CN103764166B - 蛋白质病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了与溶酶体活化相关的技术。本公开提供了用于提高溶酶体酶的水平和/或活性的若干策略，并进一步证明了此类策略在某些蛋白质病的治疗和/或预防中令人惊讶的适用性。其中，本发明提供了通过溶酶体活化对除溶酶体贮积病以外的蛋白质病进行治疗和/或预防的方法和组合物。特别地，本公开提供了用于对神经退行性蛋白质病、特别是与α‑突触核蛋白积聚相关的神经退行性蛋白质病进行治疗和/或预防的方法和组合物。本公开具体提供了用于治疗和/或预防帕金森氏病的方法和组合物。

Description

蛋白质病的治疗
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求美国临时申请号61/499,930(2011年6月22日提交)的优先权，将其内容整体引入本文作为参考。
背景技术
蛋白质病(proteinopathies)是与蛋白质的生成、折叠、聚集、代谢或降解异常相关的疾病(diseases)、障碍(disorders)和/或病症(conditions)。通常，蛋白质病与一种或多种特定蛋白质积聚成聚集体(aggregates)相关，和/或蛋白质病的特征在于一种或多种特定蛋白质积聚成聚集体。在各种不同类型的疾病、障碍和/或病症中观察到蛋白质聚集体，所述疾病、障碍和/或病症包括认知功能减退、增生性疾病、炎性疾病、心血管疾病、免疫性疾病、眼部疾病(ocular diseases)、线粒体疾病、神经退行性疾病以及溶酶体贮积病(lysosomal storage diseases)。
发明内容
本发明包括以下发现：溶酶体酶的活化(通过提高水平和/或提高活性)可为某些蛋白质病提供有效的治疗、甚至预防。例如，本发明提供了对溶酶体活性及其对蛋白质聚集的作用的新颖见解，并论证了与溶酶体功能相关的生化途径在各种环境(contexts)下对蛋白质聚集水平进行调节，所述环境具体包括各种细胞培养物(包括神经元培养物和非神经元培养物)、哺乳动物有机体(如小鼠)以及人的脑。本发明具体涵盖的观点是，在一些情况下，增加溶酶体酶的运输(trafficking)可为某些蛋白质病提供有效的治疗(和/或预防)。
本发明提供的具体的、令人惊讶的发现是，在一些实施方式中，提高溶酶体酶的水平和/或活性可以为除了溶酶体贮积病之外的蛋白质病提供有效的治疗；并且在一些实施方式中，可以为除了溶酶体贮积病之外的蛋白质病提供有效的预防。本发明特别教导了提高溶酶体酶的水平和/或活性可以为某些神经退行性疾病、障碍和/或病症提供有效的治疗；并且在一些实施方式中，可以为某些神经退行性疾病、障碍和/或病症提供有效的预防。在一些具体的实施方式中，本发明证明了，提高溶酶体酶的水平和/或活性可以为帕金森氏病提供有效的治疗；并且在一些实施方式中，可以为帕金森氏病提供有效的预防。
本发明涵盖的特殊的发现是，提高溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCase)的水平和/或活性，可为某些蛋白质病提供有效的治疗、甚至预防。
本发明涵盖的特殊的发现是，提高溶酶体降解能力可以为某些蛋白质病提供有效的治疗、甚至预防。
本发明提供的具体的发现是，在脑细胞中活化GCase活性降低了这些细胞中α-突触核蛋白(α-synuclein)的水平。根据本发明，以将降低葡糖神经酰胺(GlcCer)底物水平的水平活化GCase，可将已经形成的聚集体(例如，α-突触核蛋白质聚集体)耗竭或逆转，并且还可以阻止其由细胞至细胞的传播能力。本发明还特别提供了多种用于降低葡糖神经酰胺水平的途径，所述途径包括，例如通过抑制葡糖神经酰胺合酶的活性，提高葡糖脑苷脂酶(GCase)多肽的水平和/或活性、和/或降低GCase底物水平。
在一些实施方式中，通过小分子提高GCase多肽的水平和/或活性。在一些实施方式中，所述小分子直接结合至GCase多肽。在一些实施方式中，所述小分子结合至除GCase多肽催化位点或活性位点以外的位点。
在一些实施方式中，GCase多肽为野生型。在一些实施方式中，GCase多肽为突变型。
本发明提供的具体的发现是，神经节苷脂(gangliosides)影响α-突触核蛋白质聚集体的稳定和增强。根据本发明，以将降低鞘脂底物水平的水平活化鞘脂代谢酶(如，β-氨基己糖苷酶或β-半乳糖苷酶亚型1)，可将已经形成的聚集体(例如，α-突触核蛋白质聚集体)耗竭或逆转，并且还可以阻止其由细胞至细胞的传播能力。
在一些具体的实施方式中，saposin多肽在蛋白质病的治疗中是有效的。
本发明进一步涵盖的发现是，至少在一些实施方式中，在蛋白质病中蛋白质聚集体积聚(accumulation)的存在和/或程度可能受到Ca2+信号传递通路活性的影响。在一些具体的实施方式中，蛋白质聚集体积聚的存在和/或程度可能受到Ca2+通道介导信号的影响。因此，在一些实施方式中，利用阻断Ca2+通道的试剂，本发明提供了用于治疗功能获得性(gain of function)蛋白质病疾病、障碍和/或病症的方法和试剂；在一些实施方式中，此类试剂影响一种或多种溶酶体酶的蛋白质折叠，从而影响这些酶在溶酶体中的水平和/或活性。
本发明进一步涵盖的证明是，至少在一些实施方式中，聚集体积聚的存在或程度可能受到氧化应激的影响，和/或可能不受到至少一种特定的溶酶体酶(如GCase)的水平和/或活性的影响。因此，在一些实施方式中，利用影响氧化应激的试剂，本发明提供了用于治疗溶酶体贮积病的方法和试剂，作为影响一种或多种溶酶体酶(例如，在溶酶体中)水平和/或活性的试剂的替代或补充。
本发明更进一步涵盖的证明是，至少在一些实施方式中，在蛋白质病中蛋白质聚集体积聚的存在和/或程度可能受到蛋白质运输通路活性的影响。在一些具体的实施方式中，蛋白质聚集体积聚的存在和/或程度受到一种或多种溶酶体酶的运输的影响。因此，在一些实施方式中，利用影响蛋白质运输的试剂，本发明提供了用于治疗溶酶体贮积病的方法和试剂；在一些实施方式中，此类试剂影响一种或多种溶酶体酶的蛋白质运输，从而影响这些酶在溶酶体中的水平和/或活性。
本发明提供的具体的发现是，通过增强Rab功能和/或活化GCase，改善溶酶体酶由内质网到高尔基体，然后最终到达内体(endosome)-溶酶体***的运输，改善溶酶体功能，致使增强了溶酶体的蛋白水解作用。在一些实施方式中，通过增强酸性水解酶(通常位于溶酶体中、并在酸性pH下具有最佳酶活性的酶，例如，核酸酶、蛋白酶、糖苷酶、脂肪酶、磷酸酶、硫酸酯酶、磷脂酶以及所有溶酶体酶)的蛋白水解活性，增强溶酶体的蛋白水解作用。在一些实施方式中，通过增加溶酶体囊泡的绝对数量，增强溶酶体的蛋白水解作用。在一些实施方式中，通过增加每个溶酶体腔室中酸性水解酶的量，增强溶酶体的蛋白水解作用。在一些实施方式中，通过增加细胞存储物质的胞吐作用，增强溶酶体的蛋白水解作用。本发明特别教导的是，增加溶酶体酶的运输可以为某些神经退行性疾病、障碍和/或病症提供有效的治疗；并且在一些实施方式中，可以为某些神经退行性疾病、障碍和/或病症提供有效的预防。
在一些具体实施方式中，Rab1a多肽在溶酶体贮积病以及其它类型蛋白质病的治疗中是有效的。
在一些具体实施方式中，抗氧化剂在溶酶体贮积病以及其它类型蛋白质病的治疗中是有效的。
附图说明
附图仅用于说明目的，不进行限制。
图1A-图1G示出了GCase多肽的敲减(knockdown，KD)导致受损的溶酶体降解，并引起α-突触核蛋白的积聚。(图1A)通过蛋白质印迹显示在皮质神经元中由GCase多肽shRNA引起的GCase多肽的KD。使用神经元特异性烯醇化酶(NSE)作为上样对照。示出四次重复(replicates)。Scrb，杂乱的(scrambled)shRNA。(图1B)左：GCase多肽水平(n＝6，*p<0.01)；中：GCase多肽酶活性(n＝6，*p<0.01)；右：通过MS定量的细胞内GlcCer(Pi，磷酸盐)(n＝3，*p<0.05)。(图1C)通过GlcCerBODIPY 493荧光(下)对中性脂质进行可视化以及GlcCer免疫荧光。用DAPI对细胞核进行可视化。箭头指向具有增加的扩散染色的细胞，而箭头头部指向具有点状脂质积聚的细胞。(图1D)将在(图1C)中所示的荧光强度进行定量并相对于DAPI进行归一化(n＝3，*p<0.05)。(图1E)在8小时时评价的神经元中长寿命蛋白质的蛋白水解。使用溶酶体抑制剂亮抑酶肽(leupeptin，leu)和氯化铵(NH4Cl)(n＝4，*p<0.05)。(图1F)内源性α-突触核蛋白(mAb syn202)和Tau的蛋白质印迹。示出四次重复。在印迹下显示蛋白质和mRNA水平(n＝4，*p<0.05)。使用α-Tub作为上样对照。(图1G)在可诱导H4细胞中α-突触核蛋白的分析。由多西环素(DOX)终止表达，并使用mAb syn211通过蛋白质印迹测定蛋白质清除率。定量示于下方(n＝6，*p<0.05)。通过蛋白质印迹显示GCase多肽KD，并使用α-tub作为上样对照。分子量(MW)以kDa表示。对于所有分析，值为平均值±平均值的标准误(SEM)。
图2A-图2G证明了GCase多肽lenti感染***shRNA的特异性以及在GCase多肽敲减的情况下溶酶体蛋白水平的变化。(图2A)将来源于转导原代神经元的裂解物(lysates)用内切糖苷酶H(endo H)或PNGase进行消化。对非特异性带(N.S.)进行了注释。N.T.表示非转导的。(图2B)如图1E中所述的，在N2a细胞中进行放射性脉冲追踪。亮抑酶肽(leu)、氯化铵(NH4Cl)(n＝3，值为平均值±SEM，*p<0.05)。(图2C)用scrb或GCase多肽shRNA构建体感染原代神经元，并通过蛋白质印迹测定溶酶体蛋白质的水平。右：通过密度测定法(densitometry)对蛋白质印迹进行定量(n＝3，值为平均值±SEM，*p<0.05)。M：MW标志物。示出三个独立的实验。蛋白质MW以千道尔顿(kDa)表示。(图2D)通过LC/MS/MS分析对神经元中GCase多肽敲减后的鞘脂进行测量。Cer，神经酰胺；Sph 1-P，鞘氨醇-1-磷酸盐/酯；Sph，鞘氨醇；dh Sph 1-P，二氢鞘氨醇-1-磷酸盐/酯；dh Sph，二氢鞘氨醇；dhC16-Cer，二氢神经酰胺。(n＝3，值是平均值±SEM)。(图2E)在转导神经元中的β-氨基己糖苷酶(Hex)活性的测量(n＝3，值是平均值±SEM)。(图2F)通过霍乱毒素B亚基缀合的Alexa Fluro 488评估神经节苷脂GM1水平和染色模式。用DAPI将细胞核可视化。在下面的图中对色斑(puncta)数目和面积进行定量(n＝3，值为平均值±SEM)。N.T.，非转导的。比例尺＝10μm。(图2G)用scrb或GCase多肽shRNA构建体感染神经元，并通过免疫细胞化学评估LAMP1的细胞分布模式。LAMP1色斑尺寸的定量如图中所示(n＝3，值为平均值±SEM，*p<0.05)。比例尺(上和中)＝10μm，下＝2μm。
图3A-图3B示出了来源于Gaucher病患者成纤维细胞的诱导多能干细胞的产生。(图3A)通过免疫荧光分析对诱导多能干(iPS)细胞进行多潜能标志物Oct4、Tra-1-60、SSEA-4以及nanog分析。用DAPI将细胞核可视化。比例尺＝30μm。(图3B)GD iPS细胞的G-带核型分析示出正常的染色体数目、大小和基因组结构。
图4A-图4F显示在人GD多巴胺能神经元中内源性α-突触核蛋白的特异性积聚和长寿命蛋白质的受损的蛋白水解作用。(图4A)以神经元标志物β微管蛋白III和儿茶酚胺能标志物酪氨酸羟化酶(TH)进行的由iPS细胞产生的WT和GD神经元的免疫荧光分析。用DAPI将细胞核可视化。比例尺＝10μm。(图4B)GCase多肽的蛋白质印迹分析。使用NSE作为上样对照。下，GCase多肽活性的定量(n＝3，*p<0.05)。(图4C)评估长寿命蛋白质降解(n＝4，*p<0.05)。插图，短寿命蛋白质的蛋白水解作用(15分钟post-chase)。(图4D)使用mAb LB509、β微管蛋白III的α-突触核蛋白免疫荧光分析。比例尺＝30μm。(图4E)来源于iPS神经元的T-sol裂解物的蛋白质印迹。Htt，亨廷顿蛋白(huntingtin)；CBB，考马斯亮蓝。(图4F)通过密度测定法对由图4E得到的蛋白质印迹进行定量。
图5A-图5I示出了人α-突触核蛋白在原代皮质神经元中的表达，以及经亮抑酶肽处理或GCase多肽敲减的溶酶体抑制效果。用表达WTα-突触核蛋白的慢病毒载体以moi 3感染神经元，并在感染后天数(dp)为第7天时进行分析。(图5A)利用对人α-突触核蛋白具有特异性的mAb's(syn211和LB509)进行的免疫染色分析揭示了预期为在神经元扩展中突触富集的典型的点状图案(punctated pattern)。转导了约60％-70％的细胞。(图5B)WT、A53T和Δ71-82α-突触核蛋白在原代神经元中以moi 3表达，并通过蛋白质印迹进行分析。使用α-tub作为上样对照。下：使用mAb syn202，通过密度测定法测量α-突触核蛋白的蛋白质水平，所述mAb syn202检测小鼠和人α-突触核蛋白这两者。值代表相对于内源性小鼠蛋白质而言α-突触核蛋白过表达的水平(n＝3，值是平均值±SEM，*p<0.05)。(图5C)通过神经丝免疫染色(上)、或神经元体积分析(下)，评估以moi 3感染的、10dpi时的神经元的神经毒性(n＝4，值是平均值±SEM；相对于vect+scrb shRNA条件，*p<0.05；相对于所有测试条件，**p<0.05)。(图5D)上：在经亮抑酶肽处理的或非经亮抑酶肽处理的空载体(vect)或WTα-突触核蛋白感染的细胞中通过神经丝免疫染色进行的神经毒性评估(n＝8)。下：通过细胞体积分析进行的毒性评估(n＝4，值是平均值±SEM，N.S.，不显著)。(图5E)在GCase多肽敲减或亮抑酶肽处理下LC3-Ⅱ的蛋白质印迹。使用NSE作为上样对照。MW以kDa表示。(图5F)在7dpi时通过以mAb syn211和pAb LC3对α-突触核蛋白进行免疫染色来对神经元进行分析，并对代表总α-突触核蛋白(可溶的和不可溶的)的图中的荧光强度进行定量(n＝3，*p<0.05)。(图5G)通过在Triton X-100(T-sol)、然后是2％SDS(T-insol)中连续提取，评估在scrb shRNA(1)、GCase多肽敲减(2)或scrb shRNA+亮抑酶肽处理(3)下的总蛋白质溶解度。通过SDS-PAGE继以考马斯亮蓝(CBB)染色以对总蛋白质进行可视化，从而对提取部分(fractions)进行分析。MW以kDa表示。右：通过密度测定法对不可溶的蛋白质水平进行定量(n＝3，*p<0.05)。(图5H)α-突触核蛋白和LAMP1的免疫染色分析。各图中的比例尺＝10μm。右上：对具有致密细胞核的细胞的百分比进行了定量。仅对α-突触核蛋白阳性神经元进行计数(n＝3)。右中：对带有α-突触核蛋白/LAMP1共定位色斑的神经元的百分比进行定量(n＝3；相对于scrb shRNA，*p<0.05，相对于scrb和GC shRNA，*p<0.05)。右下：对带有α-突触核蛋白/LAMP1共定位色斑、且还包含致密细胞核的神经元的百分比进行了定量。(图5I)表达人WTα-突触核蛋白的神经元裂解物的亚细胞分级分离继以Triton X-100可溶性(左)和T-不可溶性(右)提取物的蛋白质印迹分析。使用LAPM 2来验证在P2部分中的溶酶体富集，并且如预期的那样，在上清液部分(S)中发现胞质蛋白NSE的富集。使用CBB作为上样对照。右：在每个部分中α-突触核蛋白水平的密度测定法定量(n＝3)。对于每一定量，值为平均值±SEM。采用单因素ANOVA和Tukey's post-hoc检验。N.S.＝不显著。请参见实施例4中的讨论。
图6A-图6H证明了GCase多肽耗竭通过聚集-依赖性机制增加了α-突触核蛋白介导的神经毒性。在7dpi时对表达人α-突触核蛋白蛋白质和GCase多肽shRNA的神经元进行了分析。(图6A)使用神经丝免疫染色对神经突变性(neurite degeneration)进行监测。在下方示出在表达WTα-突触核蛋白的神经元中具有代表性的神经丝免疫荧光染色。用DAPI将细胞核可视化。比例尺＝10μm。(图6B)通过神经元体积分析对神经毒性进行评估。(对于图6A和图6B：n＝8，*p<0.001)。(图6C)经由蛋白质印迹的人WT、A53T和Δ71-82α-突触核蛋白(T-sol)的蛋白质水平。使用α-tub作为上样对照。定量示于下方(n＝6，*p<0.01)。(图6D)T-sol部分的α-突触核蛋白蛋白质印迹(leu，亮抑酶肽；NT，未转导的)。使用NSE作为上样对照。(图6E)T-不可溶性α-突触核蛋白的蛋白质印迹。定量示于下方。方括号表明用于定量的信号(n＝3；相对于scrb对照，*p<0.05，**p<0.01)。(图6F-图6H)T-sol裂解物的天然SEC/蛋白质印迹分析(以埃计的半径)。使用NSE作为上样对照。对低聚α-突触核蛋白(空隙(Void)→64)进行定量(倍数变化：scrb shRNA＝1±0.5；GC shRNA＝19.5±6.0)(n＝3，值是平均值±SEM，*p<0.05)。对于每个印迹，MW以kDa表示。对于所有定量，值是平均值±SEM。
图7A-图7I示出了GlcCer直接影响重组α-突触核蛋白的体内纤丝(fibril)形成，并稳定可溶性低聚体种类。(图7A)将纯化的α-突触核蛋白与PC和GlcCer的混合物在pH5.0、37℃孵育，并由硫代黄素T荧光评估淀粉样蛋白(amyloid)的形成(相对荧光单位[RFU]，n＝4，*p<0.01)。(图7B)经SEC在1小时和5小时的100,000xg可溶性α-突触核蛋白(和部分)的分析，然后是SDS-PAGE/蛋白质印迹(syn211)。MW以kDa表示。(图7C)通过密度测定法对可溶性低聚体进行定量(n＝3，"p<0.05)。(图7D)1小时后形成的α-突触核蛋白种类的ANS荧光(n＝4，*p<0.01)。(图7E)在28小时时的离心沉降分析(s，上清液；p，沉淀(pellet))。用考马斯亮蓝染色对α-突触核蛋白进行检测。可沉淀化的α-突触核蛋白的定量如下图(n＝3)。由经硫代黄素T的相同反应测量淀粉样蛋白(n＝4，*p<0.01)。(图7F)α-突触核蛋白聚集体的EM分析示出在24小时时纤丝状结构(i-ii)和无定形结构(iv-v)的混合。图组(panel)ii-v示出使用mAb syn505的免疫-EM分析。比例尺：对于i-iii，100nm；对于iv和v，500nm。(图7G)在15小时时，α-突触核蛋白+PC25/GlcCer75反应的以syn505进行的免疫-EM分析。GlcCer脂质小管的宽度为约50nm。比例尺：对于i和iii，100nm；对于ii，500nm。(图7H)在24小时时，α-突触核蛋白+PC25/GlcCer75反应的以syn505进行的免疫-EM分析，显示似乎从GlcCer小管延伸的、伴有扭曲的(i)或直线的(ii)形态的10-14nm宽的纤丝状结构。比例尺：100nm。(图7I)单独的GlcCer脂质分散体的免疫-EM分析。比例尺：100nm。对于(图7A)以及(图7C)-(图7E)的每幅图，值为平均值±SEM。
