ES2625354T3 - Composiciones y métodos que comprenden variantes de proteasas - Google Patents

Abstract

Una variante de proteasa aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa una sustitución de cada uno de los residuos de aminoácido en las posiciones 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoácido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4, donde: (i) el residuo de aminoácido en cada una de las posiciones 76 y 188 se sustituye por un residuo de aminoácido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de ácido aspártico y ácido glutámico; (ii) el residuo de aminoácido en cada una de las posiciones 87, 118 y 244 se sustituye por un residuo de aminoácido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina; y (iii) el residuo de aminoácido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 se sustituye por un residuo de aminoácido neutro seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, tirosina y valina, y donde cada posición de aminoácido se numera según la numeración de la posición de aminoácido correspondiente en la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, según lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos que comprenden variantes de proteasas CAMPO DE LA INVENClON

[0001] La presente invencion proporciona variantes de proteasas que son utiles para aplicaciones de limpieza y en metodos de limpieza. En un aspecto, la presente invencion proporciona variantes de proteasas, entre las que se incluyen polipeptidos de variantes de subtilisinas de Bacillus sp., y composiciones de limpieza que comprenden una o mas de dichas variantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENClON

[0002] Las serina proteasas son un subgrupo de carbonil hidrolasas que comprenden una diversa clase de enzimas que tienen una amplia variedad de especificidades y funciones biologicas (vease, p. ej., Stroud, Sci. Amer. 131:74-88). Se han investigado en gran medida las serina proteasas (p. ej., las subtilisinas), debido principalmente a su utilidad en aplicaciones de limpieza y alimentacion.

[0003] El documento WO 2008/112258 describe proteasas modificadas y un metodo para alterar la expresion de proteasas en microorganismos. El documento WO 02/077187 describe protemas, incluidas las subtilisina proteasas, que producen una respuesta inmunogenica alterada. El documento WO 2010/123754 describe proteasas con prorregiones modificadas y metodos para potenciar la produccion de proteasas maduras en celulas huesped bacterianas. El documento WO 2010/056640 describe variantes de serina proteasas y composiciones de limpieza que comprenden las variantes de serina proteasas.

[0004] Aunque se ha desarrollado un numero de variantes de proteasas utiles para abordar necesidades relacionadas con estas aplicaciones, todavfa se necesitan nuevas proteasas y variantes de proteasas mejoradas para usos variados.

SUMARIO DE LA INVENCION

[0005] En un aspecto, la invencion proporciona una variante de proteasa aislada que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion de cada residuo de aminoacido en las posiciones 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 con un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4, donde:

(i) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 76 y 188 se sustituye con un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico;

(ii) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87, 118 y 244 se sustituye con un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina; y

(iii) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 se sustituye con un residuo de aminoacido neutro seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina;

y donde cada posicion de aminoacido se numera segun la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.

[0006] En algunos casos, la secuencia de aminoacidos de dicha variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R. En concreto, la variante de proteasa puede comprender la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:8.

[0007] En algunos casos, la variante de proteasa aislada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 con un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4, donde:

(i) el residuo de aminoacido en la posicion 76 se sustituye con un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico,

(ii) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87 y 118 se sustituye con un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y

(iii) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 se sustituye con un residuo de aminoacido sin carga seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina, y donde dicha variante de proteasa comprende tambien

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(iv) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 con un residuo de aminoacido diferente que es o no es un residuo de acido aspartico, y/o

(v) un residuo de asparagina en la posicion de aminoacido 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 con un residuo de aminoacido diferente que es o no es un residuo de arginina,

y donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.

[0008] En algunos casos, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 y/o un residuo de arginina en la posicion de aminoacido 248.

[0009] En determinados casos, la variante de proteasa tiene una carga global de +1.

[0010] En algunos casos, la secuencia de aminoacidos de dicha variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A. En concreto, la variante de proteasa puede comprender la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:7.

[0011] En algunos casos, la variante de proteasa comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos en relacion con SEQ ID NO:1:

(i) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de proteasa no comprenda N248R+S188D, o

(ii) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R.

[0012] En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende al menos una variante de proteasa del primer aspecto de la invencion. En algunos casos, la composicion es una composicion de limpieza y/o detergente.

[0013] En algunos casos, la composicion de limpieza es una composicion de limpieza para la colada o una composicion detergente para la colada, respectivamente.

[0014] En algunos casos, la composicion de limpieza es una composicion detergente para el lavado de la vajilla, opcionalmente una composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica o una composicion detergente para el lavado de la vajilla a mano.

[0015] En algunos casos, la composicion de limpieza es una composicion detergente lfquida.

[0016] En algunos casos, la composicion de limpieza es una composicion detergente en forma de gel, pastilla, polvo, solida o granulada.

[0017] En algunos casos, la composicion de limpieza no contiene fosfato;

[0018] En algunos casos, la composicion es una composicion de limpieza para la colada lfquida o una composicion de limpieza para la colada en polvo.

[0019] En algunos casos, la composicion es una composicion de limpieza potenciadora para colada, una composicion de limpieza para colada aditiva, o una composicion de limpieza de pretratamiento para colada.

[0020] En algunos casos, la composicion es una composicion de limpieza de lentes de contacto.

[0021] En algunos casos, la composicion no es una composicion para el lavado de la vajilla de forma automatica.

[0022] En algunos casos, la composicion de la invencion comprende al menos una enzima adicional, opcionalmente donde la al menos una enzima adicional, opcionalmente dos o mas enzimas adicionales, se selecciona(n) del grupo que consta de hemicelulasa, celulasa, amilasa, peroxidasa, proteasa, xilanasa, lipasa, fosfolipasa, esterasa, cutinasa, pectinasa, pectato liasa, mananasa, queratinasa, reductasa, oxidasa, fenoloxidasa, lipoxigenasa, ligninasa, pululanasa, tanasa, pentosanasa, malanasa, 13-glucanasa, arabinosidasa, hialuronidasa, condroitinasa y lacasa.

[0023] En un tercer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para limpiar un artfculo o una

superficie que necesite limpiarse, comprendiendo el metodo el contacto del artfculo o de la superficie con una

variante de proteasa del primer aspecto de la invencion o una composicion del segundo aspecto de la invencion, opcionalmente donde el metodo comprende tambien enjuagar el artfculo o la superficie con agua.

[0024] En un cuarto aspecto, la presente invencion proporciona acido nucleico aislado que comprende una

secuencia de polinucleotidos que codifica la variante de proteasa del primer aspecto de la invencion.

[0025] En un quinto aspecto, la presente invencion proporciona un vector de expresion que comprende al menos un acido nucleico del cuarto aspecto de la invencion, opcionalmente donde el al menos un acido nucleico se encuentra ligado de forma operativa a un promotor.

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[0026] En un sexto aspecto, la presente invencion proporciona una celula huesped recombinante que comprende el vector de expresion del quinto aspecto de la invencion o el acido nucleico del cuarto aspecto a de la invencion o la variante de proteasa del primer aspecto de la invencion, opcionalmente donde:

la celula huesped es una celula bacteriana; la celula huesped es una celula de Bacillus; o la celula huesped es una celula de Bacillus subtilis.

[0027] En un septimo aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para producir una variante de proteasa, comprendiendo el metodo el cultivo de la celula huesped recombinante del sexto aspecto de la invencion en condiciones propicias para la produccion de la variante de proteasa, comprendiendo el metodo opcionalmente tambien la recuperacion de la variante de proteasa del cultivo.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

[0028]

La figura 1 presenta un alineamiento de la secuencia de aminoacidos madura de la subtilisina GG36 de B. lentus, la secuencia de aminoacidos madura de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens, y las secuencias de aminoacidos de los ejemplos de polipeptidos de variantes de proteasas de la invencion designados como PX3, PX4 y PX5, respectivamente.

La figura 2 proporciona un mapa de plasmido del plasmido de expresion pHPLT-GG36 de B. subtilis. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0029] La presente invencion proporciona variantes de proteasas, tal como se encuentran definidas en las reivindicaciones, que son especialmente adecuadas y utiles para una variedad de aplicaciones de limpieza. En un aspecto, la invencion incluye composiciones que comprenden al menos una de las variantes de proteasas (p. ej., variantes de subtilisinas) expuestas en el presente documento. Algunas de dichas composiciones comprenden composiciones detergentes. En un aspecto, la invencion proporciona variantes de subtilisinas de especies de Bacillus y composiciones que comprenden una o mas de dichas variantes de subtilisinas. La invencion tambien proporciona composiciones enzimaticas, segun se define en las reivindicaciones, que tienen una eficacia de lavado comparable o mejorada en comparacion con las proteasas conocidas, como, p. ej., las serina proteasas y/o las subtilisina proteasas conocidas.

[0030] Salvo se indique de otro modo, la practica de la presente invencion conlleva tecnicas convencionales utilizadas comunmente en biologfa molecular, microbiologfa, purificacion de protemas, ingeniena de protemas, secuenciacion de protemas y ADN, campos de ADN recombinante, y utilizacion y desarrollo de enzimas industriales, todos los cuales se encuentran en el ambito de especializacion.

[0031] Asimismo, los encabezados proporcionados en la presente memoria no constituyen limitaciones a los diversos aspectos o formas de realizacion de la invencion, que pueden tomarse por referencia a la memoria en su conjunto. Por consiguiente, los terminos que se definen inmediatamente a continuacion se definen de forma mas completa con referencia a la memoria en su conjunto. No obstante, con el fin de facilitar la comprension de la invencion, posteriormente se proporcionan definiciones para un numero de terminos.

[0032] Salvo que se defina de otro modo en el presente texto, todos los terminos tecnicos y cientfficos tienen en el presente texto el mismo significado que el que entienden comunmente los expertos en la materia a la que pertenece esta invencion. Aunque en la practica de la presente exposicion se pueden utilizar muchos metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, aqrn se describen algunos metodos y materiales. Por consiguiente, los terminos que se definen inmediatamente a continuacion se describen de forma mas completa con referencia a la memoria en su conjunto. Asimismo, en el sentido en que se usan en la presente memoria, los terminos singulares «un», «una», «el» y «la» incluyen la referencia al plural salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Salvo que se indique de otro modo, los acidos nucleicos estan escritos de izquierda a derecha en una orientacion de 5' a 3'; las secuencias de aminoacidos estan escritas de izquierda a derecha en una orientacion de amino a carboxi, respectivamente. Ha de entenderse que la presente invencion no se limita a la metodologfa, los protocolos y los reactivos espedficos aqrn descritos, dado que estos pueden variar dependiendo del contexto en el que los utilizan los expertos en la materia.

[0033] Se pretende que cada limitacion numerica maxima proporcionada a lo largo de la presente memoria incluya cada limitacion numerica inferior, como si dichas limitaciones numericas inferiores se encontrasen expresamente escritas en el presente documento. Todo lfmite numerico mmimo dado a lo largo de esta memoria incluira todo lfmite numerico superior, como si dichos lfmites numericos superiores estuvieran escritos expresamente en el presente texto. Todo intervalo numerico dado a lo largo de esta memoria incluira todo intervalo numerico mas reducido que se encuentre dentro de dicho intervalo numerico mas amplio, como si dichos intervalos numericos mas reducidos estuvieran escritos expresamente en el presente texto.

[0034] Una proteasa (tambien conocida como una proteinasa) es una protema enzimatica que tiene la capacidad de descomponer otras protemas. Una proteasa tiene la capacidad de llevar a cabo la proteolisis, que da

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comienzo al catabolismo proteico mediante la hidrolisis de enlaces peptfdicos que unen los aminoacidos en una cadena peptidica o polipeptfdica que constituye la protema. Esta actividad de una proteasa como una enzima digestiva de protemas se denomina actividad proteolftica. Existen muchos procedimientos ampliamente conocidos para medir la actividad proteolftica (Kalisz, "Microbial Proteinases," En: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, (1988)). Por ejemplo, la actividad proteolftica puede determinarse mediante ensayos comparativos que analizan la capacidad de respectivas proteasas de hidrolizar un sustrato comercial. Los ejemplos de sustratos utiles para el analisis de la actividad de proteasa o proteolftica incluyen, sin caracter limitativo, dimetil caserna (Sigma C-9801), colageno bovino (Sigma C-9879), elastina bovina (Sigma E- 1625) y queratina bovina (ICN Biomedical 902111). Los ensayos colorimetricos que utilizan estos sustratos son ampliamente conocidos en el ambito de especializacion (vease, p.ej., WO 99/34011 y la patente de los Estados Unidos con numero 6,376,450). El ensayo pNA (vease, p. ej., Del Mar et al., Anal. Biochem. 99:316-320 (1979)) tambien puede utilizarse para determinar la concentracion de enzima activa para fracciones recogidas durante elucion en gradiente. Este ensayo mide el mdice al que se libera p-nitroanilina a medida que la enzima hidroliza el sustrato sintetico soluble, succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA). El mdice de produccion de color amarillo a partir de la reaccion de hidrolisis se mide a 410 nm en un espectrofotometro y es proporcional a la concentracion de enzima activa. Ademas, pueden utilizarse mediciones de absorbencia a 280 nanometros (nm) para determinar la concentracion de protema total. La ratio de enzima activa/protema total proporciona la pureza de la enzima.

[0035] Tal como se utilizan en el presente documento, «subtilisina» y «subtilisina proteasa» se refieren a cualquier miembro de la familia de serina proteasa S8 tal como se describe en la base de datos de peptidasas MEROPS - The Peptidase Database (Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucl. Acids Res. 34 Database issue, D270-272 (2006)). Tal como se describe en dicha base de datos, la familia de peptidasas S8 contiene la subtilisina serina endopeptidasa y sus homologos (Biochem. J. 290:205-218 (1993)). La familia S8, tambien conocida como la familia subtilasa, es la segunda familia mas grande de serina peptidasas. Recientemente, se han determinado las estructuras terciarias de varios miembros de la familia S8. Una estructura de protema S8 tfpica consta de tres capas con una lamina p de siete cadenas colocada entre dos capas de helices. La subtilisina (S08.001) es la estructura tipo del clan SB (SB). A pesar de la estructura distinta, los sitios activos de subtilisina y quimotripsina (S01.001) pueden superponerse, lo que sugiere que la similaridad es el resultado de una evolucion convergente en lugar de divergente. Muchas especies de Bacillus (Bacillus sp.) secretan grandes cantidades de subtilisinas. Tal como se emplean en el presente documento, los terminos «variante de proteasa» y «mutante de proteasa» se utilizan indistintamente en referencia a una proteasa que difiere en la secuencia de aminoacidos con respecto a la secuencia de aminoacidos de una proteasa de referencia (que puede ser una proteasa natural) en al menos un aminoacido, como en al menos una sustitucion, delecion o adicion de aminoacido. La actividad proteolftica de una variante de proteasa o mutante de proteasa puede determinarse utilizando procedimientos ampliamente conocidos en el ambito de especializacion y/o descritos en el presente documento.

[0036] Tal como se emplean en el presente documento, los terminos «variante de subtilisina» y «mutante de subtilisina» se utilizan indistintamente en referencia a una subtilisina proteasa que difiere en la secuencia de aminoacidos con respecto a la secuencia de aminoacidos de una subtilisina proteasa de referencia (que puede ser una subtilisina proteasa natural) en al menos un aminoacido, como en al menos una sustitucion, delecion o adicion de aminoacido. La actividad proteolftica de una variante de subtilisina o mutante de subtilisina puede determinarse utilizando procedimientos ampliamente conocidos en el ambito de especializacion y/o descritos en el presente documento.

[0037] Tal como se emplea en el presente documento, el genero "Bacillus" incluye todas las especies del genero Bacillus, tal como los conocen los expertos en la materia, incluidos, sin caracter limitativo, p. ej., B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, y B. thuringiensis. Se reconoce que el genero Bacillus continua siendo objeto de reorganizacion taxonomica. En consecuencia, se pretende que el genero incluya las especies que han sido reclasificadas, entre las que se incluyen, sin caracter limitativo, organismos como B. stearothermophilus, ahora denominado «Geobacillus stearothermophilus». La produccion de endosporas resistentes en presencia de oxfgeno se considera un rasgo definitorio del genero Bacillus, aunque esta caractenstica tambien se aplica a los recientemente denominados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus, y Virgibacillus.

[0038] Los terminos «polinucleotido» y «acido nucleico», que se utilizan indistintamente en el presente documento, se refieren a un poftmero de cualquier longitud de monomeros nucleotfdicos unidos de forma covalente en una cadena. El ADN (acido desoxirribonucleico), un polinucleotido que comprende desoxirribonucleotidos, y el ARN, (acido ribonucleico), un poftmero de ribonucleotidos, son ejemplos de polinucleotidos o acidos nucleicos que tienen distinta funcion biologica. Los polinucleotidos o los acidos nucleicos incluyen, sin caracter limitativo, aDn monocatenario, bicatenario o tricateniario, ADN genomico, ADNc, ARN, ADN-ARN hftbrido, o un poftmero que comprende bases de purinas y pirimidinas, u otras bases nucleotidicas naturales, modificadas qmmicamente o bioqmmicamente, no naturales o derivadas. A continuacion se presentan

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ejemplos no limitativos de polinucleotidos: genes, fragmentos de genes, fragmentos cromosomicos, marcador(es) de secuencia expresada (EST, por sus siglas en ingles), exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosomico (ARNr), ribozimas, ADN complementario (ADNc), polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de acido nucleico y cebadores. En algunos modos de realizacion, los polinucleotidos comprenden nucleotidos modificados, como nucleotidos metilados y nucleotidos analogos, uracilo, otros azucares y grupos de enlace como fluororribosa y tioato, y ramificaciones nucleotidicas. En un modo de realizacion concreto, una secuencia de nucleotidos esta interrumpida por componentes no nucleotidicos.

[0039] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «vector» se refiere a un constructo de acido nucleico o un constructo polinucleotfdico utilizado para introducir o transferir acido(s) nucleico(s) o polinucleotido(s) en un tejido o una celula diana. Normalmente se utiliza un vector para introducir ADN extrano en otro tejido o celula. Por lo general, un vector comprende una secuencia de aDn que es un transgen y una secuencia polinucleotidica mayor que sirve como «columna vertebral» del vector. El vector sirve normalmente para transferir informacion genetica, como el transgen insertado, a un tejido o una celula diana con el fin de aislar, multiplicar o expresar el inserto en el tejido o la celula diana. Los vectores incluyen plasmidos, vectores de clonacion, bacteriofagos, virus (p. ej., vector viral), cosmidos, vectores de expresion, vectores transportadores, casetes, y similares. Un vector incluye normalmente un origen de replicacion, un sitio de clonacion multiple y un marcador de seleccion. El proceso de insertar un vector en una celula diana se denomina normalmente transfeccion. La transfeccion de una celula con un vector viral se denomina normalmente transduccion. La presente invencion incluye, en un aspecto, un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de proteasa (p. ej., una variante de proteasa precursora o madura) que se encuentra ligada de forma operativa a una prosecuencia adecuada (p. ej., secretora, secuencia de peptido senal, etc.) capaz de efectuar la expresion de la secuencia de ADN en un huesped adecuado.

[0040] Tal como se utiliza en el presente documento, los terminos «casete de expresion» o «vector de expresion» se refieren a un vector o un constructo de acido nucleico generado de forma recombinante o sintetica para la expresion de un acido nucleico de interes (p. ej., un transgen o un acido nucleico extrano) en una celula diana. El acido nucleico de interes expresa normalmente una protema de interes. Un vector de expresion o casete de expresion comprende normalmente una secuencia nucleotfdica promotora que dirige o promueve la expresion del acido nucleico extrano. El vector o casete de expresion tambien incluye normalmente y otros elementos de acido nucleico espedficos que permiten la transcripcion de un acido nucleico concreto en una celula diana. Un casete de expresion recombinante se puede incorporar en un plasmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plastidial, virus o fragmento de acido nucleico. Algunos vectores de expresion tienen la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterologo en una celula huesped. Muchos vectores de expresion procariotas y eucariotas estan comercialmente disponibles. La seleccion de vectores de expresion adecuados esta dentro del conocimiento de los expertos en la materia. La seleccion de vectores de expresion apropiados para la expresion de una protema a partir de una secuencia de acido nucleico incorporada en el vector de expresion se encuentra incluida en los conocimientos de los expertos en la materia.

[0041] Un constructo de ADN es un segmento de acido nucleico construido de forma artificial que puede introducirse en una celula o tejido diana. Normalmente, un constructo de ADN comprende un inserto de ADN que comprende una secuencia nucleotidica que codifica una protema de interes que ha sido subclonada en un vector. El vector puede contener genes de resistencia bacteriana para su cultivo en bacterias y un promotor para la expresion de la protema de interes en un organismo. El ADN puede generarse in vitro mediante PCR o cualquier otra tecnica conocida por los expertos en la materia. En algunos modos de realizacion, el constructo de ADN comprende una secuencia de acido nucleico de interes. En algunos modos de realizacion, la secuencia se encuentra ligada de forma operativa a elementos adicionales, como elementos de control (p. ej., promotores, etc.). El constructo de ADN puede comprender tambien un marcador de seleccion y puede comprender tambien una secuencia de entrada flanqueada por cajas de homologfa. El constructo puede comprender otras secuencias no homologas, anadidas a los extremos (p. ej., secuencias o flancos de relleno). En algunos modos de realizacion, los extremos de la secuencia estan cerrados, de forma que el constructo de ADN forma un drculo cerrado. La secuencia de acido nucleico de interes, que se incorpora en el constructo de ADN utilizando tecnicas ampliamente conocidas en el ambito de especializacion, puede ser un acido nucleico natural, mutante o modificado. En algunos modos de realizacion, el constructo de ADN comprende una o mas secuencias de acido nucleico homologas al cromosoma de la celula huesped. En otros modos de realizacion, el constructo de ADN comprende una o mas secuencias nucleotidicas no homologas. Una vez el constructo de ADN se ensambla in vitro puede utilizarse, por ejemplo, para: 1) insertar secuencias heterologas en una secuencia diana deseada de una celula huesped; y/o 2) mutagenizar una region del cromosoma de la celula huesped (esto es, sustituir una secuencia endogena por una secuencia heterologa); 3) delecionar los genes diana; y/o 4) introducir un plasmido de replicacion en el huesped. En el presente documento, «constructo de ADN» se emplea de manera intercambiable con «casete de expresion».

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[0042] Tal como se utiliza en el presente documento, un «plasmido» se refiere a una molecula de ADN extracromosomico que es capaz de replicarse de forma independiente del ADN cromosomico. Un plasmido es bicatenario y puede ser circular, y se utiliza normalmente como un vector de clonacion.

[0043] Tal como se utiliza en el presente documento en el contexto de introducir una secuencia de acido nucleico en una celula, el termino «introducido/a(s)» se refiere a cualquier metodo adecuado para transferir la secuencia de acido nucleico en la celula. Dichos metodos de introduccion incluyen, sin caracter limitativo, transfeccion, transformacion, electroporacion, conjugacion, transduccion y fusion de protoplastos (vease, p. ej., Ferrari et al., "Genetics," en Hardwood et al. (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pp. 57-72 (1989)).

[0044] Transformacion se refiere a la alteracion genetica de una celula que resulta de la absorcion, la incorporacion genomica y la expresion de material genetico (p. ej., ADN).

[0045] Tal como se utiliza en el presente documento, un acido nucleico esta «ligado de forma operativa» con otra secuencia de acido nucleico cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se encuentra ligado de forma operativa a una secuencia que codifica nucleotidos si el promotor afecta a la transcripcion de la secuencia codificante. Un sitio de union al ribosoma puede encontrarse ligado de forma operativa a una secuencia codificante si se posiciona de forma que facilite la traduccion de la secuencia codificante. Normalmente, las secuencias de ADN «ligadas de forma operativa» son contiguas. No obstante, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La union se consigue mediante la ligadura en sitios de restriccion convenientes. Si dichos sitios no existen, pueden utilizarse enlazadores o adaptadores oligonucleotidos sinteticos segun la practica convencional.

[0046] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «gen» se refiere a un polinucleotido (p. ej., un segmento de ADN) que codifica un polipeptido e incluye regiones anteriores y posteriores a las regiones codificantes, asf como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

[0047] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «recombinante», cuando se emplea en referencia a una celula, indica normalmente que la celula se ha modificado mediante la introduccion de una secuencia de acido nucleico heterologo o que la celula se deriva de una celula modificada de esta forma. Por ejemplo, una celula recombinante puede comprender un gen que no se encuentre de forma identica en la forma nativa (no recombinante) de la celula, o una celula recombinante puede comprender un gen nativo (encontrado en la forma nativa de la celula), pero que haya sido modificado y reintroducido en la celula. Una celula recombinante puede comprender un acido nucleico endogeno a la celula que haya sido modificado sin extraer el acido nucleico de la celula; dichas modificaciones incluyen las obtenidas por sustitucion alelica, mutacion dirigida y tecnicas relacionadas conocidas por los expertos en la materia. La tecnologfa de ADN recombinante incluye tecnicas para la produccion de ADN recombinante in vitro y la transferencia del ADN recombinante a celulas donde puede expresarse o propagarse, produciendo asf un polipeptido recombinante. «Recombinacion», «que recombina(n)» y «recombinado/a(s)», en referencia a polinucleotidos o acidos nucleicos, se refieren por lo general al ensamblaje o la combinacion de dos o mas cadenas o fragmentos de acidos nucleicos o polinucleotidos para generar un nuevo polinucleotido o acido nucleico. En ocasiones, el polinucleotido o acido nucleico recombinante se denomina quimera. Un acido nucleico o polipeptido es «recombinante» cuando es artificial o modificado, o se deriva de una protema o acido nucleico artificial o modificado.

[0048] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «amplificacion» genetica o de acidos nucleicos se refiere a un proceso mediante el cual se replican de forma desproporcionada secuencias de ADN espedficas de forma que el gen o el acido nucleico amplificado se encuentra en un numero de copias mas elevado al que se encontraba inicialmente en el genoma. En algunos modos de realizacion, la seleccion de celulas por cultivo en presencia de una droga (p. ej., un inhibidor de una enzima que puede inhibirse) tiene como resultado la amplificacion bien del gen endogeno que codifica el producto genico necesario para el cultivo en presencia de la droga, bien la amplificacion de secuencias exogenas (p. ej., entrada) que codifican este producto genico o de acido nucleico, o ambas.

[0049] La «amplificacion» es un caso especial de replicacion de acido nucleico que implica especificidad de molde. Ha de contrastarse con la replicacion de molde no espedfico (es decir, replicacion que depende de un molde pero que no depende de un molde espedfico). La especificidad de molde se distingue aqrn de la fidelidad de replicacion (es decir, la smtesis de la secuencia de polinucleotidos apropiada) y de la especificidad nucleotfdica (ribo o desoxirribo). La especificidad de molde se describe frecuentemente en terminos de especificidad de «diana». Las secuencias diana son «dianas» en el sentido de que se busca diferenciarlas de otros acidos nucleicos. Las tecnicas de amplificacion se han disenado principalmente para esta diferenciacion.

[0050] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «cebador» se refiere a un oligonucleotido (un polfmero de residuos nucleotfdicos), bien de origen natural, como en una digestion de restriccion purificada, bien producido de forma sintetica, que es capaz de actuar como punto de iniciacion de smtesis cuando se pone en condiciones en las que se induce la smtesis de un producto de extension de cebador que es complementario a una cadena de acido nucleico (esto es, en presencia de nucleotidos y un agente inductor como ADN polimerasa y a una temperatura y un pH adecuados). Preferiblemente, un cebador es monocatenario para conseguir una maxima eficiencia en la amplificacion, pero de forma alternativa puede ser bicatenario. Si es bicatenario, en

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primer lugar se trata el cebador para separar sus hebras antes de utilizarse para preparar productos de extension. En un aspecto, el cebador es un oligodesoxirribonucleotido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la smtesis de productos de extension en presencia del agente inductor. La longitud exacta de un cebador depende de una variedad de factores, entre los que se incluyen la temperature, la fuente del cebador y el uso del metodo.

[0051] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «sonda» se refiere a un oligonucleotido, bien de origen natural, como en una digestion de restriccion purificada, bien producido de forma sintetica, de forma recombinante o mediante amplificacion por PCR, que es capaz normalmente de hibridar a otro oligonucleotido de interes. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas resultan de utilidad en la deteccion, identificacion y aislamiento de secuencias de genes concretas. Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invencion estara marcada con cualquier «molecula informadora» de modo que sea detectable en cualquier sistema de deteccion, entre los que se incluyen, sin caracter limitativo, sistemas enzimaticos (por ejemplo, ELISA, asf como ensayos histoqmmicos basados en enzimas), fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invencion este limitada a ningun sistema de deteccion ni marca en concreto.

[0052] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «diana», cuando se emplea en referencia a la reaccion en cadena de la polimerasa, se refiere a la region de acido nucleico limitada por los cebadores utilizada para la reaccion en cadena de la polimerasa. Por tanto, se busca diferenciar la «diana» de otras secuencias de acido nucleico. Un «segmento» nucleotfdico es una region de un acido nucleico dentro de la secuencia de acido nucleico diana.

[0053] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «reaccion en cadena de la polimerasa» (PCR, por sus siglas en ingles) se refiere a los metodos de las patentes de los Estados Unidos con numero 4,683,195, 4,683,202 y 4,965,188, que incluyen metodos para incrementar la concentracion de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genomico sin clonacion o purificacion. Este proceso para amplificar la secuencia diana es ampliamente conocido en el ambito de especializacion.

[0054] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «reactivos de amplificacion» se refiere a aquellos reactivos (p. ej., desoxirribonucleotidos trifosfatos, tampon, etc.), necesarios para la amplificacion salvo los cebadores, el molde de acido nucleico y la enzima de amplificacion. Normalmente, los reactivos de amplificacion junto con los demas componentes de reaccion estan dispuestos y contenidos en un recipiente de reaccion (tubo de ensayo, micropocillo, etc.).

[0055] Tal como se utiliza en el presente documento, los terminos «endonucleasa de restriccion» o «enzima de restriccion» se refieren a una enzima (p. ej., una enzima bacteriana) que es capaz de cortar ADN monocatenario o bicatenario en una secuencia espedfica de nucleotidos conocida como sitio de restriccion, o cerca de la misma. La secuencia nucleotfdica que comprende el sitio de restriccion es reconocida y escindida por una endonucleasa de restriccion o enzima de restriccion determinada y, con frecuencia, es el sitio de insercion de fragmentos de ADN. Un sitio de restriccion puede convertirse en un vector de expresion o constructo de ADN.

[0056] «Recombinacion homologa» se refiere al intercambio de fragmentos de ADN entre dos moleculas de ADN o cromosomas apareados en el sitio de secuencias nucleotfdicas identicas o casi identicas. En algunos modos de realizacion, la integracion cromosomica es recombinacion homologa.

[0057] Se dice que un acido nucleico o polinucleotido «codifica» un polipeptido si, en su estado nativo o cuando es manipulado mediante metodos conocidos por los expertos en la materia, puede ser transcrito y/o traducido para producir el polipeptido o un fragmento del mismo. Tambien se dice que la cadena antisentido de dicho acido nucleico codifica la secuencia.

[0058] Como se conoce en el ambito de especializacion, una secuencia de ADN puede ser transcrita mediante un ARN polimerasa para producir una secuencia de ARN, pero una secuencia de ARN puede ser retrotranscrita mediante retrotranscriptasa para producir una secuencia de ADN.

[0059] «Cepa huesped» o «celula huesped» se refieren a un huesped adecuado para un vector de expresion que comprende una secuencia de ADN de interes. La secuencia de ADN de interes puede expresar una protema de interes en la cepa huesped o celula huesped.

[0060] Una «protema» o «polipeptido» comprende una secuencia polimerica de residuos de aminoacidos. Los terminos «protema» y «polipeptido» se utilizan indistintamente en el presente documento. En la presente exposicion, se emplea el codigo de tres letras para los aminoacidos definido de conformidad con la comision sobre nomenclatura bioqmmica denominada Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) de la IUPAC-IUB. Tambien se entiende que un polipeptido puede estar codificado por mas de una secuencia nucleotfdica debido a la degeneracion del codigo genetico.

[0061] Una «prosecuencia» o «secuencia propeptfdica» se refiere a una secuencia de aminoacidos entre la secuencia de peptido senal y la secuencia de proteasa madura que es necesaria para la secrecion de la

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proteasa. La escision de la prosecuencia o secuencia propeptidica tiene como resultado la proteasa activa madura.

[0062] Los terminos «secuencia senal» o «peptido senal» se refieren a una secuencia de residuos de aminoacidos que puede participar en la secrecion o transporte directo de la forma precursora o madura de una protema. La secuencia senal se ubica normalmente en el extremo N-terminal con respecto a la secuencia de protemas precursora o madura. La secuencia senal puede ser endogena o exogena. Un ejemplo de secuencia senal exogena comprende los siete primeros residuos de aminoacidos de la secuencia senal de la subtilisina de Bacillus subtilis fusionada con lo restante de la secuencia senal de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536). Normalmente, una secuencia senal esta ausente de la protema madura. Normalmente, una secuencia senal se escinde de la protema mediante una peptidasa senal despues de que la protema se haya transportado.

[0063] El termino «secuencia senal hnbrida» se refiere a las secuencias senal en las que parte de la secuencia se obtiene del huesped de expresion fusionado con la secuencia senal del gen que se va a expresar. En algunos modos de realizacion, se utilizan secuencias sinteticas.

[0064] El termino forma «madura» de una protema, un polipeptido o un peptido se refiere a la forma funcional de la protema, el polipeptido o el peptido sin la secuencia de peptido senal y la secuencia propeptfdica.

[0065] El termino forma «precursora» de una protema o un peptido se refiere a una forma madura de la protema que tiene una prosecuencia ligada de forma operativa al extremo amino o carbonilo terminal de la protema. El precursor tambien puede tener una secuencia «senal» ligada de forma operativa al extremo amino terminal de la prosecuencia. El precursor tambien puede tener polinucleotidos adicionales que participan en la actividad posterior a la traduccion (p. ej., polinucleotidos escindidos del mismo para dejar la forma madura de una protema o peptido).

[0066] El termino «natural», en referencia a una secuencia de aminoacidos o una secuencia de acido nucleico, indica que la secuencia de aminoacidos o la secuencia de acido nucleico es una secuencia nativa o de origen natural.

[0067] Tal como se utiliza en el presente documento con respecto a posiciones de residuos de aminoacidos, los terminos «correspondiente(s) a», «que corresponde(n) a» y «corresponde(n)» se refieren a un residuo de aminoacido en la posicion enumerada en una protema o un peptido, o un residuo de aminoacido que es analogo, homologo o equivalente a un residuo enumerado en una protema o un peptido. Tal como se utiliza en el presente documento, «region correspondiente» se refiere por lo general a una posicion analoga a lo largo de protemas relacionadas o una protema de referencia.

[0068] Los terminos «derivado/a(s) de» y «obtenido/a(s) de» se refieren no solo a una proteasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestion, sino tambien una proteasa codificada por una secuencia de ADN aislada de dicha cepa y producida en un organismo huesped que contiene dicha secuencia de ADN. De forma adicional, los terminos se refieren a una proteasa codificada por una secuencia de ADN de origen ADNc y/o sintetico y que tiene las caractensticas identificativas de la proteasa en cuestion. A modo de ejemplo, «proteasas derivadas de Bacillus» se refiere a aquellas enzimas con actividad proteolftica que son producidas de forma natural por Bacillus, asf como a las serina proteasas, como las producidas por fuentes de Bacillus, pero que son producidas mediante el uso de tecnicas de ingeniena genetica por organismos no Bacillus transformados con un acido nucleico que codifica las serina proteasas.

[0069] El termino «identico/a(s)», en el contexto de dos acidos nucleicos o secuencias polipeptfdicas, se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para correspondencia maxima, medida esta mediante uno de los siguientes algoritmos de analisis o comparacion de secuencias.

[0070] Tal como se utiliza en el presente documento, «genes homologos» se refiere a un par de genes de especies diferentes, pero normamente relacionadas, que se corresponden entre sf y que son identicos o muy similares entre sf. El termino abarca genes que estan separados por especiacion (es decir, el desarrollo de nuevas especies) (p. ej., genes ortologos), asf como genes que se han separado por duplicacion genetica (p. ej., genes paralogos).

