CN110628804B - 一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法 - Google Patents

一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，涉及用于酵母使用载体引入突变DNA重组技术，运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，将过表达酿酒酵母突变基因spt15‑30的质粒YCplac22‑spt15‑30转化入宿主菌为酿酒酵母野生型菌株W303‑1A，再在CM‑Tryptophan固体培养基上培养2～3天后，筛选带有这个质粒的转化子,构建得到对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL‑104。本发明克服了现有技术中存在的在发酵后期异丁醇产率下降，并且在现有的作为生产异丁醇的酿酒酵母菌株对异丁醇的耐受性还不能适应进一步提高发酵后期异丁醇产量需求的缺陷。

Description

一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法
技术领域
本发明的技术方案涉及用于酵母使用载体引入突变DNA重组技术，具体地说是一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法。
背景技术
异丁醇具有较小的挥发性、腐蚀性、较高的辛烷值和能量密度，且易于储存和运输，是一种新型的具有巨大市场潜力的生物燃料。酿酒酵母由于其对异丁醇的耐受性较好、具有利用纤维素水解物的优势和自身具有合成异丁醇的基因等优势，可以作为生产异丁醇的优势宿主菌株。
现有技术CN103789341B公开了一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，其存在在发酵后期异丁醇产率下降，并且在现有的作为生产异丁醇的酿酒酵母菌株对异丁醇的耐受性还不能适应进一步提高发酵后期异丁醇产量需求的缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，将过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入宿主菌为酿酒酵母野生型菌株W303-1A，再在CM-Tryptophan固体培养基上培养2～3天后，筛选带有这个质粒的转化子,构建得到对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104，克服了现有技术中存在的在发酵后期异丁醇产率下降，并且在现有的作为生产异丁醇的酿酒酵母菌株对异丁醇的耐受性还不能适应进一步提高发酵后期异丁醇产量需求的缺陷。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，将过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入宿主菌为酿酒酵母野生型菌株W303-1A，再在CM-Tryptophan固体培养基上培养2～3天后，筛选带有这个质粒的转化子,构建得到对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104，具体步骤如下：
第一步，过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30的构建：
(1.1)突变基因spt15-30片段的合成：
根据酿酒酵母W303-1A染色体上SPT15基因序列设计突变位点，合成突变基因spt15-30片段；
(1.2)过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30的构建：
将质粒YCplac22和上述(1.1)步得到的突变基因spt15-30片段分别用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，用SalⅠ和BamHⅠ各0.25μL，10×酶缓冲液2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min，用T4连接酶将质粒YCplac22和突变基因spt15-30片段连接，连接操作如下：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、质粒YCplac22和上述(1.1)步得到的突变基因spt15-30片段的加入量分别为0.5μL～8μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接1～2h，得到连接产物，取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30；
第二步，对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104的构建：
将上述第一步中构建的过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-Tryptophan固体培养基上培养2～3天后，筛选带有这个质粒的转化子,构建得到对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104，即MATa leu2-3,112ura3-1 trp1-92 his3-11,15ade2-1 can1-100YCplac22-spt15-30。
大量实验证明：经上述方法一定能构建出对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104。
上述一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，所述过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A操作方法是：
(1)将平板上的酿酒酵母野生型菌株W303-1A接入5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；
(2)将供体DNA 2mg/mL于沸水浴煮5分钟后，迅速置于冰上；
(3)取上述(1)得到的酿酒酵母培养液1.5mL置于离心管中，13000rpm离心30sec，收集菌体，弃上清；
(4)往上述(3)的离心管中加入360μL的转化混合物，在漩涡分离器上高速振荡混匀，转化混合物的配置如下：
Figure GDA0002791939280000021
(5)将上述(4)得到的转化体系于42℃水浴20～30分钟；
(6)将上述(5)处理后的转化体系用离心机转速为13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；
(7)用100μL无菌水重悬上述(6)得到的菌体，涂布在合适的筛选平板上，30℃温度下培养2～3天，完成质粒YCplac22-spt15-30转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A。