图8A-图8F证明了GlcCer以pH依赖性的方式特异性地影响α-突触核蛋白纤丝和可溶性低聚体的体外形成。将纯化的α-突触核蛋白与如在图7A-图7I中所述的脂质分散体进行孵育。(图8A)在36小时时，在pH 5.0、37℃(在0.1M醋酸钠缓冲液中含2mg/ml)评估淀粉样蛋白的形成，或在pH 7.4、37℃(在0.1M磷酸钠缓冲液中含2mg/ml)评估淀粉样蛋白的形成。值表示为相对于各pH条件下的对照反应的倍数变化。在pH 5.0的条件下，使用PC 50％/聚乙二醇(PEG)50％作为对照。(n＝6，*p<0.05)。(图8B)在含脂质分散体的GlcCer的存在下，在pH 7.4、37℃进行的纤丝形成动力学分析。(n＝6)。(图8C)通过非变性凝胶电泳/蛋白质印迹，在pH 5.0对100,000xg可溶性α-突触核蛋白/脂质反应进行分析。标志物表明根据球状蛋白质标准(非变性标志物，Invitrogen)以千道尔顿计的表观MW。(图8D)通过非变性凝胶/蛋白质印迹分析检测的低聚体:单体比例的密度测定法定量。将迁移至约50kDa的带定量为单体形式(在非变性凝胶***中，因为其细长的、非球状的结构，纯化的α-突触核蛋白的迁移高于预期MW)(n＝3，*p<0.01)。(图8E)在pH 5.0，在PC25/乳糖神经酰胺75(lactosylceramide 75)(LacCer)、PC25/半乳糖神经酰胺75(galactosylceramide 75)(GalCer)、PC25/葡糖鞘氨醇75(glucosylsphingosine 75)(GluSph)存在下，孵育3小时和15小时后，通过SDS-PAGE测定100,000xgα-突触核蛋白可溶性低聚体的水平。使用GlcCer作为对照(n＝3，*p<0.05)。(图8F)孵育3小时和15小时后，在pH 5.0，α-突触核蛋白/脂质反应的沉降分析。S，上清液；P，沉淀。在15小时时未检测到可溶性α-突触核蛋白(低聚体或单体)，因为其完全被转换成沉淀化的部分(P)。对于所有定量，值为平均值±SEM。
图9A-图9E示出了鞘脂在小鼠GD模型中的积聚。(图9A)在4L/PS-NA小鼠皮质(cortex)中鞘脂的LC/MS分析。12周龄4L/PS-NA小鼠的乳糖神经酰胺和神经酰胺水平(值是平均值±SEM，n＝3，*p<0.05)(n＝3只小鼠)。(图9B)通过薄层色谱(TLC)对神经节苷脂进行分析。(图9C)在表达D409H GCase多肽的GD小鼠中α-突触核蛋白的积聚。通过免疫荧光，对来源于42周龄D409H纯合子小鼠的皮质与年龄匹配的WT小鼠的皮质的α-突触核蛋白积聚进行分析。使用DAPI将细胞核可视化。(图9D)获取于42周龄D409H小鼠的皮质组织的连续提取分析。左，用syn202、SNL-1和syn505，在42周龄D409H小鼠中测量α-突触核蛋白的T-sol水平。使用NSE作为上样对照。右，用syn202和syn505测定T-不可溶性α-突触核蛋白。使用波形蛋白(Vim)作为上样对照。下图：通过密度测定法对T-不可溶性α-突触核蛋白的水平进行定量，并相对于Vim进行归一化。值是来源于三个不同小鼠的平均值±SEM(n＝3，*p<0.05)。分子量标志物以kDa表示。(图9E)在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中GCase多肽敲减增强了α-突触核蛋白在体内的积聚。在表达人α-突触核蛋白::GFP融合蛋白的线虫体壁(body-wall)肌肉中对α-突触核蛋白聚集体进行监测(上)(Hamamichi等，PNAS，105(2)：728-733，2008年)。如前面所示，分子伴侣样蛋白TOR-2(人torsinA的线虫直向同源物)的共表达完全消除了α-突触核蛋白::GFP聚集(中)。在α-突触核蛋白::GFP+TOR-2线虫中，线虫GCase多肽直向同源物(C33C12.8)的敲减增加了α-突触核蛋白点状结构的量(下)。
图10A-图10H示出了在GD小鼠中的α-突触核蛋白积聚和可溶性低聚体形成。12周龄GD小鼠(4L/PS-NA)的分析。(图10A)黑质(SN)和皮质(Ctx)的H&E染色。箭头指示嗜酸性球状体(eosinophilic spheroids)。比例尺＝50μm。(图10B)在SN和Ctx中α-突触核蛋白的免疫荧光。使用DAPI将细胞核可视化。比例尺＝20μm。(图10C)α-突触核蛋白和神经元标志物NeuN的共染色。比例尺＝20μm。(图10D)左：神经元球状体的定量。ND，未检出。中：由NeuN免疫染色的神经元数目的定量。右：由免疫染色的α-突触核蛋白聚集体的定量。(图10E)Ctx的连续提取分析。pAb SNL-1和mAb syn202检测了总内源性α-突触核蛋白，而syn505检测了氧化/硝化以及错误折叠的α-突触核蛋白。使用NSE和α-tub作为上样对照。(图10F)T-sol单体(18kDa，左)，T-sol低聚体(>18kDa，中)以及T-不可溶性α-突触核蛋白(总泳道，右)的定量。(图10G)T-sol部分的天然SEC/SDS-PAGE/蛋白质印迹。半径，(图10H)通过syn202密度测定法获得的色谱曲线。该值代表了来源于三只小鼠的独立SEC分析。对于每一印迹，MW以kDa表示。对于所有定量，值是平均值±SEM。
图11A-图11L示出了在GD脑中发生T-solα-突触核蛋白低聚体的积聚。人皮质裂解物(T-sol)的天然SEC继以SDS-PAGE/蛋白质印迹。半径以表示(水平)，表观MW以kDa表示(垂直)。单体α-突触核蛋白在处洗脱。(图11A-图11C)健康对照。(图11D和图11E)I型非神经元病(non-neuronopathic)GD。(图11F)非典型帕金森氏病(APD)。(图11G)路易体痴呆(DLB)。(图11H和图11I)由患有II型急性神经元病GD的婴儿获得的皮质材料的分析。(图11J)来源于患有III型神经元病GD的3岁儿童的皮质裂解物。(图11K)在GBA1中伴有杂合突变的DLB。(图11L)以syn303进行的大小的部分的分析，其优选地检测病理性低聚α-突触核蛋白。利用syn303和syn211均测定到迁移至18kDa、44kDa和75kDa的带(箭头)。
图12A-图12E示出了人GD脑中GCase多肽活性、GCase蛋白水平以及α-突触核蛋白低聚体水平的定量。这里所分析的样品与呈现于图11A-图11L和表15的那些样品相同。(图12A)在皮质样品的全细胞匀浆中测定GCase多肽的活性。根据GCase多肽突变的存在、并且还根据神经病理学差异(具有或不具有突触核蛋白病)对数据进行分组。(图12B)相比于全细胞测量值，在杂合GCase多肽突变携带者和WT脑的P2部分中，GCase多肽活性表现出更急剧的活性下降(50％)。(图12C)使用mAb syn211，通过SEC/SDS-PAGE/蛋白质印迹分析的密度测定法分析对α-突触核蛋白低聚体进行定量(具有代表性的实例如图11A-图11L所示；一些GD杂合子印迹未显示于图11A-图11L，但进行了定量并在图表中呈现)。将对应于大小的颗粒直至柱空隙体积(column void volume)的部分定量为低聚体α-突触核蛋白，而将大小的部分计为单体形式。(图12D)以mAb syn303进行的大小的部分的定量。具有代表性的实例如图11L所示。由于样品限制，有些样品不能被syn303分析。(图12E)在相同的样品中对GCase多肽的蛋白质印迹进行分析，并在图11A-图11L中呈现。用endo H处理T-sol裂解物，以显示成熟GCase多肽形式的水平。使用NSE作为上样对照。MW以kDa表示。在图组A-D中的线代表平均值。
图13A-图13F证明了α-突触核蛋白水平升高抑制了GCase多肽的细胞内运输并降低了溶酶体GCase多肽功能。(图13A)通过蛋白质印迹对表达人WTα-突触核蛋白的可诱导H4细胞，在后-ER(post-ER)和ER GCase多肽方面进行了分析(n＝6，*p<0.01)。使用α-tub作为上样对照。(图13B)在表达人WT、A53T或Δ71-82α-突触核蛋白的皮质神经元中的后-ER/ERGCase多肽。通过syn211(人-特异性)和syn202(人和小鼠)测定α-突触核蛋白水平。使用NSE作为上样对照。(图13C)在P2和P3部分的皮质神经元中GCase多肽的活性(n＝6，相比于vect，*p<0.01)。(图13D)在65岁至80岁对照组的皮质中GCase多肽的分析。样品1、2、4、6＝“高α-突触核蛋白”；样品3、5＝“低α-突触核蛋白”。α-突触核蛋白的蛋白水平以及后-ER/ERGCase多肽的水平定量标注于印迹下方(*p<0.01)。(图13E)PD脑裂解物的GCase多肽蛋白质印迹。使用α-Tub和CBB作为上样对照。将GCase多肽水平定量于下方(n＝3[对照]或6[PD]，*p＝0.02)。下：在P2和P3部分中GCase多肽的活性(n＝3-6，*p＝0.04)。每一印迹的MW以kDa表示。(图13F)α-突触核蛋白的致病性正反馈机制和GCase多肽在溶酶体中的耗竭。(1)溶酶体GlcCer积聚加速并稳定了可溶性α-突触核蛋白低聚体(粗箭头)，其最终转化成淀粉样纤丝(细箭头)。(2)α-突触核蛋白的积聚阻断了GCase多肽的ER-高尔基体运输。(3)GCase多肽在溶酶体中的减少进一步增强了GlcCer积聚和可溶性α-突触核蛋白低聚体的稳定，并导致在每个致病周期(pathogenic cycle)中，对GCase多肽ER-高尔基体运输的更强抑制。对于所有定量，值是平均值±SEM。
图14A-图14H证明了在原代神经元和人的脑中，通过α-突触核蛋白的表达，调节溶酶体GCase多肽的成熟和活性。(图14A)通过亚细胞离心分级分离富集溶酶体或微粒体(microsomal)细胞器。以moi 3用表达空载体(vect)、WT、A53T或Δ71-82α-突触核蛋白的慢病毒感染并在dpi 7时收获的神经元培养物的蛋白质印迹分析。使用抗GRP78和钙联蛋白的抗体验证微粒体的富集，而使用抗LAMP1和LAMP2的抗体验证溶酶体的富集。使用考马斯亮蓝(CBB)作为上样对照。延印迹的左侧示出以kDa表示的MW。(图14B)通过密度测定法分析对蛋白质印迹进行定量(n＝3，*p<0.05)。(图14C)在原代培养中，基于人WTα-突触核蛋白的表达的ER GCase多肽的积聚和保留(retention)。转导为表达WT或Δ71-82α-突触核蛋白的T-sol神经元裂解物的endo H和PNGase F/GCase多肽的蛋白质印迹分析。使用vect和N-末端截短的polyQ扩展的亨廷顿蛋白(Htt 548-72Q)作为对照。Endo H敏感的GCase多肽免疫反应涂片迁移低于60kDa表示定位于ER的GCase多肽的水平。使用PNGase F测定去糖基化GCase多肽的迁移。使用α-Tub作为上样对照。(图14D)通过来源于感染的神经元培养物的实时PCR，对GCase多肽mRNA水平进行的定量。(图14E)在用WT或A53Tα-突触核蛋白感染的神经元培养物的P2部分中，通过4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferyl)-底物裂解测定各种溶酶体水解酶的活性，所述水解酶包括β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)、酸性磷酸酶、氨基己糖苷酶A/B/S(Hex)以及GCase多肽(n＝3，*p<0.05)。(图14F)GCase多肽和具有不同水平α-突触核蛋白的健康对照脑的活性水平的分析。用endo H处理来源于图13D的对照人脑样品5和6，并通过GCase多肽蛋白质印迹进行分析。以syn211在下方示出α-突触核蛋白水平。(图14G)采用mAb syn303对对应于的SEC部分进行蛋白质印迹分析。使用NSE作为上样对照。MW以kDa表示。syn303检测到对应于18kDa、44kDa和其它HMW种类的带的升高的水平。(图14H)左：含有α-突触核蛋白的“高”和“低”样品的全细胞GCase多肽活性。在C5和C6的P2(中)和P3(右)部分中，测量GCase多肽的活性(值是三次重复测量值的平均值±SEM，*p<0.05)。对于(图14B)、(图14D)和(图14E)的定量，值是平均值±SEM。
图15A-图15C示出了GCase多肽的活化增加了人多巴胺神经元中的蛋白水解。神经元用100μM IFG或溶媒(vehicle)对照(veh)处理5天，随后清洗1天，以除去IFG。(图15A)GCase多肽的蛋白质印迹分析。使用神经元特异性烯醇化酶(NSE)作为上样对照。(图15B)相对于NSE进行归一化的GCase多肽水平的密度测定法分析(Veh的％，n＝3，值是平均值±SEM，*p<0.05)。(图15C)通过放射性脉冲追踪来测定蛋白水解速率。由追踪后0、8和20小时时的测量值确定速率，并将其表达为每小时蛋白质降解的倍数增长。(n＝4，值是平均值±SEM，*p<0.05)。
图16A-图16B证明了在来源于PD患者的人中脑iPS多巴胺神经元中，通过GCase多肽的变构活化，增强了长寿命蛋白水解。用GCase多肽的变构活化剂处理神经元，并通过放射性脉冲追踪测定长寿命(图16A)或短寿命(图16B)的蛋白水解。
图17A-图17C证明了GCase多肽的过表达增加了非神经元细胞中的溶酶体蛋白水解。用GFP或myc-GCase多肽表达构建体转染Hela细胞。(图17A)使用抗GCase多肽或myc抗体通过蛋白质印迹测定过表达的水平。使用GAPDH作为上样对照。显示两次重复。(图17B)在36小时后，通过放射性脉冲追踪，在转染的Hela细胞中测定长寿命蛋白质的蛋白水解。使用溶酶体抑制剂亮抑酶肽(Leu)和氯化铵(NH4Cl)来测定在每种条件下溶酶体蛋白水解的量。(图17C)在用GFP或GCase多肽转染的活Hela细胞中，使用基于裂解而发出荧光的人造底物，测定组织蛋白酶B(Cathepsin B)的活性。通过在底物冲洗后0至60分钟之间的相对荧光单位(RFU)的测量来测定活性。对于(图17B)和(图17C)，n＝4，值是平均值±SEM，*p<0.05。
图18A-图18B示出了由Rab1a多肽过表达造成的α-突触核蛋白减少以及溶酶体功能的增强。(图18A)用表达Rab1a多肽的慢病毒转导来源于PD患者的人iPS多巴胺神经元。通过蛋白质印迹确认moi 5处的Rab1a多肽的过表达。使用mAb syn211，通过蛋白质印迹测定α-突触核蛋白水平。使用α-微管蛋白作为上样对照。(图18B)在如图17A-图17C中所述的转染Hela细胞中，评估组织蛋白酶B的活性。
图19A-图19B证明了在人中脑多巴胺神经元中，由GCase多肽的变构活化造成α-突触核蛋白的减少。(图19A)用GCase多肽变构活化剂对由未受影响的(unaffected)健康对照产生的iPS神经元进行的处理，降低了α-突触核蛋白水平。用mAb syn211检测α-突触核蛋白，并使用微管蛋白(tub)和亨廷顿蛋白(htt)作为上样对照。右，通过密度测定法将α-突触核蛋白水平定量，n＝3，值是平均值±SEM，*p<0.05。(图19B)如(图19A)所述对由PD患者产生的神经元进行处理并分析。
图20A-图20B示出了在PD iPS中脑多巴胺神经元中，GCase分子伴侣IFG和抗氧化剂的联合增强了后-ER GCase多肽。(图20A)用PBS(veh)、IFG、n-乙酰基-半胱氨酸(NAC)或IFG+NAC这两者处理来源于PD患者的神经元，并通过蛋白质印迹测定GCase多肽的成熟。使用βiii微管蛋白作为上样对照。(图20B)通过密度测定法对后-ER GCase多肽的量进行定量，并相对于tub进行归一化，n＝4，值是平均值±SEM；相比于veh和IFG，*p<0.05；相比于veh、IFG和NAC，**p<0.05。
图21示出了在GM1神经节苷脂或全脑神经节苷脂存在下，在pH 5.0处α-突触核蛋白的沉降分析。将样品孵育0或15小时，以100,000g离心30分钟以沉降α-突触核蛋白聚集体，并使用syn211通过SDS-PAGE/蛋白质印迹进行分析。单体形式迁移至18kDa，低聚体形式迁移至超过19kDa。s，上清液部分；p，沉淀部分。
具体实施方式
定义
为了可以更容易地理解本发明，首先将某些术语定义如下；本领域普通技术人员将会理解和明白如下所定义的和/或以其它方式在本文中所使用的这些术语的使用和范围。
活化剂：本文所使用的术语“活化剂”是指与在可比条件下活化剂不存在时靶实体(target entity)的水平和/或活性相比，提高了靶实体的水平和/或活性的试剂。例如，与在可比条件下活化剂不存在时靶实体的水平和/或活性相比，活化剂可以将靶实体的水平和/或活性提高至少约5％，包括至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、在至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多。在一些实施方式中，活化剂将其靶实体的水平和/或活性提高至参考水平和/或活性的预先确定范围内的一个点。在一些实施方式中，参考水平和/或活性是靶实体由其天然环境下的野生型版本观察到的水平和/或活性。在一些实施方式中，活化剂直接结合至其靶标。在一些实施方式中，活化剂间接地结合(即，通过与结合至所述靶标的物理独立的(physically distinct)实体结合)。在一些实施方式中，无论是直接还是间接，活化剂与其靶标均无物理相互作用，但通过其它作用(例如，结合至增加靶标表达的核酸中的调控位点；活化或抑制修饰靶标和改变其活性的酶等)提高了靶标的水平和/或活性。在一些实施方式中，活化剂稳定和/或提高其靶实体的半衰期(half-life)。在一些实施方式中，活化剂使其靶实体维持为特定的三维构象。在一些实施方式中，活化剂与抑制剂竞争结合至其靶实体。在一些实施方式中，活化剂防止或减少靶实体的聚集。在一些实施方式中，活化剂稳定其靶实体与另一实体(例如，底物蛋白质、RNA或DNA、小分子、肽或碳水化合物)的相互作用。在一些实施方式中，活化剂结合至靶实体，并与在可比条件下活化剂不存在时靶实体与另一实体的相互作用相比，增加了所述相互作用。在一些实施方式中，与在可比条件下活化剂不存在时靶实体的水平和/或活性相比，活化剂介导的靶实体与另一实体的相互作用的增加提高了该靶实体的水平和/或活性。在一些实施方式中，活化剂结合至靶实体，并与在可比条件下活化剂不存在时靶实体与另一实体的相互作用相比，减少了所述相互作用。在一些实施方式中，与在可比条件下活化剂不存在时靶实体的水平和/或活性相比，活化剂介导的靶实体与另一实体的相互作用的减少提高了该靶实体的水平和/或活性。通常情况下，活化剂可以是任何化学类别的化合物(例如，小分子、金属、核酸、多肽、脂质和/或碳水化合物)、或者可以包含任何化学类别的化合物。在一些实施方式中，活化剂是抗体或抗体模拟物(mimic)、或者包含抗体或抗体模拟物。在一些实施方式中，活化剂是核酸试剂试剂(例如，反义寡核苷酸、siRNA、shRNA等)或其模拟物、或者包含核酸试剂或其模拟物。在一些实施方式中，活化剂是小分子、或者包含小分子。在一些实施方式中，活化剂是天然存在的化合物(例如，小分子)、或者包含天然存在的化合物。在一些实施方式中，活化剂具有人工产生和/或修饰的化学结构。通常情况下，活化剂提高存在于细胞或生物体和/或由细胞或生物体生成的一种或多种靶实体的水平或活性。在一些实施方式中，靶实体是多肽、或者包含多肽。在一些实施方式中，靶实体是核酸(例如，编码或调控[例如，通过改变其表达和/或活性]多肽的核酸)、或者包含核酸。在一些实施方式中，靶实体是碳水化合物、或者包含碳水化合物。在一些实施方式中，靶实体是脂质、或者包含脂质。在一些实施方式中，靶实体是酶、或者包含酶。在一些实施方式中，靶实体是溶酶体酶、或者包含溶酶体酶。在一些实施方式中，靶实体是参与细胞运输的多肽、或者包含参与细胞运输的多肽。