[0071] Tal como se utiliza en el presente documento, «homologfa» se refiere a similaridad o identidad de secuencia, prefiriendose identidad. La homologfa puede determinarse utilizando tecnicas estandar conocidas en el ambito de especializacion (vease, p.ej., Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); programas de software como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA del paquete de software Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI); y Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387-395 (1984)). Un ejemplo de algoritmo util es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento multiple de secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineamientos progresivos por pares. Tambien puede trazar un arbol que muestre las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento. PILEUP utiliza una simplificacion del metodo de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)). El metodo es similar al descrito por Higgins y Sharp (Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)). Unos parametros utiles de PILEUP incluyen un peso de hueco por defecto de 3.00, un peso de longitud de hueco por defecto de

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0.10 y huecos de extremo ponderados. Otro ejemplo de algoritmo util es el algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, (1990); y Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Un programa BLAST especialmente util es el programa WU-BLAST-2 (Altschul et al., Meth. Enzymol. 266:460-480 (1996)). WU-BLAST-2 utiliza varios parametros de busqueda, la mayona de los cuales se establecen en los valores por defecto. Los parametros ajustables se establecen con los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1, fraccion de solapamiento = 0.125, umbral de palabra (T) = 11. Los parametros HSP S y HSP S2 son valores dinamicos y son establecidos por el propio programa dependiendo de la composicion de la secuencia concreta y de la composicion de la base de datos concreta en la que se esta buscando la secuencia de interes. No obstante, los valores pueden ajustarse para incrementar la sensibilidad.

[0072] El porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia de referencia u una secuencia de prueba de interes puede determinarse facilmente por un experto en la materia. El porcentaje de identidad compartido por las secuencias polipeptfdicas o polinucleotfdicas se determina por comparacion directa de la informacion de la secuencia entre las moleculas mediante el alineamiento de las secuencias y la determinacion de la identidad por metodos conocidos en el ambito de especializacion. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990). El software para llevar a cabo los analisis BLAST esta disponible publicamente en el National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencias de alta puntuacion (HSP, por sus siglas en ingles) mediante la identificacion de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coincidan o cumplan con alguna puntuacion umbral T con valor positivo cuando se alineen con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Estas coincidencias de palabras iniciales proximas actuan como puntos de partida para encontrar pares de secuencias de alta puntuacion mas largas que las contengan. Las coincidencias de palabras se expanden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las dos secuencias que se comparan hasta donde se pueda aumentar la puntuacion de alineamiento acumulativa. La extension de las coincidencias de palabras se detiene cuando: la puntuacion de alineamiento acumulativa disminuye en la cantidad X a partir de un valor maximo conseguido; la puntuacion acumulativa es cero o inferior; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parametros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)) alineamientos (B) de 50, expectacion (E) de 10, M'5, N'-4, y una comparacion de ambas cadenas.

[0073] El algoritmo BLAST realiza a continuacion un analisis estadfstico de la similitud entre las dos secuencias (vease, p. ej., Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad por la que un emparejamiento entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos ocurrina al azar. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a un acido nucleico de serina proteasa de la presente invencion si la probabilidad de suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de prueba con respecto a un acido nucleico de serina proteasa es inferior a aproximadamente 0,1, mas preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01 y siendo lo mas preferible inferior a aproximadamente 0,001. Cuando el acido nucleico de prueba codifica un polipeptido de serina proteasa, se lo considera similar a un acido nucleico de serina proteasa concreto si la comparacion tiene como resultado una probabilidad de suma mas pequena inferior a aproximadamente 0,5 y mas preferiblemente inferior a aproximadamente 0,2.

[0074] Por ciento «identico» o «de identidad», en el contexto de dos o mas secuencias de acidos nucleicos o polipeptidos, se refiere a dos o mas secuencias que son iguales o que tienen un porcentaje espedfico de residuos de acidos nucleicos o residuos de aminoacidos, respectivamente, cuando se comparan y se alinean para similaridad maxima, segun se determine utilizando un algoritmo de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual. «Por ciento de identidad de secuencia» o «% de identidad» o «% de identidad de secuencia» o «% de identidad de secuencia de aminoacidos» de una secuencia de aminoacidos sujeto con respecto a una secuencia de aminoacidos de referencia (es decir, de consulta) significa que la secuencia de aminoacidos sujeto es identica (es decir, aminoacido a aminoacido) en un porcentaje espedfico con respecto a la secuencia de aminoacidos de consulta a lo largo de una longitud de comparacion cuando las secuencias estan alineadas de forma optima. En consecuencia, un 80 % de identidad de secuencia de aminoacidos o un 80 % de identidad en lo que respecta a dos secuencias de aminoacidos significa que el 80 % de los residuos de aminoacidos en dos secuencias de aminoacidos alineadas de forma optima son identicos.

[0075] «Por ciento de identidad de secuencia» o «% de identidad» o «% de identidad de secuencia» o «% de identidad de secuencia de nucleotidos» de una secuencia de acidos nucleicos sujeto con respecto a una secuencia de acidos nucleicos de referencia (es decir, de consulta) significa que la secuencia de acidos nucleicos sujeto es identica (es decir, nucleotido a nucleotido para una secuencia polinucleotfdica) en un porcentaje espedfico con respecto a la secuencia de consulta a lo largo de una longitud de comparacion cuando las secuencias estan alineadas de forma optima. En consecuencia, un 80 % de identidad de secuencia de nucleotidos o un 80 % de identidad en lo que respecta a dos secuencias de acidos nucleicos significa que el 80 % de los residuos de nucleotidos en dos secuencias de acidos nucleicos alineadas de forma optima son identicos.

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[0076] En un aspecto, el porcentaje de identidad de secuencia o «% de identidad de secuencia» o «% de identidad» de una secuencia sujeto con respecto a una secuencia de consulta puede calcularse alineando de forma optima las dos secuencias y comparando las dos secuencias alineadas de forma optima a lo largo de una longitud de comparacion. Se determina el numero de posiciones en el alineamiento optimo en las que se dan residuos identicos en ambas secuencias, proporcionando asf el numero de posiciones emparejadas, y entonces se divide el numero posiciones emparejadas entre el numero total de posiciones de la longitud de comparacion (que, a menos que se especifique otra cosa, es la longitud de la secuencia de consulta). El numero resultante se multiplica por l0o para obtener el porcentaje de identidad de secuencia de la secuencia sujeto con respecto a la secuencia de consulta.

[0077] Los terminos «alineamiento optimo» o «alineado/a(s) de forma optima» se refieren al alineamiento de dos (o mas) secuencias que tienen la puntuacion mas alta de porcentaje de identidad. Por ejemplo, el alineamiento optimo de dos secuencias de protemas puede obtenerse alineando de forma manual las secuencias de forma que se alinee el maximo numero de residuos de aminoacidos identicos en cada secuencia o utilizando programas de software o procedimientos descritos en el presente documento o conocidos en el ambito de especializacion. El alineamiento optimo de dos secuencias de acidos nucleicos puede obtenerse alineando de forma manual las secuencias de forma que se alinee el maximo numero de residuos de nucleotidos identicos en cada secuencia o utilizando programas de software o procedimientos descritos en el presente documento o conocidos en el ambito de especializacion.

[0078] En un aspecto de ejemplo, dos secuencias polipeptfdicas se consideran «alineadas de forma optima» cuando se alinean utilizando distintos parametros, como una matriz de sustitucion de aminoacidos definida, una penalizacion por existencia de hueco (tambien denominada penalizacion por hueco abierto) y una penalizacion por extension de hueco, con el fin de conseguir la maxima puntuacion de similaridad posible para dicho par de secuencias. La matriz de puntuacion de BLOSUM62 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10915 (1992)) suele utilizarse como matriz de sustitucion de puntuacion por defecto en algoritmos de alineamiento de secuencias de polipeptidos (como BLASTP). La penalizacion por existencia de hueco se impone para la introduccion de un solo hueco de aminoacido en una de las secuencias alineadas, y la penalizacion por extension de hueco se impone para cada posicion de residuo en el hueco. Algunos ejemplos de parametros de alineamiento utilizados son: Matriz de puntuacion de BLOSUM62, penalizacion por existencia de hueco =11 y penalizacion por extension de hueco =1. La puntuacion del alineamiento se define por las posiciones de aminoacidos de cada secuencia en las que el alineamiento empieza y acaba (p. ej., la ventana de alineamiento), y opcionalmente por la insercion de un hueco o multiples huecos en una o ambas secuencias, con el fin de conseguir la maxima puntuacion de similaridad posible.

[0079] El alineamiento optimo entre dos o mas secuencias puede determinarse manualmente mediante inspeccion visual o utilizando un ordenador, como por ejemplo, sin caracter limitativo, el programa BLASTP para secuencias de aminoacidos y el programa BLASTN para secuencias de acidos nucleicos (vease, e.g., Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997); vease tambien la pagina web del National Center for Biotechnology Information (NCBI)).

[0080] Puede decirse que un polipeptido de interes es «sustancialmente identico» a un polipeptido de referencia

si el polipeptido de interes comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un

85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al menos aproximadamente un

92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un

95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un

98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o al menos aproximadamente un 99,5 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos del polipeptido de referencia. El porcentaje de identidad entre dos polipeptidos tales puede determinarse manualmente mediante la inspeccion de las dos secuencias polipeptfdicas alineadas de forma optima o utilizando programas de software o algoritmos (p. ej., BLAST, ALIGN, CLUSTAL) con parametros estandar. Una indicacion de que dos polipeptidos son sustancialmente identicos es que el primer polipeptido reacciona inmunitariamente de forma cruzada con el segundo polipeptido. Normalmente, los polipeptidos que difieren en sustituciones de aminoacidos conservadoras reaccionan inmunitariamente de forma cruzada. En consecuencia, un polipeptido es sustancialmente identico a un segundo polipeptido, por ejemplo, cuando los dos peptidos difieren solamente en una sustitucion de aminoacidos conservativa o en una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas.

[0081] Puede decirse que un acido nucleico de interes es «sustancialmente identico» a un acido nucleico de

referencia si el acido nucleico de interes comprende una secuencia de nucleotidica que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos

aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al menos

aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos

aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos

aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o al menos aproximadamente un 99,5 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia nucleotidica del acido nucleico de referencia. El porcentaje de identidad entre dos acidos nucleicos tales puede determinarse manualmente mediante la inspeccion de las

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dos secuencias de acidos nucleicos alineadas de forma optima o utilizando programas de software o algoritmos (p. ej., BLAST, ALIGN, CLUSTAL) con parametros estandar. Una indicacion de que dos secuencias de acidos nucleicos son sustancialmente identicas es que las dos moleculas de acidos nucleicos se hibridan entre s^ en condiciones astringentes (p. ej., dentro de un rango de astringencia media a elevada). Una variante de proteasa codificada por un acido nucleico que comprende una secuencia polinucleotfdica capaz de hibridarse con la secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11 en condiciones que vanan desde astringencia media a astringencia elevada o la astringencia mas elevada puede considerarse «equivalente» a la variante de proteasa que tiene la secuencia polipeptidica de cualquiera de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8, respectivamente.

[0082] Un acido nucleico o polinucleotido esta «aislado» cuando esta total o parcialmente separado de otros componentes (como, p. ej., sin caracter limitativo, otras protemas, acidos nucleicos, celulas, etc.). De forma similar, un polipeptido, una protema o un peptido esta «aislado» cuando esta total o parcialmente separado de otros componentes (como, p. ej., sin caracter limitativo, otras protemas, acidos nucleicos, celulas, etc.). Desde el punto de vista de la molaridad, una especie aislada es mas abundante que otras especies en una composicion. Por ejemplo, una especie aislada puede comprender al menos aproximadamente un 50 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % (desde el punto de vista de la molaridad) de todas las especies macromoleculares presentes. De forma preferible, la especie de interes esta purificada hasta lograr una homogeneidad esencial (es decir, las especies contaminantes no pueden detectarse en la composicion mediante metodos de deteccion convencionales). La pureza y la homogeneidad pueden determinarse utilizando un numero de tecnicas ampliamente conocidas en el ambito de especializacion, como electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida de una muestra de protema o acido nucleico, seguido de visualizacion tras la tincion. Si se desea, puede utilizarse una tecnica de alta resolucion, como cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC, por sus siglas en ingles), o medios similares, para la purificacion del material.

[0083] El termino «purificado(s)», en aplicacion a acidos nucleicos o polipeptidos, denota un acido nucleico o polipeptido que, en esencia, esta libre de otros componentes segun lo determinado por tecnicas analfticas ampliamente conocidas en el ambito de especializacion (p. ej., un polipeptido o un polinucleotido purificado forma una discreta banda en un gel de electroforesis, un eluato cromatografico y/o un medio sometido a centrifugacion en gradiente de densidad). Por ejemplo, un acido nucleico o polipeptido que da lugar esencialmente a una banda en un gel de electroforesis esta «purificado». Un acido nucleico o polipeptido purificado es al menos un 50 % puro, normalmente al menos aproximadamente un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 99,5 %, un 99,6 %, un 99,7 %, un 99,8 % o mas puro (p. ej., por ciento en peso desde el punto de vista de la molaridad). De forma relacionada, la invencion proporciona metodos de enriquecimiento de composiciones para una o mas moleculas de la invencion, como uno o mas polipeptidos o polinucleotidos de la invencion. Una composicion se enriquece para una molecula cuando hay un incremento sustancial en la concentracion de la molecula despues de aplicar una tecnica de purificacion o enriquecimiento. Un polipeptido o un polinucleotido sustancialmente puro de la invencion (p. ej., una variante de proteasa sustancialmente pura o un polinucleotido sustancialmente puro que codifica una variante de proteasa de la invencion, respectivamente) comprenderan normalmente al menos aproximadamente un 55 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 99,5 % o mas en peso (desde el punto de vista de la molaridad) de todas las especies macromoleculares en una composicion concreta.

[0084] De forma relacionada, la invencion proporciona metodos de enriquecimiento de composiciones para una o mas moleculas de la invencion, como uno o mas polipeptidos de la invencion (p. ej., una o mas variantes de proteasas de la invencion) o uno o mas acidos nucleicos de la invencion (p. ej., uno o mas acidos nucleicos que codifican una o mas variantes de proteasas de la invencion). Una composicion se enriquece para una molecula cuando hay un incremento sustancial en la concentracion de la molecula despues de aplicar una tecnica de purificacion o enriquecimiento. Un polipeptido o un polinucleotido sustancialmente puro comprendera normalmente al menos aproximadamente un 55 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 99,5 % o mas en peso (desde el punto de vista de la molaridad) de todas las especies macromoleculares en una composicion concreta.

[0085] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «mutagenesis combinatoria» se refiere a los metodos en los que se generan bibliotecas de variantes de acidos nucleicos de una secuencia de acidos nucleicos de referencia. En estas bibliotecas, las variantes contienen una o varias mutaciones escogidas de un conjunto de mutaciones predefinido. Los metodos tambien proporcionan medios para introducir mutaciones aleatorias que no pertenedan al conjunto de mutaciones predeterminado. Algunos de dichos metodos incluyen los expuestos en la patente de los Estados Unidos con numero 6,582,914. Algunos de dichos metodos de mutagenesis combinatoria incluyen abarcan metodos puestos en practica en kits comercializados (p. ej., el kit de mutagenesis dirigida de sitio multiple QuikChange® (Stratagene)).

[0086] Tal como se utiliza en el presente documento, «que tiene propiedades mejoradas», utilizado en relacion con una variante de proteasa, se refiere a una variante de proteasa con una eficacia de limpieza o lavado mejorada o potenciada, y/o una estabilidad mejorada o potenciada opcionalmente con eficacia de limpieza o

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lavado retenida, en comparacion con la correspondiente proteasa de referencia (p. ej., una proteasa natural o de origen natural). Las propiedades mejoradas de una variante de proteasa pueden comprender una eficacia de limpieza o lavado mejorada y/o una estabilidad mejorada. En un aspecto, la invencion proporciona variantes de proteasas de la invencion que exhiben una o mas de las siguientes propiedades: eficacia de lavado a mano mejorada, eficacia de lavado de la vajilla de forma manual o a mano mejorada, eficacia de lavado de la vajilla de forma automatica mejorada, eficacia de lavado de la colada mejorada y/o estabilidad mejorada en comparacion con una proteasa de referencia (p. ej., proteasa natural, como una subtilisina natural).

[0087] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «ensayo funcional» se refiere a un ensayo que proporciona una indicacion de la actividad de la protema. En algunos modos de realizacion, el termino se refiere a sistemas de ensayo en los que se analiza la aptitud de una protema para funcionar en su capacidad habitual. Por ejemplo, en el caso de las enzimas, un ensayo funcional conlleva la determinacion de la efectividad de la enzima para catalizar una reaccion.

[0088] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «propiedad diana» se refiere a la propiedad del gen inicial que se va a alterar. No se pretende que la presente invencion se limite a ninguna propiedad diana en concreto. No obstante, en algunos modos de realizacion, la propiedad diana es la estabilidad de un producto genico (p. ej., resistencia a desnaturalizacion, proteolisis u otros factores de degradacion), mientras que en otros modos de realizacion, el nivel de produccion se altera en un huesped de produccion.

[0089] El termino «propiedad» o equivalentes gramaticales del mismo, en el contexto de un acido nucleico, tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a cualquier caractenstica o atributo de un acido nucleico que puede seleccionarse o detectarse. Estas propiedades incluyen, sin caracter limitativo, una propiedad que afecta la union a un polipeptido, una propiedad conferida en una celula que comprende un acido nucleico concreto, una propiedad que afecta la transcripcion de genes (p. ej., fuerza del promotor, reconocimiento del promotor, regulacion del promotor, funcion potenciadora), una propiedad que afecta el procesamiento del ARN (p. ej., corte y empalme del ARN, estabilidad del ARN, conformacion del aRn y modificacion postranscripcional), una propiedad que afecta la traduccion (p. ej., nivel, regulacion, union de ARNm a protemas ribosomicas, modificacion postraduccional). Por ejemplo, un sitio de union para un factor de transcripcion, una polimerasa, una factor regulador, etc., de un acido nucleico puede alterarse con el fin de producir caractensticas deseadas o para identificar caractensticas no deseables.

[0090] El termino «propiedad» o equivalentes gramaticales del mismo, en el contexto de un polipeptido (protemas incluidas), tal como se utiliza en el presente documento, se refieren a cualquier caractenstica o atributo de un polipeptido que puede seleccionarse o detectarse. Estas propiedades incluyen, sin caracter limitativo, estabilidad frente a la oxidacion, especificidad de sustrato, actividad catalftica, actividad enzimatica, estabilidad termica, actividad alcalina, perfil de actividad de pH, resistencia a degradacion proteolttica, Km, kcat, ratio de kcat/kM, plegamiento proteico, induccion de una respuesta inmune, capacidad para unirse a un ligando, capacidad para unirse a un receptor, capacidad para secretarse, capacidad para presentarse sobre la superficie de una celula, capacidad de oligomerizarse, capacidad de senalar, capacidad de estimular la proliferacion celular, capacidad de inhibir la proliferacion celular, capacidad de inducir la apoptosis, capacidad para modificarse mediante fosforilacion o glicosilacion, y/o capacidad para tratar enfermedades, etc.

[0091] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «cribado» tiene su significado habitual en el ambito de especializacion. En un ejemplo de proceso de cribado, se proporciona un acido nucleico o una variante de polipeptido codificada en el mismo mutantes y se evalua o determina una propiedad del acido nucleico o de la variante de polipeptido mutantes, respectivamente. La propiedad determinada del acido nucleico o de la variante de polipeptido mutantes puede compararse con una propiedad del acido nucleico precursor (original) correspondiente o con la propiedad del polipeptido original correspondiente, respectivamente.

[0092] Para los expertos en la materia, resultara evidente que el procedimiento de cribado para obtener una protema o acido nucleico con una propiedad alterada depende de la propiedad del material inicial cuya modificacion se pretende facilitar mediante la generacion del acido nucleico mutante. En consecuencia, el experto en la materia apreciara que la invencion no se limita al cribado de ninguna propiedad espedfica y que la siguiente descripcion de propiedades contempla solamente ejemplos ilustrativos. En el ambito de especializacion, por lo general se describen metodos para el cribado de cualquier propiedad concreta. Por ejemplo, se puede medir la union, el pH, la especificidad, etc. antes y despues de la mutacion, donde un cambio indica una alteracion. De forma preferible, las cribas se realizan a alto rendimiento, lo que incluye que multiples muestras se criben de forma simultanea, incluyendo, sin caracter limitativo, ensayos que utilizan chips, phage display y multiples sustratos y/o indicadores.

[0093] Tal como se utiliza en el presente documento, en algunos modos de realizacion, un proceso de cribado abarca una o mas etapas de seleccion en las que las variantes de interes se enriquecen a partir de una poblacion de variantes. Ejemplos de estos modos de realizacion incluyen la seleccion de variantes que confieren una ventaja de crecimiento al organismo huesped, asf como phage display o cualquier otro metodo de visualizacion, donde las variantes pueden capturarse de una poblacion de variantes segun sus propiedades cataltticas o de union. En algunos modos de realizacion, se expone una biblioteca de variantes a estres (calor, proteasa, desnaturalizacion) y, posteriormente, las variantes que todavfa se encuentran intactas se identifican en

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una criba o se enriquecen por seleccion. Se pretende que el termino abarque cualquier medio de seleccion adecuado. De hecho, no se pretende que la presente invencion se limite a ningun metodo de cribado concreto.

[0094] Los terminos «secuencia de acido nucleico modificada» y «gen modificado» se utilizan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a una secuencia de acido nucleico que incluye una delecion, insercion o interrupcion de secuencia de acido nucleico de origen natural (esto es, natural). En algunos modos de realizacion, el producto de expresion de la secuencia de acido nucleico modificada es una protema truncada (p. ej., si la modificacion es una delecion o interrupcion de la secuencia). En algunos modos de realizacion, la protema truncada retiene actividad biologica. En modos de realizacion alternativos, el producto de expresion de la secuencia de acido nucleico modificada es una protema elongada (p. ej., modificaciones que comprenden una insercion en la secuencia de acido nucleico). En algunos modos de realizacion, una insercion nucleotidica en la secuencia de acido nucleico da lugar a una protema truncada (p. ej., cuando la insercion tiene como resultado la formacion de un codon de terminacion). En consecuencia, una insercion puede tener como resultado, bien una protema truncada, bien una protema elongada, como producto de expresion.

[0095] Una secuencia de acido nucleico «mutante» se refiere normalmente a una secuencia de acido nucleico que tiene una alteracion en al menos un codon presente en una secuencia natural de la celula huesped de forma que el producto de expresion de la secuencia de acido nucleico mutante es una protema con una secuencia de aminoacidos alterada en comparacion con la protema natural. El producto de expresion puede tener una capacidad funcional alterada (p. ej., actividad enzimatica potenciada).

[0096] Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion «alteracion de la especificidad de sustrato» se refiere a cambios de la especificidad de sustrato de una enzima. En algunos modos de realizacion, un cambio en la especificidad de sustrato se define como un cambio en kcat y/o Km para un sustrato concreto, como resultado de mutaciones de la enzima o de la alteracion de las condiciones de reaccion. La especificidad de sustrato de una enzima se determina por medio de la comparacion de las eficiencias catalfticas que esta muestra con distintos sustratos. Estas determinaciones se utilizan concretamente para evaluar la eficiencia de enzimas mutantes, dado que por lo general se desea producir variantes de enzimas que muestren mayores ratios de kcat/Km para sustratos de interes. No obstante, no se pretende que la presente invencion se limite a ninguna composicion de sustrato o especificidad de sustrato concretas.

[0097] Tal como se utiliza en el presente documento, «propiedad de superficie» se utiliza en referencia a carga electrostatica, asf como a propiedades como la hidrofobicidad e hidrofilicidad exhibidas por la superficie de una protema.

[0098] Los terminos «termicamente estable» y «termoestable» se refieren a proteasas que retienen una cantidad espedfica de actividad enzimatica despues de ser expuestas a temperaturas identificadas durante un periodo de tiempo determinado en condiciones imperantes durante el proceso proteolftico, de hidrolizacion, de limpieza u otro proceso de la invencion, como, p. ej., cuando se exponen a temperaturas alteradas. Las temperaturas alteradas incluyen temperaturas incrementadas o disminuidas. En algunos modos de realizacion, las proteasas retienen al menos aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, o aproximadamente un 99 % de actividad proteolftica despues de ser expuestas a temperaturas alteradas durante un periodo de tiempo determinado, por ejemplo, al menos aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 120 minutos, aproximadamente 180 minutos, aproximadamente 240 minutos, aproximadamente 300 minutos, etc.

[0099] El termino «estabilidad potenciada» en el contexto de una proteasa de pH estable, termoestable, de quelante estable y/o de oxidacion estable se refiere a una actividad proteolftica retenida mas elevada a lo largo del tiempo en comparacion con otras proteasas (p. ej., subtilisina proteasas) y/o enzimas naturales.

[0100] El termino «estabilidad reducida» en el contexto de una proteasa de pH estable, termoestable, de quelante estable y/o de oxidacion estable se refiere a una actividad proteolftica retenida mas baja a lo largo del tiempo en comparacion con otras proteasas (p. ej., subtilisina proteasas) y/o enzimas naturales.

[0101] El termino «actividad de limpieza» se refiere a una eficacia de limpieza obtenida por una variante de proteasa o proteasa de referencia en condiciones imperantes durante el proceso proteolftico, de hidrolizacion, de limpieza u otro proceso de la invencion. En un aspecto, el rendimiento de limpieza de una variante de proteasa o proteasa de referencia puede determinarse mediante varios ensayos para limpiar una o mas varias manchas susceptibles a enzimas en un artmulo o superficie, como, p. ej., una mancha de protemas procedentes de huevo, comida, grasa, sangre o leche. El rendimiento de limpieza de una variante de proteasa o proteasa de referencia puede determinarse sometiendo la mancha del artmulo o la superficie a condiciones de lavado estandar y evaluando la medida en la que se elimina la mancha utilizando varias metodologfas cromatograficas, espectrofotometricas u otras metodologfas cuantitativas. Entre los ejemplos de ensayos y metodos de limpieza se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., los descritos en WO 99/34011 y en la patente de los Estados Unidos con numero 6,605,458, asf como los ensayos y metodos de limpieza incluidos en los ejemplos que se presentan abajo.

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[0102] El termino «cantidad de limpieza efectiva» de una variante de proteasa o una proteasa de referencia se refiere a la cantidad de proteasa que obtiene un nivel deseado de actividad enzimatica en una composicion de limpieza espedfica. Un experto en la materia determina facilmente dichas cantidades efectivas, que se fundamentan en muchos factores, como la proteasa concreta utilizada, la aplicacion de limpieza, la composicion espedfica de la composicion de limpieza, y en si se necesita una composicion lfquida o seca (p. ej., granulada, de barra), etc.

[0103] El termino «material de limpieza adjunto» se refiere a cualquier material lfquido, solido o gaseoso incluido en la composicion de limpieza que no sea una variante de proteasa de la invencion. Una composicion de limpieza de la invencion puede incluir uno o mas materiales de limpieza adjuntos. Cada material de limpieza adjunto se selecciona normalmente dependiendo del tipo y la forma concretos de la composicion de limpieza (p. ej., composicion lfquida, granulada, en polvo, en barra, de pasta, pulverizada, en pastilla, en gel o de espuma). De forma preferible, cada material de limpieza adjunto es compatible con la enzima de proteasa utilizada en la composicion.

[0104] El termino «eficacia mejorada» en el contexto de actividad de limpieza se refiere a una actividad de limpieza mayor o incrementada de determinadas manchas susceptibles a enzimas como las de huevo, leche, grasa o sangre, segun se determina mediante una evaluacion normal despues de un ciclo de lavado estandar y/o multiples ciclos de lavado.

[0105] El termino «eficacia disminuida» en el contexto de actividad de limpieza se refiere a una actividad de limpieza menor o reducida de determinadas manchas susceptibles a enzimas como las de huevo, leche, grasa o sangre, segun se determina mediante una evaluacion normal despues de un ciclo de lavado estandar.

[0106] El termino «eficacia comparativa» en el contexto de la actividad de limpieza de una variante de proteasa

de la invencion se refiere a al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos

aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos

aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos

aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos

aproximadamente un 99 %, al menos aproximadamente un 99,5 % de la actividad de limpieza de una proteasa de referencia o comparativa (p. ej., proteasas comercializadas), entre las que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., proteasa OPTIMASE™ (Genencor), productos de proteasa PURAFECT™ (Genencor), proteasa SAVINASE™ (Novozymes), variantes de BPN' (vease, p. ej., la patente de los Estados Unidos con numero Re 34,606), proteasa RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™, KANNASE™ (Novozymes), proteasas MAXaCaL™, MAXAPEM™, PROPERASE™ (Genencor; vease tambien la patente de los Estados Unidos con numero Re 34,606 y las patentes de los Estados Unidos con numero 5,700,676; 5,955,340; 6,312,936; y 6,482,628), y productos de variante de proteasa de B. lentus (p. ej., los descritos en WO 92/21760, WO 95/23221 y/o WO 97/07770). La eficacia de limpieza puede determinarse comparando las variantes de proteasas de la presente invencion con subtilisina proteasas de referencia en varios ensayos de limpieza relativos a manchas susceptibles a enzimas como las causadas por grasa, sangre o leche, segun lo determinado por metodologfas espectrofotometricas o analfticas tras condiciones de ciclo de lavado estandar.

[0107] Tal como se utilizan en el presente documento, una «composicion de limpieza» o «formulacion de limpieza» de la invencion se refiere a cualquier composicion de la invencion que resulte util para quitar o eliminar un compuesto (p. ej., un compuesto no deseado) de un objeto, artfculo o superficie que se va a limpiar, entre lo que se incluye, sin caracter limitativo, p. ej., un tejido, un artfculo de tejido, un artfculo de vajilla, un artfculo de mesa, un artfculo de cristalena, lente de contacto, otro sustrato solido, pelo (champu) (incluido pelo humano o animal), piel (jabon o y crema), dientes (enjuagues bucales, pastas de dientes), una superficie de un artfculo u objeto (p. ej., superficie dura, como, por ejemplo, la superficie dura de una mesa, un tablero, una pared, un mueble, suelo, techo, un artfculo que no sea de vajilla, un artfculo que no sea de mesa, etc.), lentes de contacto, etc. El termino abarca cualquier material y/o compuesto anadido seleccionado para el tipo concreto de composicion de limpieza deseado y la forma del producto (p. ej., composicion lfquida, en gel, granulada o de pulverizacion), siempre que la composicion sea compatible con la proteasa y otra(s) enzima(s) utilizadas en la composicion. La seleccion espedfica de los materiales de la composicion de limpieza se realiza facilmente teniendo en cuenta la superficie, el objeto, el artfculo o el tejido se va a limpiar, y la forma deseada de la composicion para las condiciones de limpieza durante su uso.

[0108] Las composiciones de limpieza y las formulaciones de limpieza incluyen cualquier composicion adecuada para limpiar, blanquear, desinfectar y/o esterilizar cualquier objeto, artfculo y/o superficie. Dichas composiciones y formulaciones incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., composiciones lfquidas y/o solidas, incluidas composiciones de limpieza o detergentes (p. ej., composiciones detergentes para tejidos delicados y composiciones detergentes o de limpieza para la colada lfquidas, en pastillas, en gel, granuladas y/o solidas; composiciones y formulaciones de limpieza para superficies duras, como para encimeras y ventanas de vidrio, madera, ceramica y metal; limpiadores de alfombras, limpiadores para horno, ambientadores para tejidos, suavizantes de tejidos, y composiciones detergentes o de limpieza potenciadoras para la colada y artfculos textiles, composiciones de limpieza aditivas para la colada, y composiciones de limpieza de pretratado para la

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colada; composiciones para el lavado de la vajilla, entre las que se incluyen, p. ej., composiciones para el lavado de la vajilla de forma manual o a mano (p. ej., detergentes para el lavado de la vajilla de forma manual o a mano) y composiciones para el lavado de la vajilla de forma automatica (p. ej., detergentes para el lavado de la vajilla de forma automatica).

[0109] Las composiciones de limpieza o formulaciones de limpieza incluyen, tal como se utilizan en el presente documento y a menos que se indique otra cosa, agentes de lavado potentes o multiusos en polvo o granulados, especialmente detergentes de limpieza; agentes de lavado multiusos en forma lfquida, granulada, de gel, solida, de pastillas o de pasta, especialmente los tipos denominados detergentes lfquidos potentes (HDL, por sus siglas en ingles) o detergentes en polvo potentes (HDD, por sus siglas en ingles); los detergentes lfquidos para tejidos delicados; los agentes para el lavado de la vajilla de forma manual o a mano, para el lavado de la vajilla de forma automatica, o los agentes para el lavado de artfculos de vajilla o artfculos de mesa, incluidos los tipos en pastillas, en polvo, solidos, granulados, lfquidos, en gel o de enjuague para uso domestico o institucional; agentes desinfectantes y de limpieza lfquidos, incluidos los tipos para el lavado de manos antibacteriano, barras de limpieza, enjuagues bucales, productos para la limpieza de dentaduras, champus para coche, champu para alfombras, limpiadores de bano, champus para pelo y/o enjuagues de pelo para humanos y otros animales; geles de ducha y banos de espuma y limpiadores de metales; asf como productos auxiliares de limpieza, como aditivos blanqueadores y productos de tipo «antiadherencia de manchas» o de pretratamiento. En algunos modos de realizacion, las composiciones granuladas se encuentran en forma «compacta»; en otros modos de realizacion, las composiciones lfquidas se encuentran en forma «concentrada».

[0110] Tal como se utiliza en el presente documento, «composiciones de limpieza de tejidos» incluyen composiciones detergentes para el lavado de la colada a mano y a maquina, incluidas composiciones aditivas y composiciones adecuadas para su utilizacion en el remojo y/o el pretratamiento de tejidos manchados (p. ej., ropa, ropa de hogar y otros materiales textiles).

[0111] Tal como se utiliza en el presente documento, «composiciones de limpieza que no son para tejidos» incluyen composiciones para la limpieza de superficies no textiles (es decir, sin tejido), entre las que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., composiciones detergentes para el lavado de la vajilla de forma automatica, manual o a mano, composiciones de limpieza bucal, composiciones de limpieza de dentaduras y composiciones de aseo personal.

[0112] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «composicion detergente» o «formulacion detergente» se emplea en referencia a una composicion prevista para su utilizacion en un medio de lavado para la limpieza de objetos sucios o manchados, incluyendo artfculos u objetos de tejido o sin tejido concretos. Dichas composiciones de la presente invencion no se limitan a ninguna composicion o formulacion detergente en concreto. De hecho, en algunos aspectos, los detergentes de la invencion comprenden al menos una variante de proteasa de la invencion y, ademas, uno o mas surfactantes, transferasa(s), enzimas hidrolfticas, oxidorreductasas, mejoradores (como, por ejemplo, una sal mejoradora), agentes de blanqueado, activadores del blanqueado, agentes para tenir de azul, colorantes fluorescentes, inhibidores de aglomerantes, agentes secuestrantes, activadores de enzimas, antioxidantes y/o solubilizadores. En algunos casos, una sal mejoradora es una mezcla de una sal de silicato y una sal de fosfato, preferiblemente con mas silicato (p. ej., metasilicato sodico) que fosfato (p. ej., tripolifosfato sodico). Algunas composiciones de la invencion, como, sin caracter limitativo, composiciones de limpieza o composiciones detergentes, no contienen ningun fosfato (p. ej., sal de fosfato o mejorador de fosfato).

[0113] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «blanqueado» se refiere al tratamiento de un material (p. ej., tejido, colada, pasta, etc.) o una superficie durante un penodo de tiempo suficiente y/o en condiciones de pH y/o temperatura adecuadas para efectuar un abrillantado (esto es, un blanqueado) y/o limpiar el material. Entre los ejemplos de productos qrnmicos adecuados para efectuar el blanqueado se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., CO2, H2O2, peracidos, NO2, etc.

[0114] Tal como se utiliza en el presente documento, la «eficacia de lavado» de una proteasa (p. ej., una variante de proteasa de la invencion) se refiere a la contribucion de una variante de proteasa al lavado que proporciona una eficacia de limpieza adicional al detergente en comparacion con el detergente sin la adicion de la variante de proteasa a la composicion. La eficacia de lavado se compara en condiciones de lavado pertinentes. En algunos sistemas de prueba, otros factores pertinentes, como la composicion detergente, la subconcentracion, la dureza del agua, el mecanismo de lavado, el tiempo, el pH y/o la temperatura pueden ser controlados de tal forma que se imite(n) la(s) condicion(es) tfpica(s) para la aplicacion domestica en un determinado segmento de mercado (p. ej., lavado de la vajilla de forma manual o a mano, lavado de la vajilla de forma automatica, limpieza de artfculos de vajilla, limpieza de artfculos de mesa, limpieza de tejidos, etc.).

[0115] El termino «condiciones de lavado pertinentes» se utiliza en el presente documento para indicar las condiciones, concretamente la temperatura de lavado, el tiempo, el mecanismo de lavado, la subconcentracion, el tipo de detergente y la dureza del agua que se utilizan en el ambito domestico en un segmento de mercado de lavado de la vajilla a mano, lavado de la vajilla de forma automatica o detergente para la colada.

