CN103820345B - 一种提高酿酒酵母耐热性的分子调控方法 - Google Patents
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Abstract
针对现代生物医药与轻工业食品产业体系中，微生物控温发酵生产过程高能耗的问题。本发明提供一种提高酿酒酵母耐热性的分子调控方法，属于生物化工领域。以嗜热菌，耐热菌中的热激蛋白、泛素、ATP合成酶基因以及酿酒酵母中热激蛋白基因作为功能元件，以酿酒酵母中不同强度启动子作为调控元件，通过单功能、多功能、协同型3种不同组装方式构建耐热元器件，构建的耐热元器件再以载体和基因组整合2种策略导入酵母细胞中，实现耐热元器件与底盘宿主酿酒酵母的集成。通过梯度升温和恒定高温培养发酵表征元器件的耐热性，实现酿酒酵母在分子水平上不同耐热程度的调控，为工业发酵生产生物基产品的高效、低能耗过程提供了新方法。
Description
技术领域
本发明涉及利用构建的耐热元器件提高工业微生物酿酒酵母的耐热性及其工业应用，属于生物化工领域。
背景技术
微生物耐热性是决定发酵过程能量消耗和产物合成效率的重要因素。利用微生物发酵生产生物质产品的过程中，细胞新陈代谢释放出大量的热，发酵体系逐渐升温，无法自行降到反应所需的最适温度，所以需消耗大量冷却水控温，导致动力费用增加、发酵过程高能耗的问题。但与之矛盾的是，胞内大多数酶的最适反应温度都高于最适生长温度，从反应热力学角度分析，提高温度可以有效地活化反应过程，加速代谢传质，提高细胞合成效率。所以提高发酵菌株耐热性，扩宽最适生长温度的范围将很好的解决这一矛盾，能够大幅度降低成本，同时提高生产效率。
酿酒酵母的耐热性一直是酵母菌研究和发酵工业生产的热点问题。酿酒酵母不仅由于它是一种公认的安全微生物，更因为其生长速度快、易于遗传操作、发酵能力强、无内毒素、对乙醇及其他抑制物的耐受性也比较强的优势，使其成为工业生物技术中应用最广泛的工业生产菌株之一。因此，提高酿酒酵母的耐热性是获得低成本生物制品的有效途径。
目前，国内外的研究人员主要通过适应性驯化策略或者遗传操作策略主要包括杂交、随机诱变、进化工程和基因组重排等方法对酵母菌进行耐热性能的改造。但整体上来说，利用基因工程的方法构建的耐热酿酒酵母成功的例子很少，效果不明显。而且这些方法只能提高最适生长温度，无法扩宽最适生长温度范围，不能满足工业发酵逐渐升温的需求。而通过引入外源耐热机制分子水平上改造酿酒酵母的耐热性虽已有报道，但研究不***，应用于工业梯度升温发酵还未见报道。
极端微生物代表着生命的极限，蕴藏着丰富的未知生物学过程和功能，是丰富的特殊功能蛋白质资源宝库，有着不可估量的生物技术开发前景。对于极端嗜热菌，能生活在近100℃的环境中，有其独特的适应机制，主要与芽孢、细胞膜的组成成分、嗜热酶、蛋白质空间结构、热激蛋白以及遗传物质有关，其中产生大量热激蛋白是一种重要分子调控手段。其不仅在热胁迫下能够有效的保护细胞，对于有机溶剂、酸性环境等胁迫也能发挥其生理生化功能。目前，将热保护机制中的关键的基因开发成具有耐热功能的分子元器件来改造酿酒酵母的耐热性，并且应用于工业生产的发酵过程还未见有文献报道。
基于近年来合成生物学快速发展，发掘了不同强度的耐热元器件并进行人工设计及优化，对酿酒酵母进行分子水平的调控，提高了其耐热性。应用于微生物发酵生产过程，将大幅度提高生产强度，降低成本。
发明内容
本发明的目的是为解决工业微生物培养过程中由于控制常温发酵导致生产过程高能耗的问题。提供一种提高酿酒酵母耐热性的分子调控方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案提供一种构建耐热元器件及耐热酿酒酵母的方法，从分子水平上调控酿酒酵母的耐热性。