淀粉样蛋白病：本文所使用的术语“淀粉样蛋白病(amyloidopathy)”或“淀粉样蛋白病的(amyloidopathic)”是指与任何疾病关联的表现出淀粉样蛋白构象(即，β-折叠片)的蛋白质的病理积聚相关的疾病、障碍和/或病症；或者是指其特征在于任何疾病关联的表现出淀粉样蛋白构象(即，β-折叠片)的蛋白质的病理积聚的疾病、障碍和/或病症，所述疾病、障碍和/或病症包括但不限于阿尔茨海默氏病、血管性痴呆和认知功能减退。
抗氧化剂：本文所使用的术语“抗氧化剂”是指抑制另一实体氧化、硝化或亚硝基化的实体，例如，小分子、多肽、核酸、糖类、脂质、无机试剂(例如，金属和矿物质等)或上述实体的组合。
β-半乳糖苷酶多肽：本文所使用的术语“β-半乳糖苷酶多肽(β-galactosidasepolypeptide或beta-gal polypeptide)”是指作为β-半乳糖苷酶的多肽。本领域普通技术人员将会理解的是，β-半乳糖苷酶是催化半乳糖及其有机部分之间形成的β-糖苷键水解的水解酶。β-半乳糖苷酶具有不同的亚细胞定位，即，β-半乳糖苷酶亚型1位于溶酶体，β-半乳糖苷酶亚型2位于细胞质的核周区域。β-半乳糖苷酶的底物包括神经节苷脂GM1、乳糖神经酰胺、乳糖和各种糖蛋白。具有代表性的已知的β-半乳糖苷酶多肽包括在下面表1中列出的那些物质。
在一些实施方式中，β-半乳糖苷酶多肽是β-半乳糖苷酶多肽同系物(homolog)。术语“β-半乳糖苷酶多肽同系物”包含这样的多肽：其氨基酸序列包含含有表1的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性(identity)和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续(consecutive)残基。可替代地或另外地，在一些实施方式中，“β-半乳糖苷酶多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列显示出与表1中的一种或多种多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表1中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，该特征序列元件包含表1的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。
钙通道阻断剂：术语“钙通道阻断剂”是指阻断电压依赖性钙通道的试剂。术语“钙通道阻断剂”的同义词是钙通道拮抗剂、钙通道抑制剂和钙进入阻断剂(calcium entryblockers)，这些术语在本文中可互换使用。示例性的钙通道阻断剂包括但不限于氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、依拉地平(isradipine)、拉西地平(lacidipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼古地平(niguldipine)、尼鲁地平(niludipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)、尼伐地平(nivaldipine)、瑞西丁(ryosidine)、阿尼帕米(anipamil)、地尔硫(diltiazem)、芬地林(fendiline)、氟桂利嗪(flunarizine)、加洛帕米(gallopamil)、米贝拉地尔(mibefradil)、普尼拉明(prenylamine)、噻帕米(tiapamil)、维拉帕米(verapamil)、马来酸哌克昔林(perhexyline maleate)、芬地林、普尼拉明，以及上述钙通道阻断剂中任意钙通道阻断剂的衍生物。
特征序列元件(characteristic sequence element)：术语“特征序列元件”是指发现于多肽、小分子或核酸家族所有成员中的特征性的核心序列或结构元件，因此可被本领域普通技术人员用来定义家族成员。
联合疗法：术语“联合疗法”是指将两种或更多种不同药剂以重叠的方案给予，从而使受试者同时暴露(exposed)于两种或更多种试剂的情况。
可比的(comparable)：术语“可比的”在本文中用来描述两组(或更多组)彼此足够相似的条件或环境，以允许对获得的结果或观察到的现象进行比较。在一些实施方式中，可比的条件组或环境组的特征在于，具有多个基本上相同的特征以及一个或少数不同的特征。本领域普通技术人员将理解的是，当条件组以足够数量和类型的基本相同的特征为特点，从而确保下述结论是合理的：在不同的条件组或环境组下，得到的结果或观察到的现象之间的不同是由那些不同的特征的改变所引起的或由它们的改变所表示，则所述条件组彼此之间是可比的。
给药方案：如本文所用，“给药方案(dosing regimen)”或“治疗方案(therapeuticregimen)”是指各自给予受试者的单位剂量(通常多于一个)组，通常由时间段间隔开。在一些实施方式中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，所述方案可能涉及一个或多个剂量。在一些实施方式中，给药方案包含多个剂量，多个剂量中的每一个均彼此间隔相同长度的时间段；在一些实施方式中，给药方案包含多个剂量，并且由至少两个不同的时间段将单个剂量间隔开。在一些实施方式中，给药方案中的所有剂量均为相同单位剂量的量。在一些实施方式中，给药方案中不同剂量为不同的量。在一些实施方式中，给药方案包含处于第一剂量的量的第一剂量，继以一种或多种处于不同于第一剂量的量的第二剂量的量的额外剂量。在一些实施方式中，给药方案包含处于第一剂量的量的第一剂量，继以一种或多种处于与第一剂量的量相同的第二剂量的量的额外剂量。
酶替代疗法(enzyme replacement therapy)：本文所使用的术语“酶替代疗法”是指将酶给予此类受试者：与由相同物种(例如，人)的正常个体的群体所观察到的平均值相比，所述受试者在该给予之前显示出降低的酶活性水平。
等同剂量(equivalent dosage)：术语“等同剂量”在本文中用于比较产生相同生物结果的不同药学活性试剂的剂量。根据本发明，如果两种不同试剂的剂量达到可比的生物结果水平或程度，则这两种不同试剂的剂量被认为是彼此“等同”的。在一些实施方式中，使用如本文所述的体外和/或体内试验确定用于根据本发明的不同药剂的等同剂量。在一些实施方式中，用于根据本发明的一种或多种溶酶体活化剂以等同于参考溶酶体活化剂的剂量的剂量使用；在一些此类实施方式中，用于该目的的参考溶酶体活化剂选自于由以下溶酶体活化剂所组成的组：小分子变构活化剂(例如，吡唑嘧啶(pyrazolpyrimidines))、亚氨基糖(imminosugars)(例如，异法戈明(isofagomine))、抗氧化剂(例如，N-乙酰基-半胱氨酸)以及细胞运输调节剂(例如，Rab1a多肽)。
功能获得性疾病(gain of function diseases)：术语“功能获得性疾病”通常是指以增加的聚集相关的蛋白质毒性为特征的疾病。在这样的疾病中，聚集超过了细胞内和/或细胞外的清除。功能获得性疾病通常与衰老有关，也被称为毒性功能获得性疾病。示例性的功能获得性疾病包括但不限于，与蛋白质中多聚谷氨酰胺重复的聚集或其它氨基酸(如丙氨酸)重复的聚集有关的神经退行性疾病、路易体病、以及与α-突触核蛋白聚集有关的其它障碍、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、甲状腺素运载蛋白相关的聚集疾病(transthyretin-associated aggregation disease)、阿尔茨海默氏病、衰老相关的黄斑变性、包涵体肌炎(inclusion body myositosis)和朊病毒疾病。与多聚谷氨酰胺聚集相关的神经退行性疾病包括但不限于，亨廷顿氏病、齿状核-红核-苍白球-丘脑底核萎缩(dentatorubral andpallidoluysian atrophy)、脊髓-小脑共济失调的几种形式、以及脊髓延髓肌萎缩。阿尔茨海默氏病的特征在于两种类型的聚集体的形成：Aβ肽的细胞内和细胞外聚集体、以及微管相关蛋白tau的细胞内聚集体。甲状腺素运载蛋白相关的聚集疾病包括，例如，老年性全身性淀粉样变性、家族性淀粉样神经病(familial amyloidotic neuropathy)、家族性淀粉样心肌病(familial amyloid cardiomyopathy)。路易体病的特征在于α-突触核蛋白的聚集，包括，例如，帕金森氏病。朊病毒疾病(也称为传染性海绵状脑病)的特征在于朊病毒蛋白的聚集。示例性的人朊病毒疾病是Creutzfeldt-Jakob病(CJD)、变异型Creutzfeldt-Jakob病、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征。致命性家族性失眠症和库鲁病(Kuru)。
基因疗法：如本文使用的术语“基因疗法”是指将编码多肽的核酸(或衍生自例如通过逆转录而来的核酸的核酸)给予受试者(例如，人类受试者)。在多个实施方式中，进行这样的给予，使得给予后在受试者的细胞中或由受试者的细胞表达所述多肽。可将核酸整合进细胞的基因组，或作为附加体(episome)(某些细胞的遗传粒子，所述遗传粒子可以自主存在于细胞质中或者作为染色体的一部分)永久保留在细胞中。基因疗法也包括对不进行整合或者不永久保留于它们所递送的细胞中的核酸的递送。
葡糖脑苷脂酶多肽：本文所使用的术语“葡糖脑苷脂酶多肽”是指为β-葡糖脑苷脂酶的多肽。本领域普通技术人员将理解的是，发现葡糖脑苷脂酶天然地存在于溶酶体中，在溶酶体中，葡糖脑苷脂酶水解葡糖神经酰胺的β-糖苷键。这种天然存在的葡糖脑苷脂酶也被称为酸性β-葡糖苷酶、阿糖苷酶(alglucerase)、β-葡糖脑苷脂酶、D-葡糖基-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶、GBA1、Glcm_人、Gluc、葡糖脑苷脂酶β-葡糖苷酶、葡糖鞘氨醇葡糖水解酶(glucosphingosine glucosylhydrolase)、葡糖神经酰胺酶、葡糖神经酰胺β-葡糖苷酶、或伊米苷酶(imiglucerase)。具有代表性的已知葡糖脑苷脂酶多肽包括在下面表2中所列出的葡糖脑苷脂酶多肽。
在一些实施方式中，葡糖脑苷脂酶多肽可以是葡糖脑苷脂酶多肽同系物。术语“葡糖脑苷脂酶多肽同系物”包含这样的多肽：其氨基酸序列包含含有表2的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替代地或另外地，在一些实施方式中，“葡糖脑苷脂酶多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列显示出与表2中的一种或多种多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表2中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，该特征序列元件包含表2的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。
葡糖神经酰胺合酶多肽：本文所使用的术语“葡糖神经酰胺合酶多肽”是指这样的多肽：所述多肽与参与基于葡糖神经酰胺的鞘糖脂(glycosphingolipids)生产的葡糖基转移酶共享至少一个特征序列元件和/或整体序列同一性，并类似地显示出糖基转移酶活性。天然情况下，葡糖神经酰胺合酶通过将葡糖基转移至神经酰胺，来调节称作神经节苷脂(如GM3)的鞘糖脂缀合物的生产。具有代表性的已知葡糖神经酰胺合酶多肽包括在下面表3中列出的葡糖神经酰胺合酶多肽。在一些实施方式中，葡糖神经酰胺合酶多肽这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列包含含有表3的多肽中的保守残基的至少一个元件。
在一些实施方式中，葡糖神经酰胺合酶多肽可以是葡糖神经酰胺合酶多肽同系物。术语“葡糖神经酰胺合酶多肽同系物”包含这样的多肽：其氨基酸序列包含含有表3的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替代地或另外地，在一些实施方式中，“葡糖神经酰胺合酶多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列显示出与表3中的一种或多种多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表3中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，该特征序列元件包含表3的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。
氨基己糖苷酶多肽：本文所使用的术语“氨基己糖苷酶多肽”或“β-氨基己糖苷酶多肽”是指为β-氨基己糖苷酶的多肽。本领域普通技术人员将会理解的是，β-氨基己糖苷酶参与N-乙酰基-β-D-氨基己糖中的末端N-乙酰基-D-氨基己糖残基的水解。β-氨基己糖苷酶和辅因子GM2活化蛋白催化GM2神经节苷脂和含末端N-乙酰基氨基己糖的其它分子的降解。溶酶体β-氨基己糖苷酶在结构上是二聚体，并且通过α-亚基和β-亚基(分别由HEXA和HEXB基因编码)的组合产生三种活性二聚体同工酶。氨基己糖苷酶同工酶A可在体内水解GM2神经节苷脂，并且具有α/β异二聚体亚基的组成。氨基己糖苷酶同工酶B具有β/β同二聚体亚基的组成，氨基己糖苷酶同工酶S具有α/α同二聚体亚基的组成。具有代表性的已知氨基己糖苷酶多肽包括在下面表4中列出的氨基己糖苷酶多肽。
在一些实施方式中，氨基己糖苷酶多肽可以是氨基己糖苷酶多肽同系物。术语“氨基己糖苷酶多肽同系物”包含这样的多肽：其氨基酸序列包含含有表4的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替代地或另外地，在一些实施方式中，“氨基己糖苷酶多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列显示出与表4中的一种或多种多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表4中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，该特征序列元件包含表4的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。
改善、提高或降低：本文所使用的术语“改善”、“提高”或“降低”或语法等同的术语表示相对于参考测量值的值。在一些实施方式中，参考测量值是在可比的条件下取得的。在一些实施方式中，参考测量值是历史值(historical value)或者包含历史值。在一些实施方式中，参考测量值是在不同时间(例如，在特定治疗或事件开始之前)在同一个体中的测量值或者包含在不同时间在同一个体中的测量值。在一些实施方式中，参考测量值是在对照个体(或多个对照个体)中的测量值或者包含在对照个体(或多个对照个体)中的测量值；在一些这样的实施方式中，“对照”个体是这样的个体：a)尚未暴露于特定的治疗或事件；和/或b)显示出对蛋白质病不同的(与测试个体相比较)的易感性(susceptibility)或痛苦(affliction)，但任选地与测试个体共享一种或多种以下特征：例如种族、年龄(例如，如在一定范围内近似)、体重(例如，如在一定范围内近似)、身高(例如，如在一定范围内近似)、性情、居住地(geographic residence)、饮食习惯、运动习惯等。在一些实施方式中，参考测量值是在不同的设置(setting)中(例如，在未发生或从未发生这样的治疗或事件的设置中)所取得的测量值。
功能丧失性疾病(loss of function disease)：术语“功能丧失性疾病”通常是指以由蛋白质的低效率折叠引起蛋白质的过度降解为特征的疾病。示例性的功能丧失性疾病包括但不限于，囊性纤维化、溶酶体贮积病和Von Hippel-Lindau(VHL)病。在囊性纤维化中，突变酶或缺陷酶是囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)。该蛋白最常见的一种突变是ΔF508，ΔF508是3个核苷酸的删除(Δ)，导致蛋白质上508位的氨基酸苯丙氨酸(F)的丧失。
溶酶体酶：本文所使用的术语“溶酶体酶”是指在溶酶体中发挥功能的酶。一些溶酶体酶的实例包括但不限于，α-半乳糖苷酶A、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、α-L-艾杜糖苷酸酶(α-L-iduronidase)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)、α-葡糖醛酸苷酶、α-岩藻糖苷酶、硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、NPC 1、酸性鞘磷脂酶、组织蛋白酶(A、D、H、S和Z)、H(+)-ATP酶、唾液酸酶、β-半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase)、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、α-N-乙酰基神经氨酸酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、以及α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶。具有代表性的已知溶酶体酶包括在下面的表5中列出的溶酶体酶。在一些实施方式中，溶酶体酶可以是溶酶体酶同系物。“溶酶体酶同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列包含含有表5的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替代地或另外地，在一些实施方式中，“溶酶体酶同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列显示出与表5中的一种或多种多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表5中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，该特征序列元件包含表5的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。