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[0116] El termino «eficacia de lavado mejorada» se utiliza para indicar que se obtiene un mejor resultado final en la eliminacion de manchas en condiciones de lavado relevantes, o que se necesita una cantidad de menor de variante de proteasa, desde el punto de vista del peso, para obtener el mismo resultado final en comparacion con la proteasa original inicial o natural.

[0117] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino «desinfeccion» designa la eliminacion de contaminantes de las superficies, asf como la inhibicion o destruccion de microbios sobre las superficies de los artmulos. No se pretende que la presente invencion este limitada a ninguna superficie ni artmulo en concreto ni a contaminante(s) o microbios que van a eliminarse.

[0118] La forma «compacta» de las composiciones de limpieza del presente documento se refleja de la mejor forma por densidad y, en lo que respecta a la composicion, por la cantidad de sal de relleno inorganica. Las sales de relleno inorganicas son ingredientes convencionales de las composiciones de detergentes en polvo. En composiciones detergentes convencionales, las sales de relleno se encuentran presentes en cantidades sustanciales, normalmente desde aproximadamente un 17 % hasta aproximadamente un 35 % en peso de la composicion total. En contraste, en composiciones compactas, la sal de relleno se encuentra presente en cantidades que no exceden aproximadamente un 15 % de la composicion total. En algunos modos de realizacion, la sal de relleno se encuentra presente en cantidades que no exceden aproximadamente un 10 %, o mas preferiblemente, aproximadamente un 5 % en peso de la composicion. En algunos modos de realizacion, las sales de relleno inorganicas se seleccionan de las sales alcalinas y las sales metalicas alcalinoterreas de sulfatos y cloruros. En algunos modos de realizacion, la sal de relleno es sulfato de sodio.

[0119] La posicion de un residuo de aminoacido en una determinada secuencia de aminoacidos se numera normalmente en el presente documento utilizando la numeracion de la posicion del residuo de aminoacido correspondiente de la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2. Por tanto, la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens de SEQ ID NO:2 sirve como secuencia de referencia. Una determinada secuencia de aminoacidos, como una secuencia de aminoacidos de una variante de proteasa descrita en el presente documento, puede alinearse con la secuencia de la BPN' (SEQ ID NO:2) utilizando un algoritmo de alineamiento como se describe aqrn, y un residuo de aminoacido de la secuencia de aminoacidos dada que se alinea (preferiblemente, se alinea de forma optima) con el residuo de aminoacido de la secuencia BPN' puede numerarse de forma conveniente por referencia al residuo de aminoacido correspondiente de secuencia de la subtilisina BPN'. Por ejemplo, la variante de proteasa PX4 de la invencion puede describirse como una variante de proteasa de la proteasa GG36 mostrada en SEQ ID NO:1 que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las seis sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A en relacion con SEQ ID NO:1, donde las posiciones de los residuos de aminoacidos de la variante de proteasa PX4 se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacidos correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de PX4 con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN'.

[0120] De forma alternativa, si las posiciones de los residuos de aminoacidos de la secuencia de la variante de proteasa PX4 se numeran utilizando la numeracion de las posiciones de los residuos de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de GG36 (SEQ ID NO:1), y no por referencia a las posiciones de aminoacidos correspondientes en la secuencia de la BPN' tras el alineamiento, la variante de proteasa PX4 puede describirse como una variante de proteasa de la proteasa GG36 mostrada en SEQ ID NO:1 que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende las seis sustituciones de aminoacidos N74D+S85R+G116R+S126L+P127Q+S128A.

[0121] Por lo general, la nomenclatura utilizada en el presente documento y muchos de los procedimientos de laboratorio de cultivo celular, genetica molecular, biologfa molecular, qmmica de acidos nucleicos y qmmica de protemas descritos posteriormente son ampliamente conocidos y comunmente empleados por los expertos en la materia. Se utilizan tecnicas estandar, como las descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2a Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (en lo sucesivo, "Sambrook") y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una iniciativa conjunta de Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (1994, complementada con 1999) (en lo sucesivo, "Ausubel"), para metodos de acido nucleico recombinante, smtesis de acidos nucleicos, metodos de cultivo celular e incorporacion de transgenes, p. ej., transfeccion, electroporacion. Las etapas de smtesis y purificacion de oligonucleotidos se realizan normalmente segun la memoria. Las tecnicas y los procedimientos se realizan por lo general segun metodos convencionales ampliamente conocidos en el ambito de especializacion y varias referencias generales que se proporcionan a lo largo del presente documento. Se considera que dichos procedimientos son ampliamente conocidos por los expertos en la materia y se proporcionan para comodidad del lector.

Polipeptidos de la invencion

[0122] La presente invencion proporciona polipeptidos novedosos, a los que se puede hacer referencia de forma colectiva como «polipeptidos de la invencion». Los polipeptidos de la invencion incluyen polipeptidos de variantes de proteasas aislados, recombinantes, sustancialmente puros o de origen no natural, entre los que se incluyen,

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p. ej., polipeptidos de variantes de subtilisina, que tienen actividad enzimatica (p. ej., actividad proteolftica). En un aspecto, los polipeptidos de la invencion son utiles en aplicaciones de limpieza y pueden incorporarse en composiciones de limpieza que son utiles en metodos para limpiar un artfculo o una superficie (p. ej., la superficie de un artfculo) que necesita limpiarse.

[0123] En un aspecto, una variante de proteasa de la invencion comprende una «variante de subtilisina», tal como se define en las reivindicaciones. En un aspecto, la invencion proporciona una «variante de proteasa de Bacillus sp.» En un aspecto, la invencion proporciona una «variante de subtilisina de Bacillus sp.»

[0124] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante,

sustancialmente pura o de origen no natural que tiene actividad proteolftica, cuyo polipeptido comprende una secuencia polipepftdica que tiene al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 86 %, al menos aproximadamente un 87 %, al menos aproximadamente un 88 %, al menos aproximadamente un 89 %, al

menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al menos aproximadamente un 92 %, al

menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al

menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al

menos aproximadamente un 99 %, al menos aproximadamente un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion de cada uno de los residuos de aminoacidos en las posiciones 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, donde cada posicion de aminoacido se numera segun la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ iD NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1). En un aspecto, dichas variantes de proteasas comprenden variantes de subtilisinas.

[0125] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion de cada uno de los residuos de aminoacidos en las posiciones 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, donde cada posicion de aminoacido se numera segun la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1). En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion de cada uno de los residuos de aminoacidos en las posiciones 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, donde cada posicion de aminoacido se numera segun la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3, +4, +5, +6, +7 o +8; o, en un aspecto, una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4; o, en un aspecto, -2, -1, 0, +1 o +2; o, en un aspecto, +1. En algunas de dichas variantes de proteasas, en la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa, (i) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 76 y 188 por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico; (ii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87, 118 y 244 con un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina; y (iii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129, y 130 por un residuo de aminoacido neutro seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de dicha variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R. En un aspecto, la variante de proteasa comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:8.

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[0126] En el presente documento tambien se expone un polipeptido aislado, recombinante, sustancialmente puro

o de origen no natural que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicho polipeptido una secuencia polipeptidica que tiene al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un l0o % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico y/o (ii) un residuo de asparagina en la posicion de aminoacido 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina, donde las posiciones de aminoacidos se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de

aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:1, segun lo

determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1).

[0127] Tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no

natural que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un

99,5% o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1,

comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico, y/o (ii) un residuo de asparagina en la posicion de aminoacido 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina, donde las posiciones de aminoacidos se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1). En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 y/o un residuo de arginina en la posicion de aminoacido 248. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:2 por un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3, +4, +5, +6, +7 o +8; o, en un aspecto, una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4; o, en un aspecto, una variante de proteasa que tiene una carga global de +1. En algunas de dichas variantes de proteasas, en la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa, (i) se sustituye el residuo de aminoacido en la posicion 76 por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico, (ii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87 y 118 con un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y (iii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129, y 130 por un residuo de aminoacido sin carga (neutro) seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A. En un aspecto, la variante de proteasa comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:7.

[0128] Tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico, y (ii) una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de arginina, donde las posiciones de aminoacidos se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la

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secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1). En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:2 por un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3, +4, +5, +6, +7 o +8; o, en un aspecto, una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4; o, en un aspecto, una variante de proteasa que tiene una carga global de +1. En algunas de dichas variantes de proteasas, en la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa, (i) se sustituye el residuo de aminoacido en la posicion 76 por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico, (ii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87 y 118 con un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y (iii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 por un residuo de aminoacido sin carga (neutro) seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+N248R.

[0129] Tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de acido aspartico, y (ii) un residuo de asparagina en la posicion de aminoacido 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina, donde las posiciones de aminoacidos se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1). En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:2 por un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3, +4, +5, +6, +7 o +8; o, en un aspecto, una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4; o, en un aspecto, una variante de proteasa que tiene una carga global de +1. En algunas de dichas variantes de proteasas, en la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa, (i) se sustituye el residuo de aminoacido en la posicion 76 por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico, (ii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87 y 118 por un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y (iii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 por un residuo de aminoacido sin carga (neutro) seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D.

[0130] Tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 248 en relacion con SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, donde las posiciones de aminoacidos se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacidos correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1). En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:2 por un aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3, +4, +5, +6, +7 o +8; o, en un aspecto, una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4; o, en un aspecto, una variante de proteasa que tiene una carga global de +1. En algunas de dichas variantes de proteasas, en la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa, (i) se sustituye el residuo de aminoacido en las posiciones

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76 y 188 por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico, (ii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87, 118 y 248 con un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y (iii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 por un residuo de aminoacido sin carga (neutro) seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+N248R. En un aspecto, la variante de proteasa comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:6.

[0131] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolttica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha variante de proteasa uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos en relacion con SEQ ID NO:1:

(i) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de proteasa no comprenda ambas N248R+S188D, o

(ii) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R,

donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1).

[0132] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolttica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha variante de proteasa uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos en relacion con SEQ ID NO:1:

(i) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de proteasa no comprenda ambas N248R+S188D, o

(ii) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R,

donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1).

[0133] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolttica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha variante de proteasa uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos en relacion con SEQ ID NO:1:

(i) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de proteasa no comprenda ambas N248R y S188D, o

(ii) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R,

donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1).

[0134] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, sustancialmente pura o recombinante (p. ej., variante de subtilisina) de una proteasa original (p. ej., subtilisina), comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos en relacion con la secuencia de aminoacidos de la proteasa original:

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(i) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de proteasa no comprenda ambas N248R y S188D, o

(ii) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R.

[0135] En el presente documento tambien se expone una variante de subtilisina aislada, sustancialmente pura o recombinante de una subtilisina original, comprendiendo dicha variante de subtilisina una secuencia de aminoacidos que comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos en relacion con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina original:

(i) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de subtilisina no comprenda ambas N248R y S188D, o

(ii) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R.

[0136] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) de una proteasa original, comprendiendo dicha proteasa original una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, teniendo dicha variante de proteasa actividad proteolftica y comprendiendo uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos frente a dicha proteasa original:

(i) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de proteasa no comprenda ambas N248R y S188D, o

(ii) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R,

donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1).

[0137] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico y/o (ii) un residuo de asparagina en la posicion de aminoacido 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina y/o (iii) una asparagina en la posicion 76 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico, donde las posiciones de aminoacidos se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1). En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o un residuo de arginina en la posicion de aminoacido 248. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga neta de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4. En algunas de dichas variantes de proteasas, en la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa, (i) el residuo de aminoacido en la posicion 76 comprende un residuo de asparagina, un residuo de acido glutamico o un residuo de aminoacido sin carga (neutro) seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina neutro, (ii) se sustituye el residuo de aminoacido en la posicion 118 con un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y (iii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 por un residuo de aminoacido sin carga seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A.

[0138] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia

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de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha variante de proteasa uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos en relacion con SEQ ID NO:1:

(i) S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de proteasa no comprenda ninguno de N248R, S188D y N76D, o

(ii) S87R+G118R+S128L+P129Q+S130a+S188D+V244R, con la condicion de que dicha variante de proteasa no comprenda N76D,

donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN'.

[0139] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que (a) difiere de la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO:1 de 9 a 15 residuos de aminoacidos y (b) comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S118D+N248r, donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento.

[0140] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que (a) difiere de la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO:1 en no mas de 30, no mas de 25, no mas de 20, no mas de 15, no mas de 14, no mas de 13, no mas de 12, no mas de 11, no mas de 10, no mas de 9, o no mas de 8 residuos de aminoacidos; y (b) comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacidos 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN'. Algunos de dichos polipeptidos de variantes de proteasas difieren de la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO:1 en una o mas deleciones de aminoacidos, adiciones o inserciones de aminoacidos y/o sustituciones de aminoacidos. Una sustitucion de aminoacido suele realizarse con uno de los otros 19 aminoacidos de origen natural y puede ser una sustitucion de aminoacidos conservativa o no conservativa. En otra parte del presente documento, se analizan ejemplos de sustituciones conservativas de aminoacidos. En un aspecto, se deleciona al menos un aminoacido y/o se sustituye al menos un aminoacido en la secuencia de forma que el polipeptido resultante exhibe actividad enzimatica (p. ej., actividad proteolftica), tal como determinan los ensayos estandar ampliamente conocidos en el ambito de especializacion, entre los que se incluye, por ejemplo, un ensayo descrito en el presente documento.

[0141] Algunas de dichas variantes de proteasas (p. ej., variantes de subtilisinas) que tienen actividad proteolftica comprenden una secuencia de aminoacidos que (a) difiere de la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO:1 en no mas de 25, no mas de 20, no mas de 15, no mas de 14, no mas de 13, no mas de 12, no mas de 11, no mas de 10, no mas de 9, o no mas de 8 residuos de aminoacidos; y (b) comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacidos 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1, donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN'. Algunos de dichos polipeptidos de variantes de proteasas difieren de la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO:1 en una o mas deleciones de aminoacidos, adiciones o inserciones de aminoacidos y/o sustituciones de aminoacidos. Una sustitucion de aminoacido suele realizarse con uno de los otros 19 aminoacidos de origen natural y puede ser una sustitucion de aminoacidos conservativa o no conservativa. En otra parte del presente documento, se analizan ejemplos de sustituciones conservativas de aminoacidos. En un aspecto, se deleciona al menos un aminoacido y/o se sustituye al menos un aminoacido en la secuencia de forma que el polipeptido resultante exhibe actividad enzimatica (p. ej., actividad proteolftica), tal como determina un ensayo ampliamente conocido en el ambito de especializacion, incluido, por ejemplo, un ensayo descrito en el presente documento.

[0142] Tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que:

(a) difiere de la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO:1 en o en no mas de 30, no mas de 25, no mas de 20, no mas de 15, no mas de 14, no mas de 13, no mas de 12, no mas de 11, no mas de 10, no mas de 9, no mas de 8, no mas de 7, o no mas de 6 residuo(s) de aminoacidos; y

(b) comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) un residuo de

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serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico y/o (ii) un residuo de asparagina en la posicion 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina, donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN'. Algunos de dichos polipeptidos de variantes de proteasas difieren de la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO:1 en una o mas deleciones de aminoacidos, adiciones o inserciones de aminoacidos y/o sustituciones de aminoacidos. Una sustitucion de aminoacido suele realizarse con uno de los otros 19 aminoacidos de origen natural y puede ser una sustitucion de aminoacidos conservativa o no conservativa. En otra parte del presente documento, se analizan ejemplos de sustituciones conservativas de aminoacidos. En un aspecto, se deleciona al menos un aminoacido y/o se sustituye al menos un aminoacido en la secuencia de forma que el polipeptido resultante exhibe actividad enzimatica (p. ej., actividad proteolftica), tal como determina un ensayo ampliamente conocido en el ambito de especializacion, incluido, por ejemplo, un ensayo descrito en el presente documento.

[0143] Tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que:

(a) difiere de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1 en no mas de 25, no mas de 20, no mas de 15, no mas de 14, no mas de 13, no mas de 12, no mas de 11, no mas de 10, no mas de 9, no mas de 8, no mas de 7, o no mas de 6 residuo(s) de aminoacidos; y

(b) comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico y/o (ii) un residuo de asparagina en la posicion 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina, donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN'. En un aspecto, algunas de dichas variantes de proteasas comprenden (i) un residuo de serina en la posicion 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico, y (ii) una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de arginina. En un aspecto, algunas de dichas variantes de proteasas comprenden (i) una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de acido aspartico, y (ii) un residuo de asparagina en la posicion 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina.

[0144] Algunos de dichos polipeptidos de variantes de proteasas difieren de la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO:1 en una o mas deleciones de aminoacidos, adiciones o inserciones de aminoacidos y/o sustituciones de aminoacidos. Una sustitucion de aminoacido suele realizarse con uno de los otros 19 aminoacidos de origen natural y puede ser una sustitucion de aminoacidos conservativa o no conservativa. En otra parte del presente documento, se analizan ejemplos de sustituciones conservativas de aminoacidos. En un aspecto, se deleciona al menos un aminoacido y/o se sustituye al menos un aminoacido en la secuencia de forma que el polipeptido resultante exhibe actividad enzimatica (p. ej., actividad proteolftica), tal como determina un ensayo ampliamente conocido en el ambito de especializacion, incluido, por ejemplo, un ensayo descrito en el presente documento. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o un residuo de arginina en la posicion de aminoacido 248. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:2 por un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga neta de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4. En algunas de dichas variantes de proteasas, en la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa, (i) se sustituye el residuo de aminoacido en la posicion 76 por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico, (ii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87 y 118 con un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y (iii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 por un residuo de aminoacido sin carga (neutro) seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina. En algunas de dichas variantes de proteasas, la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A.

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[0145] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 99 % o 99,5 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8.

[0146] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 en no mas de 1 residuo de aminoacido. Por ejemplo, la secuencia de la variante de proteasa puede diferir de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 en una sustitucion de aminoacido (como una sustitucion de aminoacido conservativa o no conservativa), una delecion de aminoacido, o una insercion de aminoacido.

[0147] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:7 en no mas de 1 sustitucion de aminoacido (como una sustitucion de aminoacido conservativa o no conservativa), en no mas de 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 delecion(es) de aminoacido(s), y/o en no mas de 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 delecion(es) de aminoacido(s), insercion(es) o adicion(es) de aminoacido(s).

[0148] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante o de origen no natural que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:8 en no mas de 1 sustitucion de aminoacido (como una sustitucion de aminoacido conservativa o no conservativa), en no mas de 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 delecion(es) de aminoacido(s), y/o en no mas de 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 delecion(es) de aminoacido(s), insercion(es) o adicion(es) de aminoacido(s).

[0149] Como se ha indicado anteriormente, los polipeptidos de variantes de proteasas de la invencion tienen actividades enzimaticas (como, p. ej., actividades proteolfticas) y, en consecuencia, son utiles en aplicaciones de limpieza como, p. ej., sin caracter limitativo, metodos para limpiar artfculos de vajilla, artfculos de mesa, tejidos y artfculos que tengan superficies duras (p. ej., la superficie dura de una mesa, tablero, pared, mueble, suelo, techo, etc.). Algunos ejemplos de composiciones de limpieza que comprenden uno o mas polipeptidos de variantes de proteasas se describen posteriormente. La actividad enzimatica (p. ej., la actividad de proteasa) de un polipeptido de variante de proteasa de la invencion puede determinarse facilmente utilizando procedimientos ampliamente conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos presentados posteriormente describen metodos para evaluar la actividad enzimatica, la eficacia de limpieza y/o la eficacia de lavado. La eficacia de las variantes de proteasas de la invencion para eliminar manchas como, p. ej., una mancha inducida por protema(s), limpiar superficies duras o lavar artfculos de la colada, la vajilla o de mesa puede determinarse facilmente utilizando procedimientos ampliamente conocidos en el ambito de especializacion y/o utilizando procedimientos expuestos en los ejemplos.

[0150] Un polipeptido expuesto en el presente documento puede someterse a varios cambios, como una o mas inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoacidos, ya sean conservativas o no conservativas, incluido donde, por ejemplo, dichos cambios no alteran de forma sustancial la actividad enzimatica del polipeptido. De forma similar, un acido nucleico de la invencion tambien puede someterse a varios cambios, como una o mas sustituciones de uno o mas acidos nucleicos en uno o mas codones de forma que un codon concreto codifique el mismo o aminoacido o uno diferente, teniendo como resultado bien una variacion silenciosa (p. ej., una mutacion en una secuencia nucleoftdica tiene como resultado una mutacion silenciosa en la secuencia de aminoacidos, p. ej., cuando el aminoacido codificado no es alterado por la mutacion del acido nucleico) o una variacion no silenciosa, una o mas deleciones de uno o mas acidos nucleicos (o codones) en la secuencia, una o mas adiciones o inserciones de uno o mas acidos nucleicos (o codones) en la secuencia, y/o la escision de o uno o mas truncamientos de uno o mas acidos nucleicos (o codones) en la secuencia. Muchos de estos cambios en la secuencia de acido nucleico pueden no alterar de forma sustancial la actividad enzimatica de la variante de proteasa codificada resultante en comparacion con la variante de proteasa codificada por la secuencia de acido nucleico original. Un acido nucleico de la invencion tambien puede modificarse para incluir uno o mas codones que proporcionen una expresion optima en un sistema de expresion (p. ej., sistemas de expresion en bacterias), aunque, si se desea, dichos uno o mas codones todavfa codifiquen el/los mismo(s) aminoacido(s).

[0151] En un aspecto, un genero de polipeptidos expuesto en el presente documento puede comprender polipeptidos de variantes de proteasas que tengan la actividad enzimatica deseada (p. ej., actividad de proteasa o actividad de eficacia de limpieza) que comprendan secuencias que tengan las sustituciones de aminoacidos descritas en el presente documento y que tambien comprendan una o mas sustituciones de aminoacidos adicionales, como sustituciones conservativas o no conservativas, donde el polipeptido exhibe, mantiene o mantiene de forma aproximada la actividad enzimatica deseada (p. ej., actividad de proteasa o actividad de subtilisina), p. ej., como se refleja en la actividad o en la eficacia de limpieza de la variante de proteasa. Las sustituciones de aminoacidos segun la presente exposicion pueden incluir, p. ej., sin caracter limitativo, una o mas sustituciones no conservativas de aminoacidos y/o una o mas sustituciones conservativas de aminoacidos. Una sustitucion de residuo de aminoacido conservativa conlleva normalmente el intercambio de un miembro

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dentro de una clase funcional de residuos de aminoacidos por un residuo que pertenece a la misma clase funcional (los residuos de aminoacidos identicos se consideran funcionalmente homologos o se conservan calculando el porcentaje de homologfa funcional). Una sustitucion de aminoacido conservativa conlleva normalmente la sustitucion de un aminoacido en una secuencia de aminoacidos con un aminoacido funcionalmente similar. Por ejemplo, la alanina, la glicina, la serina y la treonina son funcionalmente similares y, en consecuencia, pueden servir como sustituciones conservativas de aminoacidos entre st El acido aspartico y el acido glutamico pueden servir como sustituciones conservativas entre st La asparagina y la glutamina pueden servir como sustituciones conservativas entre sf. La arginina, la lisina y la histidina pueden servir como sustituciones conservativas entre sf. La isoleucina, la leucina, la metionina y la valina pueden servir como sustituciones conservativas entre sf. La fenilalanina, la tirosina y el triptofano pueden servir como sustituciones conservativas entre sf.

[0152] Pueden concebirse otros grupos de sustituciones conservativas de aminoacidos. Por ejemplo, los aminoacidos pueden agruparse por estructura qmmica, composicion o funcion similar (p. ej., acidos, basicos, alifaticos, aromaticos, contenedores de sulfuro). Por ejemplo, un grupo Alifatico puede comprender: Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I). Otros grupos que contienen aminoacidos que se consideran sustituciones conservativas entre sf incluyen: Aromaticos: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); Contenedores de sulfuro: Metionina (M), Cistema (C); Basicos: Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H); Acidos: Acido aspartico (D), Acido glutamico (E); Residuos sin carga no polares, Cistema (C), Metionina (M) y Prolina (P); Residuos sin carga hidrofflicos: Serina (S), Treonina (T), Asparagina (N) y Glutamina (Q). Vease tambien Creighton (1984) Proteins: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (2a Ed. 1993), W.H. Freeman and Company para grupos de aminoacidos adicionales. El listado de una secuencia polipeptfdica en el presente documento, junto con los anteriores grupos de sustituciones, proporciona una relacion expresa de todas las secuencias polipeptfdicas sustituidas de forma conservativa.

[0153] Existen mas sustituciones conservativas dentro de las clases de residuos de aminoacidos descritas anteriormente, que tambien pueden ser adecuadas de forma alternativa o adicional. Los grupos de conservacion para sustituciones mas conservativas incluyen: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina. En consecuencia, por ejemplo, en el presente documento se expone un polipeptido de variante de proteasa recombinante o aislado (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad protelttica, comprendiendo dicho polipeptido de variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, o un 99,5 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico y/o (ii) un residuo de asparagina en la posicion 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina, donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento optimo de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de la BPN', y donde un residuo de aminoacido en la secuencia de la variante de proteasa en una posicion de aminoacido distinta a la posicion 76, 87, 118, 128, 129 o 130 difiere de la posicion de aminoacido correspondiente en SEQ ID NO:1 (segun lo determinado por alineamiento utilizando el esquema de numeracion de la BPN') por una sustitucion de aminoacido conservativa, donde la variante de proteasa resultante exhibe o mantiene una actividad enzimatica o una actividad de eficacia de limpieza deseadas. No se espera que una sustitucion conservativa de un aminoacido por otro en la variante de proteasa de la invencion altere de forma significativa la actividad enzimatica o la actividad de eficacia de limpieza de la variante de proteasa. La actividad enzimatica o la actividad de eficacia de limpieza de la proteasa resultante puede determinarse facilmente utilizando ensayos estandar y los ensayos descritos en el presente documento. Por consiguiente, la variante de proteasa puede incluir una o mas sustituciones conservativas de aminoacidos en posiciones distintas a las especificadas anteriormente manteniendo la actividad enzimatica o la actividad de eficacia de limpieza deseadas. En algunos aspectos, al menos un 10 %, un 20 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, o mas (p. ej., al menos un 75 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 99,5 %) de las sustituciones en una secuencia de aminoacidos de una variante de proteasa comprenden sustituciones de uno o mas residuos de aminoacidos en posiciones de aminoacidos distintas a las posiciones 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en una secuencia polipeptfdica de una variante de proteasa de la invencion en relacion con SEQ ID nO:1, donde las posiciones de aminoacidos se numeran por alineacion con SEQ ID NO:2 y utilizan el esquema de numeracion de BPN', con uno o mas residuos de aminoacidos, respectivamente, que se encuentran dentro de la misma clase de homologfa funcional (segun lo determinado por cualquier sistema de clasificacion adecuado) que los residuos de aminoacidos de la secuencia polipeptfdica que reemplaza cada uno.

[0154] Las variaciones de una secuencia polipeptfdica de la exposicion sustituidas de forma conservativa (p. ej., variante de proteasa de la exposicion) incluyen sustituciones de un pequeno porcentaje, en ocasiones menor a un 25 %, un 20 %, un 15 %, un 14 %, un 13 %, un 12 %, un 11 %, un 10 %, un 9 %, un 8 %, un 7 % o un 6 % de los aminoacidos de la secuencia polipeptfdica, o menos de un 5 %, un 4 %, un 3 %, un 2 % o un 1 % de los

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aminoacidos de la secuencia polipeptfdica, con un aminoacido seleccionado de forma conservativa del mismo grupo de sustitucion conservativa.

[0155] Como se describe con mayor detalle en otro lugar del presente documento (y en los ejemplos expuestos posteriormente), los polipeptidos de la invencion pueden tener capacidades de limpieza que pueden compararse con proteasas conocidas, entre las que se incluyen subtilisinas conocidas. Entre los ejemplos de subtilisina proteasas se incluyen, sin caracter limitativo, la subtilisina GG36 de B. lentus (tambien denominada en el presente documento «GCI-P036»), la subtilisina BPN’ de B. amyloliquefaciens, la subtilisina BPN'-Y217L de B. amyloliquefaciens, y PB92 de B. clausii (tambien denominada en el presente documento «GCI-P037»). Otra subtilisina proteasa conocida utilizada como referencia para comparacion en el presente documento se denomina "GCI-P038".

[0156] La secuencia de aminoacidos de la protema de la subtilisina GG36 de B. lentus madura (GCI-P036) es:

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGIS:THPDLNIRGGASFVPGEPST:QDGNGHG THVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGS PSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAG LDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHL KNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:l)

[0157] La secuencia de aminoacidos de la protema de la subtilisina BPN’ de B. amyloliquefaciens madura es: AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSH GTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLG GPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFS SVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSL ENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ (SEQ ID NO:2)

[0158] La secuencia de aminoacidos de la protema de la subtilisina BPN'-Y217L de B. amyloliquefaciens madura (tambien denominada "FNA") es:

AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSH GTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLG GPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFS SVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSL ENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ (SEQ ID NOG)

[0159] La secuencia de aminoacidos de la protema de la subtilisina proteasa de referencia PB92 (GCI-P037) madura es:

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGT HVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSP SPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGL DIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGS TNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NON)

[0160] La secuencia de aminoacidos de la protema de la subtilisina proteasa de referencia GCI-P038 madura es:

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGT HVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQ APSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGL DIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGS TNLY GSGLVNAEAATR (SEQ ID NOG)

Acidos nucleicos de la invencion

[0161] La invencion proporciona acidos nucleicos aislados, de origen no natural o recombinantes (tambien denominados en el presente documento polinucleotidos), a los que se puede hacer referencia de forma colectiva

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como «acidos nucleicos de la invencion» o «polinucleotidos de la invencion», que codifican polipeptidos de la invencion, tal como se define en las reivindicaciones. Los acidos nucleicos de la invencion, tal como se definen en las reivindicaciones, son utiles en la produccion recombinante (p. ej., expresion) de polipeptidos de la invencion, normalmente a traves de la expresion de un vector de expresion plasmido que comprende una secuencia que codifica el polipeptido de interes o un fragmento del mismo. Como se ha analizado previamente, los polipeptidos incluyen polipeptidos de variante de proteasa, entre los que se incluyen, p. ej., polipeptidos de variante de subtilisina, que tienen actividad enzimatica (p. ej., actividad proteolftica) que son utiles en aplicaciones de limpieza y composiciones de limpieza para limpiar un artfculo o una superficie (p. ej., la superficie de un artfculo) que necesita limpiarse.

[0162] En un aspecto, la invencion proporciona un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia nucleotfdica que codifica cualquier polipeptido (incluida cualquier protema de fusion, etc.) de la invencion tal como se define en las reivindicaciones. La invencion tambien proporciona un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia nucleotfdica que codifica una combinacion de dos o mas de cualquier polipeptido de la invencion descrito anteriormente y en cualquier otra parte del presente documento.

[0163] Por ejemplo, en el presente documento se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica una variante de proteasa (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 85%, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion de cada uno de los residuos de aminoacidos en las posiciones 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, donde cada posicion de aminoacido se numera segun la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (vease la figura 1). Algunas de dichas variantes de proteasas comprenden una secuencia de aminoacidos que comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga neta de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4. En algunas de dichas variantes de proteasas: (i) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 76 y 188 por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico, (ii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87, 118 y 244 por un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y (iii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129, y 130 por un residuo de aminoacido neutro seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina. En algunas de dichas variantes de proteasas, donde la secuencia de aminoacidos de dicha variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R.

[0164] En el presente documento tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica una variante de proteasa (p. ej., variante de subtilisina) que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:6. En otro aspecto, la invencion proporciona un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotidica que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia nucleotidica con la secuencia polinucleotidica de SEQ ID NO:9 o una secuencia polinucleotfdica complementaria de la misma. En el presente documento tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende la secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO:9 o una secuencia polinucleotfdica complementaria de la misma.

[0165] En el presente documento tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica una variante de proteasa (p. ej., variante de subtilisina) que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:8. En el presente documento tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotfdica que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia nucleotfdica con la secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO:11 o una secuencia polinucleotfdica complementaria de la misma. En el presente documento tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende la secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO:11 o una secuencia polinucleotfdica complementaria de la misma.

[0166] En el presente documento tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica una variante de proteasa (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa una

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secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 85%, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico y/o (ii) un residuo de asparagina en la posicion de aminoacido 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina, donde las posiciones de aminoacidos se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN'. Algunas de dichas variantes de proteasas codificadas comprenden una secuencia de aminoacidos que comprende un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o un residuo de arginina en la posicion de aminoacido 248. Algunas de dichas variantes de proteasas comprenden (i) un residuo de serina en la posicion 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico, y (ii) una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de arginina. Algunas de dichas variantes de proteasas comprenden (i) una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de acido aspartico, y (ii) un residuo de asparagina en la posicion 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina. Algunas de dichas variantes de proteasas comprenden una secuencia de aminoacidos que comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 por un aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga neta de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4. En algunas de dichas variantes de proteasas: (i) se sustituye el residuo de aminoacido en la posicion 76 por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico, (ii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87 y 118 por un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y (iii) se sustituye el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 por un residuo de aminoacido sin carga seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina.

[0167] En un aspecto, la invencion proporciona un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica una variante de proteasa (p. ej., variante de subtilisina) que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:7.

[0168] En el presente documento tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotidica que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia nucleotidica con la secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO:10 o una secuencia polinucleotfdica complementaria de la misma. En el presente documento tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende la secuencia polinucleotfdica de SEQ ID NO:10 o una secuencia polinucleotidica complementaria de la misma.

[0169] Tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica una variante de proteasa que tiene actividad proteolftica, comprendiendo dicha variante de proteasa (p. ej., variante de subtilisina) una secuencia de aminoacidos que:

(a) difiere de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1 en no mas de 25, no mas de 20, no mas de 15, no mas de 14, no mas de 13, no mas de 12, no mas de 11, no mas de 10, no mas de 9, no mas de 8, no mas de 7, o no mas de 6 residuos de aminoacidos; y

(b) comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente, y (i) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de acido aspartico y/o (ii) un residuo de asparagina en la posicion 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina, donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens. Algunas de dichas variantes de proteasas codificadas comprenden una secuencia de aminoacidos que comprende (i) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo aspartico, y (ii) una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de arginina. Algunas de dichas variantes de proteasas codificadas comprenden una secuencia de aminoacidos que comprende una sustitucion del

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residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de acido aspartico, y (ii) un residuo de asparagina en la posicion 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que no sea un residuo de arginina.

[0170] En el presente documento tambien se expone una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural (p. ej., variante de subtilisina) que tiene actividad proteolttica, comprendiendo dicha variante de proteasa una secuencia de aminoacidos que (a) difiere de la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO:1 en no mas de 25, no mas de 20, no mas de 15, no mas de 14, no mas de 13, no mas de 12, no mas de 11, no mas de 10, no mas de 9 o no mas de 8 residuos de aminoacidos, y (b) comprende una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacidos 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1, donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.

[0171] En el presente documento tambien se expone un acido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia polinucleotidica que tiene al menos un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 99,5 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotfdica de cualquiera de SEQ ID NO:9, 10 y 11.

[0172] Los acidos nucleicos de la invencion pueden generarse utilizando cualquier tecnica adecuada de smtesis, manipulacion y/o aislamiento, o combinaciones de las mismas. Por ejemplo, un polinucleotido de la invencion puede producirse utilizando tecnicas de smtesis de acido nucleico estandar, como tecnicas de smtesis en fase solida que son ampliamente conocidas por los expertos en la materia. En dichas tecnicas, normalmente se sintetizan fragmentos de hasta 50 o mas bases nucleotfdicas, que despues se unen (p. ej., con metodos de ligadura qrnmica o enzimatica, o metodos de recombinacion mediante polimerasa) para formar basicamente cualquier secuencia de acido nucleico continuada que se desee. La smtesis de los acidos nucleicos de la invencion tambien puede facilitarse (o, de forma alternativa, conseguirse) por smtesis qrnmica utilizando, p. ej., el metodo con fosforamidita clasico, que se describe, p. ej., en Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:185969, o el metodo descrito por Matthes et al. (1984) EMBO J. 3:801-05, p. ej., como se suele practicar en metodos sinteticos automatizados. Los acidos nucleicos de la invencion tambien pueden producirse utilizando un sintetizador de ADN automatico. Pueden adquirirse acidos nucleicos personalizados de una variedad de fuentes comerciales, como The Midland Certified Reagent Company (
[email protected]), the Great American Gene Company (pagina web para todo el mundo: genco.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, Calif.) y DNA2.0 (Menlo Park, CA). Otras tecnicas para sintetizar acidos nucleicos y principios relacionados se describen, p. ej., en Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984) e Itakura et al., Science 198:1056 (1984).