从嗜热菌和耐热菌中通过克隆或人工合成得到一系列对细胞具有热保护功能的基因作为功能元件，如热激蛋白，泛素和ATP合成酶基因等，以酿酒酵母中不同强度启动子作为调控元件，通过以下3种不同的组装方式构建耐热元器件：（1）以单个功能元件和调控元件组装成单功能型耐热元器件：启动子-功能元件-终止子;（2）针对功能互作的或者具有不同热保护功能的功能元件组装成多功能型耐热元器件：启动子1-功能元件1-终止子1-启动子2-功能元件2-终止子2-启动子n-功能元件n-终止子n(n≧2);（3）以从底盘宿主酿酒酵母中挖掘出的耐热基因作为内源功能元件，与上述外源功能元件进行组装成协同型耐热元器件：启动子1-外源功能元件1-终止子1-启动子2-内源功能元件2-终止子2-启动子n-（内，外）功能元件n-终止子n(n≧2)。将构建的所有耐热元器件以2种策略导入酿酒酵母中，第一种策略是以载体的形式导入，第二种策略是利用基因组装的方法将其直接整合到酿酒酵母基因组上，实现耐热元器件与酿酒酵母的集成，以拓宽酿酒酵母的最适生长温度范围，提高其耐热性，作为真正意义上的耐热底盘宿主用于工业微生物发酵过程。通过梯度升温发酵及恒定高温发酵表征工程菌耐热性，并进行耐热元器件与β-香树脂醇人工合成途径的功能验证，实现酿酒酵母不同耐热程度的分子调控，使其在高温培养下β-香树脂醇的产量有了明显的提高。此外对构建的耐热元器件进行了有机溶剂的耐受性分析，发现这种分子水平调控方法使酿酒酵母兼备耐热和耐有机溶剂的双重功能。
本发明的提高酿酒酵母耐热性的分子调控方法，具有以下优点：
1、本发明构建的耐热元器件实现了酿酒酵母不同程度耐热性的分子调控，满足了不同发酵生产要求。
2、本发明构建的耐热酿酒酵母工程菌，简化了发酵工艺，降低了生产成本，达到节能减排的目的。
附图说明
图1为构建的三个工程菌T.te-TTE2469,T.te-GroS2,T.te-IbpA以及WT/Vector对照菌株分别在6%（v/v）和8%（v/v）乙醇浓度下的OD660nm值的变化（a）（b）和细胞存活率（c）（d）图。
图2为构建的耐热β-香树脂醇工程菌Sg-sb-T.te-TTE2469和Sg-sb对照菌株在40℃培养下β-香树脂醇的产量图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：单功能型耐热元器件组装
通过NCBI、HSPIA等数据库查阅已完成测序的嗜热微生物以及相关具有热保护功能基因，选取嗜热菌和耐热菌中的热激蛋白、泛素和ATP合成酶基因作为功能元件。以腾冲嗜热菌HSP10家族基因GroS2为例，与启动子和终止子进行两次OE-PCR连接组装耐热元器件：启动子-GroS2-终止子。将构建的所有耐热元器件与穿梭载体连接后，转化大肠杆菌，阳性筛选后，挑单菌落培养提取质粒，转化到酿酒酵母菌中，或者利用基因组装的方法将耐热元器件直接整合到酿酒酵母基因组上，实现与底盘宿主酿酒酵母的集成。
实施例2：多功能型耐热元器件组装
NCBI、HSPIA等数据库获得的功能元件中，针对功能互作的如热激蛋白GroES/GroEL***或者具有不同热保护功能的功能元件如（泛素，热激蛋白和ATP合成酶）组装成多功能型耐热元器件。先以GroES/GroEL***为例，14个单体GroEL分子和7个GroES分子形成中间位空腔的聚合体，帮助蛋白质正确折叠。首先通过两次OE-PCR分别得到单功能元件耐热元器件启动子1-GroES-终止子1和启动子2-GroEL-终止子2。然后用基因组装的方法把两个单功能耐热元器件和穿梭载体按一定的浓度比例转化到酿酒酵母中，或者将两个单功能耐热元器件直接整合到酿酒酵母基因组上，阳性筛选后，得到新的耐热元器件：启动子1-GroES-终止子1-启动子2-GroEL-终止子2。不同的耐热功能元件对细胞具有不同的保护作用，以泛素，热激蛋白和ATP合成酶为例，泛素的主要功能是将高温胁迫下细胞中变性蛋白的进行降解，生成一系列的短肽和游离氨基酸后，作为营养物质继续供细胞利用，使细胞体内达到一种蛋白的平衡，维持其继续生长。而热激蛋白最基本的功能是与高温环境下的变性的蛋白质结合，修复错误折叠的蛋白并维持空间构象和功能，防止其受到环境的损害。ATP合成酶参与氧化磷酸化，在跨膜质子动力势的推动下合成ATP，为细胞提供能力。实施方法同上，首先通过两次OE-PCR分别得到单功能耐热元器件：启动子1-泛素-终止子1，启动子2-热激蛋白-终止子2和启动子3-ATP合成酶-终止子3，然后用基因组装的方法把三个单功能耐热元器件和穿梭载体按一定的浓度比例转化到酿酒酵母中，或者将三个单功能耐热元器件直接整合到酿酒酵母基因组上，阳性筛选后，得到新的耐热元器件：启动子1-泛素-终止子1-启动子2-热激蛋白-终止子2-启动子3-ATP合成酶-终止子3，实现了与底盘宿主酿酒酵母的集成。其他功能互作的或不同功能的元件采用同样的方式构建耐热元器件。