溶酶体贮积病：本文所使用的术语“溶酶体贮积病”是指由至少一种酶(例如，酸性水解酶)的缺陷所导致的一组遗传障碍(genetic disorders)，在溶酶体中需要所述酶将大分子分解为肽、氨基酸、单糖、核酸和脂肪酸。溶酶体贮积病可能是由可能具有或可能不具有酶活性的非溶酶体蛋白导致的，例如参与将酸性水解酶运输至溶酶体的蛋白质的缺乏，例如溶酶体整合膜蛋白2(lysosomal integral membrane protein 2，LIMP2)；例如在多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD)中发现的、参与酸性水解酶的翻译后修饰的ER驻留蛋白的缺乏；在高尔基体中发现的、参与将酸性水解酶以及其它溶酶体蛋白质运输至溶酶体腔室中的蛋白质的缺乏，例如在细胞内含物病(Inclusion cell disease)(I-cell病)中缺乏的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶；酸性水解酶辅因子的缺乏，如鞘脂激活蛋白(saposin A、B、C、D)；膜融合蛋白的缺乏，例如导致神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)的蜡样质脂褐质沉积症神经元蛋白(CLN1-9)的缺乏；参与将酸性水解酶的底物运送至溶酶体，或将酸性水解酶的代谢产物由溶酶体运送出来的蛋白质的缺乏，例如在Niemann-Pick C型(NPC)中缺乏的Niemann-Pick C型蛋白质(一种胆固醇转运蛋白)；以及将酸性水解酶的底物递送入溶酶体内腔的溶酶体受体或转运蛋白的缺乏，例如在Dannon疾病中缺乏的LAMP2A。其结果是，患有溶酶体贮积病的个体在溶酶体中存在物质积聚。具有代表性的溶酶体贮积病包括在下面表10中所列出的溶酶体贮积病。
突变体：本文所使用的术语“突变体”是指与参考实体相比，显示出与参考实体具有显著的结构同一性、但在结构上与参考实体在一个或多个化学部分的存在或水平上不同的实体。在多个实施方式中，突变体还在功能上不同于其参考实体。通常情况下，基于特定实体与参考实体的结构同一性的程度，适当地考虑特定实体是否是参考实体的“突变体”。本领域技术人员将会理解的是，任何生物参考实体或化学参考实体具有特定的特征结构元件(characteristic structural elements)。突变体，顾名思义，是拥有一个或多个这样的特征结构元件的不同的化学实体。仅给出若干实例，小分子可以具有特征核心结构元件(例如，大环核心)和/或一个或多个特征侧基部分(pendent moieties)，以使小分子的突变体是如下分子：共享核心结构元素和特征侧基部分，但在其它侧基部分存在不同和/或在核心中的键的类型(单键相对于双键，E相对于Z等)存在不同的分子；多肽可以具有由多个氨基酸组成的特征序列元件，所述氨基酸在线性空间或三维空间中彼此间具有指定的相对位置，和/或有助于特定的生物功能；核酸可以具有由多个核苷酸残基组成的特征序列元件，所述核苷酸残基在线性空间或三维空间中彼此间具有指定的相对位置。例如，突变体多肽可由于在氨基酸序列中的一种或多种差异、和/或由于共价连接至多肽骨架的化学部分(例如，碳水化合物、脂质等)中的一种或多种差异而不同于参考多肽。在一些实施方式中，突变体多肽显示出与参考多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的整体序列同一性。可替代地或另外地，在一些实施方式中，突变体多肽不与参考多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方式中，突变体多肽共享参考多肽的一种或多种生物活性。在一些实施方式中，突变体多肽缺失参考多肽的一种或多种生物活性。在一些实施方式中，与参考多肽相比，突变体多肽显示出降低的一种或多种生物活性水平。
药物组合物：本文所使用的术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的活性试剂。在一些实施方式中，活性试剂以适合于在治疗方案中给予的单位剂量的量存在，当给予相关群体时，所述治疗方案表现出达到预期治疗效果的统计学上显著的概率(probability)。在一些实施方式中，药物组合物可以特别地配制成以固体或液体形式给药，包括配制成适于以下给药形式：口服给药，例如，顿服药(drenches)(水性或非水性的溶液或混悬液)、片剂(例如用于口腔、舌下和全身吸收的片剂)、大丸剂(boluses)、散剂、颗粒剂、用于施用至舌的糊剂；胃肠外给药，例如作为无菌的溶液或悬浮液或缓释制剂，经皮下注射、肌内注射、静脉注射或硬膜外注射；局部施用，例如以膏剂(cream)、软膏剂(oitment)或控释贴剂或喷雾剂施用至皮肤、肺部或口腔；***内给药或直肠内给药，例如***栓剂(pessary)、膏剂或泡沫剂；舌下给药；眼部给药；经皮给药；或鼻部给药、肺部给药及给药至其它粘膜表面。
药学上可接受的：本文所使用的短语“药学上可接受的”是指在健全的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织相接触，并且无过度的毒性、刺激性、过敏反应、或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的载体：本文所使用的术语“药学上可接受的载体”是指参与将主题化合物由身体的一个器官或部位运载或运输至身体的另一个器官或部位的药学上可接受的材料、组合物或辅料，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂封装材料。在与制剂中的其它成分相容并且不会伤害患者的意义上而言，每种载体都必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡(suppository waxes)；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水(pyrogen-free water)；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酸酐类；以及在药物制剂中使用的其它无毒的相容性物质。
药学上可接受的盐：本文所使用的术语“药学上可接受的盐”是指适合于在药学环境下使用的化合物的盐，即，在健全的医学判断范围内，适用于与人和低等动物的组织相接触，并且无过度的毒性、刺激性、过敏反应等，与合理的利益/风险比相称的盐。药学上可接受的盐在本领域中为人所熟知。例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences，66：1-19(1977)中对药学上可接受的盐进行了详细描述。在一些实施方式中，药学上可接受的盐包括但不限于，无毒的酸加成盐，所述无毒的酸加成盐是与无机酸或有机酸形成的、或使用其它本领域所使用的方法(例如离子交换)形成的氨基基团的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，所述有机酸例如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸。在一些实施方式中，药学上可接受的盐包括但不限于，己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐(picrate)、新戊酸盐(pivalate)、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。具有代表性的碱金属或碱土金属盐涉及钠、锂、钾、钙、镁等。在一些实施方式中，在适当情况下，药学上可接受的盐包括使用反离子(counterions)(例如卤化物、羟化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、具有1至6个碳原子的烷基、磺酸盐和芳基磺酸盐)形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。
多肽：通常，“多肽”是至少两个残基(例如，氨基酸)通过肽键彼此连接成的串(string)。在一些实施方式中，多肽包含不同于该残基的一个或多个部分。例如，在一些实施方式中，多肽包含附着在其残基上的一个或多个聚糖部分(glycan moieties)(例如，为糖肽)。在一些实施方式中，多肽包含一个或多个聚乙二醇部分(即，为聚乙二醇化的)。在一些实施方式中，多肽包含通过一个或多个二硫键连接或通过其它方式相关联的一个或多个多肽链。在一些实施方式中，多肽包含氨基酸残基。在一些实施方式中，多肽包含一个或多个非氨基酸的残基。在一些实施方式中，多肽包含一个或多个不存在于自然界中的氨基酸残基。
药理学分子伴侣(pharmacological chaperone)：本文所使用的术语“药理学分子伴侣”是指特异地结合至蛋白质、并且具有以下效果中的一种或多种的分子(如小分子、多肽、核酸、脂质或碳水化合物)：提高蛋白质稳定分子构象的形成；诱导蛋白质由ER向另一细胞位点的运输，优选天然细胞位点，即，防止蛋白质的ER-相关降解；防止错误折叠蛋白质的聚集；和/或回复(restoring)或增强蛋白质的至少部分野生型功能和/或活性。例如，在一些实施方式中，药理学分子伴侣作用于一种或多种溶酶体酶。在一些这样的实施方式中，药理学分子伴侣是结合至溶酶体酶的实体，使得相对于该药理学分子伴侣不存在时所观察到的结果，提高了其正确折叠、运输、非聚集、和/或活性。
蛋白质病：本文所使用的术语“蛋白质病”或“蛋白质病的(proteinopathic)”是指与一种或多种类型的蛋白质的致病聚集和/或积聚相关的疾病、障碍和/或病症，所述蛋白质例如但并不限于，α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白和/或tau蛋白。在一些实施方式中，蛋白质病的特征在于蛋白质的生产、折叠、聚集、代谢或降解(例如，自噬)、转运等中的一种或多种中的异常。在一些实施方式中，蛋白质病是神经退行性疾病。在一些实施方式中，蛋白质病是炎性疾病。在一些实施方式中，蛋白质病是心血管疾病。在一些实施方式中，蛋白质病是增生性疾病。诸如突触核蛋白病、tau蛋白病、淀粉样蛋白病、TDP-43蛋白质病及其它具体病状是蛋白质病的实例。示例性的涉及蛋白质病的蛋白质包括：在帕金森氏病、路易体病及其它突触核蛋白病情况下的α-突触核蛋白；在阿尔茨海默氏病和某些其它神经退行性疾病情况下的tau蛋白和β-淀粉样蛋白；在肌萎缩性脊髓侧索硬化症情况下的SOD1和TDP-43；在亨廷顿氏病情况下的亨廷顿蛋白；在视网膜色素变性(retinitis pigmentosa)情况下的视紫质(rhodopsin)；以及涉及溶酶体贮积病的蛋白质。
蛋白质内稳态：术语“蛋白质内稳态(proteostasis或)”或“蛋白质稳态(proteinhomeostasis)”是指构成蛋白质组的蛋白质的浓度、构象、结合相互作用(例如，四级结构)及位置。蛋白质内稳态受到如下因素影响：蛋白质折叠/错误折叠的化学作用；以及相互作用和竞争生物学通路的众多调控网络(影响蛋白质的合成、折叠、构象、结合相互作用、运输、解聚集和降解)。在一些实施方式中，例如，通过改变一种或多种核酸或蛋白质的水平和/或活性控制蛋白质内稳态。在一些实施方式中，通过转录和/或翻译的改变控制蛋白质内稳态。
Rab多肽：本文所使用的术语“Rab多肽”是指与调节囊泡运输和膜融合的多个步骤的小鸟苷三磷酸酶(GTPases)的Rab家族成员共享特征序列元件和/或整体序列同一性程度的多肽，包括但不限于，内体-溶酶体***的囊泡、神经元的突触小泡、细胞存储物质的胞吐作用、以及将新合成的蛋白质由内质网转运至高尔基体和高尔基体区室中。Rab多肽的实例是Rab1a多肽。表6提供了编码Rab1a多肽的核酸序列。表6提供了Rab多肽序列具有代表性的实例。
在一些实施方式中，Rab多肽是Rab多肽同系物。术语“Rab多肽同系物”包含这样的多肽：其氨基酸序列包含含有表6的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替代地或另外地，在一些实施方式中，“Rab多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列显示出与表6中的一种或多种多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表6中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，该特征序列元件包含表6的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。
样品：本文所使用的术语“样品”是指如本文所述的获得自或衍生自感兴趣的来源的生物样品。在一些实施方式中，感兴趣的来源包括有机体，如动物或人。在一些实施方式中，生物样品包含生物组织或流体。在一些实施方式中，生物样品是如下物质或者包含如下物质：骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活组织检查样品、含细胞的体液、自由浮动的核酸(free floating nucleic acids)、痰、唾液、尿液、脑脊髓液、腹膜液、胸膜液、粪便(feces)、淋巴液、妇科液(gynecological fluid)、皮肤拭物(swabs)、***拭物、口腔拭物、鼻腔拭物、洗涤物或灌洗物(例如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物)、抽出物(aspirates)、刮出物(scrapings)、骨髓样品、组织活检样品、手术样品、粪便、其它体液、分泌物和/或***物、和/或来自于上述样品的细胞等。在一些实施方式中，生物样品是由个体获得的细胞或包含由个体获得的细胞。在一些实施方式中，样品是以任何适当的方式由感兴趣的来源直接获得的“原始样品(primary sample)”。例如，在一些实施方式中，原始生物样品通过选自于由以下方法组成的组中的方法获得：活检(例如，细针抽吸或组织活检)、外科手术、收集体液(例如血液、淋巴液、粪便等)等。在一些实施方式中，如由上下文将很清楚的，术语“样品”是指通过处理原始样品(例如，通过由其中除去一种或多种组分，和/或通过向其中加入一种或多种试剂)而获得的制剂。例如，使用半透膜进行的过滤。这样的“处理的样品”可以包括，例如由样品中提取的核酸或蛋白质；或通过对原始样品施加诸如mRNA的逆转录或扩增、特定成分的分离和/或纯化等技术而获得的核酸或蛋白质。
Saposin多肽：本文所使用的术语“saposin”是指与saposin蛋白结构域共享至少一个特征序列元件和/或整体序列同一性的多肽。Saposin是小的热稳定溶酶体蛋白质，它通过将脂质底物由膜环境分离并使其对于可溶性降解酶而言更易接近，从而发挥作为各种溶酶体脂质降解酶的活化剂的作用。Saposin被合成为单一的前体分子prosaposin，它包含四个saposin-B结构域(四个saposin-B结构域均为SapB1和SapB2)以及两个saposin-A结构域(SapA)，其中，四个saposin-B结构域在蛋白水解切割后产生活性saposin(saposin A、B、C和D)，而两个saposin-A结构域(SapA)在活化过程中被移除。具有代表性的已知saposin多肽包括在下面表7中列出的saposin多肽。
在一些实施方式中，saposin多肽是saposin多肽同系物。术语“saposin多肽同系物”是这样的多肽或包含这样的多肽：其氨基酸序列包含含有表7的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替代地或另外地，在一些实施方式中，“saposin多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列显示出与表7中的一种或多种多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表7中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，该特征序列元件包含表7的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。
小分子：本文所使用的术语“小分子”包括分子量低于约5000道尔顿(Da)的任何化学部分或其它部分。在一些实施方式中，小分子的分子量低于约2500道尔顿、约1000道尔顿或约500道尔顿。在一些实施方式中，小分子不是聚合物。在一些实施方式中，小分子不是肽。在一些实施方式中，小分子不是核酸。在一些实施方式中，小分子具有生物学活性和/或发挥影响生物过程的作用。在一些实施方式中，小分子是天然产物。在一些实施方式中，小分子不是天然产物(例如，首先经化学合成制备)。
鞘脂代谢酶：本文所使用的术语“鞘脂代谢酶”是指控制鞘脂的合成和降解的酶。这些酶协调鞘脂代谢物(例如，神经酰胺、鞘氨醇、二脂酰甘油(diacyglycerol)或鞘氨醇-1-磷酸盐/酯)的互相转换。示例性的鞘脂代谢酶包括但不限于，丝氨酸棕榈酰转移酶、3-酮基二氢鞘氨醇还原酶、神经酰胺半乳糖基转移酶、葡糖神经酰胺合酶、鞘磷脂合酶和/或各种溶酶体酶(例如β-氨基己糖苷酶、β-半乳糖苷酶)。具有代表性的已知鞘脂代谢酶包括在下面表8中列出的鞘脂代谢酶。在一些实施方式中，鞘脂代谢酶可以是鞘脂代谢酶同系物。“鞘脂代谢酶同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列包含含有表8的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替代地或另外地，在一些实施方式中，“鞘脂代谢酶同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽：其氨基酸序列显示出与表8中的一种或多种多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表8中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，该特征序列元件包含表8的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。
稳定性：本文所使用的术语“稳定性”是指诱导或稳定溶酶体酶处于其野生型或功能上相同的构象。本文所使用的术语功能上相同意味着，虽然由于几乎所有蛋白质在它们的生理状态下展现出一些构象灵活性，在构象上可能存在轻微的变化，构象灵活性不会导致蛋白质的聚集、通过内质网相关的降解途径而清除、蛋白质功能削弱和/或在细胞内运送不当。可以通过以下任一项确定稳定化作用：在细胞中提高的酶半衰期；在溶酶体中提高的酶水平；或使用人工底物在细胞裂解物中测定的提高的水解活性。
受试者：本文所使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”是指可在其上使用或给予本发明的实施方式的任何有机体，例如，用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人；昆虫；线虫(worms)等)。人包括出生前和出生后的形式。在一些实施方式中，受试者携带由所给予的溶酶体活化剂靶向的溶酶体酶的突变等位基因。