[0173] Las tecnicas de ADN recombinantes utiles en la modificacion de acidos nucleicos son ampliamente conocidas en el ambito de especializacion. Por ejemplo, tecnicas como la digestion con endonucleasas de restriccion, la ligadura, la transcripcion inversa y la produccion de ADNc, asf como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles) son conocidas y ampliamente utilizadas por los expertos en la materia. Algunas tecnicas de tecnologfa de ADN recombinante utiles y principios relacionados con las mismas se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, asf como en su tercera edicion (2001); Ausubel et al. (1994-1999) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers; y Berger y Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques," en Methods in Enzymol. Vol. 152, Acad. Press, Inc., San Diego, CA.

[0174] Los nucleotidos de la invencion tambien pueden obtenerse cribando bibliotecas de ADNc (generadas mediante tecnicas de mutagenesis utilizadas en el ambito de especializacion, incluidas las descritas en el presente documento) utilizando una o mas sondas de oligonucleotidos que puedan hibridarse con polinucleotidos que codifican uno o mas polipeptidos de variante de proteasa de la invencion, o que puedan amplificarlos con PCR. Los procedimientos para cribar y aislar clones de ADNc y los procedimientos de amplificacion con PCR son ampliamente conocidos por los expertos en la materia y se describen en Berger, Sambrook, y Ausubel, todos mencionados con anterioridad. Algunos acidos nucleicos de la invencion pueden obtenerse alterando la columna vertebral del polinucleotido de origen natural (p. ej., que codifica una enzima o proteasa original) mediante, p. ej., un procedimiento de mutagenesis conocido (p. ej., mutagenesis de sitio dirigido, mutagenesis de saturacion de sitio y recombinacion in vitro).

Metodos para elaborar variantes de proteasas modificadas de la invencion

[0175] En el ambito de especializacion se conoce una variedad de metodos que son adecuados para generar polinucleotidos modificados de la invencion que codifican variantes de proteasas de la invencion, entre los que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., mutagenesis de saturacion de sitio, mutagenesis de rastreo, mutagenesis aleatoria, mutagenesis de sitio dirigido y evolucion dirigida, asf como otros varios enfoques de recombinacion. Los metodos para elaborar polinucleotidos y protemas modificados (p. ej., variantes de proteasas) incluyen metodologfas de barajado de ADN (vease, p. ej., Stemmer WP, 91(22):10747-51 (1994)), metodos basados en la recombinacion de genes no homologa, p. ej., ITCHY (Ostermeier et al., 7(10):2139-44 (1999)), SCRACHY (Lutz

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et al. 98(20):11248-53 (2001)), SHIPREC (Sieber et al., 19(5):456-60 (2001)), yNRR (Bittker et al., 20(10):1024-9 (2001); Bittker et al., 101(18):7011-6 (2004)), y metodos que se fundamentan en el uso de oligonucleotidos para insertar deleciones, inserciones y/o mutaciones aleatorias y dirigidas (Ness et al., 20(12):1251-5 (2002); Coco et al., 20(12):1246-50 (2002); Zha et al., 4(1):34-9 (2003), Glaser et al., 149(12):3903-13 (1992), y Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(8):3581-5 (1992), Yanez et al., 32(20):e158 (2004), Osuna et al., 32(17):e136 (2004), Gaytan et al., 29(3):E9 (2001), y Gaytan et al., 30(16):e84 (2002)).

Vectores, celulas y metodos para producir variantes de proteasas de la invencion

[0176] La presente invencion proporciona vectores aislados o recombinantes que comprenden al menos un polinucleotido de la invencion descrito en el presente documento (p. ej., un polinucleotido que codifica una variante de proteasa de la invencion descrito en el presente documento), casetes de expresion o vectores de expresion aislados o recombinantes que comprenden al menos un acido nucleico o polinucleotido de la invencion, constructos de ADN aislados, sustancialmente puros o recombinantes que comprenden al menos un acido nucleico o polinucleotido de la invencion, celulas aisladas o recombinantes que comprenden al menos un polinucleotido de la invencion, cultivos celulares que comprenden celulas que comprenden al menos un polinucleotido de la invencion, cultivos celulares que comprenden al menos un acido nucleico o polinucleotido de la invencion, y composiciones que comprenden uno o mas de dichos vectores, acidos nucleicos, vectores de expresion, casetes de expresion, constructos de ADN, celulas, cultivos celulares o cualquier combinacion o mezcla de los mismos.

[0177] En un aspecto, la invencion proporciona celulas recombinantes que comprenden al menos un vector (p. ej., vector de expresion o constructo de ADN) de la invencion que comprende al menos un acido nucleico o polinucleotido de la invencion, como se define en las reivindicaciones. Algunas de dichas celulas recombinantes se transforman o se transfectan con dicho al menos un vector. Dichas celulas se denominan normalmente celulas huesped. Algunas de dichas celulas comprenden celulas bacterianas, entre las que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., las celulas de Bacillus sp, como, p. ej., las celulas de Bacillus subtilis. La invencion tambien proporciona celulas recombinantes (p. ej., celulas huesped recombinantes) que comprenden al menos una variante de proteasa de la invencion.

[0178] En un aspecto, la invencion proporciona un vector que comprende un acido nucleico o polinucleotido de la invencion. En un aspecto, el vector es un vector de expresion o un casete de expresion en el que una secuencia polinucleotidica de la invencion que codifica una variante de proteasa de la invencion se encuentra ligada de forma operativa a un segmento de acido nucleico, o segmentos adicionales, necesarios para una expresion genetica eficiente (p. ej., un promotor ligado de forma operativa al polinucleotido de la invencion que codifica una variante de proteasa de la invencion). Un vector puede incluir un terminador de la transcripcion y/o un gen de seleccion, como un gen de resistencia a los antibioticos que permite el mantenimiento continuo en el cultivo de celulas huesped infectadas con plasmidos mediante el cultivo en medios antimicrobianos.

[0179] Un vector de expresion puede derivarse de ADN plasmfdico o viral o, en modos de realizacion alternativos, contiene elementos de ambos. Algunos ejemplos de vectores incluyen, sin caracter limitativo, pXX, pC194, pJH101, pE194, pHP13 (Harwood y Cutting (eds.)), Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons (1990), vease, p. ej., el capftulo 3; los plasmidos de replicacion adecuados para B. subtilis incluyen los listados en la pag. 92; Perego, M. (1993) Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, pags. 615-624; A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, y R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria: biochemistry, physiology and molecular genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C.

[0180] Para la expresion y la produccion de una protema de interes (p. ej., variante de proteasa) en una celula, al menos un vector de expresion que comprende al menos una copia de un polinucleotido que codifica la proteasa modificada, y que preferiblemente comprende multiples copias, se transforma en la celula en condiciones adecuadas para la expresion de la proteasa. En un aspecto, una secuencia polinucleotfdica que codifica la variante de proteasa (asf como otras secuencias incluidas en el vector) se integra en el genoma de la celula huesped, mientras que en otro aspecto, un vector plasirndico que comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica una variante de proteasa permanece como elemento extracromosomico autonomo en el interior de la celula. La invencion proporciona tanto elementos de acido nucleico extracromosomico como secuencias nucleotfdicas entrantes que estan integradas en el genoma de la celula huesped. Los vectores descritos en el presente documento son utiles para la produccion de las variantes de proteasas de la invencion. En un aspecto, un constructo polinucleotfdico que codifica la variante de proteasa se encuentra presente en un vector de integracion que permite la integracion y, opcionalmente, la amplificacion del polinucleotido que codifica la variante de proteasa en el cromosoma bacteriano. Los ejemplos de sitios de integracion son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. En algunos modos de realizacion, la transcripcion de un polinucleotido que codifica una variante de proteasa de la invencion es efectuada por un promotor que es el promotor natural para la proteasa precursora seleccionada. En algunos modos de realizacion, el promotor es heterologo a la proteasa precursora, pero es funcional en la celula huesped. Concretamente, entre los ejemplos de promotores adecuados para su uso en celulas huesped bacterianas se incluyen, sin caracter limitativo, los promotores amyE, amyQ, amyL, pstS, sacB, pSPAC, pAprE, pVeg, pHpall, el promotor del gen de amilasa maltogenica de B. stearothermophilus, el gen de amilasa (BAN) de B. amyloliquefaciens, el gen de proteasa alcalina de B.

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subtilis, el gen de proteasa alcalina de B. clausii, el gen de xilosidasa de B. pumilis, el cryINA de B. thuringiensis y el gen de alfa-amilasa de B. licheniformis. Entre los promotores adicionales se incluyen, sin caracter limitativo, el promotor A4, asf como los promotores Pr o Pl de fago lambda, y los promotores lac trp o tac de E. coli.

[0181] Las variantes de proteasas de la invencion se pueden producir en celulas huesped de cualquier microorganismo grampositivo adecuado, incluidos hongos y bacterias. Por ejemplo, en algunos modos de realizacion, la variante de proteasa se produce en celulas huesped de origen fungico y/o bacteriano. En algunos modos de realizacion, las celulas huesped son Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp. o Aspergillus sp. En algunos modos de realizacion, las variantes de proteasas son producidas por celulas huesped de Bacillus sp. Entre los ejemplos de celulas huesped de Bacillus sp. que son de utilidad en la produccion de variantes de proteasas de la invencion se incluyen, sin caracter limitativo, B. licheniformis, B. lentus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. coagulans, B. circulans, B. pumilis, B. thuringiensis, B. clausii B. megaterium, asf como otros organismos del genero Bacillus. En algunos modos de realizacion, las celulas huesped de B. subtilis son utiles para la produccion de variantes de proteasas. Las patentes de los Estados Unidos con numero 5,264,366 y 4,760,025 (RE 34,606) describen varias cepas huesped de Bacillus que pueden utilizarse para producir variantes de proteasas de la invencion, aunque puede utilizarse otras cepas adecuadas.

[0182] Varias cepas bacterianas industriales que pueden utilizarse para producir variantes de proteasas de la invencion incluyen cepas de Bacillus sp. no recombinantes (esto es, naturales), asf como variantes de cepas de origen natural y/o cepas recombinantes. En algunos modos de realizacion, la cepa huesped es una cepa recombinante, donde un polinucleotido que codifica un polipeptido de interes se ha introducido en el huesped. En algunos modos de realizacion, la cepa huesped es una cepa huesped de B. subtilis y, en particular, una cepa huesped de Bacillus subtilis recombinante. Se conocen numerosas cepas de B. subtilis, entre las que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., 1A6 (ATCC 39085), 168 (1A01), SB19, W23, Ts85, B637, PB1753 a PB1758, PB3360, JH642, 1A243 (ATCC 39,087), ATCC 21332, ATCC 6051, MI113, DE100 (ATCC 39,094), GX4931, PBT 110 y PEP 211 (vease, p. ej., Hoch et al., Genetics 73:215-228 (1973)) (vease tambien las patentes de los Estados Unidos con numero 4,450,235 y 4,302,544, asf como EP 0134048). El uso de B. subtilis como celulas huesped de expresion es ampliamente conocido en el ambito de especializacion (vease, p. ej., Palva et al., Gene 19:81-87 (1982); Fahnestock and Fischer, J. Bacteriol., 165:796-804 (1986); y Wang et al., Gene 69:39-47 (1988)).

[0183] En algunos modos de realizacion, la celula huesped de Bacillus es una Bacillus sp. que incluye una mutacion o delecion en al menos uno de los siguientes genes: degU, degS, degR y degQ. Preferiblemente, la mutacion se produce en un gen degU, y mas preferiblemente la mutacion es degU(Hy)32. Vease, p. ej., Msadek et al., J. Bacteriol. 172:824-834 (1990) y Olmos et al., Mol. Gen. Genet. 253:562-567 (1997)). Una cepa huesped preferida es una Bacillus subtilis que porta una mutacion degU32(Hy). En algunos modos de realizacion, el huesped de Bacillus comprende una mutacion o delecion en scoC4 (vease, p. ej., Caldwell et al., J. Bacteriol. 183:7329-7340 (2001)); spoIIE (vease, p. ej., Arigoni et al., Mol. Microbiol. 31:1407-1415 (1999)); y/o oppA u otros genes del operon opp (vease, p. ej., Perego et al., Mol. Microbiol. 5:173-185 (1991)). De hecho, se contempla que cualquier mutacion en el operon opp que cause el mismo fenotipo que una mutacion en el gen oppA se utilizara en algunos modos de realizacion de la cepa de Bacillus alterada de la invencion. En algunos modos de realizacion, estas mutaciones ocurren de forma independiente, mientras que en otros modos de realizacion se dan combinaciones de mutaciones. En algunos modos de realizacion, una celula huesped de Bacillus que puede utilizarse para producir una variante de proteasa de la invencion es una cepa huesped de Bacillus que ya incluye una mutacion en uno o mas de los genes anteriormente mencionados. Ademas, son de utilidad las celulas huesped de Bacillus sp. que comprenden mutaciones y/o deleciones de genes de proteasa endogenos. En algunos modos de realizacion, la celula huesped de Bacillus comprende una delecion de los genes aprE y nprE. En otros modos de realizacion, la celula huesped de Bacillus sp. comprende una delecion de 5 genes de proteasa, mientras que en otros modos de realizacion, la celula huesped de Bacillus sp. comprende una delecion de 9 genes de proteasa (vease, p. ej., la solicitud de patente de los Estados Unidos con numero 2005/0202535).

[0184] Las celulas huesped se transforman con al menos un acido nucleico que codifica al menos una variante de proteasa de la invencion utilizando cualquier metodo adecuado conocido en el ambito de especializacion. Tanto si el acido nucleico se incorpora en un vector como si se utiliza sin la presencia de ADN plasirndico, este se introduce normalmente en un microorganismo, en algunos modos de realizacion, preferiblemente una celula de E. coli o una celula de Bacillus competente. Los metodos para introducir un acido nucleico (p. ej., ADN) en celulas de Bacillus o celulas de E. coli utilizando vectores o constructos de ADN plasirndico y transformando dichos vectores o constructos de ADN plasirndico en dichas celulas son ampliamente conocidos. En algunos modos de realizacion, posteriormente los plasmidos se afslan de celulas de E. coli y se transforman en celulas de Bacillus. No obstante, no es esencial utilizar microorganismos de intervencion como E. coli, y en algunos modos de realizacion, un vector o constructo de ADN se introduce directamente en un huesped de Bacillus.

[0185] Los expertos en la materia estan bien informados de metodos adecuados para introducir secuencias de acido nucleico o polinucleotidicas de la invencion en celulas de Bacillus (vease, p. ej., Ferrari et al., "Genetics," in Harwood et al. (ed.), Bacillus, Plenum Publishing Corp. (1989), pp. 57-72; Saunders et al., J. Bacteriol. 157:71832

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726 (1984); Hoch et al., J. Bacteriol. 93:1925 -1937 (1967); Mann et al., Current Microbiol. 13:131-135 (1986); y Holubova, Folia Microbiol. 30:97 (1985); Chang et al., Mol. Gen. Genet. 168:11-115 (1979); Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett. 7:261-263 (1980); Smith et al., Appl. Env. Microbiol. 51:634 (1986); Fisher et al., Arch. Microbiol. 139:213-217 (1981); y McDonald, J. Gen. Microbiol. 130:203 (1984)). De hecho, dichos metodos como la transformacion, incluyendo la transformacion y la congregacion de protoplastos, la transduccion y la fusion de protoplastos, son ampliamente conocidos y adecuados para su utilizacion en la presente invencion. Se utilizan metodos de transformacion para introducir un vector o constructo de ADN que comprende un acido nucleico que codifica una variante de proteasa de la invencion en una celula huesped. Los metodos conocidos en el ambito de especializacion para transformar celulas de Bacillus incluyen metodos como transformacion de recuperacion de un marcador plasmfdico, que conlleva la absorcion de un plasmido donante por celulas competentes que portan un plasmido residente parcialmente homologo (Contente et al., Plasmid 2:555-571 (1979); Haima et al., Mol. Gen. Genet. 223:185-191 (1990); Weinrauch et al., J. Bacteriol. 154:1077-1087 (1983); y Weinrauch et al., J. Bacteriol. 169:1205-1211 (1987)). En este metodo, el plasmido donante entrante se recombina con la region homologa del plasmido «auxiliar» residente en un proceso que imita la transformacion cromosomica.

[0186] Ademas de los metodos utilizados comunmente, en algunos modos de realizacion, las celulas huesped se transforman directamente con un vector o constructo de ADN que comprende un acido nucleico que codifica una variante de proteasa de la invencion (esto es, no se utiliza una celula intermedia para amplificar o procesar de cualquier otra forma el vector o constructo de ADN antes de su introduccion en la celula huesped). La introduccion del vector o constructo de ADN de la invencion en la celula huesped incluye los metodos ffsicos y qrnmicos conocidos en el ambito de especializacion para introducir una secuencia de acido nucleico (p. ej., secuencia de ADN) en una celula huesped sin insercion en un plasmido o vector. Dichos metodos incluyen, sin caracter limitativo, precipitacion con cloruro de calcio, electroporacion, ADN desnudo, liposomas y similares. En modos de realizacion adicionales, el vector o los constructos de ADN se cotransforman con un plasmido sin insertarse en el plasmido. En otros modos de realizacion, se deleciona un marcador selectivo de la cepa de Bacillus alterada utilizando metodos conocidos en el ambito de especializacion (vease Stahl et al., J. Bacteriol. 158:411-418 (1984); y Palmeros et al., Gene 247:255 -264 (2000)).

[0187] En algunos modos de realizacion, las celulas transformadas de la presente invencion se cultivan en medios nutrientes convencionales. Las condiciones de cultivo espedficas adecuadas, como la temperatura, el pH y similares son conocidas por los expertos en la materia. Ademas, algunas condiciones de cultivo pueden encontrarse en la literatura cientffica, como en Hopwood (2000) Practical Streptomyces Genetics, John Innes Foundation, Norwich UK; Hardwood et al., (1990) Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley y de la American Type Culture Collection (ATCC). En un aspecto, la invencion proporciona un cultivo (p. ej., cultivo celular) que comprende al menos una variante de proteasa o al menos un acido nucleico de la invencion. Tambien se proporciona una composicion que comprende al menos un acido nucleico, vector o constructo de ADN de la invencion.

[0188] En algunos modos de realizacion, las celulas huesped transformadas con al menos una secuencia polinucleotidica que codifica al menos una variante de proteasa de la invencion se cultivan en un medio nutriente adecuado en condiciones que permiten la expresion de la proteasa presente, tras lo cual se recupera la proteasa resultante del cultivo. El medio utilizado para cultivar las celulas comprende cualquier medio convencional adecuado para el cultivo de las celulas huesped, como medios complejos o mmimos que contienen suplementos apropiados. Los medios adecuados han sido comercializados por proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con las formulas publicadas (p. ej., en catalogos de la American Type Culture Collection). En algunos modos de realizacion, la proteasa producida por las celulas se recupera del medio de cultivo por procedimientos convencionales, incluyendo, sin caracter limitativo, p. ej., separar las celulas huesped del medio por centrifugacion o filtracion, precipitar los componentes protemicos del sobrenadante o filtrado mediante una sal (p. ej., sulfato de amonio), purificacion cromatografica (p. ej., intercambio de iones, filtracion por gel, afinidad, etc.). Puede utilizarse cualquier metodo adecuado para recuperar o purificar una variante de proteasa de la invencion.

[0189] En un aspecto, una variante de proteasa producida por una celula huesped recombinante se secreta en el medio de cultivo. Una secuencia de acido nucleico que codifica un dominio que facilita la purificacion puede utilizarse para facilitar la purificacion de protemas solubles. Un vector o constructo de ADN que comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica una variante de proteasa puede comprender tambien una secuencia de acido nucleico que codifica un dominio que facilita la purificacion para facilitar la purificacion de la variante de proteasa (vease, p. ej., Kroll, D.J. et al., DNA Cell Biol. 12:441-53 (1993)). Dichos dominios que facilitan la purificacion incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., peptidos quelantes de metal como modulos histidina-triptofano que permiten la purificacion en metales inmovilizados (Porath J., Protein Expr. Purif. 3:263-281 (1992)), dominios de protema A que permiten la purificacion en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificacion por afinidad/extension FLAGS (Immunex Corp., Seattle, WA). La inclusion de una secuencia de enlace escindible como un Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificacion y la protema heterologa tambien resulta de utilidad para facilitar la purificacion.

[0190] Son ampliamente conocidos los ensayos para detectar y medir la actividad enzimatica de una enzima, como una variante de proteasa de la invencion. Tambien son ampliamente conocidos por los expertos en la materia varios ensayos para detectar y medir la actividad de las proteasas, como, p. ej., las variantes de

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proteasas de la invencion. En concreto, se dispone de ensayos para medir la actividad de proteasa que se basan en la liberacion de peptidos solubles en acido de casema o hemoglobina, medida como absorbancia a 280 nm o de forma colorimetrica utilizando el metodo de Folin (vease, p. ej., Bergmeyer et al., "Methods of Enzymatic Analysis" vol. 5, Peptidases, Proteinases and their Inhibitors, Verlag Chemie, Weinheim (1984)). Otros ejemplos de ensayos implican la solubilizacion de sustratos cromogenicos (vease, p. ej., Ward, "Proteinases," en Fogarty (ed.)., Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, London, (1983), pp. 251-317). Otros ejemplos de ensayos incluyen, sin caracter limitativo, el ensayo con succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-para nitroanilanida (SAApFpNA) y el ensayo con acido 2,4,6-trinitrobenceno sulfonico (ensayo TBNS). Numerosas referencias adicionales conocidas por los expertos en la materia proporcionan metodos adecuados (vease, p. ej., Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7911-7925 (1983); Christianson et al., Anal. Biochem. 223:119 -129 (1994); y Hsia et al., Anal Biochem. 242:221-227 (1999)).

[0191] Puede utilizarse una variedad de metodos para determinar el nivel de produccion de una proteasa madura (p. ej., variante de proteasa madura de la invencion) en una celula huesped. Dichos metodos incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., metodos que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales espedficos para la proteasa. Entre los ejemplos de metodos se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., los ensayos de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA, por sus siglas en ingles), los radioinmunoensayos (RIA, por sus siglas en ingles), los inmunoensayos fluorescentes (FIA, por sus siglas en ingles) y la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en ingles). Estos y otros ensayos son ampliamente conocidos en el ambito de especializacion (vease, p. ej., Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211 (1983)).

[0192] En otro aspecto, la invencion proporciona metodos para elaborar o producir una variante de proteasa madura de la invencion, tal como se define en las reivindicaciones. Una variante de proteasa madura no incluye un peptido senal o una secuencia propeptidica. Algunos de dichos metodos comprenden la elaboracion o produccion de una variante de proteasa de la invencion en una celula huesped bacteriana recombinante, como, p. ej., una celula de Bacillus sp. incluida, p. ej., una celula de Bacillus subtilis. En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para producir una variante de proteasa de la invencion, comprendiendo el metodo el cultivo de una celula huesped recombinante que comprende un vector de expresion recombinante que comprende un acido nucleico que codifica una variante de proteasa de la invencion en condiciones propicias para la produccion de la variante de proteasa. Algunos de dichos metodos comprenden tambien recuperar la variante de proteasa del cultivo.

[0193] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para producir una variante de proteasa de la invencion, comprendiendo el metodo: (a) introducir un vector de expresion recombinante que comprende un acido nucleico que codifica una variante de proteasa de la invencion en una poblacion celular (p. ej., celulas bacterianas, como celulas de Bacillus subtilis); y (b) cultivar las celulas en un medio de cultivo en condiciones propicias para producir la variante de proteasa codificada por el vector de expresion. Algunos de dichos metodos comprenden tambien: (c) aislar la variante de proteasa de las celulas o del medio de cultivo.

Composiciones de limpieza de la invencion

[0194] En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion (p. ej., una composicion de limpieza) que comprende uno o mas polipeptidos (p. ej., variantes de proteasas) de la invencion, tal como se define en las reivindicaciones. Dichas composiciones pueden comprender al menos un excipiente o portador y/u otro sustituyente, componente o material. Tal como se analiza en mayor profundidad en el presente documento, los polipeptidos de la invencion, entre los que se incluyen las variantes de proteasas de la invencion, son de utilidad en una variedad de aplicaciones de limpieza, incluidas aplicaciones de limpieza de la colada, aplicaciones de lavado de la vajilla de forma automatica, aplicaciones de lavado de la vajilla a mano, aplicaciones de limpieza para superficies duras y otras aplicaciones descritas en el presente documento. En consecuencia, por ejemplo, en un aspecto, la invencion proporciona composiciones de limpieza que comprenden al menos un polipeptido (p. ej., variante de proteasa) de la invencion, tal como se define en las reivindicaciones. Como se ha indicado previamente, dichas composiciones de limpieza incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., composiciones detergentes para el lavado de la vajilla de forma automatica y manual, composiciones detergentes para la colada (incluyendo, p. ej., composiciones detergentes para la colada lfquidas y en polvo), composiciones de limpieza para superficies duras (incluyendo, sin caracter limitativo, p. ej., superficies duras de un ardculo que no sea un artfculo de vajilla, un artfculo que no sea un artfculo de mesa, una mesa, un tablero, un mueble, una pared, el suelo, el techo, etc.). Dichas composiciones de limpieza, que son utiles en metodos para limpiar un artfculo o una superficie que sea necesario limpiar, pueden comprender, p. ej., sin caracter limitativo, al menos un excipiente o portador y/u otro sustituyente, componente o material. En un aspecto, la invencion proporciona cualquier composicion de la invencion (p. ej., composicion de limpieza o composicion detergente) descrita en el presente documento y a lo largo del mismo, comprendiendo dicha composicion cualquier polipeptido de la invencion (p. ej., cualquier variante de proteasa o variante de subtilisina de la invencion) descrito en el presente documento y a lo largo del mismo, pero donde dicha composicion no es una composicion para el lavado de la vajilla de forma automatica (p. ej., composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica).

[0195] Salvo que se indique otra cosa, todos los niveles de componentes o composiciones que se proporcionan en la presente memoria se realizan en referencia al nivel activo de dicho componente o composicion y no

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incluyen impurezas, como por ejemplo subproductos o disolventes residuales, que pueden estar presentes en fuentes comercializadas. Los pesos de los componentes enzimaticos estan basados en la protema activa total. Todos los porcentajes y ratios se calculan en peso salvo que se indique otra cosa. Todos los porcentajes y ratios se calculan en funcion de la composicion total salvo que se indique otra cosa. En las composiciones detergentes ejemplificadas, los niveles de enzimas se expresan por enzima pura en peso de la composicion total y, a menos que se indique otra cosa, los componentes detergentes se expresan en peso de las composiciones totales.

[0196] Tal como se indica en el presente documento, en algunos modos de realizacion, las composiciones de limpieza de la presente invencion pueden comprender tambien uno o mas materiales adjuntos entre los que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., uno o mas surfactantes, mejoradores, blanqueadores, activadores del blanqueado, catalizadores del blanqueado, otras enzimas, sistemas de estabilizadores de enzimas, quelantes, abrillantadores opticos, polfmeros quitamanchas, agentes de transferencia de tintes, dispersantes, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, colorantes, sales de relleno, hidrotropos, fotoactivadores, fluorescentes, suavizantes de tejidos, surfactantes hidrolizables, conservantes, antioxidantes, agentes contra el encogimiento, agentes contra la formacion de arrugas, germicidas, fungicidas, motas de color, agentes para el cuidado de la plata, contra la perdida de lustre y/o contra la corrosion, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes, portadores, coadyuvantes de elaboracion, pigmentos, abrillantador (p. ej., un abrillantador que contenga al menos un surfactante para evitar la formacion de gotas de agua haciendo que el agua se drene de la superficie del artfculo que se esta limpiando en una fina lamina, en lugar de formando gotas) y/o agentes de control del pH (vease, p. ej., las patentes de los Estados Unidos con numero 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,ll5, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101). A continuacion, se ejemplifican de forma detallada algunos modos de realizacion de materiales espedficos que constituyen la composicion de limpieza. Si algun material de limpieza adjunto no es compatible con una variante de proteasa de la presente invencion en una composicion de limpieza deseada, se utiliza un metodo adecuado para mantener separados el material de limpieza adjunto y la(s) variante(s) de proteasa(s) (esto es, no en contacto entre sf) hasta que la combinacion de los dos componentes sea apropiada. Dichos metodos de separacion incluyen cualquier metodo adecuado conocido en el ambito de especializacion (p. ej., capsulas recubiertas de gelatina, encapsulacion, pastillas, separacion ffsica, etc.).

[0197] Las composiciones de limpieza de la presente invencion se emplean, de forma ventajosa, por ejemplo, en aplicaciones de lavado de la colada, aplicaciones de limpieza de superficies duras, aplicaciones de lavado de la vajilla de forma manual o a mano, aplicaciones de lavado de la vajilla de forma automatica, aplicaciones de limpieza de lentes oculares, asf como aplicaciones cosmeticas, como para el lavado de dentaduras, los dientes, el pelo y la piel. Debido a las ventajas unicas de la efectividad incrementada en soluciones con temperaturas mas bajas, las enzimas de variantes de proteasas de la presente invencion son adecuadas para aplicaciones de lavado de la colada y aplicaciones de lavado de la vajilla, incluidas las aplicaciones de lavado de la vajilla de forma automatica y a mano. Ademas, las enzimas de variantes de proteasas de la presente invencion son de utilidad en composiciones solidas, lfquidas, granuladas y/o en gel, incluidas formulaciones y/o composiciones detergentes solidas, lfquidas, granuladas y/o en gel.

[0198] Las variantes de proteasas de la presente invencion tambien son de utilidad en composiciones de productos de limpieza aditivos. En algunos modos de realizacion, una variante de proteasa de la invencion es util en metodos y aplicaciones de limpieza con solucion a baja temperatura. En un aspecto, la invencion proporciona composiciones de productos aditivos de limpieza que incluyen al menos una enzima de variante de proteasa de la presente invencion y que son ideales para su inclusion en un proceso de lavado cuando se desea una efectividad de blanqueado adicional. Dichos ejemplos incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., aplicaciones de limpieza con solucion a baja temperatura. En algunos modos de realizacion, la composicion de producto aditivo se encuentra en su forma mas simple, esto es, una o mas variantes de proteasas de la invencion. En algunos modos de realizacion, la composicion de producto aditivo se envasa en forma de dosis para su adicion en un proceso de limpieza. En algunos modos de realizacion, la composicion de producto aditivo se envasa en forma de dosis para su adicion en un proceso de limpieza donde se emplea una fuente de peroxfgeno y se desea una efectividad de blanqueado incrementada. Puede utilizarse cualquier forma de unidad de dosis unica adecuada, incluyendo, sin caracter limitativo, p. ej., pfldoras, pastillas, capsulas recubiertas de gelatina u otra unidad de dosis unica, como lfquidos o polvos medidos previamente. En consecuencia, en un aspecto, la invencion proporciona una composicion de producto de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion, donde el producto se formula en de forma adecuada (p. ej., como un lfquido, un solido en polvo, una pfldora, una pastilla, una capsula recubierta de gelatina u otra forma adecuada) en una unidad de dosis unica adecuada de forma que se proporcione una dosis unica de la variante de proteasa. Dichos productos de limpieza son utiles en una variedad de metodos y aplicaciones de limpieza, entre los que se incluyen, sin caracter limitativo, metodos y aplicaciones de lavado de la colada a maquina o a mano, metodos y aplicaciones de lavado de la vajilla a mano o de forma automatica, etc. Dichos metodos y aplicaciones de limpieza pueden llevarse a cabo a una temperatura baja o en condiciones de pH bajo. En algunos modos de realizacion, se incluye al menos un material portador y/o al menos un material de relleno para incrementar el volumen de dichas composiciones. Entre los materiales portadores o de relleno se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., varias sales de sulfato, carbonato y silicato, asf como talco, arcilla y similares. Entre los materiales portadores o de relleno adecuados para composiciones lfquidas se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., agua o alcoholes primarios y secundarios

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de bajo peso molecular que incluyen polioles y dioles. Entre los ejemplos de dichos alcoholes se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., metanol, etanol, propanol e isopropanol. En algunos modos de realizacion, las composiciones contienen desde aproximadamente un 5 % hasta aproximadamente un 90 % de dichos materiales portadores o de relleno. Pueden incluirse materiales de relleno acidos en dichas composiciones para reducir el pH de la solucion resultante en el metodo o la aplicacion de limpieza. De forma alternativa, en algunos modos de realizacion, el aditivo de limpieza incluye uno o mas componentes adjuntos, como se describe de forma mas completa posteriormente.

[0199] Las presentes composiciones de limpieza y aditivos de limpieza requieren una cantidad efectiva de al menos una variante de proteasa de la invencion, sola o en combinacion con otras proteasas y/o enzimas adicionales. El nivel requerido de enzima se obtiene mediante la adicion de una o mas variantes de proteasas de la invencion. Normalmente, una composicion de limpieza comprende al menos aproximadamente un 0,0001 por ciento en peso hasta aproximadamente un 20 por ciento en peso, desde aproximadamente un 0,0001 hasta aproximadamente un 10 por ciento en peso, desde aproximadamente un 0,0001 hasta aproximadamente un 1 por ciento en peso, desde aproximadamente un 0,001 hasta aproximadamente un 1 por ciento en peso, o desde aproximadamente un 0,01 hasta aproximadamente un 0,1 por ciento en peso de al menos una variante de proteasa de la invencion. En un aspecto, una composicion de la invencion (p. ej., composicion de limpieza de la invencion) comprende desde aproximadamente 0,01 miligramos (mg) hasta aproximadamente 10 mg, aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 5 mg, aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 2 mg, aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 1 mg, aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 10 mg, aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5 mg, aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 4 mg,

aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 4 mg, aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 3 mg,

aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2 mg, aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 1 mg,

aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 mg, aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5 mg, aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 4 mg, aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 3 mg,

aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 2 mg, aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 2 mg,

aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1 mg, aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 0,5 mg de al menos una variante de proteasa activa de la invencion por gramo de la composicion.

[0200] Las composiciones de limpieza de la invencion se formulan normalmente de forma que, durante su uso en operaciones de limpieza acuosa, el agua de lavado tenga un pH desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 11.5 o incluso desde aproximadamente 7.5 hasta aproximadamente 10.5. Las formulaciones o composiciones de producto lfquido se formulan normalmente para tener un pH puro desde aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 9.0 o desde aproximadamente 3.0 a aproximadamente 5.0. Las composiciones de producto de lavado para la colada granulado se formulan normalmente para tener un pH desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 11. Las composiciones detergentes de lavado de vajilla de forma automatica y a mano se formulan normalmente para tener un pH desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 11.5, entre los que se incluyen, sin caracter limitativo, rangos de pH de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10, desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 11.5, y desde aproximadamente 9.5 hasta aproximadamente 11.5 dependiendo del metodo y de la aplicacion espedfica. Las tecnicas para controlar el pH en los niveles de uso recomendados incluyen el uso de tampones, alcalis, acidos, etc., y son ampliamente conocidas por los expertos en la materia.

[0201] Las composiciones de limpieza con pH bajo adecuadas tienen normalmente un pH puro desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5 y no suelen contener surfactantes que se hidrolicen en tal entorno de pH. Dichos surfactantes incluyen surfactantes de alquil sulfato de sodio que comprenden al menos una fraccion de oxido de etileno o incluso desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 16 moles de oxido de etileno. Dichas composiciones de limpieza comprenden normalmente una cantidad suficiente de un modificador de pH, como hidroxido sodico, monoetanolamina o acido clorhndrico, para proporcionar a dicha composicion de limpieza un pH puro desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5. Dichas composiciones comprenden normalmente al menos una enzima estable en acido. En algunos modos de realizacion, las composiciones son lfquidas, mientras que en otros modos de realizacion, estas son solidas. El pH de dichas composiciones lfquidas se mide normalmente como un pH puro. El pH de dichas composiciones solidas se mide como un 10 % de solucion de solidos de dicha composicion donde el disolvente es agua destilada. En estos modos de realizacion, todas las mediciones del pH se toman a 20 °C, a menos que se indique otra cosa.