实施例3：协同型耐热元器件组装
从底盘宿主酿酒酵母中克隆或人工合成对细胞具有较好热保护功能的基因如HSP104作为内源功能元件，与上述较好的外源功能元件如泛素，HSP10等再次组装成协同型耐热元器件。首先通过两次OE-PCR分别得到单功能耐热元器件：启动子1-HSP104-终止子1、启动子2-泛素-终止子2、启动子3-HSP10-终止子3，然后用基因组装的方法把三个单功能耐热元器件和穿梭载体按一定的浓度比例转化到酿酒酵母中，或者将三个单功能耐热元器件直接整合到酿酒酵母基因组上，阳性筛选后，得到新的耐热元器件：启动子1-HSP104-终止子1-启动子2-泛素-终止子2-启动子3-HSP10-终止子3，实现了与底盘宿主酿酒酵母的集成。其他不同功能或功能互作的内，外源功能元件采用同样的方式构建耐热元器件。
实施例4：耐热元器件的生化表型验证
通过工程菌高温发酵表征所有元器件的耐热性。挑一单菌落30℃170rpm培养36小时后，按初始OD660nm0.1接种到新的培养基中，正常培养12小时后，通过两种方式进行高温培养发酵：（1）发酵温度上升到35℃继续培养12后，再以2℃为一个温度梯度，逐步提高培养温度至45℃，每个温度梯度培养12h；（2）发酵温度直接上升至42℃、44℃和46℃并连续培养84h。通过菌落形态来定性表征耐热性，OD660nm值的变化、细胞存活率、海藻糖含量来定量表征耐热性。通过工程菌常温发酵表征元器件的乙醇耐受性，挑一单菌落30℃170rpm培养36小时后，按初始OD660nm0.1接种到含有6%（v/v）和8%（v/v）乙醇浓度下的新的YPD培养基中,连续培养84小时，通过OD660nm值的变化和细胞存活率来定量表征乙醇耐受性。结果表明构建的工程菌对乙醇耐受性有了明显的提高。
实施例5：耐热元器件的功能验证
将获得的较好的耐热元器件以载体的形式电转到酿酒酵母β-香树脂醇人工合成体系中，构建具有耐热特性的β-香树脂醇合成体系。通过β-香树脂醇产量的变化研究耐热元器件的引入对底盘宿主及人工合成β-香树脂醇体系的效应。
挑一耐热β-香树脂醇工程菌30℃170rpm培养36小时后，按初始OD660nm0.1接种到新的培养基中，然后通过三种方式进行高温培养发酵：（1）正常培养12小时后，温度上升到37℃继续培养12后，再以2℃为一个温度梯度，逐步提高培养温度至45℃，每个温度梯度培养24h；（2）正常培养12小时后，温度直接上升至40℃并连续培养至72h；（3）直接在35℃和38℃分别培养120小时。培养结束后，处理培养物，萃取β-香树脂醇，最后利用气相色谱-质谱联用仪GCMS-QP2010进行耐热酿酒酵母工程菌发酵生产β-香树脂醇的分析，产量明显提高，结果说明耐热元器件的构建提高了酿酒酵母在高温下的耐受能力。
Claims (3)
1.一种提高酿酒酵母耐热性的分子调控方法，其特征在于，从嗜热菌和耐热菌中通过克隆或人工合成得到对细胞具有热保护功能的基因，包括泛素、热激蛋白和ATP合成酶，作为功能元件，以载体或基因组整合的方式构建耐热元器件，实现酿酒酵母不同耐热程度的分子调控。
2.如权利要求1所述的一种提高酿酒酵母耐热性的分子调控方法，其中组装方式为如下2种：
(1)针对功能互作的或者具有不同热保护功能的功能元件组装成多功能型耐热元器件；
(2)以从底盘宿主酿酒酵母中挖掘的耐热基因作为内源功能元件，与上述外源功能元件进行再次组装的协同型耐热元器件，构建的耐热元器件以2种不同策略导入酵母细胞中，第一种策略是以载体的形式导入，第二种策略是将其直接整合到酿酒酵母基因组上。
3.如权利要求2中所述的构建的耐热元器件在提高酿酒酵母耐热性及乙醇耐受性方面的应用。
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