基本上(substantially)：本文所使用的术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或性质的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物学领域普通技术人员会明白的是，生物和化学现象很少(如果有的话)进行到完成和/或进展到完全或达到或避免绝对的结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕捉(capture)在许多生物和化学现象中完全固有(completeness inherent)的潜在缺乏。
患有(suffering from)：“患有”疾病、障碍和/或病症(例如，中风)的个体被诊断出患有和/或表现出所述疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状。
易感(susceptible to)：“易感”疾病、障碍和/或病症(例如，任何疾病、障碍和/或病症，包括但不限于本文所述的任何疾病、障碍和/或病症)的个体处于发展为所述疾病、障碍和/或病症的风险中。在一些实施方式中，易感疾病、障碍和/或病症的个体未显示出所述疾病、障碍和/或病症的任何症状。在一些实施方式中，易感疾病、障碍和/或病症的个体未曾被诊断为患有所述疾病、障碍和/或病症。在一些实施方式中，易感疾病、障碍和/或病症的个体是已经暴露于与所述疾病、障碍和/或病症的发展相关的条件下的个体(例如，个体已暴露于感染原(infectious agent)；个体已暴露于具有认为导致所述疾病、障碍和/或病症的有害环境中等)。在一些实施方式中，发展疾病、障碍和/或病症的风险是基于群体的风险(例如，个体携带与所述疾病、障碍和/或病症相关的基因和/或等位基因)。
突触核蛋白病：本文所使用的术语“突触核蛋白病”或“α-突触核蛋白病”是指与蛋白质α-突触核蛋白的病理积聚相关的疾病、障碍和/或病症，或者特征为蛋白质α-突触核蛋白的病理积聚的疾病、障碍和/或病症，包括但不限于帕金森氏病、路易体病、多***萎缩、Hallervorden-Spatz病和额颞痴呆(frontotemporal dementia)。
tau蛋白病：本文所使用的术语“tau蛋白病(tauopathy)”或“tau蛋白病的(tauopathic)”是指与tau蛋白的病理积聚相关的疾病、障碍和/或病症，或者特征为tau蛋白的病理积聚的疾病、障碍和/或病症，包括但不限于阿尔茨海默氏病、额颞痴呆和进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy)。
治疗剂：本文所使用的短语“治疗剂”是指当给予有机体时，引发所期望的药理作用的任何试剂。在一些实施方式中，如果试剂展示出在适当的群体中具有统计学显著效果，则认为该试剂是治疗剂。在一些实施方式中，适当的群体可以是模型有机体的群体。在一些实施方式中，适当的群体可以通过不同的标准定义，如特定的年龄组、性别、遗传背景、既往临床病史(preexisting clinical conditions)等。在一些实施方式中，治疗剂是可用于特定疾病、障碍和/或病症的至少一种症状或特征的缓和、改善、缓解、抑制、延迟发作、降低严重程度和/或减少发生率的任何物质。
治疗有效量：本文所使用的术语“治疗有效量”是指当在相关群体中观察到治疗剂的给予与达到特定治疗效果相关或合理预期与达到特定治疗效果相关时的治疗剂的量。治疗效果可以是客观的(即，通过一些测试或标志物是可测量的)或主观的(即，受试者给出效果的指征或感受)。在一些实施方式中，物质的治疗有效量是，当给予患有或易感疾病、障碍和/或病症的患者时，足够治疗、诊断、预防和/或延迟和/或缓和所述疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状的量。在一些实施方式中，治疗有效量是增加靶细胞中溶酶体酶后-ER形式的量。在一些实施方式中，治疗有效量是增加靶细胞中溶酶体蛋白水解的量。在一些实施方式中，治疗有效量是降低靶细胞中鞘脂水平的量。在一些实施方式中，治疗有效量是降低靶细胞中葡糖神经酰胺水平的量。在一些实施方式中，治疗有效量是降低靶细胞中α-突触核蛋白水平的量。可以通过对本领域的技术人员显而易见的临床观察、实验室和神经影像学研究监测疾病进展。通常以可包含多个单位剂量的给药方案给予治疗有效量。对于任何特定的治疗剂，治疗有效量(和/或在有效给药方案内的合适单位剂量)可以变化，例如，取决于给予途径以及与其它药剂的联合。另外，对于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)，可能取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；所使用的具体药剂的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所使用的特定融合蛋白的给予时间、给予途径和/或***或代谢的速率；治疗持续时间；以及医学领域众所周知的类似因素。此外，有效量可以在治疗方案中通过单一剂量或通过多个剂量给予。在一些实施方式中，当单独的剂量或组合物含有效果同治疗方案的上下文中的剂量时，则认为该单独的剂量或组合物含有“治疗有效量”。本领域普通技术人员将会理解的是，如果某剂量或量给予患者群体时，被证实或曾被证实显示出统计学显著效果，则可以认为该剂量或量是有效的；在认定某个量是如本文所述的治疗有效量时，无需在特定个体患者中达到特定结果。
运输：如本文所使用的术语“运输”是指多肽或囊泡经由内质网至细胞、细胞膜中的预先确定位置、或进入细胞外环境中的运动。在一些具体的实施方式中，如本文中所使用的术语是指多肽(例如，溶酶体酶)经由ER和/或进入溶酶体的运动。
治疗：本文所使用的术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指特定疾病、障碍和/或病症的至少一种症状或特征的缓和、改善、缓解、抑制、严重程度降低和/或发生率降低的药剂的任何给予。治疗包括防止疾病状况恶化，即从受试者根据一些症状被诊断为患有该种疾病的时刻起，阻止(halting)额外症状的发展。在本申请的上下文中，也可以将治疗定义为受试者中α-突触核蛋白水平的降低。在一些实施方式中，治疗是治疗性的，将其给予表现出疾病、障碍和/或病症的至少一个迹象(sign)或症状的受试者。
预防(prophylaxis)：本文所使用的术语“预防”是指在受试者中给予延迟至少一种症状的发作的药剂，其中，所述受试者未曾表现出相关疾病、障碍和/或症状的既往迹象或症状。
单位剂量(unit dose)：如本文所使用的表述“单位剂量”是指作为单一剂量给予的量和/或药物组合物的在物理上离散的单位的量。在许多实施方式中，单位剂量含有预先确定量的活性试剂。在一些实施方式中，单位剂量含有试剂的整个单一剂量。在一些实施方式中，给予多于一个单位剂量，以达到总的单一剂量。在一些实施方式中，给予所需的或预期所需的多个单位剂量，以达到预期效果。单位剂量可以是，例如，含有预先确定量的一种或多种治疗剂的一定体积的液体(例如，可接受的载体)；处于固体形式的预先确定量的一种或多种治疗剂；含有预先确定量的一种或多种治疗剂的缓释制剂或药物递送装置等。将会理解的是，单位剂量存在于如下制剂中：除所述治疗剂以外，该制剂还包含任意多种成分。例如，可接受的载体(例如，药学上可接受的载体)、稀释剂、稳定剂、缓冲剂和防腐剂等，可以包括在如下文所述的内容中。本领域技术人员将会理解的是，在许多实施方式中，特定治疗剂的总的合适的每日剂量可包含单位剂量的一部分或多个单位剂量，并且例如，可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定。在一些实施方式中，对于任何特定受试者或有机体而言的具体有效剂量水平可取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；所使用的具体活性化合物的活性；所使用的具体组合物；受试者的年龄、体重、整体健康状况、性别和饮食；所使用的具体活性化合物的给药时间以及***速率；治疗持续时间；与所使用的具体化合物联合使用或同步(coincidental with)使用的药物和/或额外的治疗方法；以及在医学领域众所周知的类似因素。
野生型：本文所使用的术语“野生型”具有其领域所理解的含义，是指具有如同在自然界中发现的“正常”(与突变体、患病的和改变的等形成对比)状态或环境的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将会理解的是，野生型基因和多肽通常以多个不同的形式(例如，等位基因)存在。
小分子化学化合物结构的定义
本文中使用标准命名法描述小分子化学化合物结构。除非另外定义，本文中使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员普遍理解的相同意义。
除非另有指明(即，通过暗示或陈述)，可以理解的是，本文所描绘(depicted)或描述的任何具体小分子化合物可以由构成该化合物的原子的任何可获得的或适当的同位素构成。如本领域技术人员所理解的，同位素是具有相同原子序数但具有不同质量数的原子。不受限制地举出一般实例，氢的同位素包括氚和氘；碳的同位素包括11C、13C和14C。
术语“取代”是指在指定的原子或基团上的任何一个或多个氢原子被替换为选自于指定基团的基团，条件是不超过所指定原子的正常价。当取代基是氧代基(oxo)(即，＝O)时，原子上的2个氢被替代。当芳族部分被氧代基取代时，芳族环被替换为对应的部分不饱和环。例如被氧代基取代的吡啶基为吡啶酮。在某些实施方式中，仅在特定的取代基和/或变化的组合产生稳定的化合物或有用的合成中间体时，容许存在特定的取代基和/或变化。稳定的化合物或稳定的结构是指在暴露于本发明实践中的环境下足够稳健地存在的化合物或结构。例如，在一些实施方式中，如果化合物或结构足够稳健以被分离和/或纯化，则该化合物或结构是稳定的。在一些实施方式中，如果化合物或结构足够稳健以被混合(compounded)为药物组合物，则该化合物或结构是稳定的。在一些实施方式中，如果化合物或结构足够稳健以被用于本文所述的功能测试中，则该化合物或结构是稳定的。
可存在于“任选取代的(optionally substituted)”位置上的合适基团包括但不限于，例如，卤素、氰基、羟基、氨基、硝基、氧代基、叠氮基、烷酰基(alkanoyl)(例如C2-C6烷酰基，如酰基等)；甲酰胺(carboxamido)；烷基甲酰胺；烷基、烷氧基、烷硫基(alkylthio)(包括那些具有一个或多个硫醚键的烷硫基)、烷基亚磺酰基(包括那些具有一个或多个亚磺酰键的烷基亚磺酰基)、烷基磺酰基(包括那些具有一个或多个磺酰键的烷基磺酰基)、单-氨基烷基和二-氨基烷基(包括具有一个或多个N原子的基团)，所有上述任选的烷基取代基中可具有由氧或-NH-取代的一个或多个亚甲基，并且具有约1至约8、约1至约6、或1至约4个碳原子，以及环烷基；苯基；以苄基为示例性苯基烷基的苯基烷基、以苄氧基为示例性苯基烷氧基的苯基烷氧基。
不在两个字母或符号之间的短线(“-”)用来表示取代基的连接点。
“烷基”包括具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂肪烃基团。术语C1-C2烷基是指具有1至约2个碳原子的烷基，例如，分别为甲基和乙基。
“亚烷基”是具有指定碳原子数的直链或支链饱和二价碳链。
“烷基酯”是通过酯键连接的如上定义的烷基。酯键可为任何取向，例如，式-O(C＝O)烷基的基团或式-(C＝O)O烷基的基团。
“烷酰基”是通过酮(-(C＝O)-)桥连接的如上所定义的烷基。烷酰基具有指定的碳原子数，酮基的碳原子包含在编号的碳原子中。例如，C2烷酰基是具有式CH3(C＝O)-的乙酰基。
“烷基磺酰基”是式烷基-(SO2)-的基团，其中烷基是具有指定碳原子数的如上所定义的烷基。示例性的烷基磺酰基是甲磺酰基。
“烷基硫”表示通过硫键连接的如上所定义的烷基，即，式烷基-S-的基团。实例包括乙基硫和戊基硫。
“烷氧基”是指具有指定碳原子数、通过氧桥连接的如上所定义的烷基。
“环烷基”是具有指定碳原子数(通常为3至约7个碳原子)的饱和烃环基团。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基或环己基，以及桥连或笼状饱和环基团(如降冰片烷(norbornane)或金刚烷)。
“单环或双环碳环”是仅含有碳环原子的3至8元的饱和、部分不饱和或芳族的环；或仅含有碳环原子的6至11元的饱和、部分不饱和或芳族的双环碳环环***。除非另有指明，碳环基团可在任何碳原子处连接至其侧基(pendant group)，生成稳定的结构。当有所指定时，如果所得化合物是稳定的，本文所述的碳环可在任何可用的环碳上被取代。碳环基团包括环烷基，如环丙基和环己基；环烯基，如环己烯基，桥连的环烷基；以及芳基，如苯基。
“卤代(halo)”或“卤素”是指氟代、氯代、溴代或碘代。
“杂环烷基”是具有指定环原子数的饱和环基团，其含有1至约3个选自于N、O和S的杂原子，剩余环原子则是碳。杂环烷基的实例包括四氢呋喃基和吡咯烷基。
“单环或双环杂环”是5至8元的饱和、部分不饱和或芳族的环，其含有1至约4个选自于N、O和S的杂原子，剩余环原子则是碳；或是7至11元的双环饱和、部分不饱和或芳族的杂环环***，多环***中的每个环各自包含至少1个选自于N、O和S的杂原子，并且多环***中的每个环包含至多约4个独立地选自于N、O和S的杂原子。除非另有指明，所述杂环可以在任何杂原子或碳原子处连接至其取代的基团，生成稳定的结构。当有所指定时，如果所得化合物是稳定的，本文所述的杂环可在碳原子或氮原子上被取代。杂环中的氮原子可以任选地被季铵化(quaternized)。优选的是杂环基团中杂原子的总数不超过4个，并且杂环基团中S和O原子的总数不超过2个，更优选不超过1个。杂环基团的实例包括吡啶基(pyridyl)、吲哚基、嘧啶基、pyridizinyl、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、呋喃基、苯硫基(thiophenyl)、噻唑基(thiazolyl)、***基、四唑基、异噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、苯并[b]苯硫基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、噻吩基(thienyl)、异吲哚基、二氢异吲哚基、5,6,7,8-四氢异喹啉、吡啶基(pyridinyl)、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基和吡咯烷基。
“单-烷基氨基(mono-alkylamino)和/或二-烷基氨基”是指仲烷基氨基基团或叔烷基氨基基团，其中烷基如上所定义并具有指定的碳原子数。烷基氨基基团的连接点在氮上。独立地选择烷基。单-烷基氨基和二-烷基氨基基团的实例包括乙基氨基、二甲基氨基和甲基-丙基-氨基。
“单-烷基甲酰胺(mono-alkylcarboxamide)或二-烷基甲酰胺”是式-(C＝O)N烷基1烷基2的基团，其中所述烷基1和烷基2基团独立地选自于如本文所定义的烷基，通过甲酰胺键连接。所述甲酰胺键可为任意取向，例如，-NH(C＝O)-或-(C＝O)NH-。
“卤代烷基”是指以1个或多个卤素原子(通常最多为卤素原子允许的最大数)进行取代、具有指定碳原子数的支链和直链烷基。卤代烷基的实例包括但不限于，三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基(penta-fluoroethyl)。
“卤代烷氧基”表示通过氧桥(醇基(alcohol radical)的氧)连接的如上所定义的卤代烷基。
术语“手性”是指具有镜像伴侣的非-重合性(non-superimposability)属性的分子。
“立体异构体”是具有相同的化学组成、但原子或基团空间排布不同的化合物。
“非对映异构体”是具有两个或多个手性中心、且其分子彼此不成镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体的混合物可通过高效拆分分析方法分离，如电泳、在拆分剂(resolving agent)存在下结晶、或使用例如手性HPLC柱的色谱法。
“对映异构体”是指彼此为不可重合的镜像的化合物的两种立体异构体。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，其可以发生在不存在立体选择或立体特异性的化学反应或过程中。
本文所使用的立体化学定义和规范通常遵从S.P.Parker,Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984年)McGraw-Hill Book Company，纽约；以及Eliel,E.和Wilen,S.，Stereochemistry of Organic Compounds(1994年)John Wiley&Sons,Inc.，纽约。多种有机化合物以光学活性形式存在，即，它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示该分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或者(+)和(-)用于指定由化合物引起的平面偏振光的旋转符号，其中(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。
“外消旋混合物”或“外消旋体”是两种对映异构体物质的等摩尔(或50:50)混合物，没有光学活性。外消旋混合物可以发生在不存在立体选择或立体特异性的化学反应或过程中。
表1：β-半乳糖苷酶多肽具有代表性的氨基酸序列
表2：β-葡糖脑苷脂酶多肽具有代表性的氨基酸序列
表3：葡糖神经酰胺合酶多肽具有代表性的氨基酸序列
表4：氨基己糖苷酶多肽具有代表性的氨基酸序列
表5：溶酶体酶具有代表性的氨基酸序列
表6：Rab多肽具有代表性的序列
表7：saposin多肽具有代表性的氨基酸序列
表8：鞘脂代谢酶具有代表性的氨基酸序列
某些实施方式的详细说明
本发明提供了关于蛋白质病疾病、障碍和/或病症的治疗(不管是治疗性的还是预防性的)和/或关于对此类治疗有用的试剂的鉴定和/或表征的方法和组合物。特别是，本发明提供了给予一种或多种治疗剂的方法，所述一种或多种治疗剂在被诊断患有蛋白质病疾病、障碍和/或病症的个体，具有患蛋白质病疾病、障碍和/或病症风险的个体，或疑似(suspect of)患有蛋白质病疾病、障碍和/或病症的个体中使溶酶体酶活化。特别是，本发明提供了使溶酶体酶的水平和/或功能活性增加以对某些蛋白质病进行有效治疗和/或预防的方法。具体而言，在一些实施方式中，本发明提供了下述方法：所述方法实现增加的溶酶体酶运输，从而提供了对某些蛋白质病的有效治疗和/或预防。
在一些实施方式中，本发明提供了将溶酶体活化剂(例如，使溶酶体酶的运输增加的试剂)和/或抗氧化剂单独或彼此联合使用以对蛋白质病进行有效治疗和/或预防的方法。特别是，在一些实施方式中，本发明提供了如下方法：所述方法实现了增加的蛋白质运输途径活性以对某些蛋白质病进行有效治疗和/或预防。具体而言，其中，本发明提供了使用试剂的方法，所述试剂影响蛋白质的运输，进而影响到溶酶体中溶酶体酶的水平和/或活性。特别是，在某些实施方式中，本发明提供了用于使细胞中葡糖神经酰胺水平降低以使得α-突触核蛋白的积聚或聚集减少的方法。