[0202] En algunos modos de realizacion, cuando la(s) variante(s) de proteasa(s) de la invencion se emplea(n) en una composicion granulada o lfquida, se desea que la variante de proteasa se encuentre en la forma de una partfcula encapsulada para proteger la variante de proteasa de otros componentes de la composicion granulada durante su almacenamiento. Ademas, la encapsulacion tambien es un medio para controlar la disponibilidad de la(s) variante(s) de proteasa(s) durante el proceso de limpieza. En algunos modos de realizacion, la encapsulacion potencia la eficacia de la(s) variante(s) de proteasa(s) y/o enzimas adicionales. En este sentido, las variantes de proteasas de la presente invencion se encapsulan con cualquier material de encapsulacion adecuado conocido en el ambito de especializacion. En algunos modos de realizacion, el material de encapsulacion normalmente encapsula al menos parte del catalizador para la(s) variante(s) de proteasa(s) de la invencion. Normalmente, el material de encapsulacion es soluble en agua y/o dispersable en agua. En algunos

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modos de realizacion, el material de encapsulacion tiene una temperatura de transicion vftrea (Tg) de 0 °C o mayor. La temperatura de transicion vftrea se describe en mayor detalle en WO 97/11151. El material de encapsulacion se selecciona normalmente del grupo que consta de carbohidratos, gomas sinteticas o naturales, quitina, chitosan, celulosa y derivados de celulosa, silicatos, fosfatos, boratos, alcohol polivimlico, polietilenglicol, ceras de parafina y combinaciones de los mismos. Cuando el material de encapsulacion es un carbohidrato, se selecciona normalmente de entre monosacaridos, oligosacaridos, polisacaridos y combinaciones de los mismos. En algunos modos de realizacion tfpicos, el material de encapsulacion es un almidon (vease, p. ej., EP 0 922 499; las patentes de los Estados Unidos con numero 4,977,252, 5,354,559 y 5,935,826). En algunos modos de realizacion, el material de encapsulacion es una microesfera hecha de plastico como termoplasticos, acrilonitrilo, metacrilonitrilo, poliacrilonitrilo, polimetacrilonitrilo y mezclas de los mismos; entre las microesferas comercializadas que son de utilidad se encuentran, sin caracter limitativo, las suministradas por EXPANCEL® (Stockviksverken, Suecia) y PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® y SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA).

[0203] Como se describe en el presente documento, las variantes de proteasas de la invencion son de especial utilidad en los metodos y aplicaciones de limpieza, entre los que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., composiciones detergentes para el lavado de la vajilla de forma automatica, el lavado de la vajilla a mano, la colada y la limpieza. Estas aplicaciones someten las enzimas a varios niveles de exigencia ambiental. Las variantes de proteasas de la invencion proporcionan ventajas con respecto a muchas enzimas utilizadas en la actualidad en tales aplicaciones de limpieza debido a su actividad proteolftica y estabilidad en varias condiciones.

[0204] De hecho, existe una variedad de condiciones de lavado, entre las que se incluyen extensiones de tiempo de lavado, temperaturas del agua de lavado, volumenes del agua de lavado y formulaciones detergentes variables, a las que se exponen las proteasas empleadas en el lavado. Ademas, las formulaciones detergentes utilizadas en areas geograficas distintas tienen distintas concentraciones de sus componentes pertinentes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, los detergentes europeos tienen aproximadamente 4500-5000 partes por millon (ppm) de componentes detergentes en el agua de lavado, mientras que los detergentes japoneses tienen aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. En America del Norte, concretamente en los Estados Unidos, los detergentes tienen normalmente aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

[0205] Un sistema de baja concentracion de detergente incluye los detergentes en los que menos de aproximadamente 800 ppm de componentes detergentes se encuentran presentes en el agua de lavado. Los detergentes japoneses suelen adscribirse al sistema de baja concentracion de detergente, dado que tienen aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

[0206] Una concentracion de detergente media incluye los detergentes en los que entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes estan presentes en el agua de lavado. Los detergentes norteamericanos se adscriben, por lo general, a los sistemas de concentracion de detergente media, dado que tienen aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Brasil tiene normalmente aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado.

[0207] Un sistema de alta concentracion de detergente incluye los detergentes en los que mas de aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes se encuentran presentes en el agua de lavado. Los detergentes europeos se adscriben, por lo general, a los sistemas de alta concentracion de detergente, dado que tienen aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado.

[0208] Los detergentes latinoamericanos son generalmente detergentes con mejoradores de fosfato con altos niveles de jabonadura,y la gama de detergentes utilizada en Latinoamerica puede adscribirse tanto a las concentraciones de detergente medias como a las altas, dado que las mismas vanan entre 1500 ppm y 6000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Como se ha mencionado anteriormente, Brasil tiene normalmente aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Sin embargo, otras zonas geograficas con detergentes con mejoradores de fosfato con altos niveles de jabonadura, no limitadas a otros pafses de Latinoamerica, pueden tener sistemas de alta concentracion de detergente de hasta aproximadamente 6000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

[0209] En vista de lo anterior, es evidente que las concentraciones de composiciones detergentes en las soluciones tfpicas de lavado en todo el mundo vanan desde menos de aproximadamente 800 ppm de composicion detergente (“zonas geograficas con baja concentracion de detergente”), por ejemplo, aproximadamente 667 ppm en Japon, hasta aproximadamente 800 ppm a aproximadamente 2000 ppm (“zonas geograficas con concentracion de detergente media”), por ejemplo, aproximadamente 975 ppm en EE. UU. y aproximadamente 1500 ppm en Brasil, hasta mas de aproximadamente 2000 ppm (“zonas geograficas con alta concentracion de detergente”), por ejemplo, aproximadamente 4500 ppm a aproximadamente 5000 ppm en Europa y aproximadamente 6000 ppm en zonas geograficas con mejoradores de fosfato con altos niveles de jabonadura.

[0210] Las concentraciones de las soluciones tfpicas de lavado se determinan de forma empmca. Por ejemplo, en los EE. UU., una maquina lavadora tfpica soporta un volumen de aproximadamente 64,4 l de solucion de

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lavado. Por consiguiente, para obtener una concentracion de aproximadamente 975 ppm de detergente en la solucion de lavado hay que anadir aproximadamente 62,79 g de composicion detergente a los 64,4 l de solucion de lavado. Esta cantidad es la cantidad tfpica introducida en el agua de lavado por el usuario al utilizar la cubeta de medida proporcionada con el detergente.

[0211] Como ejemplo adicional, distintas zonas geograficas utilizan distintas temperaturas de lavado. La temperature del agua de lavado en Japon es normalmente inferior a la utilizada en Europa. Por ejemplo, la temperature del agua de lavado en America del Norte y Japon se encuentra normalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 °C (p. ej., aproximadamente 20 °C), mientras que la temperatura del agua de lavado en Europa se encuentra normalmente entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60 °C (p. ej., aproximadamente 40 °C). No obstante, en aras de ahorrar energfa, muchos consumidores estan pasando a utilizar el lavado en agua fna. Ademas, en algunas otras regiones, normalmente se emplea agua fna para la colada, asf como para aplicaciones de lavado de la vajilla. En algunos modos de realizacion, el «lavado en agua fna» de la presente invencion utiliza lavado a temperaturas desde aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 40 °C, o desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 30 °C, o desde aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 25 °C, asf como cualquier otra combinacion en el rango que va desde aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 35 °C, y todos los rangos que se encuentran dentro de 10 °C y 40°C.

[0212] Como ejemplo adicional, distintas zonas geograficas tienen normalmente distinta dureza del agua. La dureza del agua suele describirse en terminos de granos por galon de Ca2+/Mg2+ mezclados. La dureza es una medida de la cantidad de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) en el agua. La mayona del agua en los Estados Unidos es dura, pero el grado de dureza vana. El agua moderadamente dura (60-120 ppm) a dura (121-181 ppm) tiene de 60 a 181 partes por millon (partes por millon convertido a granos por galon estadounidense es # ppm dividido entre 17,1 igual a granos por galon) de minerales de dureza.

Agua

Granos por galon Partes por millon

Blanda

Menor que 1,0 Menor que 17

Ligeramente dura

1,0 a 3,5 17 a 60

Moderadamente dura

3,5 a 7,0 60 a 120

Dura

7,0 a 10,5 120 a 180

Muy dura

Mayor que 10,5 Mayor que180

[0213] La dureza del agua europea es normalmente mayor que 10,5 (p. ej., aproximadamente de 10,5 hasta aproximadamente 20,0) granos por galon de Ca2+/Mg2+ mezclados (p. ej., aproximadamente 15 granos por galon de Ca2+;Mg2+ mezclados). La dureza del agua norteamericana es normalmente mayor que la dureza del agua japonesa, pero menor que la dureza del agua europea. Por ejemplo, la dureza del agua del agua norteamericana puede ser de entre aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 granos, aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 granos, o aproximadamente 6 granos. La dureza del agua japonesa suele ser menor que la dureza del agua norteamericana, normalmente menor que aproximadamente 4, por ejemplo aproximadamente 3 granos por galon de Ca2+/Mg2+ mezclados.

[0214] Por consiguiente, en algunos aspectos, la invencion proporciona variantes de proteasas que muestran una eficacia de lavado sorprendente en al menos un conjunto de condiciones de lavado (p. ej., temperatura del agua, dureza del agua y/o concentracion de detergente). En algunos aspectos, las variantes de proteasas de la invencion son comparables en eficacia de lavado con otras subtilisina proteasas. En algunos aspectos, las variantes de proteasas de la presente invencion exhiben una eficacia de lavado potenciada en comparacion con las subtilisina proteasas comercializadas en la actualidad. En consecuencia, en algunos aspectos de la invencion, las variantes de proteasas proporcionadas en el presente documento exhiben una estabilidad oxidativa potenciada, una estabilidad termica potenciada, capacidades de limpieza potenciadas en varias condiciones y/o estabilidad quelante potenciada. Ademas, las variantes de proteasas de la invencion son de utilidad en composiciones de limpieza que no incluyan detergentes, de nuevo por sf solas o en combinacion con mejoradores y estabilizadores.

[0215] En un aspecto, la invencion proporciona una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa de la presente invencion que esta presente a un nivel desde aproximadamente un 0,00001 % hasta aproximadamente un 10 % en peso de la composicion con el resto (p. ej., aproximadamente un 99,999% hasta aproximadamente un 90,0 %) comprendiendo uno o mas materiales de limpieza adjuntos en peso de la composicion. En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion que esta presente a un nivel desde aproximadamente un 0,0001 % hasta aproximadamente un 10 %, aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente un 5 %,

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aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 2 %, o aproximdamente un 0,005 % hasta aproximadamente un 0,5 % en peso de la composicion con el resto de la composicion de limpieza (p. ej., aproximadamente un 99,9999 % hasta aproximadamente un 90,0 %, aproximadamente un 99,999 % hasta aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99,995 % hasta aproximadamente un 99,5 % en peso) comprendiendo uno o mas materiales de limpieza adjuntos.

[0216] En algunos aspectos, una composicion de limpieza de la invencion comprende, ademas de al menos una variante de proteasa de la invencion, una o mas enzimas adicionales, que proporcionan beneficios de eficacia de limpieza y/o cuidado de tejidos y/o lavado de la vajilla de forma manual o a mano y/o lavado de la vajilla de forma automatica. Entre los ejemplos de enzimas adecuadas se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., hemicelulasas, celulasas, peroxidasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, pectato liasas, mananasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, p-glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, lacasa y/o amilasas, enzimas de metaloproteasa neutra (abreviadas como «nprE»), o mezclas de las mismas. En algunos aspectos, la composicion de limpieza comprende, ademas de al menos una variante de proteasa de la invencion, una combinacion de enzimas adicionales (esto es, un «coctel») que comprende enzimas aplicables convencionales como, p. ej., al menos una proteasa, lipasa, cutinasa, celulosa y/o amilasa adicional.

[0217] Ademas de las variantes de proteasas proporcionadas en el presente documento, cualquier otra proteasa adecuada puede ser de utilidad e incluirse en una composicion de la invencion. En un aspecto, la invencion proporciona una composicion (p. ej., composicion de limpieza) que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y al menos una proteasa adicional. Entre las proteasas adecuadas se incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. En un modo de realizacion, puede incluirse una proteasa microbiana. Puede incluirse un mutante de una proteasa modificado geneticamente o qmmicamente. En un aspecto, la al menos una proteasa adicional es una serina proteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a la tripsina. Entre los ejemplos de proteasas alcalinas se incluyen las subtilisinas, especialmente las derivadas de Bacillus (p. ej., subtilisina, subtilisina de B. lentus (esto es, GG36), subtilisina de B. amyloliquefaciens (esto es, BPN'), subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147, PB92, y subtilisina 168). Algunos ejemplos adicionales incluyen las proteasas mutantes (esto es, variantes de proteasas) descritas en las patentes de los Estados Unidos con numero RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936 y 6,482,628. Algunas proteasas adicionales incluyen, sin caracter limitativo, la tripsina (p. ej., de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270. Una composicion de la invencion que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion tambien puede comprender al menos una enzima de proteasa comercializada. Las enzimas de proteasa comercializadas que son de utilidad en las composiciones de la presente invencion incluyen, sin caracter limitativo, MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAX™, EXCELLASE™, y PURAFAST™ (Genencor); ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE®, LIQUANASE®, NEUTRASE®, RELASE® y ESPERASE® (Novozymes); subtilisina de Bacillus alkalophilus KAP con A230V+S256G+S259N (Kao); y proteasa de B. lentus BLAP™, BLAP X y BLAP S ((Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Dusseldorf, Alemania). Algunas proteasas adicionales que pueden incluirse en composiciones de la invencion incluyen las descritas en WO95/23221, WO 92/21760, la patente de los Estados Unidos con numero de publicacion 2008/0090747, y las patentes de los Estados Unidos con numero 5,801,039, 5,340,735, 5,500,364, 5,855,625, RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936 y 6,482,628, asf como en varias otras patentes. Pueden incluirse metaloproteasas en las composiciones de la invencion. Entre dichas metaloproteasas se incluye, sin caracter limitativo, la enzima de metaloproteasa neutra (nprE) descrita en WO 07/044993.

[0218] En un aspecto, la invencion proporciona una composicion (p. ej., composicion de limpieza) que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y al menos una lipasa. Entre las lipasas adecuadas se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., las de origen bacteriano o fungico. En la composicion de la invencion, puede incluirse un mutante de una lipasa modificado geneticamente o qmmicamente. Entre los ejemplos de lipasas utiles se incluyen la lipasa de Humicola lanuginosa (vease, p. ej., EP 258 068 y EP 305 216), la lipasa de Rhizomucor miehei (vease, p. ej., EP 238 023), la lipasa de Candida, como la lipasa de C. antartica (p. ej., lipasa de C. antartica A o B; vease, p. ej., EP 214 761), las lipasas de Pseudomonas como la lipasa de P. alcaligenes y la lipasa de P. pseudoalcaligenes (vease, p. ej., EP 218 272), la lipasa de P. cepacia (vease, p. ej., EP 331 376), la lipasa de P. stutzeri (vease, p. ej., GB 1,372,034), la lipasa de P. fluorescens, la lipasa de Bacillus (p. ej., la lipasa de B. subtilis (Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 (1993)); la lipasa de B. stearothermophilus (vease, p. ej., JP 64/744992); y la lipasa de B. pumilus (vease, p. ej., WO 91/16422)).

[0219] Ademas, un numero de lipasas clonadas son de utilidad en composiciones (p. ej,. composiciones de limpieza) de la presente invencion, entre las que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., la lipasa de Penicillium camembertii (Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 (1991)), la lipasa de Geotricum candidum (Schimada et al., J. Biochem. 106:383-388 (1989)) y varias lipasas de Rhizopus, como la lipasa de R. delemar (Hass et al., Gene 109:117-113 (1991)), una lipasa de R. niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 (1992)) y la lipasa de R. oryzae.

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[0220] Otros tipos de enzimas lipolfticas, como las cutinasas, tambien son de utilidad en algunos modos de realizacion de la presente invencion, entre los que se incluyen, sin caracter limitativo, por ejemplo, la cutinasa derivada de Pseudomonas mendocina (vease WO 88/09367) y la cutinasa derivada de Fusarium solani pisi (vease WO 90/09446).

[0221] Las lipasas adecuadas adicionales incluyen lipasas comercializadas como M1 LIPASE™, LUMA FAST™ y LIPOMAX™ (Genencor); LIPOLASE® y LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); y LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japon).

[0222] En algunos modos de realizacion, la invencion proporciona composiciones (p. ej., composiciones de limpieza) que comprenden al menos una variante de proteasa de la invencion y al menos una lipasa que esta presente a un nivel de aproximadamente un 0,00001 % hasta aproximadamente un 10 % de lipasa adicional en peso de la composicion y el resto de uno o mas materiales de limpieza adjuntos en peso de la composicion. En un aspecto, una composicion de limpieza de la presente invencion comprende, ademas de al menos una variante de proteasa de la invencion, al menos una lipasa a un nivel de aproximadamente un 0,0001 % hasta aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 2 % o aproximadamente un 0,005 % hasta aproximadamente un 0,5 % de lipasa en peso de la composicion de limpieza.

[0223] Tambien se incluye una composicion (p. ej., composicion de limpieza) que comprende al menos una variante de la invencion y al menos una amilasa. Cualquier amilasa (p. ej., alfa y/o beta) adecuada para su utilizacion en soluciones alcalinas puede ser util para su inclusion en tal composicion. Entre las amilasas adecuadas se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., las de origen bacteriano o fungico. Puede incluirse un mutante de una amilasa modificado geneticamente o qmmicamente. Entre las amilasas que son de utilidad en composiciones de la invencion se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., las alfa-amilasas obtenidas de B. licheniformis (vease, p. ej., GB 1,296,839). Entre las amilasas comercializadas que son de utilidad en composiciones de la invencion se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA® y BAN™ (Novozymes), asf como POWERASE™, RAPIDASE® y MAXAMYL® P (Genencor).

[0224] En un aspecto, la invencion proporciona una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa o al menos una amilasa, donde la amilasa esta presente a un nivel de aproximadamente un 0,00001 % hasta aproximadamente un 10 % de amilasa adicional en peso de la composicion y el resto de uno o mas materiales de limpieza adjuntos en peso de la composicion. En otro aspecto, la invencion incluye una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa y al menos una amilasa que esta presente a un nivel de aproximadamente un 0,0001 % hasta aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 0,005 % hasta aproximadamente un 0,5 % de amilasa en peso de la composicion.

[0225] Cualquier celulasa adecuada puede ser de utilidad en una composicion de limpieza de la presente invencion. En un aspecto, la invencion proporciona una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y una o al menos una celulasa. Entre las celulasas adecuadas se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., las de origen bacteriano o fungico. En una composicion de la invencion, puede incluirse un mutante de una celulasa modificado geneticamente o qmmicamente. Entre las celulasas adecuadas se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., las celulasas de Humicola insolens (vease, p. ej., la patente de los Estados Unidos con numero 4,435,307) y las celulasas que tienen beneficios para el cuidado del color (vease, p. ej., EP 0 495 257). En el ambito de especializacion, se conocen celulasas adecuadas adicionales. Entre las celulasas comercializadas que son de utilidad y pueden incluirse en una composicion de la invencion se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., CELLUZYME®, CAREZYME® (Novozymes) y KAC-500(B)™ (Kao Corporation). En algunos modos de realizacion, las celulasas se incorporan como partes o fragmentos de celulasas naturales o variantes de celulasas maduras, donde se deleciona una parte del N-terminal (vease, p. ej., la patente de los Estados Unidos con numero 5,874,276). En un aspecto, una composicion de limpieza de la invencion comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y al menos una celulasa a un nivel desde aproximadamente un 0,00001 % hasta aproximadamente un 10 % de celulasa adicional en peso de la composicion y el resto de uno o mas materiales de limpieza adjuntos en peso de la composicion. En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y al menos una celulasa a un nivel de aproximadamente un 0,0001 % hasta aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 0,005 % hasta aproximadamente un 0,5 % de celulasa en peso de la composicion.

[0226] Cualquier mananasa adecuada para su utilizacion en composiciones detergentes tambien es de utilidad y, por tanto, puede incluirse en una composicion de limpieza de la invencion. En un aspecto, la invencion proporciona una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y al menos una mananasa. Entre las mananasas adecuadas se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., las de origen bacteriano o fungico. En una composicion de la invencion, puede incluirse un mutante de una mananasa modificado geneticamente o qmmicamente. Se conocen varias mananasas que son utiles y pueden incluirse en una composicion de la invencion (vease, p. ej., las mananasas descritas en las patentes de los Estados Unidos

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con numero 6,566,114, 6,602,842 y 6,440,991). En un aspecto, la invencion proporciona una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y al menos una mananasa a un nivel desde aproximadamente un 0,00001 % hasta aproximadamente un 10 % de mananasa adicional en peso de la composicion y el resto de uno o mas materiales de limpieza adjuntos en peso de la composicion. En algunas de dichas composiciones de limpieza, cada mananasa esta presente a un nivel de aproximadamente un 0,0001 % hasta aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 2 % o aproximadamente un 0,005 % hasta aproximadamente un 0,5 % de mananasa en peso de la composicion.

[0227] En una composicion de la invencion, puede utilizarse una peroxidasa en combinacion con peroxido de hidrogeno o una fuente del mismo (p. ej., un percarbonato, perborato o persulfato) en una composicion de la invencion. En una composicion de la invencion, puede utilizarse una oxidasa en combinacion con oxfgeno. Ambos tipos de enzimas se utilizan para una «solucion de blanqueado» (esto es, para evitar la transferencia de un tinte textil de un tejido tintado a otro tejido cuando los tejidos se lavan juntos en un bano de lavado), preferiblemente junto con un agente potenciador (vease, p. ej., WO 94/12621 y WO 95/01426). Entre las peroxidasas/oxidasas adecuadas que pueden incluirse en composiciones de la invencion se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., las de origen bacteriano, fungico o vegetal. En una composicion de la invencion, puede incluirse un mutante de una peroxidasa u oxidasa modificado geneticamente o qmmicamente. En un aspecto, la invencion proporciona una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y al menos una enzima oxidasa y/o al menos una peroxidasa. Cada dicha peroxidasa u oxidasa puede estar presente en la composicion a un nivel desde aproximadamente un 0,00001 % hasta aproximadamente un 10 % de peroxidasa u oxidasa adicional en peso de la composicion y el resto de uno o mas materiales de limpieza adjuntos en peso de la composicion. En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion de limpieza que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y al menos una enzima oxidasa y/o al menos una peroxidasa, donde cada dicha peroxidasa u oxidasa esta presente a un nivel de aproximadamente un 0,0001 % hasta aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 2 %, o aproximadamente un 0,005 % hasta aproximadamente un 0,5 % de enzima oxidasa o peroxidasa en peso de la composicion.

[0228] En un aspecto, la invencion proporciona una composicion (p. ej., composicion de limpieza) que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y una o mas enzimas adicionales son de utilidad, entre las que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., una o mas perhidrolasas (vease, p. ej., WO 05/056782).

[0229] En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion (p. ej., composicion de limpieza) que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y abarca una o mas mezclas de las enzimas anteriormente mencionadas, como, p. ej., una o mas proteasas, amilasas, lipasas, mananasas y/o celulasas adicionales. De hecho, se contempla que varias mezclas de estas enzimas seran de utilidad en composiciones de la presente invencion. Tambien se contempla que los niveles variables de la(s) variante(s) de proteasa(s) y una o mas enzimas adicionales pueden variar de forma independiente hasta aproximadamente un 10 %, constituyendo uno o mas materiales de limpieza adjuntos el resto de la composicion de limpieza. La seleccion espedfica de un material de limpieza adjunto se realiza facilmente teniendo en cuenta la superficie o el artfculo (p. ej., artfculo de vajilla, artfculo de mesa o artfculo de tejido) o el tejido que se va a limpiar, y la forma deseada de la composicion para las condiciones de limpieza durante su uso (p. ej., uso en detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica o a mano).

[0230] En un aspecto, la invencion proporciona una composicion (p. ej., composicion de limpieza) que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion (y, opcionalmente, al menos una enzima adicional, si asf se desea) y uno o mas materiales de limpieza adjuntos. Entre los ejemplos de materiales de limpieza adjuntos se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., surfactantes, mejoradores, blanqueadores, activadores del blanqueado, catalizadores del blanqueado, otras enzimas, sistemas de estabilizadores de enzimas, quelantes, abrillantadores opticos, polfmeros quitamanchas, agentes de transferencia de tintes, agentes inhibidores de la transferencia de tintes, materiales catalfticos, peroxido de hidrogeno, fuentes de peroxido de hidrogeno, peracidos preformados, agentes dispersantes polimericos, agentes de eliminacion de la suciedad de arcilla, agentes elastificantes de la estructura, dispersantes, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, colorantes, sales de relleno, hidrotropos, fotoactivadores, fluorescentes, suavizantes de tejidos, portadores, hidrotropos, coadyuvantes de elaboracion, disolventes, pigmentos, surfactantes hidrolizables, conservantes, antioxidantes, agentes contra el encogimiento, agentes contra la formacion de arrugas, germicidas, fungicidas, motas de color, agentes para el cuidado de la plata, contra la perdida de lustre y/o contra la corrosion, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes, portadores, coadyuvantes de elaboracion, pigmentos y/o agentes de control del pH (vease, p. ej., las patentes de los Estados Unidos con numero 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101). A continuacion, se ejemplifican de forma detallada algunos modos de realizacion de materiales de composicion de limpieza espedficos. Como se ha indicado anteriormente, si un material de limpieza adjunto no es compatible con una variante de proteasa de la presente invencion incluida en una composicion de limpieza deseada, se utiliza un metodo adecuado para mantener separados el/los material(es) de limpieza adjunto(s) y la(s) proteasa(s) (esto es, no en contacto entre sf) hasta que la combinacion de los componentes sea apropiada. Dichos metodos de separacion incluyen cualquier metodo adecuado

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conocido en el ambito de especializacion (p. ej., capsula recubierta de gelatina, encapsulacion, pastillas, separacion ffsica, etc.).

[0231] En algunos aspectos, una composicion (p. ej., composicion de limpieza) de la invencion comprende una cantidad efectiva de al menos una variante de proteasa de la invencion que es util o efectiva para limpiar una superficie de la que sea necesario quitar una mancha protemica. Dichas composiciones de limpieza incluyen composiciones de limpieza para aplicaciones como limpiar superficies duras, la colada, tejidos, platos, artfculos de mesa o artfculos de vajilla (p. ej., mediante el lavado de la vajilla de forma automatica o el lavado de la vajilla de forma manual o a mano). De hecho, en algunos modos de realizacion, la presente invencion proporciona composiciones de limpieza de tejidos, mientras que en otros modos de realizacion, la presente invencion proporciona composiciones de limpieza que no son para tejidos. Especialmente, la presente invencion tambien proporciona composiciones de limpieza que comprenden al menos una variante de proteasa de la invencion, donde dichas composiciones de limpieza son adecuadas para el cuidado personal, incluido el cuidado bucal (que incluye dentifricos, pastas de dientes, enjuagues bucales, etc., asf como composiciones de limpieza de dentaduras), adecuadas para la limpieza de la piel y el cabello, y adecuadas para la limpieza de gafas. Se pretende que la presente invencion abarque composiciones detergentes en cualquier forma (esto es, lfquidas, granuladas, en barras, solidas, semisolidas, en gel, emulsiones, pastillas, capsulas, etc.).

[0232] Mas abajo y a modo de ejemplo, se describen en mayor detalle varias composiciones de limpieza donde las variantes de proteasas de la invencion son de utilidad. En algunos modos de realizacion en los que las composiciones de limpieza de la invencion estan formuladas como composiciones adecuadas para su uso en metodos de lavado en maquinas lavarropa, las composiciones de la invencion contienen preferiblemente al menos un surfactante y al menos un compuesto mejorador, asf como uno o mas materiales de limpieza adjuntos, incluido, p. ej., uno o mas materiales de limpieza adjuntos seleccionados del grupo de compuestos polimericos organicos, agentes blanqueantes, enzimas adicionales, supresores de jabonaduras, dispersantes, dispersantes de jabones de cal, agentes de suciedad en suspension y contra la redeposicion e inhibidores de la corrosion. En algunos modos de realizacion, las composiciones para la colada tambien contienen uno o mas agentes suavizantes (esto es, como materiales de limpieza adjuntos adicionales). En los ejemplos que se exponen mas abajo, se presentan ejemplos adicionales de formulaciones y composiciones de limpieza de tejidos y de la colada a las que puede anadirse una o mas variantes de proteasas de la invencion.

[0233] Las composiciones de la invencion tambien son de utilidad como productos detergentes aditivos en forma lfquida o solida. Dichos productos aditivos tienen por objeto suplementar y/o potenciar la eficacia de las composiciones detergentes convencionales y pueden anadirse en cualquier fase del proceso de limpieza. En algunos modos de realizacion, la densidad de la composicion detergente para la colada vana desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 1200 g/litro, mientras que en otros modos de realizacion, vana desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 950 g/litro de composicion medida a 20 °C.

[0234] En un aspecto, la invencion proporciona composiciones de limpieza como las proporcionadas en la patente de los Estados Unidos con numero 6,605,458 que comprenden al menos una variante de proteasa de la invencion. En algunos modos de realizacion, la composicion que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion es una composicion de limpieza de tejidos granulada compacta, mientras que en otros modos de realizacion, la composicion es una composicion de limpieza de tejidos granulada util para el lavado de tejidos de color; en otros modos de realizacion, la composicion es una composicion de limpieza de tejidos granulada que proporciona suavizado a traves de la capacidad de lavado; en modos de realizacion adicionales, la composicion es una composicion de limpieza de tejidos lfquida para uso intensivo. En algunos modos de realizacion, las composiciones que comprenden al menos una variante de proteasa de la invencion son composiciones de limpieza de tejidos como las descritas en las patentes de los Estados Unidos con numero 6,610,642 y 6,376,450. Tambien se proporcionan composiciones detergentes para la colada granuladas (vease, p. ej., la patente de los Estados Unidos con numero 6,610,642) que comprenden al menos una variante de proteasa de la invencion.

[0235] En algunos aspectos, la invencion proporciona composiciones de limpieza para superficies duras que comprenden al menos una variante de proteasa proporcionada en el presente documento. Algunas de dichas composiciones comprenden composiciones de limpieza para superficies duras como las descritas en las patentes de los Estados Unidos con numero 6,610,642, 6,376,450 y 6,376,450 que incluyen al menos una de las variantes de proteasas en cuestion.

[0236] En un aspecto, la invencion proporciona composiciones detergentes para el lavado de la vajilla de forma automatica o el lavado de la vajilla a mano que comprenden al menos una variante de proteasa proporcionada en el presente documento. Algunas de dichas composiciones comprenden composiciones de limpieza para superficies duras como las descritas en las patentes de los Estados Unidos con numero 6,610,642 y 6,376,450.

[0237] En un aspecto, la invencion proporciona composiciones de limpieza para su uso en metodos de lavado de la vajilla de forma manual o a mano o de lavado de la vajilla de forma automatica que comprenden al menos una variante de proteasa de la invencion y/o al menos un surfactante y/o al menos un material de limpieza adjunto adicional seleccionado del grupo de componentes polimericos organicos, agentes potenciadores de jabonaduras, iones metalicos de grupo II, disolventes, hidrotropos y enzimas adicionales.

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[0238] En algunos modos de realizacion en los que las composiciones de limpieza de la invencion estan formuladas como composiciones adecuadas para su uso en metodos con lavavajillas automatico, las composiciones de la invencion contienen normalmente al menos un surfactante y/o al menos un componente mejorador y puede contener uno o mas materiales de limpieza adjuntos seleccionados preferiblemente de compuestos polimericos organicos, agentes blanqueantes, enzimas adicionales, supresores de jabonaduras, dispersantes, dispersantes de jabones de cal, agentes de suciedad en suspension y contra la redeposicion e inhibidores de la corrosion. En los ejemplos que se exponen mas abajo, se presentan ejemplos adicionales de formulaciones y composiciones para el lavado de la vajilla a las que puede anadirse una o mas variantes de proteasas de la invencion.

[0239] En otro aspecto, la invencion proporciona composiciones de cuidado bucal que comprenden al menos una variante de proteasa de la presente invencion que son utiles para el cuidado bucal (p. ej., limpieza de dientes y dentaduras); entre los componentes de composiciones de cuidado bucal que pueden ser utiles e incluirse en dichas composiciones se incluyen los descritos en la patente de los Estados Unidos con numero 6,376,450. Las composiciones de la invencion pueden incluir tambien componentes y materiales de limpieza adjuntos descritos en las patentes de los Estados Unidos con numero 6,376,450, 6,605,458 y 6,610,642.

[0240] Las composiciones de limpieza de la invencion se formulan en cualquier forma adecuada y se preparan mediante cualquier proceso seleccionado por el formulador; ejemplos no limitativos de ello se describen en las patentes de los Estados Unidos con numero 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392 y 5,486,303. Cuando se desea una composicion de limpieza con un pH bajo, el pH de dicha composicion se ajusta mediante la adicion de un material como monoetanolamina o un material acido como cloruro de hidrogeno (HCl).

[0241] Aunque no son esenciales a los efectos de la presente invencion, los adjuntos ilustrados con caracter no limitativo en lo sucesivo son adecuados para su utilizacion en las composiciones de limpieza instantanea. En algunos modos de realizacion, estos adjuntos se incorporan, por ejemplo, para potenciar la eficacia de limpieza, o contribuir a la misma, para el tratamiento del sustrato que se va a limpiar o para modificar la estetica de la composicion de limpieza, como en el caso de los perfumes, los colorantes, los tintes o similares. Se entiende que tales adjuntos son adicionales a las variantes de proteasas de la presente invencion. La naturaleza concreta de estos componentes adicionales, asf como los niveles de incorporacion de los mismos, dependeran de la forma ffsica de la composicion y de la naturaleza de la operacion de limpieza para la que se va a utilizar. Entre los materiales adjuntos adecuados se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., los surfactantes, los mejoradores, los agentes quelantes, los agentes inhibidores de la transferencia de tintes, los coadyuvantes de deposicion, los dispersantes, las enzimas adicionales y los estabilizadores de enzimas, los materiales catalfticos, los activadores del blanqueado, los potenciadores del blanqueado, peroxido de hidrogeno, fuentes de peroxido de hidrogeno, peracidos preformados, agentes dispersantes polimericos, agentes de eliminacion de la suciedad de arcilla/contra la redeposicion, blanqueadores, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, agentes elastificantes de la estructura, suavizantes de telas, vehuculos, hidrotropos, auxiliares de procesamiento y/o pigmentos. Ademas de en la exposicion que se presenta mas abajo, pueden encontrarse ejemplos adecuados de dichos otros adjuntos y niveles de uso en las patentes de los Estados Unidos con numero 5,576,282, 6,306,812 y 6,326,348. Los componentes adjuntos mencionados con anterioridad pueden constituir el resto de las composiciones de limpieza de la presente invencion.

[0242] En algunos aspectos, las composiciones de limpieza de la invencion comprenden al menos un surfactante

y/o un sistema surfactante, donde el surfactante se selecciona de surfactantes no ionicos, surfactantes anionicos, surfactantes cationicos, surfactantes anfolfticos, surfactantes anfoteros, surfactantes no ionicos semipolares y mezclas de los mismos. En algunos modos de realizacion de composiciones limpiadoras con un pH bajo (por ejemplo, composiciones que presenten un pH puro de 3 aproximadamente a 5 aproximadamente), la composicion no contiene normalmente sulfato de alquilo etoxilado, puesto que se cree que dicho tensioactivo puede que hidrolice por medio de dichas composiciones los contenidos acidos. En algunos modos de realizacion, el surfactante esta presente a un nivel desde aproximadamente un 0,1 hasta aproximadamente un 60 %, mientras que en modos de realizacion alternativos el nivel es desde aproximadamente un 1 % hasta

aproximadamente un 50 %, mientras que en otros modos de realizacion adicionales el nivel es desde

aproximadamente un 5 % hasta aproximadamente un 40 % en peso de la composicion de limpieza.

[0243] En algunos aspectos, las composiciones de limpieza de la invencion comprenden uno o mas mejoradores

detergentes o sistemas de mejoradores. En algunas de dichas composiciones que incorporan al menos un mejorador, las composiciones de limpieza comprenden al menos aproximadamente un 1 %, desde aproximadamente un 3 % hasta aproximadamente un 60 % o incluso desde aproximadamente un 5 % hasta

aproximadamente un 40 % de mejorador en peso de la composicion de limpieza. Entre los mejoradores se

incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., sales de polifosfatos de alcanolamonio, amonio y metales alcalinos; silicatos metalicos alcalinos, carbonatos de metales alcalinos y alcalinoterreos, aluminosilicatos, compuestos de policarboxilato, eter hidroxipolicarboxilatos, copolfmeros de anhudrido maleico con etileno o vinilmetileter, acido 1, 3, 5-trihidroxi benceno-2, 4, 6-trisulfonico y acido carboximetiloxisuccrnico, las diversas sales de metal alcalino, las sales de amonio y de amonio sustituido de acidos poliaceticos como el acido tetraacetico de etilendiamina y el acido nitrilotriacetico, asf como policarboxilatos como acido melttico, acido succrnico, acido cftrico, acido

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oxidisuccmico, acido polimaleico, acido de benceno 1,3,5-tricarbox^lico, acido carboximetiloxisuccmico y sales solubles de estos. Se contempla que cualquier mejorador adecuado sera de utilidad en varias composiciones de la invencion.