上述一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，所用的原料物均是公知的并能从商购获得，其中：
大肠杆菌E.coli Top10购自北京天根生化科技有限公司；
宿主菌酿酒酵母菌为W303-1A(MATa leu2-3,112ura3-1 trp1-92 his3-11,15ade2-1 can1-100(Thomas and Rothstein,1989))；
质粒YCplac22购自北京天根生化科技有限公司；
spt15-30突变基因片段由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；
担体DNA(Single-stranded DNA)来自Sigma-Aldrich公司。
PEG4000为50％(v/v)、10×TE(pH7.5)10％和10×乙酸锂贮存液10％。
LB(Luria-Bertani)液体培养基：1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl，用NaOH调pH＝7.5，于121℃下灭菌25min，冷却至室温加入氨苄青霉素，至终浓度为1g氨苄青霉素/L，得到LB液体培养基。
LB固体培养基：在调好pH值为7.5的LB液体培养基中加入1.5％的琼脂粉，于121℃下灭菌25min，冷却至室温加入氨苄青霉素，至终浓度为1g氨苄青霉素/L，得到LB固体培养基。
YPD液体培养基：1％酵母提取物和2％蛋白胨，在pH自然条件下，121℃下灭菌25min，再加入单独灭菌的40％葡萄糖至终浓度为2％。
YPD固体培养基：在YPD液体培养基中加入1.5％(w/v)琼脂粉，于121℃下灭菌25min。
完全极限培养基(CM)：0.67％YNB(Bacto Yeast Nitrogen Base without AminoAcids(Difco))和0.83g/L Dropout Power，其中Dropout Power由以下成分构成：腺嘌呤50mg/L、亮氨酸100m/L、精氨酸20mg/L、赖氨酸30mg/L、天冬氨100mg/L、甲硫氨酸20mg/L、谷氨酸100mg/L、苯丙氨酸50mg/L、组氨酸100mg/L、丝氨酸150mg/L、异亮氨酸30mg/L、苏氨酸150mg/L、色氨酸100mg/L、酪氨酸30mg/L、尿嘧啶50mg/L、缬氨酸150mg/L。
省却上述特定的氨基酸成分，则做成选择性培养基，液体培养基调节pH为5.6，固体培养基调节pH为6.5，再加入1.5％的琼脂,于121℃灭菌25min。
上述涉及的％，除特别注明之外，均为质量百分比。
上述一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，其中根据酿酒酵母W303-1A染色体上SPT15基因序列设计突变位点，合成突变基因spt15-30片段是由基因合成公司完成的。
上述一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，所用的操作工艺是本领域的技术人员所掌握的。
本发明的有益效果如下：
与现有技术CN103789341B相比，本发明具有如下突出的实质性特点是，本发明是运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，宿主菌为酿酒酵母菌，同时转入过表达突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30，运用突变基因重组DNA技术改造酿酒酵母细胞，构建了对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株。
与现有技术相比，本发明的显著进步是：运用本发明方法所构建的酿酒酵母菌株解决了目前制约异丁醇产量进一步提高的菌株对异丁醇耐受性低的关键技术问题，为利用生物法合成异丁醇提供优良的菌株。具体为：本发明方法制得的“酿酒酵母菌株HBGDAL-104”比CN103789341B得到的菌株HBGDAL-103异丁醇耐受性大幅提高：在含有2.5％异丁醇的YPD液体培养基中培养32小时，本发明方法制得的菌株HBGDAL-104的相对存活率是CN103789341B得到的菌株HBGDAL-103相对存活率的9.25倍(详见对图1的说明)。此外，本发明方法所构建的酿酒酵母菌株HBGDAL-104，在以初始葡萄糖浓度为6％的YPD液体培养基中发酵32小时异丁醇产率较对照菌株提高了11倍。数据事实说明，本发明方法制得的“酿酒酵母菌株HBGDAL-104”比现有的“酿酒酵母菌株HBGDAL-103”及其他现有相关酿酒酵母菌株的对异丁醇的耐受性具有预料不到的技术效果。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为酿酒酵母菌株HBGDAL-104即W303-1A YCplac22-spt15-30的相对存活率曲线。
图2为质粒YCplac22-spt15-30的限制性内切酶图谱。
图3为突变基因spt15-30的DNA序列。
具体实施方式
图1所示实施例表明，由时间-相对存活率曲线显示，在含有2.5％异丁醇的YPD液体培养基中培养32小时，本发明方法制得的菌株HBGDAL-104即W303-1A YCplac22-spt15-30的相对存活率是CN103789341B得到的菌株HBGDAL-103即W303-1A YCplac22相对存活率的9.25倍。
图2所示实施例表明，质粒YCplac22-spt15-30是在质粒YCplac22上连spt15-30的突变DNA序列，spt15-30突变DNA两端的限制性内切酶酶切位点是SalⅠ和BamHⅠ。
实施例1
运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，将过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入宿主菌为酿酒酵母野生型菌株W303-1A为MATaleu2-3,112ura3-1 trp1-92 his3-11,15ade2-1 can1-100(Thomas and Rothstein,1989)，具体步骤如下：
第一步，过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒构建：
(1.1)突变基因spt15-30片段的合成：
根据酿酒酵母W303-1A染色体上SPT15基因序列设计突变位点，委托基因合成公司合成突变基因spt15-30片段，突变基因spt15-30的DNA序列如图3所示；
(1.2)过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30的构建：
将质粒YCplac22和上述(1.1)步得到的突变基因spt15-30片段分别用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，用SalⅠ和BamHⅠ各0.25μL，10×酶缓冲液2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min，用T4连接酶将质粒YCplac22和突变基因spt15-30片段连接，连接操作如下：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、质粒YCplac22和上述(1.1)步得到的突变基因spt15-30片段的加入量分别为0.5μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接1h，得到连接产物，取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30；