所提供的方法和组合物在医药方面有用。所提供的方法和组合物尤其在蛋白质病的治疗和/或预防中有用。所提供的方法和组合物令人意料不到地在除溶酶体贮积病外的蛋白质病的治疗和/或预防中有用。所提供的方法和组合物令人意料不到地在神经退行性蛋白质病的治疗和/或预防中有用。另外，所提供的方法和组合物允许对新试剂、试剂组合和/或治疗方案进行鉴定和/或表征，所述新试剂、试剂组合和/或治疗方案在医药、蛋白质病的治疗和/或预防、除溶酶体贮积病外的蛋白质病的治疗和/或预防、和/或神经退行性蛋白质病的治疗和/或预防中有用。
蛋白质病
术语蛋白质病是指与一种或多种蛋白质的致病性积聚和/或聚集有关的疾病、障碍和/或病症。在一些实施方式中，蛋白质病可包括在如下一种或多种方面中的病理改变：蛋白质的生产、折叠、代谢、降解(例如，自噬降解、溶酶体降解、蛋白酶体降解)、转运或运输、分泌等。自噬可包括微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)、分子伴侣介导的自噬、线粒体自噬(mitophagy)、和过氧化物酶体自噬(pexophagy)。
在一些实施方式中，蛋白质病可涉及蛋白质被转运出内质网到达其在细胞、细胞膜中的天然位置或进入细胞外环境的转运效率或能力。例如，溶酶体酶的天然位置为溶酶体。蛋白的常规运输途径包含：内质网→高尔基体→内体→溶酶体，但是突变蛋白和/或某些野生型蛋白(其折叠和运输可能不完全)可能会在内质网中不稳定，并且其沿正常转运途径的运输可能会受到阻碍。
在一些实施方式中，蛋白质病可涉及调节性细胞内信号通路。例如，在一些实施方式中，由于发育期间不断变化的蛋白质组的存在、新蛋白的存在和衰老时错误折叠蛋白的积聚，时间性细胞蛋白质内稳态(temporal cellular proteostasis)适应为必要的。因为蛋白质组的保真度在发育和衰老期间以及通过暴露于需要高蛋白折叠和运输能力的病原体而受到挑战，细胞利用应激感受器和可诱导途径来对蛋白质内稳态控制的缺失进行应答。这些应答涉及热休克应答(HSR)通路(调节细胞质的蛋白质内稳态)、未折叠蛋白应答(UPR)通路(帮助维持胞吐(exocytic)通路的蛋白质内稳态)、钙离子(Ca2+)信号通路、和/或与有机体寿命有关的通路(包括胰岛素/胰岛素生长因子受体信号通路)和与饮食限制有关的通路、以及与线粒体电子传递链过程有关的过程。
HSR通路是指胞浆中热休克蛋白(分子伴侣/辅分子伴侣(cochaperone)/折叠酶)增强的表达，这可对在分泌通路中折叠和运输的作为可溶性腔酶(lumenal enzyme)的蛋白的蛋白质内稳态具有影响。包括分子伴侣在内的胞浆因子对使所述分泌通路更适于折叠和运输而言可能至关重要(Bush等，J Biol Chem 272:9086,1997；Liao等，J Cell Biochem99:1085,2006；Westerheide等，J Biol Chem 279:56053,2004)。
UPR通路是指内质网(ER)中的应激感应机制(sensing mechanism)，其中，ER通过使多达3种细胞内信号通路的综合武器(integrated arms)活化以对其腔中的未折叠蛋白的积聚作出应答，例如，UPR相关应激感应器，IRE1、ATF6以及PERK(统称为未折叠蛋白应答)，其调节在分泌通路中起作用的许多基因的表达(Ron等，Nat Rev Mol Cell Biol 8:519,2007；Schroeder等，Ann Rev Biochem 74:739,2005)。UPR相关分子伴侣包括但不限于BiP、GRP94和钙网蛋白(calreticulin)。
Ca2+离子在细胞中是普遍且重要的信号传递离子。Ca2+信号传递通过各种通路对许多细胞功能产生影响，并且是内质网(ER)功能的主要调节物(Berridge等，Nat Rev MolCell Biol 4:517,2003；Burdakov等，Cell Calcium 38:303,2005；Gorlach等，AntioxidRedox Signal 8:1391,2006)。Ca2+稳态还通过ER钙受体的活性进行调整。ER钙受体包括例如，兰尼碱(ryanodine)受体(RyR)、肌醇3-磷酸酯(inositol 3-phosphate)受体(IP3R)以及肌浆/内质网钙(SERCA)泵蛋白。RyR和IP3R介导钙自ER流出，而SERCA泵蛋白介导钙流入ER。有3种RyR亚型，RyR1、RyR2和RyR3。披露的证据表明，钙信号传递可对蛋白质病疾病、障碍和/或病症产生影响(Futerman等，Nat Rev Mol Cell Biol 5:554,2004；LaFerla，NatRev Neurosci 3:862,2002；Petersen等，Cell Calcium 38:161,2005)。这一假设由如下观察结果给予支持：通过SERCA泵抑制剂(如毒胡萝卜素(thapsigargin))处理钙稳态增强了ΔF508囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)和姜黄素(curcumin)的折叠和运输(Egan等，NatMed 8:485,2002；Egan等，Science 304:600,2004)。
在一些实施方式中，本发明提供了针对如下的方法；通过给予至少一种溶酶体活化剂，使患有蛋白质病疾病、障碍和/或病症的受试者的细胞中的溶酶体降解增加，所述至少一种溶酶体活化剂可增加野生型溶酶体酶和突变溶酶体酶二者的水平和/或活性。
在一些实施方式中，本发明提供了针对使受试者细胞中α-突触核蛋白水平降低的方法，所述方法包括向所述受试者给予α-突触核蛋白水平减小量的试剂，所述试剂能够活化GCase活性，例如能够使GCase活性活化的Rab1a多肽或其同系物。在一些实施方式中，在给予能够使GCase活性活化的试剂前，所述受试者首先被诊断为具有增加的α-突触核蛋白水平。在一些实施方式中，所述受试者处于具有增加的α-突触核蛋白水平的提高的风险中。
在一些实施方式中，蛋白质病可能涉及脂质积聚。例如，在Nieman-Pick C型疾病中，存在乳糖神经酰胺、葡糖神经酰胺(GlcCer)、GM2-神经节苷脂和去唾液酸-GM2的病理性积聚，Nieman-Pick C型疾病是溶酶体胆固醇贮积病，其与由于在编码酸性鞘磷脂酶的基因中具有错义突变而来的缺陷型酸性鞘磷脂酶无关(Vanier等，Brian Pathology 8:163-74，1998)。不希望受任何特定理论的束缚，申请人注意到，已提出多种机制来解释这种积聚，例如包括，有缺陷的脂质运输。健康的内体运输***对神经元功能是至关重要的(Buckley等，J Physiol 525:11，2000)。鞘糖脂代谢(包括GlcCer)的破坏对细胞运输有损害并导致胆固醇隔离(sequestration)和积聚(Pagano等，Traffic 1(11):807,2000；Sillence等，JLipid Res 43(11):1837,2002；Helms等，Traffic 5(4):247-54,2004)。积聚的糖脂形成“脂筏”，所述脂筏可隔离对维持内体***的正常运输非常重要的蛋白。此外，在来自Niemann-Pick C型细胞的成纤维细胞中所观察到的有缺陷的脂质运输可通过用鞘糖脂生物合成的强抑制剂进行治疗而逆转(Lachmann等，Neurobiol Dis.16(3):654,2004)，这进一步强调在该疾病的病理中涉及GlcCer及其它脂质。例如，抑制葡糖神经酰胺合酶(所述酶催化鞘糖脂生物合成的第一步)通过下列可能的机制延迟蛋白质病疾病、障碍和/或病症发作：底物减少；使蛋白(例如，α-突触核蛋白)的聚集程度减轻；作为抗炎剂发挥作用；或抑制非溶酶体GCase，导致神经元鞘糖脂的水平改变。
另外，将α-突触核蛋白正常定位至其天然细胞位置(突触)需要与脂筏缔合(Fortin等，J Neurosci 24(30):6715-23,2004)。与帕金森氏病病理有关的突变将这一缔合破坏。因此，脂筏组成的变化(所述变化也破坏这一缔合)可通过损害α-突触核蛋白的正常定位和分布而导致帕金森氏病。
在一些实施方式中，本发明提供了针对如下的方法：通过向受试者给予至少一种溶酶体活化剂，使所述受试者细胞中由蛋白质病疾病、障碍和/或病症所引起的脂质积聚减少。具体而言，本发明提供了针对通过给予至少一种溶酶体活化剂使GlcCer积聚减少的方法。
在特定蛋白质病中观察到其聚集的示例性蛋白包括，α-突触核蛋白(突触核蛋白病，如帕金森氏病(PD)和路易体病)、tau蛋白(tau蛋白病，例如阿尔兹海默氏病)、β淀粉样蛋白(淀粉样蛋白病，例如血管性痴呆、认知功能减退以及阿尔兹海默氏病)、SOD1(SOD1蛋白质病，例如，肌萎缩性脊髓侧索硬化症)、TDP-43(TDP-43蛋白质病，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症)、亨廷顿蛋白(亨廷顿氏病)、视紫质(视网膜色素变性)和/或在被统称为溶酶体贮积病的疾病情况下的许多蛋白(例如，葡糖神经酰胺)。本领域普通技术人员将会了解的是，某些疾病、障碍和/或病症与多于一种不同蛋白的错误折叠和/或聚集有关。
在一些实施方式中，本发明提供了通过给予至少一种溶酶体活化剂减少受试者细胞中的α-突触核蛋白水平的方法。
在多种不同类型的障碍、疾病和/或病症中观察到了蛋白质聚集体，所述障碍、疾病和/或病症包括认知功能减退、增生性疾病、炎性疾病、心血管疾病、免疫性疾病、眼部疾病、线粒体疾病、神经退行性疾病以及溶酶体贮积病。本发明的一些实施方式适用于所有蛋白质病。本发明的一些实施方式适用于除了溶酶体贮积病以外的蛋白质病。
A.神经退行性疾病
本发明提供了与神经退行性疾病相关的方法和组合物。许多神经退行性疾病与特定蛋白质聚集体的细胞内积聚和/或细胞外积聚有关。在很多情况下，认为蛋白质聚集体对脑发挥毒性效应，并对疾病病理学有贡献。
神经退行性蛋白质病典型地与以下结构中的聚集体有关：胞浆，例如，PD和亨廷顿氏病；细胞核，例如，脊髓小脑共济失调1型(spinocerebellar ataxia 1，SCA1)；内质网(ER)，例如，具有神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(neuroserpin)包涵体的家族性脑病；细胞外蛋白，例如，阿尔兹海默氏病(AD)中的β淀粉样蛋白。
线粒体机能障碍和氧化应激也可能在神经退行性疾病发病机制中起作用(Lin等，Nature 443:787,2006)。
1.突触核蛋白病
本发明提供与突触核蛋白病有关的方法和组合物。突触核蛋白病是多组神经退行性蛋白质病，其共享共同的病理病变，所述病理病变由某些神经元和胶质群体中的蛋白α-突触核蛋白的构象改变和翻译后修饰的聚集体构成。
PD是神经退行性运动障碍，其特征在于突触前α-突触核蛋白以路易体内含物(inclusions)的形式积聚(Spillantini等，Nature 388(6645)；839,1997)。其它神经退行性障碍以α-突触核蛋白积聚为特征，包括多***萎缩、路易体痴呆以及阿尔兹海默氏病的路易体突变。病理性α-突触核蛋白还被认为是在如下疾病中检测到的蛋白质病变的子集：伴随脑铁沉积I型的神经退行性变(neurodegeneration with brain iron accumulatetype I)、关岛型肌萎缩性脊髓侧索硬化症/帕金森氏痴呆综合症、以及家族性AD。
某些证据联系了如下内容：α-突触核蛋白与tau(存在于神经纤丝缠结中的中枢神经***的另一有聚集倾向的蛋白，其表征散发性AD)相互作用并促进tau的聚集(Giasson等，Sci.Aging Knowl.Environ.18:or6,2003)。已在罕有的家族性PD形式中发现了α-突触核蛋白中的若干突变(所有突变稳定并促进蛋白聚集)(Hardy等，Am.J.Epidmeiol.164(2):126,2006)。若干体内和细胞培养模型已证明α-突触核蛋白的过表达和聚集引起神经毒性(Dawson等，Neuron 66:646,2010)。
突触核蛋白为小蛋白(123个氨基酸-143个氨基酸)，并且一级结构通常分成3个不同的结构域：两亲性N端区，以共有序列(consensus sequence)KTKEGV的负电不完全重复(negative imperfect repeats)为特征。这种序列导致所有突触核蛋白共同具有高度保守的α螺旋脂质结合基序；中央疏水区，所述中央疏水区包含阿尔兹海默氏病淀粉样蛋白斑的非Aβ成分(NAC)区(参与蛋白聚集)；以及高酸性且富含脯氨酸的C端区，所述C端区没有明显的结构倾向。
人突触核蛋白家族成员包括α-突触核蛋白、β-突触核蛋白以及γ-突触核蛋白，并且所有突触核蛋白基因在种内和种间均具有相对良好的保守性(Cookson MR,MolecularNeurodegeneration 4(9):1750,2009)。最近克隆的突触核蛋白(synoretin)与γ-突触核蛋白具有紧密同源性，并主要在视网膜中表达。表9中提供了已知的α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白序列的代表性实例。
表9：α-突触核蛋白、β-突触核蛋白以及γ-突触核蛋白具有代表性的氨基酸序列
α-突触核蛋白(还被称为老年斑(senile plaques)前体蛋白的非淀粉样蛋白成分(NACP))，SYN 1或赛尼芬(synelfin)为功能未很好界定的热稳定、“天然非折叠”蛋白。其主要在中枢神经***(CNS)神经元中表达，在此处，其定位于突触前末梢。电镜分析已表明，α-突触核蛋白定位于轴突末端非常接近于突触小泡，这指明α-突触核蛋白在神经传递或突触组织化中起作用。另外，生化分析已揭示，α-突触核蛋白的一小部分可能与囊泡膜(vesicular membranes)相缔合，但是多数α-突触核蛋白是胞浆的(cytosolic)。
遗传证据和组织病理学证据支持如下观点：α-突触核蛋白是若干蛋白质内含物的主要成分，所述蛋白质内含物表征特定神经退行性疾病。病理性突触核蛋白聚集限于α-突触核蛋白亚型，因为在这些包含物中还未检测到β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白。α-突触核蛋白阳性聚集体的存在为疾病特异性的。路易体(神经纤维细胞质内含物，其为PD和DLBD的组织病理学标志)强烈标记有抗α-突触核蛋白的抗体。与PD病理学相关的营养不良泛素阳性神经突(dystrophic ubiquitin-positive neurites)，被称为路易神经突(Lewyneurites，LN)，以及CA2/CA3泛素神经突也是α-突触核蛋白阳性的。此外，苍白小体(palebodies，LB的推定前体，在患有LB疾病的患者中脑中稍膨胀神经元的核周体(perikarya)和神经胶质银阳性内含物中的螺纹样(thread-like)结构)也具有α-突触核蛋白免疫反应性。α-突触核蛋白可能是MSA和脑铁积聚I型(PANK1)中的神经胶质细胞内含物(GCI)和神经元细胞质内含物的主要成分。在阿尔兹海默氏病(AD)的老年斑中的一些营养不良神经突和ALS中的脊髓和皮质中存在α-突触核蛋白免疫反应性。α-突触核蛋白免疫反应性在PD、AD、ALS和HD的转基因小鼠模型和毒素诱导小鼠模型中显著。
进一步的证据支持如下见解：α-突触核蛋白为LB、LN和GCI的纤丝构件的实际构件块(building block)。免疫电镜研究已证明，这些纤丝在原位被α-突触核蛋白抗体强烈地标记。具有直的和扭曲的形态学的十二烷基肌氨酸纳(Sarcosyl)-不可溶性α-突触核蛋白丝还可在DLBD和MSA脑的提取物中观察到。此外，α-突触核蛋白可在体外组装成具有类似于原位可视化的十二烷基肌氨酸纳-不可溶性纤丝或丝的宽度的细长均聚物。聚合与与这些丝的硫代黄素-S反应性一致的从无规则卷曲至反向平行β-折叠结构的二级结构的伴随变化有关。此外，PD相关的α-突触核蛋白突变(A53T)可促进这一过程，因为，重组A53Tα-突触核蛋白相比野生型α-突触核蛋白，具有更高的聚合倾向。这一突变也影响聚合物的超微结构(ultrastructure)；所述丝在外观上较宽并更扭曲，好像由2条原丝(protofilaments)组装成。A30P突变还可能适度增加α-突触核蛋白聚合的倾向，但是，这一突变的病理学效果也可能与其与囊泡的结合减少有关。有趣的是，羧基末端截短的α-突触核蛋白相比全长蛋白更倾向于形成丝。
目前对于突触核蛋白病疾病的治疗选择包括具有广泛可变利益的对症用药，例如，卡比多巴-左旋多巴(carbidopa-levodopa)、抗胆碱能药以及单胺氧化酶抑制剂。即便是最好的应答者(responders)(即，患有特发性帕金森氏病的患者)，对左旋多巴的初始良好应答通常被在接下来治疗的第一个五年或七年里药物诱导的并发症(例如，症状波动(motor fluctuations)和使人衰弱的运动障碍(debilitating dyskinesia))所掩盖。对于其它障碍，目前用药提供边缘症状效益(marginal symptomatic benefit)。考虑到这些障碍的严重使人衰弱的特性以及它们的患病率，本领域明显需要对突触核蛋白病进行治疗和管理的新手段。
其中，本发明提供了令人惊讶的见地，突触核蛋白病可通过活化溶酶体活性而有效地进行治疗。在一些实施方式中，本发明提供通过给予溶酶体活化剂使细胞中的可溶性和不可溶性α-突触核蛋白的毒性均减少的方法。在一些实施方式中，本发明提供了在细胞中使α-突触核蛋白的积聚减少的方法，所述方法包括给予细胞治疗上有效量的提供的溶酶体活化剂。在一些实施方式中，本发明提供了在细胞中减少α-突触核蛋白的毒性和/或积聚的方法，所述方法包括与一种或多种另一治疗剂联合，给予细胞治疗上有效量的提供的溶酶体活化剂。在一些实施方式中，所述细胞为神经元细胞。在一些实施方式中，所述细胞为非神经元细胞。在一些实施方式中，所述细胞表达α-突触核蛋白。在某些实施方式中，所述突触核蛋白病为帕金森氏病、弥漫性路易体病和/或多***萎缩障碍。
帕金森氏病
在一些实施方式中，本发明特别提供了与PD(一种突触核蛋白病)有关的方法。PD为神经退行性障碍，其特征在于运动迟缓(bradykinesia)、强直(rigidity)、震颤(tremor)以及姿势不稳(postural instability)。PD的病理性标志为黑质致密部(substantianigra pars compacta，SNpc)中神经元的缺失以及在其余神经元中路易体的出现。看起来，在运动症状(motor symptom)出现前，需要SNpc中超过约50％的细胞发生缺失。相关症状经常包括小笔迹(写字过小症(micrographia))、皮脂溢(seborrhea)、***性低血压(orthostatic hypotension)、尿困难、便秘以及其它胃肠机能障碍、睡眠障碍、抑郁(depression)以及其它神经精神病学现象、痴呆、以及嗅觉紊乱(早期发生)。患有帕金森氏综合征(Parkinsonism)的患者相比未患有PD的普通群体，具有约2倍高的死亡率。这归因于较虚弱(frailty)或减少的运动性。