[0244] En algunas de dichas composiciones, los mejoradores forman complejos con iones de dureza solubles en agua (p. ej., mejoradores secuestrantes), como citratos y polifosfatos (p. ej., tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de sodio hexahidratado, tripolifosfato de potasio y tripolifosfato con mezcla de sodio y potasio, etc.). Se contempla que cualquier mejorador adecuado sera de utilidad en la presente invencion, incluidos los ya conocidos en el ambito de especializacion (vease, p. ej., EP 2 100 949).

[0245] Algunas composiciones de limpieza de la invencion comprenden al menos un agente quelante ademas de al menos una variante de proteasa. Entre los agentes quelantes adecuados se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., los agentes quelantes de cobre, hierro y/o manganeso y mezclas de los mismos. En los modos de realizacion en los que se utiliza al menos un agente quelante, las composiciones de limpieza de la presente invencion comprenden desde aproximadamente un 0,1 % hasta aproximadamente un 15 % o incluso desde aproximadamente un 3 % hasta aproximadamente un 10 % de agente quelante en peso de la composicion de limpieza en cuestion.

[0246] Algunas composiciones de limpieza proporcionadas en el presente documento comprenden al menos un coadyuvante de deposicion ademas de al menos una variante de proteasa. Entre los coadyuvantes de deposicion adecuados se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., polietilenglicol, polipropilenglicol, policarboxilato, poifmeros quitamanchas como acido politereftalico, arcillas como caolinita, montmorillonita, atapulgita, illita, bentonita, halloysita y mezclas de estos.

[0247] Como se indica en el presente documento, en algunos modos de realizacion, los agentes contra la redeposicion son de utilidad en algunos modos de realizacion de la presente invencion. En algunos modos de realizacion, son de utilidad los surfactantes no ionicos. Estos surfactantes no ionicos tambien son de utilidad en la prevencion de la redeposicion de suciedad. En algunos modos de realizacion, el agentes contra la redeposicion es un surfactante no ionico como se conoce en el ambito de especializacion (vease, p. ej., EP 2 100 949).

[0248] En algunos modos de realizacion, las composiciones de limpieza de la presente invencion incluyen uno o mas agentes inhibidores de la transferencia de tintes. Los inhibidores de la transferencia de tintes polimericos adecuados incluyen, sin caracter limitativo, polfmeros de polivinilpirrolidona, polfmeros de N-oxido de poliamina, copolfmeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de estos. En los modos de realizacion en los que se utiliza al menos un agente inhibidor de la transferencia de tintes, las composiciones de limpieza de la presente invencion comprenden desde aproximadamente un 0,0001 % hasta aproximadamente un 10 %, desde aproximadamente un 0,01 % hasta aproximadamente un 5 %, o incluso desde aproximadamente un 0,1 % hasta aproximadamente un 3 % en peso de la composicion de limpieza.

[0249] En algunos modos de realizacion, se incluyen silicatos en las composiciones de la presente invencion. En algunos de dichos modos de realizacion, son de utilidad los silicatos de sodio (p. ej., disilicato de sodio, metasilicato de sodio y filosilicatos cristalinos). En algunos modos de realizacion, los silicatos estan presentes a un nivel desde aproximadamente un 1 % hasta aproximadamente un 20 %. En algunos modos de realizacion, los silicatos estan presentes a un nivel desde aproximadamente un 5 % hasta aproximadamente un 15 % en peso de la composicion.

[0250] En algunos modos de realizacion adicionales, las composiciones de limpieza de la invencion tambien comprenden dispersantes. Entre los materiales organicos solubles en agua adecuados se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., los acidos homopolimericos o copolimericos o sus sales, en los que el acido policarboxflico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre sf por no mas de dos atomos de carbono.

[0251] En algunos modos de realizacion adicionales, las enzimas (p. ej., las variantes de proteasas de la invencion u otras enzimas adicionales) utilizadas en las composiciones de limpieza se estabilizan con cualquier tecnica adecuada. En algunos modos de realizacion, las enzimas empleadas en el presente documento se estabilizan mediante la presencia de fuentes solubles en agua de iones de magnesio y/o calcio en las composiciones finalizadas que proporcionan dichos iones a las enzimas. En algunos modos de realizacion, los estabilizadores de enzimas incluyen oligosacaridos, polisacaridos y sales metalicas divalentes inorganicas, incluidos metales alcalinoterreos, como sales de calcio. Se contempla que se utilizaran diversas tecnicas para la estabilizacion enzimatica en la presente invencion. Por ejemplo, en algunos modos de realizacion, las enzimas empleadas en el presente documento se estabilizan mediante la presencia de fuentes solubles en agua de iones de zinc (II), calcio (II) y/o magnesio (II) en las composiciones que proporcionan dichos iones a las enzimas, asf como otros iones metalicos (p. ej., bario (II), escandio (II), hierro (II), manganeso (II), aluminio (III), estano (II), cobalto (II), cobre (II), mquel (II) y oxovanadio (IV). Los cloruros y los sulfatos tambien son de utilidad en algunos modos de realizacion de la presente invencion. En el ambito de especializacion, se conocen ejemplos de oligosacaridos y polisacaridos adecuados (p. ej., dextrinas) (vease, p. ej., WO 07/145964). En algunos modos de realizacion, tambien son de utilidad los inhibidores de proteasas reversibles, como los compuestos que contienen

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boro (p. ej., borato, acido 4-formil fenil boronico) y/o un tripeptido aldelddo en composiciones de la invencion para mejorar la estabilidad de forma adicional, segun se desee.

[0252] En algunos modos de realizacion, se incluyen blanqueadores, activadores del blanqueado y/o catalizadores del blanqueado en las composiciones de la invencion. En algunos modos de realizacion, las composiciones de limpieza de la invencion comprenden componentes blanqueadores organicos y/o inorganicos. Entre los blanqueadores inorganicos se incluyen, sin caracter limitativo, las sales perhidratadas (p. ej., sales de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato y persilicato). En algunos modos de realizacion, las sales perhidratadas inorganicas son sales metalicas alcalinas. En algunos modos de realizacion, las sales perhidratadas inorganicas se incluyen como el solido cristalino, sin proteccion adicional, aunque en algunos otros modos de realizacion, la sal se encuentra recubierta. Cualquier sal adecuada conocida en el ambito de especializacion es de utilidad en las composiciones de la invencion (vease, p. ej., EP 2 100 949).

[0253] En algunos modos de realizacion, se utilizan activadores del blanqueado en las composiciones de la invencion. Los activadores del blanqueado son normalmente precursores de peracido organico que potencian la accion blanqueante durante la limpieza a temperaturas de 60 °C e inferiores. Entre los activadores del blanqueado adecuados para su uso segun el presente documento se incluyen los compuestos que, en condiciones de perhidrolisis, proporcionan acidos peroxicarboxflicos alifaticos que tienen preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 atomos de carbono, en concreto desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 atomos de carbono y/u opcionalmente acido perbenzoico sustituido. En el ambito de especializacion, se conocen activadores del blanqueado adicionales que son de utilidad en la composicion de la invencion (vease, p. ej., EP 2 100 949).

[0254] Ademas, en algunos modos de realizacion y como se describe tambien en el presente documento, las composiciones de limpieza de la invencion comprenden tambien al menos un catalizador del blanqueado. En algunos modos de realizacion, son de utilidad el triazaciclononano de manganeso y otros compuestos relacionados, asf como los complejos de hierro, manganeso, cobre y cobalto. En la presente invencion, son de utilidad catalizadores del blanqueado adicionales (vease, p. ej., las patentes de los Estados Unidos con numero 4,246,612, 5,227,084 y 4,810410; WO 99/06521; asf como EP 2 100 949).

[0255] En algunos modos de realizacion, las composiciones de limpieza de la invencion comprenden uno o mas complejos metalicos cataltticos. En algunos modos de realizacion, se utiliza un catalizador blanqueante que contiene metal. En algunos modos de realizacion, el catalizador blanqueante metalico comprende un sistema catalizador que comprende un cation de metal de transicion de actividad catalftica blanqueante definida (por ejemplo, cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, wolframio, molibdeno o manganeso), un cation de metal auxiliar que presenta una actividad catalftica blanqueante minima o nula (p. ej., cationes de zinc o aluminio) y un secuestrante que presenta unas constantes de estabilidad definidas para los cationes de metal catalfticos y auxiliares, en concreto acido etilendiaminotetraacetico, acido etilendiaminotetra (acido metilenfosfonico) y sales solubles en agua de los mismos (vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con numero 4,430,243). En algunos modos de realizacion, las composiciones de limpieza de la invencion se catalizan por medio de un compuesto de manganeso. Dichos compuestos y niveles de uso son ampliamente conocidos en el ambito de especializacion (vease, p. ej., la patente de los Estados Unidos con numero 5,576,282). En modos de realizacion adicionales, son de utilidad catalizadores del blanqueado de cobalto y se incluyen las composiciones de limpieza de la invencion. En el ambito de especializacion, se conocen varios catalizadores del blanqueado de cobalto (vease, p. ej., las patentes de los Estados Unidos con numero 5,597,936 y 5,595,967) que se preparan facilmente con procedimientos conocidos.

[0256] En algunos modos de realizacion adicionales, las composiciones de limpieza de la invencion incluyen un complejo de metal de transicion de un ligando macropolidclico ngido (MRL, por sus siglas en ingles). En la practica, y sin caracter limitativo, en algunos modos de realizacion, las composiciones y los procesos de limpieza proporcionados por la invencion se ajustan para proporcionar del orden de al menos una parte por cada cien millones de la especie de MRL activa en el medio de lavado acuoso, y en algunos modos de realizacion, proporcionar desde aproximadamente 0,005 ppm hasta aproximadamente 25 ppm, desde aproximadamente 0,05 ppm hasta aproximadamente 10 ppm, y desde aproximadamente 0,1 ppm hasta aproximadamente 5 ppm del MRL en el bano de lavado.

[0257] En algunos modos de realizacion, los metales de transicion en el catalizador del blanqueado metalico de transicion instantaneo incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., el manganeso, el hierro y el cromo. Los MRL preferidos tambien incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., ligandos ultranigidos especiales que son de puente cruzado (p. ej., 5,12-dietil-1,5,8,12-tetraazabiciclo(6.6.2)hexadecano). Los MRL metalicos de transicion se preparan facilmente mediante procedimientos conocidos (vease, p. ej., WO 2000/32601 y la patente de los Estados Unidos con numero 6,225,464).

[0258] En un aspecto, la invencion proporciona una composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica formulada como una pastilla detergente. Dicha pastilla comprende al menos una variante de proteasa de la invencion y un mejorador, como, p. ej., una sal mejoradora. Algunas de dichas pastillas tienen una alcalinidad al menos equivalente a 3 gramos (g) de hidroxido de sodio por cada 100 gramos de la composicion en pastilla y una densidad de al menos 1,4 gramos/centfmetro cubico. La sal mejoradora puede comprender una

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mezcla de una sal de silicato y una sal de fosfato, preferiblemente con mas silicato (p. ej., metasilicato sodico) que fosfato (p. ej., tripolifosfato sodico). Algunas de dichas pastillas no llevan materiales surfactantes y estan especialmente adaptadas para su utilizacion en lavavajillas automaticos.

[0259] En un aspecto, las composiciones de limpieza de la presente invencion comprenden agentes para el cuidado de los metales. Los agentes para el cuidado de los metales son utiles para evitar y/o reducir la perdida de lustre, la corrosion y/o la oxidacion de metales, incluidos el aluminio, el acero inoxidable y materiales no ferrosos (p. ej., plata y cobre). Entre los agentes adecuados para el cuidado de los metales se incluyen los descritos en EP 2 100 949, WO 9426860 y WO 94/26859). En algunas de dichas composiciones de limpieza, el agente para el cuidado de los metales es una sal de zinc. Algunas de dichas composiciones de limpieza comprenden desde aproximadamente un 0,1 % hasta aproximadamente un 5 % en peso de uno o mas agentes para el cuidado de los metales.

[0260] Como se ha indicado previamente, las composiciones de limpieza de la presente invencion se formulan en cualquier forma adecuada y se preparan mediante cualquier proceso seleccionado por el formulador; ejemplos no limitativos de ello se describen en las patentes de los Estados Unidos con numero 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,516,448, 5,489,392 y 5,486,303. En algunos modos de realizacion en los que se desea una composicion de limpieza con un pH bajo, el pH de dicha composicion se ajusta mediante la adicion de un material acido como cloruro de hidrogeno (HCl).

[0261] Las composiciones de limpieza expuestas en el presente documento son de utilidad en la limpieza de un sitio (p. ej., una superficie, vajilla, artfculos de mesa o tejidos). Normalmente, al menos una parte del sitio se pone en contacto con una composicion de limpieza presente de la invencion en estado puro o diluida en un bano de lavado, y posteriormente, de forma opcional, el sitio se lava y/o enjuaga. A efectos de la presente invencion, «lavar» y «lavado» incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., restregar o agitacion mecanica. En algunos modos de realizacion, las composiciones de limpieza se emplean en concentraciones desde aproximadamente 550 ppm hasta aproximadamente 15 000 ppm en solucion. Cuando el disolvente de lavado es agua, la temperatura del agua vana normalmente desde aproximadamente 5 °C hasta aproximadamente 90 °C y cuando el sitio comprende un tejido, la relacion entre la masa del agua y de tejido es normalmente desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 30:1.

Procesos para elaborar y utilizar composiciones de limpieza

[0262] Las composiciones de limpieza de la invencion descritas en el presente documento y a lo largo del mismo pueden formularse en cualquier forma adecuada y prepararse mediante cualquier metodo adecuado elegido por el formulador (vease, p. ej., las patentes de los Estados Unidos con numero 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, 5,486,303, 4,515,705, 4,537,706, 4,515,707, 4,550,862, 4,561,998, 4,597,898, 4,968,451, 5,565,145, 5,929,022, 6,294,514 y 6,376,445).

[0263] En algunos modos de realizacion, las composiciones de limpieza de la invencion se proporcionan en forma de dosis unitaria, lo que incluye pastillas, capsulas, sobres, bolsas y bolsas con multiples compartimentos. En algunos modos de realizacion, el formato de dosis unitaria esta disenado para proporcionar una liberacion controlada de los componentes que se encuentran en el interior de una bolsa con multiples compartimentos (u otro formato de dosis unitaria). Los formatos adecuados de dosis unitaria y liberacion controlada son conocidos en el ambito de especializacion (vease, p. ej., EP 2 100 949, WO 02/102955, las patentes de los Estados Unidos con numero 4,765,916 y 4,972,017, asf como WO 04/111178 para materiales adecuados para su uso en formatos de dosis unitaria y liberacion controlada). En algunos modos de realizacion, el formato de dosis unitaria se proporciona en pastillas envueltas con una pelfcula soluble en agua o bolsas solubles en agua. En EP 2 100 947, se proporcionan varios formatos para dosis unitarias, y estos son conocidos en el ambito de especializacion.

Metodos de la invencion

[0264] La invencion proporciona metodos para limpiar o lavar un artfculo o superficie (p. ej., superficie dura) que necesita limpiarse, incluidos, sin caracter limitativo, p. ej., metodos para limpiar o lavar un artfculo de vajilla, un artfculo de mesa, un artfculo de tejido, un artfculo de colada, un artfculo de cuidado personal, etc., o similares, como, p. ej., una superficie dura de un artfculo.

[0265] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para limpiar un artfculo, un objeto o una superficie que necesite limpiarse, comprendiendo el metodo poner en contacto el artfculo o la superficie (o una parte del artfculo o la superficie que se desee limpiar) con una variante de proteasa de cualquiera de las de la invencion o una composicion de la invencion durante un tiempo suficiente y/o en condiciones adecuadas o efectivas para limpiar el artfculo, el objeto o la superficie hasta un nivel deseado. Algunos de dichos metodos comprenden tambien enjuagar el artfculo, el objeto o la superficie con agua. Para algunos de dichos metodos, la composicion de limpieza es una composicion detergente para el lavado de la vajilla y el artfculo o el objeto que se va a limpiar es un artfculo de vajilla o un artfculo de mesa. Un artfculo de vajilla es un artfculo utilizado generalmente para servir o comer alimentos. Un artfculo de vajilla puede ser, sin caracter limitativo, p. ej., un plato, un plato llano, un plato hondo, una copa, etc., y similares. Artfculo de mesa es un termino mas amplio que incluye, sin caracter limitativo, p. ej., platos, cubiertos, cuchillos, tenedores, cucharas, palillos chinos, artfculos de cristal, jarras, salseras, recipientes para beber, etc., y similares; un artfculo de mesa incluye cualquiera de estos artfculos para servir o

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comer alimentos, o artfculos similares. Para algunos de dichos metodos, la composicion de limpieza es una composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica o una composicion detergente para el lavado de la vajilla a mano y el artfculo o el objeto que se va a limpiar es un artfculo de vajilla o un artfculo de mesa. Para algunos de dichos metodos, la composicion de limpieza es una composicion detergente para la colada, como, p. ej., una composicion detergente para la colada en polvo o una composicion detergente para la colada lfquida, y el artfculo que se va a limpiar es un artfculo de tejido.

[0266] En un aspecto, la invencion proporciona metodos para limpiar o lavar un artfculo de tejido que, de forma opcional, necesita limpiarse o lavarse, respectivamente. Algunos de dichos metodos comprenden proporcionar una composicion que comprende la variante de proteasa (como, sin caracter limitativo, p. ej., una composicion de limpieza para la colada o tejidos) y un artfculo de tejido o artfculo de colada que necesite limpiarse, y poner en contacto el artfculo de tejido o el artfculo de colada (o una parte del artfculo que se desee limpiar) con la composicion en condiciones suficientes o efectivas para limpiar o lavar el artfculo de tejido o de colada hasta un nivel deseado.

[0267] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para limpiar o lavar un artfculo o una superficie (p. ej., una superficie dura) que, de forma opcional, necesite limpiarse, comprendiendo el metodo proporcionar un artfculo o una superficie que se va a limpiar o lavar y poner en contacto el artfculo o la superficie (o una parte del artfculo o la superficie que se desee limpiar o lavar) con al menos una variante de proteasa de la invencion o una composicion de la invencion que comprenda al menos una variante de proteasa tal durante un tiempo suficiente y/o en condiciones suficientes o efectivas para limpiar o lavar el artfculo o la superficie hasta un nivel deseado. Dichas composiciones incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., una composicion de limpieza o una composicion detergente de la invencion (entre las que se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., una composicion detergente para el lavado de la vajilla a mano, una composicion de limpieza para el lavado de la vajilla a mano, una composicion de limpieza para tejidos o la colada o una composicion detergente para tejidos o la colada, una composicion de limpieza para la colada lfquida, una composicion detergente para la colada lfquida, una composicion de limpieza para la colada en polvo, una composicion detergente para la colada en polvo, una composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica, una composicion detergente o de limpieza potenciadora para la colada, un aditivo de limpieza para la colada y una composicion de pretratado para la colada, etc.). En algunos casos, si asf se desea, el metodo puede repetirse una o varias veces, especialmente si se desea limpieza o lavado adicional. Por ejemplo, en algunos casos, el metodo tambien comprende de forma opcional permitir que el artfculo o la superficie permanezca en contacto con la al menos una variante de proteasa o composicion durante un penodo de tiempo suficiente o efectivo para limpiar o lavar el artfculo o la superficie hasta el nivel deseado. Algunos de dichos metodos comprenden tambien enjuagar el artfculo o la superficie con agua. Algunos de dichos metodos comprenden tambien poner en contacto de nuevo el artfculo o la superficie con al menos una variante de proteasa de la invencion o una composicion de la invencion y permitir que el artfculo o la superficie permanezca en contacto con la al menos una variante de proteasa o composicion durante un penodo de tiempo suficiente para limpiar o lavar el artfculo o la superficie hasta el nivel deseado. Para algunos de dichos metodos, la composicion de limpieza es una composicion detergente para el lavado de la vajilla y el artfculo que se va a limpiar es un artfculo de vajilla o un artfculo de mesa. Para algunos de dichos metodos, la composicion de limpieza es una composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica o una composicion detergente para el lavado de la vajilla a mano y el artfculo que se va a limpiar es un artfculo de vajilla o un artfculo de mesa. Para algunos de dichos metodos, la composicion de limpieza es una composicion detergente para la colada y el artfculo que se va a limpiar es un artfculo de tejido.

[0268] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para limpiar un artfculo de mesa o un artfculo de vajilla en un lavavajillas automatico, comprendiendo el metodo proporcionar un lavavajillas automatico, poner una cantidad de una composicion para el lavado de la vajilla de forma automatica que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion o una composicion de la invencion suficiente para limpiar el artfculo de mesa o el artfculo de vajilla en el lavavajillas (p. ej., poniendo la composicion en un compartimento o dispensador de detergente proporcionado o adecuado en el lavavajillas), colocar un artfculo de mesa o de vajilla en el lavavajillas y poner en funcionamiento el lavavajillas con el fin de limpiar el artfculo de mesa o el artfculo de vajilla (p. ej., de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Dicho metodo puede incluir cualquier composicion para el lavado de la vajilla de forma automatica descrita en el presente documento, que comprenda, sin caracter limitativo, p. ej., cualquier variante de proteasa descrita tambien en el presente documento. La cantidad de composicion para el lavado de la vajilla de forma automatica que se ha de emplear puede determinarse facilmente segun las instrucciones o las sugerencias del fabricante y puede emplearse cualquier forma de la composicion para el lavado de la vajilla de forma automatica que comprenda al menos una variante de proteasa de la invencion (p. ej., lfquida, en polvo, solida, en gel, en pastilla, etc.), incluyendo cualquiera descrita en el presente documento.

[0269] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para limpiar una superficie, un artfculo o un objeto que, de forma opcional, necesite limpiarse, comprendiendo el metodo poner en contacto el artfculo o la superficie (o una parte del artfculo o la superficie que se desee limpiar) con al menos una variante de proteasa de la invencion o una composicion de limpieza de la invencion en forma pura o diluida en un bano de lavado durante un tiempo suficiente y/o en condiciones suficientes o efectivas para limpiar o lavar el artfculo o la superficie hasta un nivel deseado. Posteriormente, la superficie, el artfculo o el objeto pueden lavarse y/o enjuagarse (de forma

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opcional) si se desea. A los efectos de la presente invencion, «lavar» y «lavado» incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., restregar o agitacion mecanica. En algunos modos de realizacion, las composiciones de limpieza se emplean en concentraciones desde aproximadamente 550 ppm hasta aproximadamente 15 000 ppm en solucion (p. ej., solucion acuosa). Cuando el disolvente de lavado es agua, la temperatura del agua vana normalmente desde aproximadamente 5 °C hasta aproximadamente 90 °C y cuando el sitio comprende un tejido, la relacion entre la masa del agua y de tejido es normalmente desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 30:1.

[0270] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para limpiar un artfculo de colada o un artfculo de tejido en una maquina lavadora, comprendiendo el metodo proporcionar una maquina lavadora, poner una cantidad de una composicion detergente para la colada que comprende al menos una variante de proteasa de la invencion suficiente para limpiar el artfculo de colada o el artfculo de tejido en la maquina (p. ej., poniendo la composicion en un compartimento o dispensador de detergente proporcionado o adecuado en la maquina), colocar el artfculo de colada o el artfculo de tejido en la maquina y poner en funcionamiento la maquina con el fin de limpiar el artfculo de colada o el artfculo de tejido (p. ej., de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Dicho metodo puede incluir cualquier composicion detergente para la el lavado de la colada descrita en el presente documento, que comprenda, sin caracter limitativo, p. ej., cualquier variante de proteasa descrita tambien en el presente documento. La cantidad de composicion detergente para la colada que se ha de emplear puede determinarse facilmente segun las instrucciones o las sugerencias del fabricante y puede emplearse cualquier forma de la composicion detergente para la colada que comprenda al menos una variante de proteasa de la invencion (p. ej., solida, en polvo, lfquida, en pastilla, en gel, etc.), incluyendo cualquiera descrita en el presente documento.

[0271] En los ejemplos que se presentan a continuacion, se proporcionan ejemplos de metodos de limpieza adicionales.

Aspectos adicionales de la invencion

[0272] En un aspecto, la invencion proporciona cualquier composicion de la invencion (p. ej., composicion de

limpieza o composicion detergente) descrita en el presente documento y a lo largo del mismo, comprendiendo dicha composicion cualquier polipeptido de la invencion (p. ej., cualquier variante de proteasa o variante de subtilisina de la invencion) como se define en las reivindicaciones, pero donde dicha composicion no es una composicion para el lavado de la vajilla de forma automatica. En el presente documento tambien se expone una composicion que comprende cualquier variante de proteasa de la invencion descrita en el presente documento y a lo largo del mismo, pero donde dicha composicion no incluye una composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica que comprende una variante de proteasa de una proteasa original, comprendiendo dicha proteasa original una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 97 %, al menos un 99 % o un 100% de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha variante de

proteasa de dicha proteasa original uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos en

comparacion con dicha proteasa original:

(i) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de proteasa no

comprenda N248R+S188D, o

(ii) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R,

(iii) y un mejorador,

donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de

proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens. En un aspecto,

dicha composicion es una composicion detergente. En un aspecto, dicha composicion es una composicion de limpieza. En un aspecto, dicha composicion es una composicion detergente en polvo o una composicion detergente lfquida. En un aspecto, dicha composicion es una composicion de limpieza en forma de lfquido, gel, pastilla, polvo, o granulos. En un aspecto, dicha composicion es una composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica. En un aspecto, dicha composicion es una composicion de limpieza que no contiene fosfato. En cualquier aspecto, dicha composicion comprende al menos una enzima adicional. En cualquier aspecto de dicha composicion, dicha composicion comprende al menos dicha al menos una enzima adicional puede seleccionarse del grupo que consta de hemicelulasa, celulasa, amilasa, peroxidasa, proteasa, xilanasa, lipasa, fosfolipasa, esterasa, cutinasa, pectinasa, pectato liasa, mananasa, queratinasa, reductasa, oxidasa, fenoloxidasa, lipoxigenasa, ligninasa, pululanasa, tanasa, pentosanasa, malanasa, 13-glucanasa, arabinosidasa, hialuronidasa, condroitinasa y lacasa. En cualquier aspecto de dicha composicion, dicha composicion puede comprender dos o mas enzimas adicionales seleccionadas del grupo que consta de hemicelulasa, celulasa, amilasa, peroxidasa, proteasa, xilanasa, lipasa, fosfolipasa, esterasa, cutinasa, pectinasa, pectato liasa, mananasa, queratinasa, reductasa, oxidasa, fenoloxidasa, lipoxigenasa, ligninasa, pululanasa, tanasa, pentosanasa, malanasa, 13-glucanasa, arabinosidasa, hialuronidasa, condroitinasa y lacasa. En cualquier aspecto de dicha composicion, dicha composicion puede comprender tambien al menos un mejorador y/o al menos un surfactante.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

[0273] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para limpiar un artfculo o una superficie que necesita limpiarse, comprendiendo el metodo poner en contacto el artfculo o la superficie con cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente. En un aspecto de dicho metodo, dicho metodo comprende tambien enjuagar el artfculo o la superficie con agua. En un aspecto de dicho metodo, la composicion de limpieza es una composicion detergente para el lavado de la vajilla y el artfculo que se va a limpiar es un artfculo de vajilla o un artfculo de mesa. En un aspecto de dicho metodo, la composicion de limpieza es una composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica y el artfculo que se va a limpiar es un artfculo de vajilla o un artfculo de mesa.

[0274] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para limpiar una superficie, un artfculo o un objeto, comprendiendo el metodo poner en contacto al menos una parte del artfculo o de la superficie que se va a limpiar con cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente durante un tiempo suficiente y/o en condiciones suficientes o efectivas para limpiar o lavar el artfculo o la superficie hasta un nivel deseado, y comprendiendo tambien de forma opcional enjuagar la superficie, el artfculo o el objeto con agua.

[0275] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para limpiar un artfculo de mesa o un artfculo de vajilla en un lavavajillas automatico, comprendiendo el metodo (i) proporcionar un lavavajillas automatico, (ii) poner una cantidad de cualquiera de dichas composiciones o composiciones para el lavado de la vajilla de forma automatica mencionadas anteriormente que sea suficiente para limpiar el artfculo de mesa o el artfculo de vajilla en el lavavajillas, donde, de forma opcional, dicha composicion se pone en un compartimento o dispensador en dicho lavavajillas, (iii) colocar un artfculo de mesa o un artfculo de vajilla en el lavavajillas y (iv) poner en funcionamiento el lavavajillas con el fin de limpiar el artfculo de mesa o el artfculo de vajilla.

EJEMPLOS

[0276] Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar de forma adicional determinados aspectos de la presente invencion y no han de interpretarse como limitativos del alcance de la misma.

[0277] En la exposicion experimental que sigue en el presente documento, asf como en cualquier otra parte del mismo, se aplican las siguientes abreviaturas: PI (inhibidor de la proteinasa), ppm (partes por millon); M (molar); mM (milimolar); pM (micromolar); nM (nanomolar); mol (mol); mmol (milimol); pmol (micromol); nmol (nanomol); gm (gramo); mg (miligramo); pg (microgramo); pg (picogramo); L o l (litro); ml y mL (mililitros); pl o pL (micolitro); cm (centimetro); mm (milfmetro); pm (micrometro); nm (nanometro); U (unidades); V (voltio); PM (peso molecular); seg (segundo); min(s) (minuto/minutos); h(s) o hr(s) (hora/horas); °C (grados centfgrados); nD (no determinado); rpm (revoluciones por minuto); GH (grados de dureza alemana); H2O (agua); dH2O (agua desionizada); HCl (acido clorhndrico); aa (aminoacido); bp (par de base); kb (kilobase); kD (kilodaltones); ADNc (ADN complementario o copia); ADN (acido desoxirribonucleico); ADNmc (ADN monocatenario); ADNbc (ADN bicatenario); ARN (acido ribonucleico); MgCh (cloruro magnesico); NaCl (cloruro sodico); BPN' (subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens); PB92 (subtilisina de Bacillus clausii); p/v (porcentaje en masa); % v (porcentaje en volumen); p/p (porcentaje en peso); g (gravedad); DO (densidad optica); ppm (partes por millon); DO280 (densidad optica a 280 nm); DO600 (densidad optica a 600 nm); A405 (absorbencia a 405 nm); PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida); PBS (solucion tampon de fosfatos [150 mM NaCl, 10 mM tampon fosfato de sodio, pH 7.2]); PEG (polietilenglicol); PCR (reaccion en cadena de la polimerasa); SDS (dodecilsulfato sodico); TRIS o Tris (tris(hidroximetil)aminometano); HEPES (acido N-[2-Hidroxietil]piperacina-N-[2- etanosulfonico]); HBS (HEPES solucion salina); Tris-HCl (clorhidrato de tris[Hidroximetil]aminometano); DMSo (dimetil sulfoxido); SA (acido sinapico (acido cinamico s,5-dimetoxi-4-hidroxi); TCA (acido tricloroacetico); HPLC (cromatograffa lfquida de alta resolucion); Taq (ADN polimerasa Thermus aquaticus); Klenow (fragmento largo (Klenow) de ADN polimerasa I); EDTA (acido etilendiaminotetraacetico); bla (gen resistente a la ampilicina o p- lactamasa); HDL (lfquido de alta densidad); HDD (detergente en polvo para uso intensivo); HSG (detergente granulado con altos niveles de jabonadura); ECO (Europa Central y Oriental); EO (Europa Occidental); NA, cuando se utiliza en referencia a detergentes (Norteamerica); Japon y JPN, cuando se utilizan en referencia a detergentes (Japon); CFT (Center for Testmaterials, Vlaardingen, Pafses Bajos); P&G y Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Molecular Devices (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA); Siegfried Handel (Siegfried Handel AG, Zofingen, Suiza); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, Alemania); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT); Enichem (Enichem Iberica, Barcelona, Espana); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, Pafses Bajos); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI); RB (Reckitt-Benckiser, Slough, Reino Unido).

[0278] Tal como se utiliza en el presente documento, en algunas listas, se indica un «0» al principio, con el fin de proporcionar una designacion de tres numeros para cada sitio (p. ej., «001» es lo mismo que «1», por lo que

«A001C» es lo mismo que «A1C»). En algunas listas, no se incluye el «0» inicial. Ademas, tal como se utiliza en el presente documento, «X» se refiere a cualquier aminoacido.

[0279] En las composiciones detergentes ejemplificadas descritas en el presente documento, los niveles de enzimas se expresan por enzima pura en peso de la composicion total y, a menos que se indique otra cosa, los 5 componentes detergentes se expresan en peso de las composiciones totales. Las identificaciones de componentes abreviadas en la presente memoria tienen los siguientes significados:

Abreviatura

Compuesto

LAS

: Sulfonato de alquilbenceno C11-13 lineal de sodio

NaC16-17HSAS

: Sulfato de alquilo altamente soluble C16-17 de sodio

TAS

: Sulfato de alquilo de sebo de sodio

CxyAS

: Sodio sulfato de alquilo C1x - C1y

CxyEz

: Alcohol primario predominantemente lineal C1x - C1y condensado con un promedio de z moles de oxido de etileno

CxyAEzS

: Sodio sulfato de alquilo C1x - C1y condensado con un promedio de z moles de oxido de etileno. Nombre de molecula anadida en los ejemplos.

No ionico

: Alcohol graso etoxilado/propoxilado mixto p. ej., Plurafac LF404 siendo un alcohol con un grado promedio de etoxilacion de 3,8 y un grado medio de propoxilacion de 4,5

QAS

: R2.N+(CH3)2(C2H4OH) con R2 = C12-C14.

Silicato

: Silicato de sodio amorfo (ratio de SiO2:Na2O = 1,6-3,2:1)

Metasilicato

: Metasilicato de sodio (ratio de SiO2:Na2O = 1,0)

Zeolita A

: Aluminosilicato hidratado de formula Na12(AlO2SiO2)12. 27H2O

SKS-6

: Silicato laminar cristalino de formula 8-Na2Si2O5

Sulfato

: Sulfato de sodio anhidro.

STPP

: Tripolifosfato de sodio

MA/AA

: Copolfmero aleatorio de 4:1 de acrilato/maleato, peso molecular promedio de aproximadamente 70 000-80 000

AA

: Polfmero de poliacrilato de sodio de peso molecular promedio de 4500.

Policarboxilato

: Copolfmero que comprende una mezcla de monomeros carboxilados como acrilato, maleato y metacrilato con un PM que varia entre 2000-80 000 como Sokolan, comercializado por BASF, siendo un copolfmero de acido acrilico, PM de 4500

BB1

: 3-(3,4-Dihidroisoquinolinio) propano sulfonato

BB2

: decano-2-sulfato de 1 -(3,4-dihidroisoquinolinio)

PB1

: Perborato de sodio monohidratado

PB4

: Perborato de sodio tetrahidratado de formula nominal NaBO3.4H2O.

Percarbonato

: Percarbonato de sodio de formula nominal 2Na2CO3.3H2O2.

TAED

: Tetraacetiletilenodiamina

NOBS

: Nonanoiloxibenceno sulfonato en forma de sal de sodio

DTPA

: Acido pentetico

HEDP

Acido difosfonico

DETPMP

: Dietiltriamina penta (metileno) fosfonato, comercializado por Monsanto con el nombre comercial Dequest 2060.

EDDS

: Isomero (S,S) de acido etilendiamin-N,N'-disuccmico en forma de su sal de sodio

Diamina

: Dimetilaminopropilamina; 1,6-hexanodiamina; 1,3-propanodiamina; 2-metil-1,5- pentanodiamina; 1,3-pentanodiamina; 1-metildiaminopropano.

DETBCHD

: Dicloruro de 5, 12- dietil-1,5,8,12-tetraazabiciclo [6,6,2] hexadecano, sal de Mn(II)

PAAC

: Sal de cobalto (III) de acetato de pentaamina

Parafina

: Aceite de parafina vendido con el nombre comercial de Winog 70 por Wintershall.

Sulfonato de parafina

: Un aceite o cera de parafina donde algunos de los atomos de hidrogeno se han reemplazado por grupos sulfonato

Aldosa oxidasa

: Enzima oxidasa vendida con el nombre comercial de Aldose Oxidase por Novozymes A/S

Galactosa oxidasa

: Galactosa oxidasa de Sigma

nprE

: La forma recombinante de la metaloproteasa neutra expresada en Bacillus subtilis (see e.g., WO 07/044993)

PMN

: Metaloproteasa neutra purificada de Bacillus amyloliquefacients

Amilasa

: Una enzima amilolttica adecuada, como las vendidas con los nombres comerciales PURAFECT® Ox descritas en los documentos WO 94/18314, WO96/05295 y vendida por Genencor; NATALASE®, TERMAMYL®, FUNGAMYI® y DURAMYL™, todas disponibles de Novozymes A/S.