第二步，对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104的构建：
将上述第一步中构建的过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-Tryptophan固体培养基上培养2～3天后，筛选带有这个质粒的转化子,得到对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104，即MATa leu2-3,112ura3-1 trp1-92 his3-11,15ade2-1 can1-100YCplac22-spt15-30；
所述过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A操作方法是：
(1)将平板上的酿酒酵母野生型菌株W303-1A接入5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；
(2)将供体DNA 2mg/mL于沸水浴煮5分钟后，迅速置于冰上；
(3)取上述(1)得到的酿酒酵母培养液1.5mL置于离心管中，13000rpm离心30sec，收集菌体，弃上清；
(4)往上述(3)的离心管中加入360μL的转化混合物，在漩涡分离器上高速振荡混匀，转化混合物的配置如下：
Figure GDA0002791939280000051
(5)将上述(4)得到的转化体系于42℃水浴20～30分钟；
(6)将上述(5)处理后的转化体系用离心机转速为13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；
(7)用100μL无菌水重悬上述(6)得到的菌体，涂布在合适的筛选平板上，30℃温度下培养2～3天，完成质粒YCplac22-spt15-30转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A。
第三步，对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104的相对存活率检测：
对本实施例制得的对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104的相对存活力检测：使用前将上述第二步所制得的对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104接到CM-Tryptophan平板上进行2次活化处理，接种到含有2.5％异丁醇的CM-Tryptophan液体培养基中培养,葡萄糖初始浓度为2％，培养温度为30℃，初始OD600nm为1,并计算初始活细胞数。培养60小时，每四个小时取样一次，测定存活细胞数，将取样点的活细胞数除以初始活细胞数就是该取样点的相对存活率；
通过对本实施例制得的酿酒酵母菌株HBGDAL-104在含有2.5％异丁醇的培养基中培养发现，本实施例所制得的酿酒酵母菌株HBGDAL-104即W303-1A YCplac22-spt15-30的存活率比较CN103789341B得到的菌株HBGDAL-103即W303-1A YCplac22有大幅提升；在含有2.5％异丁醇的YPD液体培养基中培养32小时，菌株HBGDAL-104即W303-1A YCplac22-spt15-30的相对存活率是CN103789341B得到的菌株HBGDAL-103即W303-1A YCplac22相对存活率的9.25倍，这说明本实施例制得的酿酒酵母菌株HBGDAL-104的耐受性较对照菌株HBGDAL-103有大幅度提高(见附图1)。同时，本实施例所制得的酿酒酵母菌株HBGDAL-104的异丁醇产率较对照菌株提高了11倍。
实施例2
除用T4连接酶将质粒YCplac22和突变基因spt15-30片段连接，连接操作如下：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、质粒YCplac22和上述(1.1)步得到的突变基因spt15-30片段的加入量分别为0.6μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接1.5h，得到连接产物，取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30；使用前将制得的对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104接到CM-Tryptophan平板上进行3次活化处理，在含有2.5％异丁醇的CM-Tryptophan液体培养基中培养，接种量为12％，葡萄糖初始浓度为2％，培养温度为30℃，pH为5.5，培养60h，每四个小时取样一次，测定存活细胞数之外，其他同实施例1。
实施例3
除用T4连接酶将质粒YCplac22和突变基因spt15-30片段连接，连接操作如下：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、质粒YCplac22和上述(1.1)步得到的突变基因spt15-30片段的加入量分别为8μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接2h，得到连接产物，取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30；使用前将制得的对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104接到CM-Tryptophan平板上进行3次活化处理，在含有2.5％异丁醇的CM-Tryptophan液体培养基中培养，接种量为15％，葡萄糖初始浓度为4％，发酵温度为30℃，pH为6.0，发酵60h，每四个小时取样一次，测定存活细胞数，其他同实施例1。
实施例4
除宿主菌为酿酒酵母野生型菌株W303-1A选用为工业酿酒酵母菌株之外，其他同实施例1。
上述实施例中所用的原料物均是公知的并均从商购获得，所用的操作工艺是本领域的技术人员所掌握的。
序列表
TATA-结合蛋白spt15-30基因序列
<110> 河北工业大学
<120> 一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法
<160> 1541
<210> 1
<211> 1541
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
〈400〉1
ctgtattcctgtgctaagtggtatacttgtgaaatactaagtttgtcgccaagattttcc 60
atgaatttgtacttctttcgaaatcgttcaatttctaccaatactgattcccctctgata 120