PD的诊断主要为临床的，并基于上面所列出的临床表现。帕金森氏综合征指运动迟缓、强直和/或震颤中任意两种的组合。PD为帕金森氏综合征最常见的病因。帕金森氏综合征的其它病因为药物的副作用(主要是强安定剂(major tranquilizers)(例如Haldol))、涉及基底节(basal ganglia)的中风、以及其它神经退行性障碍(例如，DLBD、进行性核上麻痹(PSP)、额颞痴呆(FTD)、MSA以及亨廷顿氏病)。PD的病理性标志为路易体(一种细胞质内包含体)，通常见于黑质的受影响的神经元中并在不同程度上见于皮质中。目前，已鉴定出α-突触核蛋白在散发性帕金森氏综合征中作为路易体的主要成分。
虽然在若干个体中帕金森氏综合征能够清楚地追溯至病毒、中风、或毒素，多数情况下，帕金森氏病的病因学是未知的。可能有助于PD的环境影响可能包括饮用井水、耕作(farming)以及工业暴露于重金属(例如，铁、锌、铜、汞、镁和锰)、烷基化磷酸盐/酯、和orthonal chlorines。Paraquat(一种除草剂)也与增加的帕金森氏综合征(包括PD)患病率有关。吸烟与减少的PD发病率有关。目前的共识是，PD可能由罕见的毒素结合高遗传易感性引起，或者由常见的毒素结合相对较低的遗传易感性而引起。
处于PD发展的风险中的一些受试者可例如通过遗传分析进行鉴定。存在关于与PD相关的某些遗传因素的很好的证据。已报道了大的常染色体显性遗传PD家系(pedigrees)。例如，α-突触核蛋白中的突变对一个家系负责，而在其它家系中，SNCA基因(编码α-突触核蛋白的基因)的三重复(triplication)与PD有关。
弥漫性路易体病和快速眼动睡眠障碍
在一些实施方式中，本发明特别提供了涉及DLBD(一种突触核蛋白病)的方法。DLBD在老年人中为神经退行性痴呆第二种最常见的病因，它影响7％年龄大于65岁的普通人群，以及30％年龄超过80岁的普通人群。它是一系列临床表现(clinicalpresentations)的一部分，所述临床表现共享以突触蛋白α-突触核蛋白的正常聚集为基础的神经病理学。DLBD具有在PD过程中发生的痴呆的多个临床特征和病理特征。除其它临床和神经诊断标准外，“一年原则”可用于将DLBD从PD中区分。根据这一原则，在帕金森氏综合征12个月内痴呆发病称得上是DLBD，而在痴呆发病前帕金森氏综合征超过12个月称得上是PD。DLBD的核心特征包括足以打扰到正常社会功能和职业功能的进行性认知衰退(progressive cognitive decline)。突出的记忆损害或持久的记忆损害并不一定发生在早期，但是在大多数情况下，它随着发展而明显。注意力测试以及额叶皮质技能(frontalcortical skills)和视觉空间能力的测试方面的不足可为特别突出的核心诊断特征，上述中的两种对确诊(diagnosis of probable)必不可少，用于可能的DLBD的一种是波动的认知和在注意力和警觉方面的明显变化，复发性幻视(recurrent visual hallucinations)(其具有典型的形式并很详细)、以及帕金森氏综合征的自发特征。另外，可存在一些支持性特征(supportive features)，例如，反复跌倒、晕厥、暂时性意识丧失、抗精神病药敏感性(neuroleptic sensitivity)、***化妄想(systematized delusions)、幻觉及其它形态(modalities)、REM睡眠行为障碍、以及抑郁。在言语记忆(verbal memory)测试中，患有DLBD的患者比患有阿尔茨海默氏病的患者好，但在视觉性能测试中较差。在该疾病不同严重性范围内均可维持这一特性，但是由于全面困难，在后期阶段可能比较难以识别。在逐步恶化的背景下，DLBD一般表现出混乱的反复发作。患有DLBD的患者显示出皮质和皮质下神经心理损害与大量的注意力缺陷和突出的额叶皮质下功能障碍以及视觉空间机能障碍的结合。这帮助从阿尔茨海默氏病中区分出这一病患。
快速眼动(REM)，睡眠行为障碍是一种以栩栩如生且可怕的梦呈现的深眠状态，并与REM睡眠期间简单或复杂的运动行为相关。这种障碍常常与突触核蛋白病、DLBD、PD和MSA相关，但在淀粉样蛋白病和τ蛋白病中罕见。REM睡眠行为障碍/痴呆中受损的神经心理模式类似于DLBD中报道的，性质上不同于阿尔茨海默氏病中报道的。与神经退行性障碍相关的REM睡眠行为障碍的神经病理研究已经表明路易体病或多***萎缩。发作性睡病(narcolepsy)的REM睡眠觉醒解离(sleep wakefulness disassociations)(REM睡眠行为障碍、白天嗜睡症(hypersomnolence)、幻觉、猝倒)特征可以解释DLBD以及PD的一些特征。睡眠障碍可引起DLBD典型性的波动，其治疗可改善波动和生命质量。处于发生DLBD的风险之中的受试者可被鉴别出来。反复跌倒、晕厥、暂时性意识丧失和抑郁在患有认知障碍的老年人中是很寻常的，并可用作DLBD可能性诊断的指示(红旗)。相比之下，REM睡眠行为障碍中的发作性睡病敏感性可以是DLBD高预言性的。它们的检测取决于具有高水平怀疑力并询问适当筛查问题的临床医生。
受累于LBD或处于发生LBD的风险之中的突触核蛋白病受试者的临床诊断可以得到神经成像研究的支持。与DLBD相关的变化包括磁共振成像(MRI)上的海马结构保留和内侧颞叶体积、以及单光子发射计算机断层成像(SPECT)上的枕部灌注不足(occipitalhypoperfusion)。其它特征，例如广泛性萎缩、白质变化和全脑萎缩的进展速率在差别诊断上无帮助。尾壳核(caudate and putamen)中多巴胺转运体的丧失(黑质纹状体变性的一种标记)可以用多巴胺能SPECT进行检测并且可证明在临床差别诊断上是有帮助的。对于DLBD的尸检诊断的异常扫描，已报道有83％的灵敏度和100％的特异性。
用于诊断DLBD的共识标准包括用于路易体鉴定的泛素免疫组织化学并分成三个类别；脑干为主，边缘或新皮质(neocortical)，这取决于路易体的数量和分布。最近开发的α-突触核蛋白免疫组织化学可以显现更多的路易体并且在指示先前识别的神经官能症病理方面也更好，称为路易神经突。抗α-突触核蛋白的抗体的应用将来自脑干和边缘组的许多DLBD病例的诊断级别移至新皮质组中。
在大多数患有DLBD的患者中，在α-突触核蛋白或其它帕金森氏病相关的基因中没有遗传突变。由于增加的mRNA表达所致的正常野生型α-突触核蛋白的病理上调是一种可能的机制，或路易体可能因为α-突触核蛋白变成不可溶的或更能够聚集而形成。另一种可能性是α-突触核蛋白被异常加工，例如，通过机能障碍的蛋白酶体***，以及因此产生了有毒性的“原纤丝(proto fibrils)”。这些有毒性的纤丝隔绝成路易体可以反映出神经元致力于对抗细胞内的生物学应激，而不是它们仅仅简单的是神经退行性碎片。
用于DLBD准确诊断的靶症状可包括锥体束外运动特征、认知功能减退、神经精神病特征(包括幻觉、抑郁、睡眠障碍和相关的行为紊乱)或自主机能障碍。
本发明的方法可以与用于治疗DLBD的一种或多种其它药物联合使用。例如，左旋多巴的最低可接受剂量可用于治疗DLBD。D2-受体拮抗剂、特别是传统的抗精神病药剂(neuroleptic agents)在DLBD受试者中可激起严重的敏感反应，死亡率增加2-3倍。以上论述的胆碱酯酶(cholinsterase)抑制剂也用于治疗DLBD。
多***萎缩
本发明特别提供了与MSA相关的方法。MSA是以下列症状组合为标志的神经退行性疾病：受累的(affecting)运动、认知、自主和其它身体功能，因此标记为“多***萎缩”。MSA的原因未知。MSA的症状在发作分布和严重程度上因人而异。因此，其名称起初包括3个不同术语：Shy-Drager综合征、纹状体黑质变性(SD)和橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)。
在Shy-Drager综合征中，最突出的症状是涉及自主***的那些：血压、排尿功能和不涉及有意识控制的其它功能。纹状体黑质变性引起帕金森氏综合征症状，例如运动徐缓和强直，而OPCA主要影响平衡、协调和讲话(speech)。MSA的症状也可包括***性高血压、男性阳痿、排尿困难、便秘、讲话和吞咽困难、以及视力模糊。
MSA的最初诊断通常是通过与患者仔细面谈并进行体检而作出。某些类型的脑部成像，包括计算机断层成像、扫描、MRI和正电子发射断层成像(PET)，可用作确证性(corroborative)研究。对多巴胺置换治疗例如Sinemet的不完全和相对差的应答，可以作为运动迟缓和强直的呈现(帕金森氏综合征)并非因PD而致的线索。多脑***与明显自主机能障碍的特征性牵连是MSA的定义性特征并且经尸检证实该诊断。MSA患者在某些类型的脑细胞中也可存在神经胶质细胞质内含物。原型(prototypic)路易体并不存在于MSA中。然而，由免疫组织化学进行的α-突触核蛋白染色是显著的。与帕金森氏病相比，除了对Sinemet应答性差之外，也有一些其它观察结果强烈指明MSA，例如姿势不稳、站立时低血压(***性低血压)和躺下时高血压、排尿困难、阳痿、便秘、讲话和吞咽困难，与缓慢和强直不相称。
本发明的方法可与一种或多种治疗MSA的替代药物联用。通常，可用于治疗MSA的多种症状的药物随疾病进展而效果下降。用于治疗PD的左旋多巴和多巴胺激动剂有时对MSA的徐缓和强直有效。***性高血压可用可的松、米多君或升高血压的其它药物来改善。男性阳痿可用***植入物或药物来治疗。失禁可用药物或导管***术来治疗。便秘可用增加膳食纤维或轻泻药来改善。
2.淀粉样蛋白病
淀粉样前体蛋白(APP)提供各种生理功能，包括对突触功能的调制，对神经元生长和存活的促进，针对氧化应激的保护，以及对神经活性化合物、毒素和病原体的监控(surveillance)。已描述了APP加工的两种分解代谢途径：非促淀粉样蛋白级联(non-amyloidogenic cascade)和促淀粉样蛋白级联。所述非促淀粉样蛋白途径引起由α-分泌酶介导的切割所生成的APP细胞外可溶性N末端部分形成。所述促淀粉样蛋白途径引起通过连续的β-分泌酶和γ-分泌酶切割而得到的淀粉样β(Aβ)肽。Aβ被认为是固有非结构化的，意思是它不能够获得独特的三级折叠，而是处于一组结构的形式。Aβ细胞外形式为Aβ1-40，而神经元内Aβ对应于Aβ1-42。在病态状况(例如AD)中γ-分泌酶途径的活化引起Aβ的积聚。Aβ的这一积聚引起归类于淀粉样蛋白病的疾病。
本发明提供了涉及淀粉样蛋白病的方法。例如，在一些实施方式中，本发明提供了减少细胞中淀粉样β蛋白毒性的方法，所述方法包括给予细胞治疗有效量的此类提供的化合物。在一些实施方式中，本发明提供了减少细胞中淀粉样β蛋白的积聚的方法，所述方法包括给予细胞治疗有效量的此类提供的化合物。在一些实施方式中，所述细胞为神经元细胞。在一些实施方式中，所述细胞为非神经元细胞。在一些实施方式中，所述细胞表达淀粉样β蛋白。在某些实施方式中，所述淀粉样蛋白病为阿尔兹海默氏病、血管性痴呆和/或认知功能减退。
3.Tau蛋白病
Tau蛋白病是以神经元和神经胶质中存在丝状沉积物(由过度磷酸化tau蛋白组成)为特征的神经退行性障碍。神经元和神经胶质细胞中的异常tau磷酸化和沉积是tau蛋白病的主要特征之一。术语tau蛋白病最初用于描述具有额颞痴呆(FTD)和大量tau沉积物的家族。该术语目前用于鉴别具有广泛tau病理学的一组疾病，其中tau积聚看来与发病机制有直接关系。主要的神经退行性tau蛋白病包括以脑和脊髓中丝状tau沉积物为特征的散发性和遗传性疾病。
在大部分tau蛋白病中，神经胶质和神经元的tau内含物是唯一的或主要的CNS损害。示例性的这类tau蛋白病包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、帕金森氏综合征、嗜银颗粒痴呆(argyrophilic grain dementia)、弥散性神经纤丝缠结并伴有钙化、17号染色体连锁的额颞痴呆、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、Pick病、进行性核上麻痹、进行性皮质下胶质增生症和仅缠结型痴呆(tangle only dementia)。
另外，tau蛋白病表征了存在tau蛋白的明显细丝和聚集体的一大组疾病、障碍和病症。示例性的这类疾病、障碍和病症包括散发性和/或家族性阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症/帕金森氏综合征-痴呆综合症(ALS-FTDP)、嗜银颗粒痴呆、拳击员痴呆(dementia pugilistica)、弥散性神经纤丝缠结并伴有钙化、唐氏综合征(Down’ssyndrome)、额颞痴呆、17号染色体连锁的帕金森氏综合征(FTDP-17)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallervorden-Spatz病、包涵体肌炎、Creutzfeld-Jakob病(CJD)、多***萎缩、Niemann-Pick病(NPC)、Pick病、朊病毒蛋白脑淀粉样蛋白血管病、进行性核上麻痹(PSP)、亚急性硬化性全脑炎(subacute sclerosing panencephalitis)、缠结突出的(tangle-predominant)阿尔茨海默氏病、皮质基底节变性、(CBD)、强直性肌营养不良、non-guanamian运动神经元病并伴有神经纤丝缠结、脑炎后帕金森氏综合征、朊病毒蛋白脑淀粉样蛋白血管病、进行性皮质下胶质增生症、亚急性硬化性全脑炎和仅缠结型痴呆。
存在tau病理学与其它异常蛋白病变结合的神经退行性疾病可被认为是继发性tau蛋白病。实例包括AD以及朊病毒蛋白、Bri或α-突触核蛋白发生聚集的某些疾病。尽管tau可能并非最初的病理因素，但tau聚集体促进了最终的变性。
在若干其它神经退行性疾病中也可发现tau沉积物，其中tau病理学显然与其它异常蛋白病变蛋白结合。由聚集的过度磷酸化蛋白tau组成的大量细胞质内含物是在例如以下的若干神经退行性疾病中观察到的特征性病理学结果：AD、Pick病、额颞痴呆、皮质基底节变性和进行性核上麻痹。
本发明提供了tau蛋白病的相关方法。例如，在一些实施方式中，本发明提供减少细胞中tau毒性的方法，所述方法包括给予细胞治疗有效量的此类所提供化合物。在一些实施方式中，本发明提供降低细胞中tau蛋白积聚的方法，所述方法包括给予细胞治疗有效量的此类所提供化合物。在一些实施方式中，所述细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，所述细胞是非神经元细胞。在一些实施方式中，所述细胞表达tau蛋白。在一些实施方式中，所述tau蛋白病是阿尔茨海默氏病。
阿尔兹海默氏病
AD是老年人的痴呆和认知功能减退的主要原因并且在发展中国家中是继心血管疾病、癌症和中风之后的主要死因。高达70％的痴呆病例是因为AD，而血管病是第二大常见病因。在60岁人群中AD频率大约为1％。AD发病率大约每5年翻一倍。Forsyth，Phys.Ther.78:1325,1998；Evans等，JAMA 262:2551-2556,1989。仅在美国估计有4百万人饱受AD的折磨，每年要花费1千亿美元。(Schumock，J.Health Syst.Pharm.55(52):17,1998；Hay&Ernst,Am.J Public Health 77:1169,1987)。
阿尔茨海默氏病的特征是智力衰退(例如记忆缺失、意识错乱、视觉/空间理解力缺失)并与淀粉样蛋白病和tau蛋白病二者相关。已经通过多种组织病理学、遗传学和生化研究建立起长形式的淀粉样β肽、尤其是Αβ(1-42)在阿尔茨海默氏病中的核心作用。具体地讲，已经发现，Αβ(1-42)在脑部沉积是所有形式的阿尔茨海默氏病的早期和固有特征。这在有可能进行阿尔茨海默氏病诊断之前发生并且在较短的主要形式的Αβ(Αβ(1-40))沉积之前发生。Αβ(1-42)在疾病病因学中的更多意义是来自以下观察结果：与早期发作的家族性阿尔茨海默氏病相关的早老蛋白(presenilin)(γ-分泌酶)基因中的突变均会导致Αβ(1-42)水平增加。APP中的额外突变增加了总Aβ并在某些情况下仅增加Αβ(1-42)。尽管不同APP突变可影响所沉积Aβ的种类、量和位置，但已经发现沉积在脑实质(brainparenchyma)中的主要和最初种类是长Αβ。在Αβ的早期沉积中，当大多数沉积蛋白是无定形或弥漫斑块形式时，实际上所有Aβ都是长形式。这些Aβ(1-42)的最初沉积物随后能够引发Aβ长短形式二者进一步沉积。在表达Αβ的转基因动物中，沉积物与Αβ(1-42)水平升高相关，并且沉积模式类似于具有早期沉积Aβ(1-42)、然后沉积Aβ(1-40)的人类疾病中所观察到的模式。在唐氏综合征患者中可观察到类似的沉积模式和时间点，其中Αβ表达升高且沉积加速。阿尔茨海默氏病与淀粉样蛋白斑块的关联意味着阿尔茨海默氏病被认为是一种淀粉样蛋白病。阿尔茨海默氏病也与tau聚集体的积聚相关，因此是一种tau蛋白病。
认知功能减退或痴呆
认知功能减退和痴呆是与任何多种疾病、障碍和/或病症相关的高度流行的神经学病症。痴呆通常定义为因身体损伤或疾病而导致的认知功能的进行性减退超过由正常衰老所预期的。痴呆描述为精神(mental)功能缺损，涉及记忆、推理、注意力、语言和解决问题上的困难。较高水平的功能通常先受影响。痴呆干扰了人在正常日常生活中的活动能力。
认知功能减退或痴呆可源自任何病因学。认知功能减退和痴呆的示例性原因包括神经退行性疾病、神经病、精神障碍、遗传性疾病、感染性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、血管病、衰老、创伤、营养不良、儿童疾病、化学治疗、自身免疫性疾病和炎性疾病。与认知功能减退或痴呆有关的具体疾病包括但不限于动脉粥样硬化(atherosclerosis)、中风、脑血管疾病、血管性痴呆、多发梗塞性痴呆(multi-infarct dementia)、帕金森氏病和帕金森氏病痴呆、路易体病、Pick病、阿尔茨海默氏病、轻度认知功能减退、亨廷顿氏病、AIDS和AIDS相关的痴呆、脑肿瘤(brain neoplasms)、脑损伤(brain lesions)、癫痫(epilepsy)、多发性硬化、唐氏综合征、视网膜色素变性、湿性和干性衰老相关的黄斑变性、高眼压、青光眼(glaucoma)、角膜营养不良、Rett综合征、进行性核上麻痹、额叶综合征、精神***症、创伤性脑损伤、后冠状动脉旁路移植术、归因于电惊厥休克疗法的认知功能减退、归因于化疗的认知功能减退、归因于药物滥用史的认知功能减退、注意力缺失障碍(attention deficitdisorder，ADD)、注意力缺失多动障碍(ADHD)、自闭症(autism)、失读症(dyslexia)、抑郁、双极型障碍(bipolar disorder)、创伤后应激障碍、情感冷漠(apathy)、重症肌无力、归因于睡眠呼吸暂停的清醒时的认知功能减退、Tourette综合征、自身免疫性脉管炎、全身性红斑狼疮、风湿性多肌痛、肝性病症(hepatic conditions)、代谢性疾病、Kufs病、肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)、异染性脑白质营养不良、贮积病、感染性脉管炎、梅毒、神经性梅毒、Lyme病、来自于脑内出血的并发症(complications from intracerebralhemorrhage)、甲状腺功能减退症(hypothyroidism)、B12缺乏症、叶酸缺乏症、烟酸缺乏症、硫胺素缺乏症、脑积水、缺氧后并发症(complications post anoxia)、朊病毒病(Creutzfeld-Jakob病)、脆性X染色体综合征、苯丙酮尿症、营养不良(malnutrition)、神经纤维瘤病、枫糖尿病、高血钙症、甲状腺功能减退症、高血钙症和低血糖症。
