA，Steams T.Methods in Yeast Genetics：a cold spring harbor laboratory course manual.New York：Cold Spring Harbor；1997.Cold Spring Harbor Laboratory)转化实验室酵母菌株YS58(Teunissen ARH，Holub E，Hucht JVD.Physical localization of theflocculation gene FLO1 on chromosome I of Saccharomyces cerevisiae.Yeast，1993，9：1-10)，转化时用含有20mg/L Leu，Ura和Trp的YNB培养基进行筛选，因质粒中含有URA3基因，所以含有质粒pYCUP的转化子YS58(pYCUP)在不含Ura的YNB培养基上也能生长，而YS58不能生长(图4)。图4中，两个平板中的第一行的五个菌落为受体菌，其余各行的五个菌落均为转化子YS58(pYCUP)。左侧平板中的培养基为含有20mg/L Leu和20mg/L Trp的YNB培养基，右侧平板为含有20mg/LLeu，20mg/L Ura和20mg/L Trp的YNB培养基。
得到转化子YS58(pYCUP)后用含有不同Cu2+浓度的YEPD培养基验证。结果是在含有3mM Cu2+的平皿中YS58与转化子YS58(pYCUP)都能生长，而在5-9mM Cu2+的平皿中只有转化子YS58(pYCUP)能够生长，YS58不能生长(图5)。图5中，四个平板中的第一行的五个菌落为受体菌，其余各行的五个菌落均为转化子YS58(pYCUP)。实验结果表明CUP1基因具有铜抗性功能，可以用作筛选标记。
4、重组质粒pICG的构建
用BglII和SalI酶切质粒pYCUP得到CUP1片段，用SalI和XbaI酶切质粒pGF-2(Fan X，He X，Guo X，Qu N，Wang Ch，Zhang B.Increasing glutathioneformation by functional expression of the γ-glutamylcysteine synthetasegene in Saccharomyces cerevisiae.Biotechnol.Lett.2004，26：415-417)得到片段GSH1，用BglII和XbaI酶切质粒pLZ-2(李艳，铁翠娟，王正祥，张博润，诸葛健。低双乙酰啤酒酵母菌的构建。酿酒，2002，29：77-79)，将三个片段连接，构成质粒pICG(图6)。并利用SalI、BamHI、EcoRI、BglII或SacI单酶切，SalI和SacI双酶切验证pICG，结果如图7所示，pICG经SalI酶切后，得到7000bp片段和4300bp片段(泳道2)；pICG经BamHI酶切后，得到6100bp片段，3600bp片段和1600bp片段(泳道3)；pICG经EcoRI酶切后，得到6200bp片段，2900bp片段和2200bp片段(泳道4)；pICG经BglII酶切后，得到9820bp片段和990bp片段和490bp片段(泳道5)；pICG经SacI酶切后，得到5700bp和5600bp片段(泳道6)；pICG经SalI和SacI双酶切后，得到5200bp片段，4600bp片段和1500bp片段(泳道7)。酶切验证结果表明pICG的结构正确。图7中，1为DNA分子量标准sppI DNA/EcoRI(8576，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，718，710，)。
二、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2CGMCC №1377的构建
1、工程菌YSF31(pICG)-2的构建
用KpnI和PstI酶切重组质粒pICG得到一个6.0kb大小的DNA片段。此片段含有铜抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因，γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因的5′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第443-705位碱基的263bp核苷酸片段，γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第2983-3361位碱基的379bp的核苷酸片段。用该DNA片段转化(Adams A.Gottschling DE，Kaiser CA，Stearns T.Methods in Yeast Genetics：a cold spring harbor laboratory course manual.New York：Cold Spring Harbor；1997.Cold Spring Harbor Laboratory)工业啤酒酵母菌YSF-31，在含有硫酸铜的YEPD培养基平板上筛选转化子，获得硫酸铜抗性明显提高的转化子YSF31(pICG)-2。该6.0kb片段和YSF-31基因组上的ILV2发生同源重组，结果，铜抗性基因和谷胱甘肽基因被整合到染色体上。这样，在重组酵母菌株中，ILV2基因被破坏，而同时铜抗性基因和谷氨酸半胱氨酸合成酶基因都增加了一个拷贝(图8)。
用引物ILV2-1(5′-GCAGGATCCTGGCTTCAGTTGCTGTCT-3′)和CUP1的引物P2，以工程菌YSF31(pICG)-2的基因组DNA为模板，进行PCR扩增验证，结果在受体菌YSF-31中没有任何片段生成，而在挑选的工程菌YSF31(pICG)-2中扩增出了大小为1.3kb的片段(图9)。图9中，1为1kb ladder marker；2-4：转化子YSF31(pICG)-2的PCR产物；5：受体菌YSF-31的PCR产物；6：阳性对照pICG为模板的PCR产物。
2、工程菌YSF31(pICG)-2的γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(AHAS)酶活测定
菌株接于YEPD培养基中，在28℃培养36小时，离心收集细胞，按照细胞通透测定法测定工程菌YSF31(pICG)-2和受体菌YSF-31的AHAS酶活(Magee PT，Robichon-Szulmajster DH.The regulation of isoleucine-valine biosynthesisin Saccharomyces cerevisiae.2.Identification and characterization ofmutants lacking acteohydroxyacid synthase.Eur.J.Biochem.1968，3：502-506)。测定结果表明，在工程菌YSF31(pICG)-2中AHAS的酶的活性是受体菌的50％(表1)，证明在工程菌YSF31(plCG)-2中ILV2基因被破坏掉一个等位基因。