Lipasa

: Una enzima lipolftica adecuada como las vendidas con los nombres comerciales LIPEX®, LIPOLASE®, LIPOLASE® Ultra de Novozymes A/S y Lipomax™ de Gist- Brocades

Celulasa

: Una enzima celulttica adecuada como las vendidas con los nombres comerciales CAREZYME®, CELLUZYME® y/o ENDOLASE® de Novozymes A/S

Pectina liasa

: Una pectina liasa adecuada, como las vendidas con los nombres comerciales PECTAWAY® y PECTAWASH® disponibles de Novozymes A/S

PVP

: Polivinilpirrolidona con un peso molecular promedio de 60 000.

PVNO

: N-oxido de polivinilpiridina, con un peso molecular promedio de 50 000

PVPVI

: Copolfmero de vinilimidazol y vinilpirrolidona, con un peso molecular promedio de 20 000

Abrillantador 1

: 4,4'-bis(2-sulfoestiril)bifenilo de disodio

Antiespumante de silicona

: Regulador de la espuma de polidimetilsiloxano con un copolfmero de siloxano- oxialquileno como agente dispersante, con una ratio de dicho regulador de espuma con respecto a dicho dispersante de 10:1 a 100:1

Supresor de jabonaduras

: 12 % de silicona/sflice, 18 % de alcohol esteanlico, 70 % de almidon en forma granulada

SRP 1

: Poliesteres de extremo terminado anionicamente.

PEG X

: Polietilenglicol, de peso molecular X.

PVP K60®

: Homopolfmero de vinilpirrolidona (PM promedio de 160 000)

Jeffamine® ED- 2001

: Polietilenglicol con terminacion de Huntsman

Isachem® AS

: Sulfato de alquilo de alcohol ramificado de Enichem

MME PEG (2000)

: Monometileterpolietilenglicol (PM 2000) de Fluka Chemie AG

5

10

15

20

25

30

35

40

DC3225C

TEPAE

BTA

Betama

Azucar

CFAA

TPKFA

Arcilla

: Supresor de jabonaduras de silicona, mezcla de aceite de silicona y sflice de Dow Corning

: Etoxilato de tetraetilenpentaamina.

: Benzotriazol : (CHa)aN+CH2COO-

: D-glucosa de calidad industrial o azucar de calidad alimentaria : N-metilglucamida alquilo C12-C14

: Acidos grasos de fraccion completa descabezada C12-C14.

: Silicato de aluminio hidratado de formula general Al2OaSiO2-xH2O. Tipos: Caolinita, montmorillonita, atapulgita, illita, bentonita, halloysita

[0280] Para los detergentes para el lavado de la colada lfquidos de uso intensivo (HDL, por sus siglas en ingles) de Norteamerica (NA) y Europa Occidental (EO), la inactivacion por calor de las enzimas presentes en detergentes comercializados se realiza poniendo detergente lfquido pesado previamente (en una botella de vidrio) en un bano de agua a 95 °C durante 2 horas. El tiempo de incubacion para la inactivacion por calor de los detergentes para el lavado de la vajilla de forma automatica de NA y EO es de 8 horas. Tanto los detergentes calentados como los no calentados se someten a ensayo en el tiempo de 5 minutos tras la disolucion del detergente para determinar de forma precisa el porcentaje desactivado. La actividad enzimatica se evalua mediante el ensayo de AAPF.

[0281] Para someter a prueba la actividad enzimatica en detergentes inactivados por calor, se elaboran soluciones de trabajo de los detergentes a partir de soluciones madre inactivadas por calor. Se anaden cantidades apropiadas de dureza del agua (p. ej., 6 granos por galon (gpg) o 12 gpg) y de tampon a las soluciones detergentes para cumplir con las condiciones deseadas. Las soluciones se mezclan mediante agitacion vorticial o inversion de las botellas. En los siguientes ejemplos, se describen algunos detergentes comercializados.

EJEMPLO 1

Construccion de variantes de proteasas

[0282] Los polipeptidos de variantes de proteasas de la invencion y los acidos nucleicos de la invencion que codifican dichas variantes de proteasas pueden crearse utilizando uno o mas de una variedad de metodos estandar ampliamente conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, un acido nucleico que codifica una variante de proteasa de la invencion puede construirse mediante la mutagenesis dirigida de un ADN plasirndico que codifica una secuencia nucleotfdica expuesta en SEQ ID NO:18 que codifica una proteasa GG36 de B. lentus de forma que la variante de proteasa resultante ah codificada comprenda una o mas sustituciones de aminoacidos (mutaciones) deseadas en las posiciones de aminoacidos deseadas en relacion con la secuencia de aminoacidos de GG36 expuesta en SEQ ID NO:1. Por ejemplo, un experto en la materia puede emplear facilmente procedimientos estandar de mutagenesis dirigida utilizando la secuencia nucleotfdica de SEQ ID NO:18 (que codifica el polipeptido de proteasa GG36) para producir un acido nucleico que codifique un polipeptido de variante de proteasa que comprenda las sustituciones de aminoacidos deseadas en una o mas posiciones de aminoacidos de la proteasa GG36 (SEQ ID NO:1). Asimismo, un experto en la materia puede emplear facilmente procedimientos conocidos de mutagenesis dirigida utilizando la secuencia nucleotfdica de SEQ ID NO:18 para producir un acido nucleico que codifique un polipeptido de variante de proteasa que comprenda sustituciones de aminoacidos en una o mas de las posiciones de aminoacidos de GG36 (SeQ ID NO:1) seleccionados del grupo que consta de 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188, 244 y 248, donde cada posicion de aminoacido se numera segun la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa de interes con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN'.

[0283] Dichos procedimientos tambien pueden emplearse facilmente, p. ej., para producir acidos nucleicos que codifican variantes de proteasas PX3 (SEQ ID NO:6), PX4, (SEQ ID NO:7) y PX5 (SEQ ID NO:8) y variantes de proteasas de cada una de ellas, como variantes de PX3, PX4 y PX5 que comprendan sustituciones de aminoacidos adicionales, incluidas, p. ej., sustituciones de aminoacidos conservativas y no conservativas, deleciones de aminoacidos y/o adiciones o inserciones de aminoacidos.

[0284] Una secuencia nucleotidica que codifica una proteasa GG36 es de la siguiente forma:

gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgctttcagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagca

aaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctct

gaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttg

agctcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATT

AGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAA

AGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGG

CGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGC

ATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGC

CGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTC

AGCTCG ATT GCC C AAGG ATT GGAAT GGGC AGGGAAC AAT GGC AT GC AC GTT GCT AA

TTT G AGTTT AGGAAGC CCTT C GCC A AGT GC C AC ACTT G AGC A AGCT GTT AAT AGCGC

G ACTT CT AG AGGC GTT CTT GTT GT AGC GGC AT CT GG AAATT C AGGT GC AGGCT C AAT

CAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACA

ACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGT

GT AAACGT GC AGAGC AC AT ACCC AGGTT C AACGT AT GCC AGCTTAAACGGT AC AT C

GAT GGCT ACTCCT CAT GTT GC AGGT GC AGC AGCCCTT GTT AAAC AAAAGAACCC AT

CTT GGTCC AAT GT AC A AAT C CGC AAT CAT CT AA AGAAT ACGGC AACG AGCTT AGG A

AGC ACG AACTT GT AT GG AAGC GG ACTT GT C AAT GC AG AAGCT GC AACTCGTT AA

(SEQ ID NO: 18)

[0285] Como se ha mostrado anteriormente, la secuencia de ADN de SEQ ID NO:18 comprende una secuencia nucleotfdica que codifica un peptido senal (mostrado anteriormente sin subrayar, en letras minusculas), una secuencia nucleotfdica que codifica un propeptido (mostrado anteriormente subrayado, en letras minusculas) y

5 una secuencia nucleotidica que codifica un polipeptido GG36 maduro (mostrado anteriormente en letras mayusculas).

[0286] En la secuencia de protemas de GG36 proporcionada mas abajo, la secuencia de peptido senal se muestra en letras minusculas, la secuencia propeptidica se muestra en letras minusculas subrayadas y la secuencia de proteasa madura GG36 se muestra en letras mayusculas.

v rs k k 1 w i vas t a 11 i s vafs s s i as aaccakckyligfncqcavscfvcqvcandcvailsccccvcicllhcfctipvlsvclsncdvdalcldnaisy

ieedaevttmAOSVPWGISRVOAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTOD

GNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVA

NLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFS

QYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKN

10 TATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO: 19)

[0287] La secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa madura a la que se hace referencia en el presente documento como polipeptido PX3 y que tiene las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+N248R en relacion con SEQ ID NO:1 (utilizando la numeration de BPN' determinada por el alineamiento de la secuencia de polipeptido PX3 con la secuencia de

15 polipeptido BPN’ mostrada en SEQ ID NO:2) es:

AQSYPWGISRYQAPAAHNRGLTGSGYKYAYLDTGISTHPDLNIRGGASFYPGEPSTQDGNGHGT HVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQ APSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRADFSQYGAG LDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRRHLKNTATSLG STNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:6).

[0288] La secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa madura (variante de subtilisina) a la que se hace referencia en el presente documento como polipeptido PX4 y que comprende las sustituciones de aminoacidos N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A en relacion con SEQ ID NO:1 (utilizando la numeracion de BPN' determinada por el alineamiento de la secuencia de polipeptido PX4 con la secuencia de polipeptido BPN’

5 mostrada en SEQ ID NO:2) es:

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGT HVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQ APSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGL DIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGS TNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:7).

[0289] La secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa madura (variante de subtilisina) a la que se hace referencia en el presente documento como polipeptido PX5 y que comprende las sustituciones de aminoacidos N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/V244R en relacion con SEQ ID NO:1 (utilizando la numeracion

10 de BPN' determinada por el alineamiento de la secuencia de polipeptido PX3 con la secuencia de polipeptido BPN’ mostrada en SeQ ID NO:2) es:

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDG NGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVAN LSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRADFS QYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNRQIRNHLKN TATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:8).

[0290] Una secuencia de acido nucleico que codifica la variante de proteasa madura (variante de subtilisina) PX3 15 es:

GCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGAT T GAC AGGTT CTGGT GT AAAAGTT GCT GT CCT CG AT ACAGGT ATTTCCACT CAT CC AGACTT A AATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGC AT GGC ACGC AT GT GGCCGGG ACG ATT GCT GCTTT AGAC AATT CGATT GGCGTT CTTGGCGT A GCGCCGAGAGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCA GCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATCGTATGCACGTTGCTAATTTGAG TTT AGGACT GCAGGCACCAAGT GCC ACACTT GAGC AAGCT GTT AAT AGCGCGACTT CT AGA GGCGTT CTT GTT GT AGCGGC AT CT GGAAATT C AGGT GC AGGCT C AAT C AGCT AT CCGGCCCG TTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCGATTTTTCA CAGT AT GGCGC AGGGCTT GAC ATT GT CGC ACCAGGT GT AAACGT GCAGAGC AC AT ACCCAG GTT CAACGT AT GCC AGCTT AAACGGT AC AT CG AT GGCT ACTCCT CAT GTT GC AGGT GC AGCA GCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAGACATCTAAAGA ATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGC TGCAACTCGTTAA (SEQ ID NO:9)

[0291] Una secuencia de acido nucleico que codifica la variante de proteasa madura (variante de subtilisina) PX4

es:

GCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGAT T GAC AGGTT CTGGT GT AAAAGTT GCT GT CCT CG AT ACAGGT ATTTCCACT CAT CC AGACTT A AATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGC AT GGC ACGC AT GT GGCCGGG ACG ATT GCT GCTTT AGAC AATT CGATT GGCGTT CTT GGCGT A GCGCCGAGAGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCA GCT CGATTGCCCAAGGATTGGAAT GGGC AGGGAAC AAT CGT AT GCACGTT GCT AATTT GAG TTTAGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGA GGCGTT CTT GTT GT AGCGGC AT CT GGAAATT C AGGT GC AGGCT C AAT C AGCT AT CCGGCCCG TT AT GCGAACGC AAT GGC AGTCGGAGCT ACT GACC AAAAC AACAACCGCGCC AGCTTTT C A CAGT AT GGCGC AGGGCTT GAC ATT GT CGC ACCAGGT GT AAACGT GCAGAGC AC AT ACCCAG GTT CAACGT AT GCC AGCTTAAACGGT AC AT CG AT GGCT ACTCCT CAT GTT GC AGGT GC AGCA GCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAA TACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCT GCAACTCGTTAA (SEQ ID NO: 10)

5

[0292] Una secuencia de acido nucleico que codifica la variante de proteasa madura (variante de subtilisina) PX5 es:

GCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGAT T GAC AGGTT CTGGT GT AAAAGTT GCT GT CCT CG AT ACAGGT ATTTCCACT CAT CC AGACTT A AATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGC ATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAGACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTA GCGCCGAGAGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCA GCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATCGTATGCACGTTGCTAATTTGAG TTT AGGACT GCAGGCACCAAGT GCC ACACTTGAGC AAGCT GTT AAT AGCGCGACTT CT AGA GGCGTT CTT GTT GT AGCGGC AT CT GGAAATT C AGGT GC AGGCT C AAT C AGCT AT CCGGCCCG TTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCGATTTTTCA CAGT AT GGCGC AGGGCTT GAC ATT GT CGC ACCAGGT GT AAACGT GCAGAGC AC AT ACCCAG GTT CAACGT AT GCC AGCTT AAACGGT AC AT CG AT GGCT ACTCCT CAT GTT GC AGGT GC AGCA GCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATCGTCAAATCCGCAATCATCTAAAGAA TACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCT GCAACTCGTTAA (SEQ ID NO: 11)

[0293] Entre los ejemplos de procedimientos de mutagenesis dirigida ampliamente conocidos en el ambito de especializacion se incluyen, sin caracter limitativo, p. ej., el metodo de mutagenesis dirigida de sitio multiple QuikChange® incorporado en el kit QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (QCMS; Agilent Technologies - Stratagene, La Jolla, CA), que permite la mutagenesis dirigida de ADN plasmidico hasta en cinco 10 sitios distintos de forma simultanea. En otras partes del presente documento, se describen ejemplos adicionales conocidos de procedimientos de mutagenesis. Los acidos nucleicos de la invencion que codifican variantes de proteasas de la invencion tal como se describe en el presente documento, incluidos, p. ej., los polipeptidos de variante de proteasa PX3, PX4 y PX5 tambien pueden ser elaborados facilmente, p. ej., a partir de la secuencia nucleotidica que codifica proteasa GG36 expuesta en SEQ ID NO:18 por un experto en la materia utilizando 15 metodos de smtesis genetica y/o metodos de PCR de fusion ampliamente conocidos (vease, p. ej., la solicitud de patente de los Estados unidos con numero 2006/0252155).

[0294] Los acidos nucleicos que codifican las variantes de proteasas tambien pueden elaborarse mediante smtesis qmmica utilizando, p. ej., el metodo con fosforamidita clasico (vease, p. ej., Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22:1859-69 (1981)) o el metodo descrito por Matthes et al., EMBO J. 3:801-05 (1984), p. ej., como se 20 pone en practica normalmente en metodos de smtesis automatizada. De forma alternativa, los acidos nucleicos que codifican las variantes de proteasas pueden adquirirse de una variedad de fuentes comerciales, como de The Midland Certified Reagent Company (Midland, Texas) (pagina web para todo el mundo: oligos.com), The

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Great American Gene Company (pagina web para todo el mundo: genco.com), Operon Technologies, Inc. (Alameda, California) (ahora Qiagen, vease su pagina web para todo el mundo en qiagen.com) y DNA2.0 (Menlo Park, CA). Otras tecnicas para sintetizar acidos nucleicos y principios relacionados se describen, p. ej., en Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984) e Itakura et al., Science 198:1056 (1984).

[0295] En un aspecto, por ejemplo, si se utiliza la smtesis genetica para crear los acidos nucleicos que codifican variante de proteasa, dichos acidos nucleicos pueden disenarse con sitios de restriccion flanqueantes como, p. ej., Bglll, que puede utilizarse para clonar los acidos nucleicos que codifican las variantes en un plasmido de expresion (e.g., un plasmido de expresion de B. subtilis) tambien digerido con Bglll, como el plasmido de expresion de B. subtilis pHPLT-GG36 descrito en el presente documento. Este ejemplo de vector de expresion de B. subtilis pHPLT contiene el promotor LAT (Plat) de B. licheniformis, promotor HPA2 y elementos adicionales de pUB110 (vease, p. ej., McKenzie et al., Plasmid, 15:93-103 (1986)), incluido un gen de replicasa (reppUB), un gen de resistencia a la neomicina (neo) y un marcador de resistencia a la bleomicina (bleo) (vease tambien la firgura 4 de la patente de los Estados Unidos con numero 6,566,112). En la figura 2 se proporciona el mapa del plasmido pHPLT-GG36 y la secuencia del casete de expresion de GG36 se proporciona abajo. Para el kit de mutagenesis dirigida de sitio multiple QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (kit QCMS) o los metodos de PCR de fusion descritos en el presente documento, puede utilizarse el plasmido pHPLT-GG36 que comprende acido nucleico que codifica GG36 de B. lentus como molde de ADN para elaborar las variantes de proteasas de la invencion. En un formato de ejemplo, los cebadores nucleotfdicos que contienen las mutaciones deseadas se aparean con el acido nucleico que codifica GG36 en el plasmido pHPLT-GG36 y se extienden con un ADN polimerasa como se describe en el manual del producto QCMS de Stratagene y en la solicitud de patente de los Estados Unidos con numero 2006/0252155 para PCR de fusion. La tabla 1-1 proporciona ejemplos de secuencias nucleotidicas de los cebadores que pueden utilizarse para la mutagenesis dirigida.

Tabla 1-1 Ejemplos de cebadores utilizados para el metodo de mutagenesis dirigida de sitio multiple QuikChange®

Secuencia del cebador

Nombre del cebador

CGGGACGATTGCTGCTTTAGACAATTCGATTGGCGTTC (SEQ ID NO:12)

N76D

GGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAACGCGGAACTATACG (SEQ ID NO:13)

S87N

CCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATCGTATGCACGTTG (SEQ ID NO:14)

G118R

TAATTTGAGTTTAGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGC (SEQ ID NO:15)

S128L,P129Q,S130A

CCAAAACAACAACCGCGCCGATTTTTCACAGTATGGCGC (SEQ ID NO:16)

S188D

ATCTTGGTCCAATCGTCAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGC (SEQ ID NO:17)

V244R

[0296] La incorporacion de mutaciones en cada variante de proteasa puede realizarse en multiples rondas hasta obtener la variante de proteasa final. La amplificacion en cfrculo rodante (GE Healthcare, Piscataway, NJ) puede utilizarse como lo describe el fabricante para amplificar los plasmidos mutantes contenidos en las reacciones de ligacion de la PCR de fusion o el QCMS antes de la transformacion en celulas de B. subtilis (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

[0297] Las celulas de B. subtilis competentes (fenotipo: AaprE, AnprE, oppA, AspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK)) pueden transformarse con las variantes de plasmidos o 1 pL de la reaccion de la amplificacion en cfrculo rodante para obtener transformantes positivos en proteasa utilizando procedimientos conocidos en el ambito de especializacion (vease, p. ej., WO 02/14490). Las bacterias pueden hacerse competentes mediante la induccion del gen comK bajo el control de un promotor inducible por xilosa (vease, p. ej., Hahn et al., Mol. Microbiol. 21:763-775, 1996). Los clones positivos de variante de proteasa pueden seleccionarse en placas de agar/leche desnatada, aislarse, secuenciarse y la protema de variante de proteasa puede producirse en cultivos en frasco agitador para generar cantidades significativas de muestras de enzimas para caracterizacion.

EJEMPLO 2

Produccion de variantes de proteasas en Bacillus subtilis

[0298] Las variantes de proteasas (p. ej., variantes de subtilisinas) se produjeron mediante el cultivo de los transformantes de B. subtilis durante la noche a 37 °C en 10 ml de medio TSB (caldo basado en triptona y soja). Una alfcuota de 250 pl del cultivo a lo largo de la noche se transfirio a 25 ml de un medio definido basado en MOPS en un frasco agitador de 100 ml y se cultivo a 37 °C durante 68 horas. El medio definido se elaboro

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fundamentalmente como se conoce en el ambito de especializacion (vease Neidhardt et al., J Bacteriol. 119: 736747, 1974), salvo que el NH4Cl, FeSO4 y el CaCl2 se dejaron fuera del medio base, se utilizaron 3 mM de K2HPO4, y se suplemento el medio base con 60 mM de urea, 75 g/L de glucosa y 1 % soytone. Asimismo, los micronutrientes se hicieron como una solucion madre de 100 X que contema, en un litro, 400 mg de FeSO4.7H2O, 100 mg de MnSO4.H2O, 100 mg de ZnSO4.7H2O, 50 mg de CuCl2.2H2O, 100 mg de CoCl2.6H2O, 100 mg de NaMoO4.2H2O, 100 mg de Na2B4O7.10H2O, 10 ml de 1M de CaCl2 y 10 ml de 0,5 M de citrato de sodio. Las proteasas de interes se aislaron del medio de cultivo.

EJEMPLO 3

Metodos analiticos para determinar la pureza de muestras de variante de proteasa

[0299] En este ejemplo, se describen metodos utilizados para determinar la pureza de las variantes de proteasas recombinantes (p. ej., variantes de subtilisinas) obtenidas de cultivos de B. subtilis. Se considero que las variantes de proteasas eran puras cuando se encontro una sola banda o pico mediante electroforesis en gel y cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC, por sus siglas en ingles), respectivamente.

[0300] Se realizo una electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, pos sus siglas en ingles) en presencia de dodecilsulfato sodico (SDS, por sus siglas en ingles) como se conoce en el ambito de especializacion (Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970). No obstante, antes de la desnaturalizacion de las muestras de protemas (p. ej., 10 minutos en tampon de muestra que contenga SDS a 100 °C), era necesaria la inactivacion de la actividad de proteasa con el fin de evitar la autodegradacion. La inactivacion de la proteasa se consiguio mediante la incubacion de la muestra de protema con 1 mM de PMSF durante 30 minutos a temperatura ambiente o mediante la precipitacion de la protema con 8 % de acido tricloroacetico (TCA, por sus siglas en ingles) durante 30 minutos en hielo. Las muestras de protemas se sometieron a PAGE nativa llevada a cabo con un pH de 7.45. El tampon de gel constaba de 20 mM de histidina y 50 mM de acido 3-(N-morfolino)propanosulfonico (MOPS) y el 5 % de geles de poliacrilamida tema una ratio de acrilamida:bisacrilamida de 20:1. Las muestras de protemas se cargaron en la parte superior de placas de gel y se sometieron a electroforesis hacia el catodo. El mismo tampon de histidina/MOPS se utilizo como tampon (tanque) de electroforesis, pero ajustado a pH 6.3. Tras la electroforesis (~1-2 horas a 350 V), el gel se remojo en 8 % de acido acetico para fijar las protemas en el gel y, posteriormente, este se tinto con azul de Coomassie Brilliant Blue R250 y se destino como se conoce en el ambito de especializacion, para ubicar las bandas de protemas en el gel.

[0301] La pureza de la muestra de proteasa tambien se confirmo mediante analisis con HPLC utilizando una columna de intercambio de cationes MonoS y despues una columna de filtracion por gel TSK 2000. La primera se ejecuto en un tampon de 10 mM de fosfato de sodio a un pH de 5.5 con elucion de la proteasa ligada utilizando un gradiente lineal de 10-300 mM de fosfato de sodio a un pH de 5.5. La columna de filtracion por gel se ejecuto en 0,25 M de acetato de sodio a un pH de 5.5. Los perfiles de elucion de protemas se monitorizaron a 280 nm para ubicar la proteasa de interes y determinar el porcentaje de pureza de la muestra.

EJEMPLO 4

Determinacion de la concentracion de la variante de proteasa

[0302] En este ejemplo, se describen metodos utilizados para determinar las concentraciones de las variantes de proteasas. En algunos experimentos, se realizaron mediciones de la extincion (absorbencia) a 280 nm utilizando el coeficiente de extincion calculado (e) y se utilizaron titulaciones de sitio activo para determinar la concentracion de protema en una solucion de proteasa purificada, como se describe mas abajo.

[0303] El coeficiente de extincion a 280 nm se calculo a partir del numero de triptofanos (Trp, e = 5600 M'1.cm'1) y tirosinas (Tyr, e = 1330 M'1.cm'1) por molecula de enzima. Para la proteasa PB92, el coeficiente de extincion molar fue 26 100 M'1.cm'1 (3 residuos de Trp + 7 de Tyr) equivalente a e 1 %, medido a 280 nm = 9,7 (Mr = 26 729 Da). En el caso de mutantes de proteasas con un numero alterado de residuos de triptofano y/o tirosina, se realizaron las consiguientes correcciones.

[0304] Se obtuvo una estimacion de la concentracion de moleculas de enzima activa mediante titulacion de sitio activo. Dado que el metodo ampliamente utilizado de acilacion mediante N-transcinamoilimidazol (Bender et al., J. Amer. Chem. Soc., 88:5890-5931, 1966) no funciono de manera satisfactoria para la proteasa PB92, en su lugar se desarrollo un metodo que utilizaba el inhibidor irreversible PMSF. En este metodo, una solucion de proteasas con una concentracion de enzimas estimada (a partir de la absorcion de 280 nm) se mezclo con 0,25, 0,50, 0,75, 1,00 y 1,25 de equivalentes de PMSF, respectivamente, y se dejo reaccionar durante una hora a temperatura ambiente en 10 mM de fosfato de sodio a pH 6.5. La actividad de proteasa residual se midio de forma espectrofotometrica utilizando succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-alanil-para-nitroanilida (suc-AAPF- pNA) como sustrato. Para estos estudios, la pureza (y, por tanto, la concentracion) del PMSF se determino mediante espectroscopia de RMN y se prepararon soluciones madre de PMSF en isopropanol. Se hallo que los resultados de la titulacion de sitio activo concordaban con los resultados de la concentracion de protemas del control de pureza realizado mediante el metodo con HPLC.

EJEMPLO 5

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Ensayos

[0305] En este ejemplo, se describen metodos para evaluar la estabilidad y la eficacia de limpieza de una variante de proteasa de la invention.

Metodo de hidrolisis de AAPF

[0306] La termoestabilidad de la serina variante de proteasa se determino sometiendo a ensayo la actividad de proteasa con el ensayo de AAPF tras la incubacion de variantes de proteasas a 68 °C durante 1 hora. En las condiciones del ensayo, la actividad residual de la proteasa de referencia (p. ej., GG36 natural = GCI-P036) era de aproximadamente un 50 %. El equipamiento empleado fue: MTP con base plana (Costar, numero 90l7), Biomek FX y/o Biomek FXp Robot (Beckman Coulter), lector Spectramax Plus 384 MTP Reader (Molecular Devices), incubador/agitador iEMS (1 mm de amplitud) (Thermo/Labsystems), cinta de sellado (Nunc, numero 236366) y bano de hielo. Se preparo un tampon de glicina disolviendo 3,75 g de glicina (Merck, numero 1.04201.1000) en 960 mL de agua. A esta solution se anadio 1 ml de 5 % Tween®-80 (Sigma, numero P-8074) y 10 ml de una solucion madre de 1000 mM de CaCl2 (Merck, numero 1.02382.1000) (29,4 g disueltos en 200 ml). El pH se ajusto a 10.5 con 4 N de NaOH y el volumen se elevo a 1000 ml. Las concentraciones finales de glicina, CaCl2 y TWEEN®-80 fueron: 50 mM, 10 mM and 0,005 % respectivamente. Las incubadoras se ajustaron a 68 °C (para la incubacion) y a 25 °C (para el ensayo de AAPF). Se anadieron 90 ^l y 190 ^l de tampon de glicina a las placas de dilution e incubacion vatias, respectivamente. Entonces, se anadieron 10 ^l de sobrenadante a la placa de dilucion, seguido por la adicion de 10 ^l de la placa de dilucion a la placa de incubacion. Posteriormente, se anadieron 10 ^l de mezcla de la placa de incubacion a una placa calentada previamente que contema sustrato suc-AAPF-pNA. Se leyo la placa de suc-AAPF-pNA con el lector de MTP a 410 nm (medicion a t = 0). Se cubrio la placa de incubacion con cinta y se incubo durante 1 hora a 68 °C y 400 rpm. Al final de la incubacion, se quito la placa de la incubadora y se enfrio en hielo durante al menos 5 minutos. Se transfirieron 10 ^l de mezcla de la placa de incubacion a la placa que contema el sustrato suc-AAPF-pNA y se leyo la placa a 410 nm (medicion a t=60). El porcentaje de actividad residual se calculo como:

% de actividad residual: (mDO.mm-1 a t=60) / (mDO.mm-1 a t=0) x 100

Ensayos de estabilidad de quelantes y surfactantes

[0307] La estabilidad del LAS y el LAS/EDTA se midio tras la incubacion de la proteasa de prueba en presencia de LAS y LAS/EDTA, respectivamente, como una funcion de actividad residual determinada con el ensayo de AAPF.

Metodo de estabilidad de LAS Reactivos:

[0308]

Dodecilbencenosulfonato, sal de sodio (=LAS): Sigma D-2525 TWEEN®-80: Sigma P-8074

Tampon TRIS (acido libre): Sigma T-1378); se disuelven 6,35 g en aproximadamente 960 ml de agua; el pH se ajusta a 8.2 con 4 N de HCl. La concentration final de TRIS es de 52,5 mM.

Solucion madre de LAS: Preparar una solucion de LAS al 10,5 % en agua MQ (=10,5 g por 100 ml de MQ)

Tampon TRIS-100 mM / pH 8.6 (100 mM de Tris/Tween®-80 al 0,005 %)

Tampon TRIS-Ca, pH 8.6 (100 mM de Tris/10 mM de CaCh/Tween®-80 al 0,005 %)

Hardware:

[0309]

MTP de base plana (Costar, numero 9017)

Biomek FX ASYS multipipeta Lector de MTP Spectramax Incubadora/agitador iEMS Incubadora/agitador Innova 4330 Pipeta multicanal Biohit Agitador Thermostar de BMG

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[0310] Se preparo una solution de LAS al 0,063 % en 52,5 mM de tampon TRIS a pH 8.2. La solution de trabajo de suc-AAPF-pNA se preparo anadiendo 1 ml de 100 mg/ml de solucion madre de suc-AAPF-pNA (en DMSO) a 100 ml (100 mM) de tampon TRIS, a pH 8.6. Para diluir los sobrenadantes, se llenaron las placas con bases planas con tampon de dilution, y se anadio y se mezclo bien una aKcuota del sobrenadante. La ratio de dilution dependio de la concentration de los controles de proteasa en las placas de cultivo (actividad de AAPF). La concentration de protemas deseada era de 80 ppm.

[0311] Se anadieron 10 ^l del sobrenadante a 190 ^l de tampon/pocillo de LAS al 0,063 %. La MTP se cubrio con cinta, se agito durante unos segundos y se coloco en una incubadora (Innova 4230) a 25 °C o 35 °C para ASP, o 45 °C para BPN' o GG36, durante 60 minutos a una agitation de 200 rpm. La actividad inicial (t=10 minutos) se determino tras 10 minutos de incubation transfiriendo 10 ^l de la mezcla en cada pocillo a una MTP fresca que contema 190 ^l de solucion de trabajo de suc-AAPF-pNA. Estas soluciones se mezclaron bien y la actividad de AAPF se midio utilizando un lector de MTP (20 lecturas en 5 minutos y a 25 °C).

[0312] La actividad final (t=60 minutos) se determino quitando otros 10 ^l de solucion de la placa incubadora tras 60 minutos de incubacion. Entonces, se determino la actividad de AAPF como se ha descrito anteriormente. La estabilidad de las muestras se determino calculando la ratio de la actividad de AAPF residual e inicial de la siguiente forma:

Actividad residual (%): (valor t-60)* x 100 / (valor t-10).

Metodo de estabilidad de LAS/EDTA

[0313] La estabilidad de una variante de proteasa en presencia de un surfactante anionico representativo (LAS=sulfonato alquilobenceno lineal, dodecilbencenosulfonato de sodio-DOBS) y EDTA disodico se midio tras la incubacion en condiciones definidas y la actividad residual se determino mediante el ensayo de AAPF. Los reactivos utilizados fueron dodecilbenceno sulfonato, sal de sodio (DOBS, Sigma, numero D-2525), TWEEN®-80 (Sigma, numero P-8074), EDTA disodico (Siegfried Handel, numero 164599-02), HEPES (Sigma, numero H- 7523), tampon no sometido a tensiones: 50 mM de HEPES (11,9 g/l) + TWEEN®-80 al 0,005 %, a pH 8.0, tampon sometido a tensiones: 50 mM de HEPES (11,9 g/l), 0,1 % (p/v) DOBS (1 g/l), 10 mM de EDTA (3,36 g/l), a pH 8.0, sobrenadantes de cultivo de proteasa de referencia y variante de proteasa, con 200 - 400 ^g/ml de protema. El equipamiento empleado fue MTP con base en forma de V o de U como placas de dilucion (Greiner 651101 y 650161, respectivamente), MTP con base plana (Corning 9017) para tampon no sometido a tensiones o de lAs/EDTA asi como para placas de suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter), lector de MTP Spectramax Plus 384 (Molecular Devices), incubadora/agitador iEMS (1 mm de amplitud) de Thermo Electron Corporation, cinta de sellado: Nunc (236366).

[0314] La incubadora/agitador iEMS (Thermo/Labsystems) se ajusto a 29 °C. Los sobrenadantes del cultivo se diluyeron en placas que conteman tampon no sometido a tensiones en una concentracion de ~ 25 ppm (placa de dilucion maestra). Se anadieron 20 ^l de muestra de la placa de dilucion maestra a placas que conteman 180 ^l de tampon no sometido a tensiones para proporcionar una concentracion de incubacion final de 2,5 ppm. Los contenidos se mezclaron y se mantuvieron a temperatura ambiente, y se realizo un ensayo de AAPF en esta placa. Tambien se anadieron 20 ^l de muestra de la placa de dilucion maestra a placas que conteman 180 ^l de tampon sometido a tensiones (50 mM de HEPES (11,9 g/l), 0,1 % (p/v) DOBS (1 g/l), 10 mM de EDTA (3,36 g/l), a pH 8.0). Las soluciones se mezclaron y se pusieron inmediatamente en el agitador iEMS a 29 °C durante 30 minutos a 400 rpm. Tras 30 minutos de incubacion, se realizo un ensayo de AAPF en la placa sometida a tensiones. (DO = absorbencia de densidad optica). La estabilidad de las muestras se determino calculando la ratio de la actividad de AAPF residual e inicial de la siguiente forma: Actividad residual (%) = (mDO.min-1 sometida a tensiones)*100 / (mDO. min-1 no sometida a tensiones).

EJEMPLO 6

Prueba de eficacia de lavado para la variante PX3

[0315] En este ejemplo, se describen metodos adecuados para la evaluation de la eficacia de limpieza de tejidos y de la vajilla de la variante de proteasa PX3 (p. ej., variante de subtilisina) y la subtilisina de referencia GCI-P038 en detergentes para la colada y el lavado de la vajilla comercializados.

Eficacia de lavado de la vajilla

[0316] En el presente documento se describen los metodos utilizados para medir la eficacia de lavado de la vajilla de las variantes de proteasas de la invention (p. ej., variantes de subtilisinas) y la subtilisina de referencia GCI-P038 en detergentes para el lavado de la vajilla comercializados.

[0317] La eficacia de las variantes de proteasas se probo en varias condiciones de lavado de la vajilla de forma automatica. Las composiciones de los detergentes para el lavado de la vajilla se muestran en las tablas 6-1 y 62. Estos detergentes estan comercializados por wfk Testmaterials (
www.testgewebe.de/en/products/detergents/) y se hace referencia a ellos por sus denominaciones de wfk Testmaterials. Estos detergentes se obtuvieron de la fuente sin la presencia de enzimas, con el fin de permitir el analisis de las variantes de proteasas.