gctgagatgtcgggattccctttgctgatagatctaactcatctctttacgtattttaat 180
tgtgaagccgtaaatagttatcttccaagtttctcttacgcgagctttttgggaaaagaa 240
aaaaatttgaagatctacatataaaacatggcttcaaaggattactaatgacttttttta 300
ccttgataggtattcttgatggtaagagtaaacaagggacgtgaaaattacagtagttac 360
tgttttttttggactataagatcgggggaagataacacataagaaataaaacgactact 419
agttagactgctctgcggaagaagcaaggaagtaaagggctgcattttatttttcttttc 479
tagtccaacataaacaggtgtatcaagagaaacttttttaattatggccgatgaggaacg 539
tttaaaggagtttaaagaggcaaacaagatagtgtttgatccaaataccagacaagtatg 599
ggaaaaccagaatcgagatggtacaaaaccagcaactactttccagagtgaagaggacat 659
aaaaagagctgccccagaatctgaaaaagacacctccgccacatcaggtattgttccaac 719
actacaaaacattgtggcaactgtgactttggggtgcaggttagatctgaaaacagttgc 779
gctacatgcccgtaatgcagaatataaccccaagcgttttgctgctgtcatcatgcgcat 839
tagagagccaaaaactacagctttaatttttgcctcagggaaaatggttgttaccggtgc 899
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cgggtttgctgctaaattcacagacttcaaaatacaaaatattgtcggttcgtgtgacgt 1019
taaattccctatacgtctagaagggttagcattcagtcatggtactttctcctcctatga 1079
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Claims (2)

1.一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，其特征在于：将过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入宿主菌酿酒酵母野生型菌株W303-1A，即MATa leu2-3,112 ura3-1 trp1-92 his3-11,15 ade2-1 can1-100，再在CM-Tryptophan固体培养基上培养2～3天后，筛选带有这个质粒的转化子,构建得到对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104，具体步骤如下：
第一步，过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30的构建：
(1.1)突变基因spt15-30片段的合成：
根据酿酒酵母W303-1A染色体上SPT15基因序列设计突变位点，委托基因合成公司合成突变基因spt15-30片段，突变基因spt15-30的DNA序列如序列1所示；
(1.2)过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30的构建：
将质粒YCplac22和上述(1.1)步得到的突变基因spt15-30片段分别用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ消化，消化体系为：DNA为5μL，用SalⅠ和BamHⅠ各0.25μL，10×酶缓冲液2μL，加无菌水12.5μL，在37℃条件下消化10min，用T4连接酶将质粒YCplac22和突变基因spt15-30片段连接，连接操作如下：在1.5mL离心管中，加入10×T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、质粒YCplac22和上述(1.1)步得到的突变基因spt15-30片段的加入量分别为0.5μL，再用无菌水将总体积补至20μL，在16℃条件下连接1h，得到连接产物，取10μL该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30；
第二步，对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104的构建：
将上述第一步中构建的过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-Tryptophan固体培养基上培养2～3天后，筛选带有这个质粒的转化子,得到对异丁醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HBGDAL-104，即MATaleu2-3,112 ura3-1 trp1-92 his3-11,15ade2-1 can1-100YCplac22-spt15-30。
2.根据权利要求1所述一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，其特征在于：所述过表达酿酒酵母突变基因spt15-30的质粒YCplac22-spt15-30转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A操作方法是：
(1)将平板上的酿酒酵母野生型菌株W303-1A接入5mLYPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；
(2)将供体DNA2mg/mL于沸水浴煮5分钟后，迅速置于冰上；
(3)取上述(1)得到的酿酒酵母培养液1.5mL置于离心管中，13000rpm离心30sec，收集菌体，弃上清；
(4)往上述(3)的离心管中加入360μL的转化混合物，在漩涡分离器上高速振荡混匀，转化混合物的配置如下：
Figure FDA0002961179980000021
(5)将上述(4)得到的转化体系于42℃水浴20～30分钟；
(6)将上述(5)处理后的转化体系用离心机转速为13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；
(7)用100μL无菌水重悬上述(6)得到的菌体，涂布在合适的筛选平板上，30℃温度下培养2～3天，完成质粒YCplac22-spt15-30转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A。
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