表1转化子YSF31(pICG)-2和受体菌YSF-31的AHAS酶活比较
    菌株     AHAS酶活(U mg-1蛋白)
    受体菌YSF-31工程菌YSF31(pICG)-2     4.182.33
3、摇瓶发酵实验结果
将受体菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2分别接入5ml麦芽汁培养基，25℃培养12小时，以10％的接种量接种于10ml麦芽汁培养基，25℃培养36小时，全部接于含有270ml麦芽汁的三角瓶中，9℃静置培养10天。每两天取样，每次用无菌移液管取10ml培养液，用两层3MM滤纸过滤，分别检测细胞内谷胱甘肽含量(Fan X，He X，Guo X，Qu N，Wang Ch，Zhang B.Increasing glutathioneformation by functional expression of the γ-glutamylcysteine synthetasegene in Saccharomyces cerevisiae.Biotechnol.Lett.2004，26：415-417)和滤液中双乙酰含量(管敦仪。啤酒工业手册，中册，p234，轻工业出版社)。结果表明工程菌的谷胱甘肽的含量比受体菌的高，而在发酵液中，工程菌的双乙酰含量比受体菌的低，特别是工程茵的峰值是YSF-31的75％。这充分说明在工程菌中GSH1基因得到了高表达而ILV2基因被破坏掉一个拷贝(图10)。图10中，YSF-31的GSH含量(■)：工程菌YSF31(pICG)-2的GSH含量(□)；YSF-31的双乙酰含量(▲)；工程菌YSF31(pICG)-2的双乙酰含量(△)。
4、小试(百升)发酵实验
将酵母菌接入5mL麦芽汁培养基，25℃培养12小时，以10％的接种量接种于10mL麦芽汁培养基，25℃培养36小时，培养液全部接于270mL麦芽汁中，25℃培养36小时，然后将培养液接入2000ml大三角瓶，20℃培养36小时，接至100L发酵罐(装有80L麦芽汁培养基)中。启发后10℃培养，当糖度降到2.6时，降温到0℃后储。
(1)谷胱甘肽含量检测
将发酵液离心收集菌体，然后测细胞中的GSH含量，结果表明转化子YSF31(pICG)-2细胞中的GSH含量是受体YSF31细胞的1.38倍，说明在转化子YSF31(pICG)-2细胞中GSH1基因得到了高表达(表2)。
表2受体菌和工程菌的谷胱甘肽含量的比较
  菌株   GSH含量(mg/g干细胞)
  受体菌YSF-31   1.5032
  工程菌YSF31(pICG)-2   2.0704
(2)双乙酰含量检测
将发酵液用滤纸过滤，然后测滤液中的双乙酰含量，在百升发酵实验中，工程菌YSF31(pICG)-2的发酵速度比受体菌的快得多，工程菌YSF31(pICG)-2从第10天开始进入后储期，受体菌YSF-31从第14天开始进入后储期，工程菌提前4天进入后储期。工程菌的双乙酰含量的峰值比受体的低(图11)。图11中，受体菌YSF-31的双乙酰含量(▲)；工程菌YSF31(pICG)-2的双乙酰含量检测(△)。
(3)糖度检测
从发酵罐中取500ml发酵液，通过反复倾倒排除二氧化碳，用糖度计检测发酵液的糖度。糖度检测实验表明，工程菌YSF31(pICG)-2的糖发酵速度比受体菌YSF-31的快，提前六天达到2.5(图12)。图12中，受体菌YSF-31的糖度检测(▲)；工程菌YSF31(pICG)-2的糖度检测(△)。
(4)发酵结束后其他指标的检测
百升实验在后储期(工程菌YSF31(pICG)-2和受体菌YSF-31的后储期均为14天)取样检测pH、絮凝性、α-N同化率和发酵度，结果表明pH、絮凝性、α-N同化率和发酵度，受体菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2基本相同，说明染色体上的整合没有改变酵母的其他特性(表3)。
表3其他发酵指标的检测
  检测项目   受体菌YSF-31  工程菌YSF31(pICG)-2T2
  pH   4.42  4.42
  絮凝性(％)   84.9  88.9
  α-N同化率(％)   53.4  53.7
  发酵度(％)   61.83  62.04
5、中试(两吨)发酵实验
将酵母菌接入5mL麦芽汁培养基，25℃培养12小时，以10％的接种量接种于10mL麦芽汁培养基，25℃培养36小时，培养液全部接于270mL麦芽汁中，25℃培养36小时，然后将培养液接入2000ml大三角瓶，20℃培养36小时，接至15L的卡氏罐中，20℃培养36小时，菌液全部接于两吨发酵罐(装有1600L麦芽汁培养基)中，10℃发酵，当糖度降到2.6时，降温到0℃后储。
(1)谷胱甘肽含量与双乙酰含量检测
在两吨发酵实验中，工程菌YSF31(pICG)-2的谷胱甘肽的含量比受体菌YSF-31的高，而工程菌YSF31(pICG)-2的双乙酰的含量比受体菌YSF-31的低。跟小试实验结果和百升发酵实验结果一致(图13)。图13中，受体菌YSF-31的双乙酰含量(■)；工程菌YSF31(pICG)-2的双乙酰含量(□)；受体菌YSF-31谷胱甘肽含量(○)；工程菌YSF31(pICG)-2的谷胱甘肽含量(●)。
(2)抗老化实验
硫代巴比妥酸(TBA)法测定羰基化合物的检测报告表明，用工程菌YSF31(pICG)-2生产的成品酒的保鲜时间是受体菌YSF-31生产的成品酒保鲜时间的1.5倍左右(表4)。
表4受体菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的抗老化实验
样品   分析项目及结果
  TBA  ΔTBA12  ΔTBA24  ΔTBA36  ΔTBA48   RSV
  1   0.222  0.111  0.205  0.284  0.391   237.352
  1’   0.225  0.125  0.252  0.333  0.374   213.844
  2   0.220  0.163  0.322  0.491  0.567   153.065
  2’   0.215  0.171  0.341  0.441  0.608   150.568
注：1和1’样品为两吨中试工程菌YSF31(pICG)-2及其平行样，2和2’为两吨中试受体菌YSF-31及其平行样。说明：RSV值越大，表示成品啤酒的保鲜时间越长。
(3)受体菌和工程菌发酵生产的啤酒经过陈化以后，品评结果如下：