Tabla 6-1 Detergente sin fosfato IEC-60436 WFK Tipo B (pH=10.4 en 3g/l)

Componente

% en peso

Citrato de sodio dihidratado

30,0

Sal de sodio de copolfmero de acido acnlico/acido maleico

12,0

Perborato de sodio monohidratado

5,0

TAED

2,0

Disilicato de sodio Protil A (Cognis)

25,0

Alcohol graso lineal etoxilado

2,0

Carbonato de sodio anhidro

anadir hasta 100

Tabla 6-2 Detergente con fosfato: IEC-60436 WFK Tipo C (pH=10.5 en 3 g/l)

Componente

% en peso

Tripolifosfato de sodio

23,0

Citrato de sodio dihidratado

22,3

Sal de sodio de copolfmero de acido acnlico/acido maleico

4,0

Perborato de sodio monohidratado

6,0

TAED

2,0

Disilicato de sodio: Protil A (Cognis)

5,0

Alcohol graso lineal etoxilado

2,0

Carbonato de sodio anhidro

anadir hasta 100

[0318] Mas abajo, se proporcionan los protocolos para la preparacion de cada uno de los tipos de manchas (yema de huevo, carne picada y huevo, as^ como huevo con leche). Antes de aplicar los tipos de suciedad 5 individuales a las piezas de vajilla de prueba, estas se lavaron en profundidad. Esto era especialmente necesario, dado que todavfa puede haber presentes residuos de determinadas manchas persistentes en las piezas de la vajilla desde pruebas anteriores. Tambien se sometieron nuevas piezas de vajilla a tres lavados en profundidad antes de utilizarse por primera vez en la prueba.

Preparacion de manchas de yema de huevo sobre acero inoxidable

10 [0319] Las laminas de acero inoxidable (10 x 15 cm; cepilladas en uno de sus lados) utilizadas en estos

experimented se lavaron en profundidad a 95 °C en un lavavajillas de laboratorio con un detergente comercial de elevada alcalinidad (p. ej., detergente ECOLAB®; Henkel) para proporcionar laminas que estuvieran limpias y no tuvieran grasa. Antes de su primer uso, se eliminaron las rebabas de estas laminas. Las laminas se secaron durante 30 minutos a 80 °C en una caja termica antes de ser ensuciadas con yema de huevo. Las superficies 15 cepilladas no se tocaron antes de ser ensuciadas. Asimismo, no se permitieron manchas de agua o pelusas sobre las superficies. Las laminas enfriadas se pesaron antes de ser ensuciadas.

[0320] Las yemas de huevo se prepararon separando las yemas de aproximadamente 10-11 huevos (200 g de yema de huevo) de las claras. Las yemas se batieron con un tenedor en un vaso de laboratorio para homogeneizar la suspension de huevo. Entonces, se filtraron las yemas (malla de tamiz de aproximadamente 0,5

20 mm) para eliminar las partteulas gruesas y cualquier fragmento de cascara de huevo.

[0321] Se utilizo un cepillo plano (2,5") para aplicar 2,0 ± 0,1 g de suspension de yema de huevo de la forma mas uniforme posible en un area de 140 cm2 sobre los lados cepillados de cada lamina de acero inoxidable, dejando una orilla de aproximadamente 1 cm de ancho sin ensuciar (se empleo cinta adhesiva en caso de ser necesaria).

60

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Las laminas sucias se secaron en sentido horizontal (para evitar la formacion de gotas sobre los bordes de las laminas) a temperatura ambiente durante 4 horas (max. 24 horas).

[0322] Para desnaturalizar las protemas de yema de huevo, se sumergieron las laminas durante 30 segundos en agua hirviendo desmineralizada (utilizando un dispositivo de sujecion, en caso de ser necesario). Entonces, las laminas se secaron de nuevo durante 30 minutos a 80 °C. Despues de secarse y enfriarse, las laminas se pesaron. Despues de pesarlas, se dejaron las placas durante al menos 24 horas (20 °C, 40-60 % de humedad relativa) antes de someterlas a la prueba de lavado. Con el fin de cumplir con los requisitos de las pruebas, en estas solamente se utilizaron las laminas con 1000 ± 100 mg/140 cm2 (yema de huevo tras la desnaturalizacion). Despues de llevar a cabo las pruebas de lavado, las laminas se secaron durante 30 minutos a 80 °C en la caja termica y se pesaron de nuevo despues de enfriarse. El porcentaje de eficacia de limpieza se determino dividiendo los mg de yema de huevo liberados tras el lavado entre los mg de yema de huevo aplicados y multiplicando por 100.

Preparacion de manchas de carne picada y huevo sobre platos de porcelana

[0323] Para estos experimentos, se utilizaron platos de postre (Arzberg, 19 cm de diametro, blancos, porcelana vitrificada) conforme a EN 50242, formulario 1495, numero 0219. Se cortaron de forma fina 225 g de magra de cerdo y ternera (ratio 50:50) y se mantuvieron fnos. La mezcla se proceso dos veces mediante una picadora. Se evitaron temperaturas superiores a 35 °C. Los 225 g de carne picada se mezclaron entonces con 75 g de huevo (clara y yema mezcladas). Despues, se congelo la preparacion durante hasta tres meses a -18 °C antes de su uso. Si no se dispoma de cerdo, se utilizo 100 % de ternera, dado que son intercambiables.

[0324] Se devolvio la mezcla de carne picada y huevo (300 g) a temperatura ambiente y se mezclo con 80 ml de agua desmineralizada. Entonces, se homogeneizo la mezcla durante dos minutos utilizando una batidora manual de cocina. Se utilizo un tenedor para expandir 3 g de la mezcla de carne picada/huevo/agua sobre cada plato de porcelana blanco, dejando un margen de aproximadamente 2 cm alrededor de la orilla. La cantidad aplicada fue de 11,8 ± 0,5 mg/cm2. Los platos se secaron durante 2 horas a 120 °C en una caja termica calentada previamente. Tan pronto como los platos se enfriaron, estaban listos para su uso.

[0325] Tras realizar las pruebas del lavado de la vajilla, se pulverizaron los platos con solucion de ninhidrina (preparada al 1 % de etanol) para una mejor identificacion de los residuos de protemas de la carne picada. Para facilitar la reaccion de color, se calentaron los platos durante 10 minutos a 80 °C en la caja termica. La evaluacion de la eficacia de lavado se realizo inspeccionando visualmente las reacciones de color del residuo de carne picada con referencia al catalogo fotografico de IKW (IKW - The German Cosmetic, Toiletry, Perfumery and Detergent Association).

Preparacion de manchas de huevo/leche sobre acero inoxidable

[0326] Las laminas de acero inoxidable (10 x 15 cm; cepilladas en uno de sus lados) utilizadas en estos experimentos se lavaron en profundidad a 95 °C en un lavavajillas de laboratorio con un detergente comercial de elevada alcalinidad para quitar la grasa y limpiar las laminas. Las laminas se secaron con un pano de celulosa. Las superficies cepilladas no se tocaron antes de ser ensuciadas. Asimismo, no se permitieron manchas de agua o pelusas sobre las superficies. Antes de ser ensuciadas, las laminas se pusieron en una caja termica a 80 °C durante 30 minutos. Las laminas enfriadas se pesaron antes de ensuciarse.

[0327] Las yemas y las blancas de huevos crudos enteros (3-4 huevos; aproximadamente 160 g/huevo) se pusieron en un bol y se batieron con un batidor de huevo. Entonces, se anadieron a la mezcla 50 ml de leche semidesnatada (1,5 % de grasa, temperatura ultraelevada, homogeneizada). La leche y el huevo se mezclaron sin generar espuma. Se utilizo un cepillo plano para distribuir de manera uniforme 1,0 ± 0,1 g de la mezcla de huevo y leche sobre el lado cepillado de las laminas de acero inoxidable, utilizando una balanza para comprobar la distribucion. Se dejo un margen de aproximadamente 1,0 cm alrededor de los lados cortos de las laminas. Las laminas sucias se secaron en sentido horizontal (para evitar la formacion de gotas sobre los bordes de las laminas) a temperatura ambiente durante 4 horas (max. 24 horas).

[0328] Entonces, se sumergieron las laminas durante 30 segundos en agua hirviendo desmineralizada (utilizando un dispositivo de sujecion, en caso de ser necesario). Entonces, las laminas se secaron de nuevo durante 30 minutos a 80 °C. Despues de secarse y enfriarse, las laminas se pesaron. Despues de pesarlas, se dejo reposar las placas durante al menos 24 horas (20 °C, 40-60 % de humedad relativa) antes de someterlas a la prueba de lavado. Con el fin de cumplir con los requisitos de las pruebas, solamente se utilizaron laminas con 190 ± 10 mg de yema de huevo/leche.

[0329] Despues de llevar a cabo las pruebas de lavado, las laminas se secaron durante 30 minutos a 80 °C en la caja termica y se pesaron de nuevo despues de enfriarse. El porcentaje de eficacia de limpieza se determino dividiendo los mg de huevo/leche liberados tras el lavado entre los mg de huevo/leche aplicados y multiplicando por 100.

Equipamiento y condiciones de lavado

[0330] Las pruebas de lavado se realizaron en un lavavajillas automatico (Miele, modelo G690SC), equipado con piezas de vajilla sucias y laminas de acero inoxidable, preparadas como se ha descrito anteriormente. Se utilizo una cantidad de detergente definida. La temperatura en la prueba fue de 50 °C. La dureza del agua era de 21° GH (dureza alemana).

5 [0331] Tal como se ha descrito anteriormente, tras el lavado, los platos ensuciados con carne picada fueron

evaluados visualmente utilizando una escala de calificacion fotografica del 0 al 10, donde «0» designaba un plato totalmente sucio y «10» designaba un plato limpio. Estos valores corresponden a la capacidad de eliminar la suciedad o las manchas (SR, por sus siglas en ingles) del detergente que contiene las enzimas.

[0332] Los platos de acero inoxidable lavados que habfan sido ensuciados con yema de huevo o yema de 10 huevo/leche se analizaron gravimetricamente para determinar la cantidad de manchas residuales tras el lavado.

La variante de subtilisina PX3 y la subtilisina de referencia GCI-P038 se probaron a un nivel de entre 0 y 30 mg/protema activa por lavado.

[0333] Los resultados de varias pruebas de lavado de la vajilla se proporcionan mas abajo, en las tablas 6-3 a 66. En cada experimento, se utilizaron distintas concentraciones de proteasa activa por lavado. A la eficacia de

15 lavado de la subtilisina de referencia GCI-P038 se le asigno un valor de «100», mientras que la eficacia de lavado de las variantes se comparo con este valor. Por ejemplo, si la subtilisina de referencia GCI-P038 tuviera un resultado del 45 % de eliminacion de manchas y una variante tuviera un resultado del 52 % de eliminacion de manchas, el resultado de la variante de subtilisina mostrado como mdice de eficacia (IE) sena 52/45 x 100 = 116. En consecuencia, en los dos detergentes probados, la variante de subtilisina PX3 era mas efectiva o igual de 20 efectiva que la subtilisina de referencia GCI-P038 para la eliminacion de manchas protemicas en aplicaciones de lavado de la vajilla.

Tabla 6-3 Detergente con fosfato, 50 °C, 21 °GH, dosificado a 0,05 % de protema activa

Enzima

IE IE IE

Yema de huevo Carne picada Yema de huevo/leche

GCI-P038 de referencia

100 100 100

Variante PX3

111 157 147

Tabla 6-4 Detergente con fosfato 50 °C, 21 °GH, dosificado a 0,15 % de protema activa

Enzima

IE IE IE

Yema de huevo Carne picada Yema de huevo/leche

GCI-P038 de referencia

100 100 100

Variante PX3

135 100* 113

* En estas condiciones especificadas la eliminacion de suciedad mediante GCI-P038 fue del 100 %.

Tabla 6-5 Detergente sin fosfato 50 °C, 21 °GH, dosificado a 0,05 % de protema activa

Enzima

IE IE IE

Yema de huevo

Carne picada Yema de huevo/leche

GCI-P038 de referencia

100 100 100

Variante PX3

124 150 117

Tabla 6-6 Detergente sin fosfato 50 °C, 21 °GH, dosificado a 0,15 % de protema activa

Enzima

IE IE IE

Yema de huevo Carne picada Yema de huevo/leche

Tabla 6-6 Detergente sin fosfato

50 °C, 21 °GH, dosificado a 0,15 % de protema activa

GCI-P038 de referencia

100 100 100

Variante PX3

115 118 103

EJEMPLO 7

Pruebas de eficacia de lavado

[0334] En este ejemplo, se describen metodos adecuados para evaluar la eficacia de limpieza de tejidos de las 5 variantes de proteasas de la invencion en detergentes para la colada comercializados.

Tabla 7-1 Condiciones de lavado de la colada

Region

Forma Dosis Detergente* Tampon Gpg pH T (°C)

Colada (granulado y lfquido para uso intensivo)

NA

HDL 0,78 g/l P&G TIDE® 2X 5 mM de HEPES 6 8,0 20

EO

HDL 5,0 g/L Henkel PERSIL™ 5 mM de HEPES 12 8,2 40

EO

HDG 8,0 g/L P&G ARIELI™ 2 mM Na2 CO3 12 10,5 40

JPN

HDG 0,7 g/L P&G TIDE® 2 mM Na2 CO3 6 10,0 20

NA

HDG 1,0 g/L P&G TIDE® 2 mM Na2 CO3 6 10,0 20

* Abreviaturas: Procter & Gamble (P&G); Reckitt Benckiser (RB); detergente lfquido para uso intensivo (HDL,

por sus siglas en ingles); detergente granulado para uso intensivo (HDG, por sus siglas en ingles).

Ensayo con micromuestras de sangre, leche y tinta (BMI, por sus siglas en ingles)

[0335] La eficacia de eliminacion de manchas de las variantes de proteasas puede determinate a escala de una placa microtituladora (MTP, por sus siglas en ingles) en detergentes comercializados. Las muestras de una 10 enzima de proteasa de referencia (p. ej., subtilisina de referencia) y las variantes de proteasas se obtienen de caldo de cultivo filtrado de cultivos llevados a cabo en placas microtituladoras durante 3 dfas a 37 °C/ 300 rpm/ 90 % de humedad relativa. El equipamiento empleado incluye: placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, numero 9017, base plana sin tratar), Biomek FX y/o Biomek FXp (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 (Molecular Devices), incubadora/agitador iEMS con 1 mm de amplitud (Thermo Electron Corporation) y cinta de 15 sellado (Nunc, numero 236366). Los reactivos utilizados incluyen: tampon de 5 mM de HEPEs, pH 8.0 o 5 mM de MOPS, pH 7, 3:1 Ca: Mg para dureza media del agua (CaCl2: MgC^6H2O); 15 000 granos por galon (gpg) de solucion madre diluidos a 6 gpg, dos muestras de BMI (sangre/leche/tinta) por placa: muestras de algodon con BMI EMPA-116 procesadas por CFT: dos muestras perforadas y enjuagadas previamente por pocillo, y detergente disponible en el mercado TIDE® 2X inactivado por calor en el que puede confirmarse la falta de 20 actividad de proteasa. En este ensayo, las proteasas hidrolizan el sustrato y liberan pigmento y partfculas insolubles del sustrato.

Tabla 7-2 Soluciones detergentes de trabajo

Detergente

Temp (°C) Detergente g/L PH Tampon Granos por galon (gpg)

TIDE® 2X

16 0,98 8 5 mM de HEPES 6

TIDE® 2X

32 0,98 8 5 mM de HEPES 6

TIDE® 2X

16 0,98 7 5 mM de MOPS 6

[0336] La incubadora se configura a la temperatura deseada (16 °C o 32 °C). En primer lugar, se anaden muestras de 10 |jL de las placas de dilucion maestra de ~10 ppm de enzima a las placas con dos muestras de 25 BMI con 190 jL de soluciones detergentes de trabajo mencionadas anteriormente. El volumen se ajusta para proporcionar una concentracion final de 0,5 ppm de variantes de proteasas en las placas del ensayo. Entonces, las placas se transfieren inmediatamente a incubadoras iEMS y se incuban durante 30 minutos con agitacion a

5

10

15

20

25

30

35

40

1400 rpm a una temperatura determinada. Tras la incubacion, se transfieren 100 pL de sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos y se mide la absorbencia en un lector de MTP a 405 nm y/o 600 nm. Tambien se incluyen en la prueba pocillos de control que contienen una o dos micromuestras y detergente sin la adicion de muestras de proteasa. La medicion de absorbencia a 405 nm proporciona un valor mas elevado y monitoriza la eliminacion de pigmentos, mientras que la medicion de la absorbencia a 600 nm monitoriza la turbiedad y la limpieza.

Calculo de la actividad de eliminacion de manchas:

[0337] El valor de absorbencia obtenido se corrige para el valor en blanco (sustrato sin enzima), proporcionando una medicion de la actividad hidrolftica. Para cada muestra (p. ej., enzima de variante de proteasa o enzima de proteasa de referencia), se calcula el mdice de eficacia (IE). El mdice de eficacia compara la eficacia de la variante de proteasa (valor real) y la enzima de proteasa de referencia estandar (valor teorico) en la misma concentracion de protemas. Ademas, los valores teoricos de la enzima estandar pueden calcularse utilizando los parametros de la ecuacion de Langmuir. Un mdice de eficacia (IE) que es mayor que 1 (IE>1) identifica una variante de proteasa mejor en comparacion con la enzima de proteasa de referencia (p. ej., subtilisina natural); esto es, un mdice de eficacia mayor que 1 identifica una variante de proteasa que tiene una capacidad potenciada o mejorada de reducir, eliminar o quitar una mancha de interes en comparacion con la capacidad de la enzima de proteasa de referencia de reducir o eliminar la misma mancha o una similar. Un IE de 1 (IE=1) identifica una variante de proteasa que tiene la misma eficacia o aproximadamente la misma eficacia que la enzima de proteasa de referencia (esto es, la variante de proteasa tiene la misma o aproximadamente la misma capacidad de reducir, eliminar o quitar una mancha de interes en comparacion con la capacidad de la enzima de proteasa de referencia de reducir o eliminar la misma mancha o una similar). Un IE menor que 1 (IE<1) identifica una variante de proteasa que tiene una eficacia menor que la enzima de proteasa de referencia (esto es, la variante de proteasa tiene una capacidad reducida o mas baja de reducir, eliminar o quitar una mancha de interes en comparacion con la capacidad de la enzima de proteasa de referencia de reducir o eliminar la misma mancha o una similar). En consecuencia, el valor del IE identifica variantes de proteasas que tienen una capacidad potenciada o mejorada de reducir, eliminar o quitar una mancha de interes en comparacion con la capacidad de la enzima de proteasa de referencia de reducir o eliminar la misma mancha o una similar en determinadas circunstancias o condiciones, asf como variantes de proteasas cuyo uso es menos deseable en determinadas circunstancias como, p. ej., aquellas variantes de proteasas que tienen una capacidad disminuida de reducir, eliminar o quitar una mancha de interes en comparacion con la capacidad de una proteasa de referencia de eliminar la misma mancha o una similar.

EJEMPLO 8

Eficacia de limpieza de las variantes de proteasas PX3, PX4 y PX5 Ensayo de micromuestras de BMI en aplicaciones de colada

[0338] En la tabla 8-1 se muestran los resultados de los experimentos realizados para determinar la eficacia de limpieza de las variantes PX4 y PX5 en aplicaciones de colada. Los detergentes de prueba utilizados fueron los detergentes inactivados por calor comercializados TIDE® 2X Free (P&G; "NA HDL") y TIDE Free (P&G; "NA HDD"). La eficacia de limpieza de las micromuestras manchadas de BMI se probo utilizando 0,2 ppm de las variantes a 25 °C durante 30 minutos con una agitacion de 1400 rpm en un volumen de 200 pL. La funcionalidad de las variantes de GCI-P036 se cuantifico como un mdice de eficacia (IE), que es la ratio de la eficacia de una variante y una protema GCI-P036 original. Tambien se sometieron a prueba la subtilisina FNA (BPN'-Y217L) y las protemas GCI-P036-S87N-G118V-S128L-P129Q-S130A.

Tabla 8-1. Valores del Ie de variantes de GCI-P036 sometidas a prueba para la eficacia de eliminacion de manchas en micromuestras de BMI en detergentes NA HDL y NA HDD

UV #

Variantes basadas en GCI-P036 NA HDL pH 8 NA HDD pH 10

GCI-P036

- 1,00 1,00

PX4

N76D/S87R/G118R/S128L/ P129Q/S130A 0,97 1,07

PX5

S87R/ N76D/G118R/ S128L/ P129Q/ S130A/ S188D/V244R 0,87 0,98

Variante de GCI- P036

S87N-G118V-S128L-P129Q-S130A 1,22 1,14

FNA

BPN'Y217L 1,29 0,66

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

EJEMPLO 9

Eficacia de limpieza de las variantes de proteasas PX3, PX4 y PX5

Ensayo de micromuestras con yema de huevo batida en aplicaciones de lavado de la vajilla

[0339] La eficacia de eliminacion de manchas de las variantes de proteasas (p. ej., variantes de subtilisinas) se determino a escala de una placa microtituladora (MTP) en detergentes comercializados (CALGONIT® (Reckitt- Benckiser) y CASCADE® (P&G)). Las muestras para someter a prueba las variantes de subtilisinas se obtuvieron de caldo de cultivo filtrado de cultivos llevados a cabo en placas microtituladoras durante 3 dfas a 37 °C/ 300 rpm/ 90 % de humedad relativa. El equipamiento utilizado inclrna: un robot Biomek FX (Beckman Coulter), una placa microtituladora SpectraMAX (MTP) (tipo 340; Molecular Devices), una incubadora/agitador iEMS (Thermo/Labsystems); MTP de base plana (Costar, tipo 9017) para la lectura de placas de reaccion tras la incubacion MTP con base en forma de V (Greiner 651l0l) para la dilucion previa del sobrenadante. Como sustrato, se utilizaron micromuestras CS-38 (yema de huevo con pigmento, envejecidas por calentamiento), obtenidas de CFT Vlaardingen. Se utilizaron dos muestras por pocillo. Para preparar la solucion detergente, se utilizaron pastillas para el lavado de la vajilla de forma automatica (ADW, por sus siglas en ingles) de Calgonit 5 en 1. Para inactivar la actividad de proteasa presente en las pastillas, se disolvio una pastilla de 21 g en agua Milli-Q calentada en un bano de agua a una temperatura de 60 °C. Se enfrio la solucion a temperatura ambiente y el volumen del agua se ajusto a 700 mL. La solucion tambien se diluyo con agua para obtener una concentracion final de 3 g/l. La dureza del agua se ajusto a to 21 °GH anadiendo 1,46 ml de la mezcla Ca/Mg (mezcla Ca/Mg ((3:1), 1,92 M de CaCh =282,3 g/L de CaCl2.2H20; 0,64 M de MgCh = 130,1 g/L de MgCl2.6H2O), 15 000 gpg). Las muestras de enzimas se diluyeron previamente en 10 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, solucion TWEEN®-80 al 0,005 % y se sometieron a prueba en concentraciones apropiadas.

[0340] Se ajusto la incubadora a la temperatura deseada de 40 °C o 50 °C, y se anadieron 72 pl de tampon de dilucion a la placa con base en forma de V vacfa (= placa de dilucion) seguido de 8 pl de sobrenadante. Entonces, se anadieron 9 pl de la placa de dilucion a placas que conteman las micromuestras incubadas en 171 pl de solucion detergente. La placa de micromuestras (con detergente y enzima) se cubrio con cinta y se puso en la incubadora/agitador durante 30 minutos a 1400 rpm. Tras la incubacion, se transfirieron 75 pl de la mezcla de reaccion a una placa con base plana vacfa y se leyo la absorbencia en un lector de MTP a 405 nm despues de eliminar las burbujas con un secador de pelo. En la prueba, tambien se incluyeron ensayos en blanco que conteman una o dos micromuestras y detergente sin la adicion de las muestras que conteman la subtilisina de referencia.

Tabla 9-1. Condiciones de lavado de la vajilla de forma automatica

Region

Forma Dosis Detergente* Tampon Gpg pH T (°C)

EO

ADW 3,0 g/L RB CALGONIT™ 2 mM Na2 CO3 21 10,0 40

NA

ADW 3,0 g/L P&G CASCADE™ 2 mM Na2 CO3 9 10,0 40

* Abreviaturas: Procter & Gamble (P&G); y Reckitt Benckiser (RB).

Calculo de la actividad de eliminacion de manchas:

[0341] El valor de absorbencia obtenido se corrigio para el valor en blanco (sustrato sin enzima), proporcionando una medicion de la actividad hidrolttica. Para cada muestra (p. ej., enzima de variante de proteasa o enzima de proteasa de referencia), se calculo el mdice de eficacia (IE). El mdice de eficacia compara la eficacia de la variante de proteasa (valor real) y la enzima de proteasa de referencia (valor teorico) en la misma concentracion de protemas. Ademas, los valores teoricos de la enzima estandar pueden calcularse utilizando los parametros de la ecuacion de Langmuir. Un mdice de eficacia (IE) que es mayor que 1 (IE>1) identifica una variante de proteasa mejor en comparacion con la enzima de proteasa de referencia (p. ej., subtilisina natural); esto es, un mdice de eficacia mayor que 1 identifica una variante de proteasa que tiene una capacidad potenciada o mejorada de reducir, eliminar o quitar una mancha de interes (p. ej., yema de huevo con pigmento, envejecidas por calentamiento) en comparacion con la capacidad de la enzima de proteasa de referencia de reducir o eliminar la misma mancha o una similar. Un IE de 1 (IE=1) identifica una variante de proteasa que tiene la misma eficacia o aproximadamente la misma eficacia que la enzima de proteasa de referencia (esto es, la variante de proteasa tiene la misma o aproximadamente la misma capacidad de reducir, eliminar o quitar una mancha de interes en comparacion con la capacidad de la enzima de proteasa de referencia de reducir o eliminar la misma mancha o una similar). Un IE menor que 1 (IE<1) identifica una variante de proteasa que tiene una eficacia menor que la enzima de proteasa de referencia (esto es, la variante de proteasa tiene una capacidad reducida o mas baja de reducir, eliminar o quitar una mancha de interes en comparacion con la capacidad de la enzima de proteasa de referencia de reducir o eliminar la misma mancha o una similar). En consecuencia, el valor del IE identifica variantes de proteasas que tienen una capacidad potenciada o mejorada de reducir, eliminar o quitar una

mancha de interes en comparacion con la capacidad de la enzima de proteasa de referencia de reducir o eliminar la misma mancha o una similar en determinadas circunstancias o condiciones, asf como variantes de proteasas cuyo uso es menos deseable en determinadas circunstancias como, p. ej., aquellas variantes de proteasas que tienen una capacidad disminuida de reducir, eliminar o quitar una mancha de interes en comparacion con la 5 capacidad de una proteasa de referencia de eliminar la misma mancha o una similar.

[0342] La eficacia de limpieza de las variantes de proteasas (p. ej., variantes de subtilisinas) se determino utilizando un ensayo con micromuestras (muestras cS-38, p. ej., manchadas con yema de huevo con pigmento, envejecidas por calentamiento). La estabilidad, la termoestabilidad y la determinacion de protemas del LAS/EDTA mediante precipitacion con TCA para la(s) variante(s) tambien se determino utilizando los metodos 10 descritos anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 9-2.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   1. Una variante de proteasa aislada que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion de cada uno de los residuos de aminoacido en las posiciones 76, 87, 118, 128, 129, 130, 188 y 244 de SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, + 1, +2, +3 o +4, donde:

   (i) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 76 y 188 se sustituye por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico;

   (ii) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87, 118 y 244 se sustituye por un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina; y

   (iii) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 se sustituye por un residuo de aminoacido neutro seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina, y donde cada posicion de aminoacido se numera segun la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
2. 2. La variante de proteasa de la reivindicacion 1, donde la secuencia de aminoacidos de dicha variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R,

   opcionalmente donde dicha variante de proteasa comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:8.
3. 3. Una variante de proteasa aislada que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa una sustitucion del residuo de aminoacido en cada una de las posiciones de aminoacido 76, 87, 118, 128, 129 y 130 en relacion con SEQ ID NO:1 por un residuo de aminoacido diferente para producir una variante de proteasa que tiene una carga global de -2, -1, 0, +1, +2, +3 o +4, donde:

   (i) el residuo de aminoacido en la posicion 76 se sustituye por un residuo de aminoacido de carga negativa seleccionado del grupo que consta de acido aspartico y acido glutamico,

   (ii) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 87 y 118 se sustituye por un residuo de aminoacido de carga positiva seleccionado del grupo que consta de arginina, histidina y lisina, y

   (iii) el residuo de aminoacido en cada una de las posiciones 128, 129 y 130 se sustituye por un residuo de aminoacido sin carga seleccionado del grupo que consta de serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina y valina, y donde dicha variante de proteasa comprende tambien

   (iv) un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 o una sustitucion del residuo de serina en la posicion 188 por un residuo de aminoacido diferente que es o no es un residuo de acido aspartico, y/o

   (v) un residuo de asparagina en la posicion de aminoacido 248 o una sustitucion del residuo de asparagina en la posicion 248 por un residuo de aminoacido diferente que es o no es un residuo de arginina,

   y donde las posiciones de aminoacido se numeran segun la numeracion de las posiciones de aminoacido correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID NO:2, segun lo determinado por el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
4. 4. La variante de proteasa de la reivindicacion 3, donde dicha secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa comprende un residuo de serina en la posicion de aminoacido 188 y/o un residuo de arginina en la posicion de aminoacido 248.
5. 5. La variante de proteasa de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 3, donde dicha variante de proteasa tiene una carga global de +1.
6. 6. La variante de proteasa de la reivindicacion 3, donde la secuencia de aminoacidos de dicha variante de proteasa comprende las sustituciones de aminoacidos N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, opcionalmente donde dicha variante de proteasa comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:7.

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50
7. 7. Una variante de proteasa aislada segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 3, comprendiendo dicha variante de proteasa uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoacidos en relacion con SEQ ID NO:1:

   (i) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A, con la condicion de que dicha variante de proteasa no comprenda N248R+S188D, o

   (ii) N76D+S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+V244R.
8. 8. Una composicion que comprende al menos una variante de proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, opcionalmente donde dicha composicion es una composicion de limpieza y/o detergente.
9. 9. La composicion de la reivindicacion 8, donde:

   (i) la composicion de limpieza es una composicion de limpieza para la colada o una composicion detergente para la colada, respectivamente;

   (ii) la composicion de limpieza es una composicion detergente para el lavado de la vajilla, opcionalmente una composicion detergente para el lavado de la vajilla de forma automatica o una composicion detergente para el lavado de la vajilla a mano;

   (iii) la composicion de limpieza es una composicion detergente lfquida;

   (iv) la composicion de limpieza es una composicion detergente en forma de gel, pastilla, polvo, solida o granulada;

   (v) la composicion de limpieza no contiene fosfato;

   (vi) la composicion es una composicion de limpieza para la colada lfquida o una composicion de limpieza para la colada en polvo;

   (vii) la composicion es una composicion de limpieza potenciadora para la colada, una composicion de limpieza aditiva para la colada, o una composicion de limpieza de pretratamiento para la colada;

   (viii) la composicion es una composicion de limpieza de lentes de contacto; o

   (ix) la composicion no es una composicion para el lavado de la vajilla de forma automatica.
10. 10. La composicion de la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, comprendiendo al menos una enzima adicional, opcionalmente donde la al menos una enzima opcional, opcionalmente dos o mas enzimas adicionales, se selecciona(n) del grupo que consta de hemicelulasa, celulasa, amilasa, peroxidasa, proteasa, xilanasa, lipasa, fosfolipasa, esterasa, cutinasa, pectinasa, pectato liasa, mananasa, queratinasa, reductasa, oxidasa, fenoloxidasa, lipoxigenasa, ligninasa, pululanasa, tanasa, pentosanasa, malanasa, 13-glucanasa, arabinosidasa, hialuronidasa, condroitinasa y lacasa.
11. 11. Un metodo para limpiar un artfculo o una superficie que necesite limpiarse, comprendiendo el metodo poner en contacto el artfculo o la superficie con una variante de proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una composicion de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, opcionalmente donde el metodo comprende tambien enjuagar el artfculo o la superficie con agua.
12. 12. Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica la variante de proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
13. 13. Un vector de expresion que comprende al menos un acido nucleico de la reivindicacion 12, opcionalmente

    donde el al menos un acido nucleico se encuentra ligado de forma operativa a un promotor.
14. 14. Una celula huesped recombinante que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 13 o el acido nucleico de la reivindicacion 12 o la variante de proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, opcionalmente donde:

    (i) la celula huesped es una celula bacteriana;

    (ii) la celula huesped es una celula de Bacillus; o

    (iii) la celula huesped es una celula de Bacillus subtilis.
15. 15. Un metodo para producir una variante de proteasa, comprendiendo el metodo el cultivo de la celula huesped recombinante de la reivindicacion 14 en condiciones propicias para la produccion de la variante de proteasa, comprendiendo el metodo opcionalmente tambien la recuperacion de la variante de proteasa del cultivo.

    GG36 BPN'

    PX3

    PX4

    PX5

    Conservacion

    GG36

    BPN'

    PX3

    PX4

    PX5

    Conservacion

    GG36

    BPN'

    ^ PX3

    to pX4

    PX5

    Conservacion

    GG36

    BPN'

    PX3

    PX4

    PX5

    Conservacion

    GG36

    BPN'

    PX3

    PX4

    PX5

    Conservacion

    1 AQSVPWGISR VQAPAAHNRG LTGSGVKVAV 1 AQSVPYGVSQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV 1 AQSVPWGISR VQAPAAHNRG LTGSGVKVAV 1 AQSVPWGISR VQAPAAHNRG LTGSGVKVAV 1 AQSVPWGISR VQAPAAHNRG LTGSGVKVAV *****;*.*. ; • *** .* *** *****

    59 GNGHGTHVAG TIAALNNSIG VLGVAPSAEL 61 NNSHGTHVAG TVAALNNSIG VLGVAPSASL 59 GNGHGTHVAG TIAALDNSIG VLGVAPRAEL 59 GNGHGTHVAG TIAALDNSIG VLGVAPRAEL 59 GNGHGTHVAG TIAALDNSIG VLGVAPRAEL 61 * ******* *•***•**** ****** * *

    119 VANLSLGSPS PSATLEQAVN SATSRGVLVV 121 VINMSLGGPS GSAALKAAVD KAVASGVVVV ;L19 VANLSLGLQA PSATLEQAVN SATSRGVLVV 119 VANLSLGLQA PSATLEQAVN SATSRGVLVV 119 VANLSLGLQA PSATLEQAVN SATSRGVLVV 121 * ***** * **•*• **• * . **•**

    175 DQNNNRASFS QYGAGLDIVA PGVNVQSTYP 181 DSSNQRASFS SVGPELDVMA PGVSIQSTLP 175 DQNNNRADFS QYGAGLDIVA PGVNVQSTYP 175 DQNNNRASFS QYGAGLDIVA PGVNVQSTYP 175 DQNNNRADFS QYGAGLDIVA PGVNVQSTYP 181 *#>*«**>** ^ * ^ **••* *** . *** *

    235 WSNVQIRNHL KNTATSLGST NLYGSGLVNA 241 WTNTQVRSSL ENTTTKLGDS FYYGKGLINV 235 WSNVQIRRHL KNTATSLGST NLYGSGLVNA 235 WSNVQIRNHL KNTATSLGST NLYGSGLVNA 235 WSNRQIRNHL KNTATSLGST NLYGSGLVNA 241 *•* *•* * •**•* ** • ** **•*

    LDTGIS-THP DLNIRGGASF VPGEPST-QD IDSGIDSSHP DLKVAGGASM VPSETNPFQD LDTGIS-THP DLNIRGGASF VPGEPST-QD LDTGIS-THP DLNIRGGASF VPGEPST-QD

    LDTGIS-THP DLNIRGGASF VPGEPST-QD .*.**_ .** **.. ****. ** * **

    YAVKVLGASG SGSVSSIAQG LEWAGNNGMH YAVKVLGADG SGQYSWIING IEWAIANNMD YAVKVLGASG SGSVSSIAQG LEWAGNNRMH YAVKVLGASG SGSVSSIAQG LEWAGNNRMH

    YAVKVLGASG SGSVSSIAQG LEWAGNNRMH

    ******** * ** * * .* •*** * *

    AASGNSGAGS ----ISYPAR YANAMAVGAT

    AAAGNEGTSG SSSTVGYPGK YPSVIAVGAV

    AASGNSGAGS ----ISYPAR YANAMAVGAT

    AASGNSGAGS ----ISYPAR YANAMAVGAT

    AASGNSGAGS ----ISYPAR YANAMAVGAT

    **•** *• • ** • * *****

    GSTYASLNGT SMATPHVAGA AALVKQKNPS GNKYGAYNGT SMASPHVAGA AALILSKHPN GSTYASLNGT SMATPHVAGA AALVKQKNPS GSTYASLNGT SMATPHVAGA AALVKQKNPS GSTYASLNGT SMATPHVAGA AALVKQKNPS * ( ( * • *** *** • ****** *** • * * *

    EAATR

    QAAAQ

    EAATR

    EAATR

    EAATR

    GG36 (region de codificacion de proteina madura)

    FIG. 2

    KSV

    Propeptido Secuencia senal

    Promotor LAT Promotor HPA2

    PHPLT-GG36

    4772 bp

    \ reppUB

    Marcador de resistencia a la bleomicina

    '\

    Marcador de resistencia Neo