10位评委品评结果是：认为工程菌YSF31(pICG)-2发酵生产的啤酒优于受体菌YSF-31生产的啤酒的有7位评委；认为工程菌YSF31(pICG)-2发酵生产的啤酒同于受体菌YSF-31生产的啤酒的有1位评委；认为工程菌发酵生产的啤酒逊于受体菌YSF-31生产的啤酒的有2位评委。
6、工程菌YSF31(pICG)-2的稳定性检测
将工程菌YSF31(pICG)-2分别在有选择压力(YEPD+3mmol/L CuSO4)及无选择压力(YEPD)的液体培养基中连续传代培养120h(24小时传一次代)，每天取样检测***的DNA片段的丢失情况，结果表明，无论在有选择压力条件下，还是在无选择压力条件下，连续培养120h后，100％的工程菌细胞带有***DNA片段，未发生丢失现象。
通过上述实验步骤，获得高谷胱甘肽含量低双乙酰生成量的工业啤酒酵母工程菌YSF31(pICG)-2。啤酒酵母工程菌YSF31(pICG)-2已于2005年05月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1377。

Claims (10)

1、一种啤酒酵母工程菌，是将γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因导入酿酒酵母YSF-31中，得到的高谷胱甘肽含量低双乙酰含量的菌株；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有70-705bp的选自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有70-539bp的选自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第1-705位碱基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第2983-3522位碱基的核苷酸序列。
2、根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的氨基酸序列的GenBank号为CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank号为X02549；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶编码基因的核苷酸序列如GenBank号D90220。
3、根据权利要求2所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第443-705位碱基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第2983-3361位碱基的379bp的核苷酸片段。
4、根据权利要求1、2或3所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：在导入所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的同时还将铜抗性基因CUP1一同导入酿酒酵母YSF-31；所述铜抗性基因CUP1的核苷酸序列如GenBank号K02204。
5、根据权利要求4所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因和铜抗性基因CUP1是通过用KpnI和PstI从重组质粒pICG切下的6.0kb的DNA片段导入酿酒酵母YSF-31；所述重组质粒pICG的物理图谱如图7。
6、根据权利要求5所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：所述啤酒酵母工程菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
7、一种构建权利要求1所述啤酒酵母工程菌的方法，是将γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因导入酿酒酵母YSF-31中，得到的高谷胱甘肽含量低双乙酰含量的菌株即为啤酒酵母工程菌；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有70-705bp的选自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有70-539bp的选自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第1-705位碱基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank号为X02549的5′端第2983-3522位碱基的核苷酸序列。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的氨基酸序列的GenBank号为CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank号为X02549；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶编码基因的核苷酸序列如GenBank号D90220。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的5′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第443-705位碱基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的3′端连接有自GenBank号为X02549的5′端第2983-3361位碱基的379bp的核苷酸片段；在导入所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因的同时还将铜抗性基因CUP1一同导入酿酒酵母YSF-31；所述铜抗性基因CUP1的核苷酸序列的GenBank号为K02204。
10、根据权利要求7、8或9所述的方法，其特征在于：所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的编码基因和铜抗性基因CUP1是通过用KpnI和PstI从重组质粒pICG切下的6.0kb的DNA片段导入酿酒酵母YSF-31；所述重组质粒pICG的物理图谱如图7；所述啤酒酵母工程菌优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
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