可由健康保健专业人员评价认知功能减退的程度。各种各样的标准化测试可用于评价认知，包括但不限于简易精神状态检查(Mini-Mental Status Examination)、痴呆症状评价量表和阿尔茨海默氏痴呆评价量表(ADAS)。这样的测试通常提供认知功能减退的可测量的评分。在某些实施方式中，要治疗或预防的认知功能减退与阿尔茨海默氏病相关。在某些实施方式中，所述认知功能减退与精神障碍(例如，精神***症)有关。在某些实施方式中，要治疗或预防的认知功能减退与遗传性疾病相关。在某些实施方式中，要治疗或预防的认知功能减退与传染病(例如，HIV、梅毒)有关。
B.溶酶体贮积病
溶酶体贮积病代表以溶酶体活性缺陷为特征的一组障碍、疾病和/或病症。在很多实施方式中，溶酶体贮积病由一种或多种溶酶体酶的水平或活性的降低导致。涉及溶酶体贮积病的溶酶体活性破坏可干涉例如，溶酶体对脂质、蛋白或细胞器的降解，或干涉分子进出溶酶体的适当运输，和/或干涉溶酶体介导的信号传递。许多溶酶体贮积病与溶酶体中一种或多种蛋白的聚集体的积聚有关(尤其是，一种或多种相关溶酶体酶的底物蛋白)；此类溶酶体贮积病可被认为是根据本发明的某些实施方式所述的蛋白质病。
因此，由本发明提供的关于溶酶体活性和蛋白质病间的关联的见地在一些实施方式中对于适当的溶酶体贮积病是适用的。因此，本发明提供了用于治疗和/或预防此类溶酶体贮积病的方法和试剂。
许多溶酶体贮积病包括可以是(虽然并非总是如此)进行性的和退行性的神经***关联；症状可包括发育延迟、共济失调(ataxia)、视觉问题、惊厥等。在健康状况下，溶酶体将不想要的物质加工成可被细胞利用的物质。当涉及这一加工过程的一种或多种酶是或变为缺陷或缺失时，溶酶体贮积病通常发生。此类酶的缺陷或缺失导致不想要的物质在细胞内积聚，最终破坏细胞。在许多实施方式中，溶酶体贮积病是遗传性疾病，表现出常染色体隐性遗传；一些(例如Fabry病和Hunter综合征)是X连锁的。
代表性的溶酶体贮积病包括例如Activator Deficiency/GM2神经节苷脂贮积病、α-甘露糖苷贮积病(alpha-mannosidosis)、天冬氨酰葡萄糖胺尿症(aspartylglucosaminuria)、胆固醇酯贮积病、慢性氨基己糖苷酶A缺乏症、胱氨酸贮积病(cystinosis)、Danon病、Fabry病、Farber病、岩藻糖苷贮积病(Fucosidosis)、半乳糖唾液酸贮积病、Gaucher病(例如I型、II型、III型)、GM1神经节苷脂贮积病(例如婴儿、晚期婴儿型/青少年、成人/慢性)、I-细胞病/粘脂贮积病(mucolipidosis)II、婴儿游离唾液酸贮积病(Infantile Free Sialic Acid Storage Disease)/ISSD、青少年氨基己糖苷酶A缺乏症、Krabbe病(例如婴儿发作、晚期发作)、异染性脑白质营养不良(metachromaticleukodystropy)、粘多糖贮积病、假性Hurler多营养不良(Pseudo-Hurlerpolydystrophy)/粘脂贮积病IIIA(例如MPSI Hurler综合征、MPSI Scheie综合征)、MPS IHurler-Scheie综合征、MPS II Hunter综合征、Sanfilippo综合征A型/MPS IIIΑ、Sanfilippo综合征B型/MPS III B、Sanfilippo综合征C型/MPS III C、Sanfilippo综合征D型/MPS III D、Morquio A型/MPS IVA、Morquio B型/MPS IVB、MPS IX透明质酸酶缺乏症、MPS VI Maroteaux-Lamy、MPS VII Sly综合征、粘脂贮积病I/唾液酸贮积病、粘脂贮积病IIIC、粘脂贮积病IV型)、多硫酸酯酶缺乏症、Niemann-Pick病(例如A型、B型、C型)、神经元蜡样质脂褐质沉积症(Neuronal ceroid-lipofuscinoses)(例如CLN6病-非典型性晚期婴儿型、迟发性变体、青少年早期、Batten-Spielmeyer-Vogt/青少年NCL/CLN3病、芬兰变体晚期婴儿型CLN5、Jansky-Bielschowsky病/晚期婴儿型CLN2/TPP1病、Kufs/成人发作NCL/CLN4病、北方癫痫/变体晚期婴儿型CLN8、Santavuori-Haltia/婴儿CLN1/PPT病、β-甘露糖苷贮积病)、Pompe病/糖原贮积病II型、致密性成骨不全(pycnodystosis)、Sandhoff病/GM2神经节苷脂贮积病(例如成人发作、婴儿、青少年)、Schindler病、Salla病/唾液酸贮积病、Tay-Sachs/GM2神经节苷脂贮积病、Wolman病等。
溶酶体贮积病可由多种缺陷导致，包括溶酶体酶活性的主要(primary)缺陷(例如在Gaucher病或Fabry病中)；或溶酶体酶翻译后加工的缺陷(例如在Mucosuphatidosis中)；或溶酶体酶运输的缺陷(例如在粘脂贮积病IIIA型中)；或并非酶的溶酶体蛋白的缺陷(例如在Danon病中)；或非溶酶体蛋白的缺陷(例如在晚期婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积症突变体中)。在溶酶体贮积病中，经常存在着以下物质的积聚：某些脂质(例如葡糖神经酰胺或胆固醇)，或者某些蛋白质(例如ATP合酶亚基c)，或者某些损坏的细胞器或细胞器片段(例如破碎的线粒体)。药物诱发的细胞吞噬反应的刺激在溶酶体贮积病中可能具有治疗益处；这样的吞噬反应可包括微自噬、巨自噬、分子伴侣介导的自噬、线粒体自噬、过氧化物酶体自噬。
可导致或有助于溶酶体贮积病的示例性溶酶体酶、缺陷列于表10中。
表10.溶酶体贮积病以及相关酶缺陷
C.其它蛋白质病
其它蛋白质病可包括，例如，炎性疾病、障碍和/或病症；增殖性疾病、障碍和/或病症；心血管疾病、障碍和/或病症；免疫性疾病、障碍和/或病症；眼部疾病、障碍和/或病症；和/或线粒体疾病、障碍和/或病症。
1.炎性疾病
通常情况下，炎性疾病、障碍和/或病症的特征在于炎症的剧烈发作，导致如发热、皮疹或关节肿胀的症状。哺乳动物免疫***提供了用于鉴别和清除外源病原体的方法。而免疫***通常提供抵抗外源病原体的防线，在很多情况下，免疫应答本身参与了疾病进展。炎性疾病、障碍和/或病症与免疫疾病不同，但是两组疾患共享由免疫***攻击身体自身组织而导致这一特征，并且也导致增加的炎症。
在某些实施方式中，蛋白质病炎性疾病、障碍和/或病症可以包括一种或多种以下疾病：炎性盆腔疾病、尿道炎、皮肤晒伤、鼻窦炎、肺炎、脑炎、脑膜炎、心肌炎、肾炎、骨髓炎、肌炎、肝炎、胃炎、肠炎、皮炎、齿龈炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎(cholocystitus)、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎、皮肤肌炎、硬皮病、血管炎、变应性障碍(包括哮喘，如支气管、过敏性、内源性、外源性和尘埃性哮喘，特别是慢性或顽固性哮喘(如迟发性哮喘气道高反应性)和支气管炎)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多发性硬化、类风湿关节炎、胃肠道障碍(包括但不限于，腹腔疾病、直肠炎、嗜酸性胃肠炎(osinophilic gastro-enteritis)、肥大细胞增多症、胰腺炎、Crohn病、溃疡性结肠炎)、具有远离肠作用的食物相关的过敏症(例如偏头痛、鼻炎和湿疹)。以鼻粘膜炎症为特征的病症包括急性鼻炎、过敏性鼻炎、萎缩性鼻炎和慢性鼻炎，包括干酪性鼻炎(rhinitis caseosa)、肥厚性鼻炎、化脓性鼻炎(rhinitispurulenta)、干性鼻炎和药物性鼻炎；膜性鼻炎，包括格鲁布性、纤维蛋白性和假膜性鼻炎以及腺病性(scrofoulous)鼻炎；季节性鼻炎，包括神经性鼻炎(枯草热)和血管舒缩性鼻炎；结节病(sarcoidosis)；农民肺及相关疾病；纤维化肺和特发性间质性肺炎；急性胰腺炎；慢性胰腺炎；成人呼吸窘迫综合征和/或急性炎症反应(如急性呼吸窘迫综合征和局部缺血/再灌注损伤)。
2.增生和免疫疾病
通常情况下，细胞增生性障碍、疾病和/或病症包括多种特征为异常细胞生长、优选异常增多的细胞增殖的病症。例如，蛋白质病细胞增生性疾病、障碍和/或病症包括但不限于癌症、免疫介导的应答和疾病(例如，移植排斥、移植物抗宿主疾病、针对基因疗法的免疫反应、自身免疫性疾病、病原体诱导的免疫失调等)、某些循环***疾病以及某些神经退行性疾病。
通常，癌症是特征为异常细胞不受控制的生长和扩散的一组疾病。这类疾病的实例是癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤等。
例如，癌症包括但不限于白血病和淋巴瘤，例如皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤、与人类T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV)相关的淋巴瘤，如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、间皮瘤、成人常见实体瘤，如头部和颈部癌(例如，口腔、喉部和食管)、泌尿生殖***癌(例如，***癌、膀胱癌、肾癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、直肠和结肠癌)、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤及其它皮肤癌、胃癌、脑肿瘤、肝癌和甲状腺癌，和/或儿童实体瘤，例如脑肿瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、Wilms肿瘤、骨肿瘤和软组织肉瘤。
免疫介导的应答和疾病的实例包括进行如下事项后的排斥：利用合成的或有机的移植材料、细胞、器官或组织进行移植以替代组织(如心脏、肾脏、肝脏、骨髓、皮肤、角膜、血管、肺、胰脏、肠、肢体、肌肉、神经组织、十二指肠、小肠、胰岛细胞)的全部或部分功能，包括异种移植；对移植物抗宿主疾病、自身免疫性疾病的治疗，例如类风湿关节炎、全身性红斑狼疮、甲状腺炎、Hashimoto甲状腺炎、多发性硬化、重症肌无力、I型糖尿病葡萄膜炎、青少年发病或新近发病型糖尿病、葡萄膜炎、Graves病、银屑病(psoriasis)、特应性皮炎、Crohn病、溃疡性结肠炎、血管炎、自身抗体介导的疾病、再生障碍性贫血、Evan综合征、自身免疫性溶血性贫血等；以及进一步地对引起异常免疫应答和/或活化的感染性疾病的治疗，例如创伤或病原体诱导的免疫失调，包括例如，由乙肝和丙肝感染、HIV、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染、病毒性脑炎、败血症、寄生性疾病(其中，损伤是由炎症应答诱导的，如麻风病(leprosy))引起的疾病。其它免疫介导的应答和疾病涉及移植物抗宿主疾病(尤其是与同种异体细胞)、类风湿关节炎、全身性红斑狼疮、银屑病、特应性皮炎、Crohn病、溃疡性结肠炎和/或多发性硬化。
实例还包括，由宿主自身免疫应答引起或加重的疾病。例如，自身免疫性疾病，如多发性硬化、红斑狼疮、银屑病、肺纤维化以及类风湿关节炎，以及免疫应答造成发病机理的疾病，例如动脉粥样硬化、炎性疾病、骨髓炎、溃疡性结肠炎、Crohn病，以及移植物抗宿主病(GVHD)往往导致器官移植排斥。额外的示例性炎性疾病状态包括纤维肌痛、骨关节炎、结节病、全身性硬化症、Sjogren综合征、皮肤炎症(例如，银屑病)、肾小球肾炎、增生性视网膜病、再狭窄和慢性炎症。
3.心血管疾病
心血管疾病、障碍和/或病症是世界范围内死亡的主要原因。超过五千万美国人具有心脏和心血管相关问题。通常到检测出心血管心脏问题的时候，这种疾病通常是相当的晚期了，已经发展了几十年，并且通常太过于晚期以至于不能成功防止重大永久性残疾。
通常情况下，心血管疾病可以是涉及心脏和/或血管、动脉并间或涉及静脉的疾病。在一些实施方式中，所述疾病是血管疾病。这些问题最常归因于动脉疾病、动脉粥样硬化、动脉粥样化(atheroma)的后果，但也可与感染、瓣膜和凝血问题相关。在一些实施方式中，所述蛋白质病疾病、障碍和/或病症与循环***疾病相关，如动脉硬化(arteriosclerosis)、动脉粥样硬化、血管炎、结节性多动脉炎和/或心肌炎。
示例性的具体蛋白质病心血管疾病、障碍和/或病症可以包括以下中的一种或多种：心肌缺血、心肌梗死、血管增生(hyperplasia)、心脏肥厚(cardiac hypertrophy)、充血性心脏衰竭、心脏肥大(cardiomegaly)、再狭窄、动脉粥样硬化、高血压和/或心绞痛(angina pectoris)。
在某些实施方式中，所述蛋白质病心血管疾病、障碍或病症是动脉粥样硬化、冠心病、急性冠脉症状(acute coronary symptom)、不稳定心绞痛或急性心肌梗死、稳定型心绞痛、中风、缺血性中风、炎症或自身免疫疾病相关的动脉粥样硬化或再狭窄。
4.线粒体病
通常情况下，线粒体疾病、障碍和/或病症可能是由线粒体DNA中或编码线粒体组分的核基因中的获得性或遗传性突变引起的。它们也可能是由归因于药物副作用、感染或其它环境因素的获得性线粒体机能障碍导致的结果。
线粒体产生大多数细胞的供给物三磷酸腺苷(ATP)，用作化学能量的来源。除了供给细胞能量外，线粒体涉及一系列其它过程，如信号传递、细胞分化、细胞死亡、以及细胞周期和细胞生长的控制(McBride等，Curr.Biol.，16(14)：R551，2006年)。考虑到线粒体在细胞代谢中的核心作用，线粒体中的损伤和随后的机能障碍是广泛的人类疾病的重要因素，并且可能在衰老过程中发挥作用。
线粒体DNA遗传行为不同于常染色体和伴性遗传。不像核DNA那样，线粒体DNA严格遗传自母本，并且每个线粒体细胞器通常包含多个mtDNA拷贝。在细胞***过程中，线粒体DNA拷贝随机分隔于两个新线粒体之间，然后这些新线粒体产生更多拷贝。其结果是，如果仅有少量遗传自母本的mtDNA拷贝是有缺陷的，则线粒体***可导致大多数缺陷拷贝在仅一个新线粒体中终止。一旦受影响的线粒体的数量达到一定程度，线粒体疾病可能变得临床显著，这种现象被称为“阈值表达”。由于缺乏核DNA具有的错误检测能力，线粒体DNA突变经常发生。这意味着，线粒体DNA障碍可能自发地并且较频繁地发生。另外，在控制线粒体DNA复制的酶中的缺陷可能导致线粒体DNA突变。
线粒体疾病包括任何临床异质性多***疾病，其特征在于脑-线粒体脑病和/或肌肉-线粒体肌病的突变，其归因于在氧化磷酸化的电子传递链的蛋白质复合物中的改变。在一些实施方式中，蛋白质病线粒体疾病可包括以下一种或多种：Leber遗传性视神经萎缩、MERRF(肌阵挛癫痫伴蓬毛样红纤维(Myoclonus Epilepsy with Ragged Red Fibers))、MELAS(线粒体脑病、乳酸中毒和中风样发作)、Alper综合征、Lowe综合征、Luft综合征、Menke氏卷缩毛发综合征、Zellweger综合征、线粒体肌病和肢近端型点状软骨发育不良(rhizomelic chondrodysplasia punctata)。
核基因缺陷导致线粒体蛋白质的机能障碍。Friedreich共济失调、遗传性痉挛性截瘫和Wilson病中是此类情况(Chinnery等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatr.，74(9)：1188，2003年)。与适用于大多数其它遗传病的情况相同，这些疾病以显性关系遗传。氧化磷酸化的酶的核突变可引起各种病症，例如辅酶Q10缺乏症和Barth综合征(Zeviani等，Brian，127(pt 10)：2153，2004年)。环境影响可与遗传易感性相互作用，并导致线粒体病。例如，在农药接触和帕金森氏病的后来发作之间可能是有关联的(Gomez等，FrontBiosci.，12：1079，2007年)。
具有涉及线粒体机能障碍病因的其它病理包括精神***症、双极型障碍、痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癫痫、中风、心血管病和视网膜色素变性。被认为是与这些看似无关的病症相关联的共同主线是细胞损伤引起氧化应激。
在一些实施方式中，本发明为以线粒体机能障碍和氧化应激为特征的疾病提供了治疗和/或预防。
溶酶体酶
溶酶体束缚于膜，并含有消化酶，每种消化酶可以切割分布于天然物质中的特定化学键。大多数溶酶体酶在酸性环境中效果最好，所述环境是由内置于溶酶体周围的膜上的质子泵来实现的。溶酶体消化由外部带入细胞内的物质(称为异体吞噬的过程)，以及来源于细胞自身细胞质的其它物质(自体吞噬)。待消化的物质最终被纳入与溶酶体相同的膜为界的隔室中。选择性降解产物可以穿过膜传递出溶酶体，但酶不能。这种保护细胞的隔离作用持续，由于酶和待消化的物质的混合经由以膜为界的隔室的融合发生。
如本文所述，本发明提供了与通过调整溶酶体功能而治疗蛋白质病有关的见解和技术。在一些实施方式中，通过提高一种或多种溶酶体酶的水平和/或活性来实现所述调整。具有代表性的此类溶酶体酶包括，例如，硫酸肝素磺酰胺酶、β-葡糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、氨基己糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶，以及如在表5中列出的其它酶。
一些溶酶体酶(例如葡糖脑苷脂酶)共享相似的催化结构域或活性位点，其由(α/β)8桶(barrel)构成，保守的功能性氨基酸位于构成β-桶的八条链中的六条链的C末端(Durand P等，Glycobiology，1997年)。酶的活性位点是酶的一部分，底物在该部分结合并发生化学反应。活性位点残基(氨基酸或核苷酸)参与底物的识别，并直接参与催化反应机制。经报道引起溶酶体酶介导的疾病(例如，溶酶体贮积病)的若干突变位于溶酶体酶催化结构域的这些保守区域内。
1.葡糖脑苷脂酶多肽
由GBA或GBA1基因编码的天然存在的葡糖脑苷脂酶(GCase)为在溶酶体中有活性的酶，在溶酶体中，该酶将鞘脂葡糖神经酰胺(GlcCer)的β-糖苷键(glucosidic linkage)水解成糖(葡萄糖)和更简单的脂肪分子(神经酰胺)。代表性GCase多肽在表2中提供。
非溶酶体GCase多肽由GBA2基因和GBA3基因编码。胞浆GCase多肽，在人中由GBA3基因编码。胞浆GCase为主要的肝脏酶，所述酶高效地水解β-D-葡糖苷和β-D-半乳糖苷，但不水解任何已知的病理性β-糖苷(β-glycoside)。GBA3还具有显著的中性糖基神经酰胺酶(glycosylceramidase)活性，表明其可能涉及葡糖神经酰胺代谢的非溶酶体分解代谢途径。GBA2基因编码微粒体GCase多肽，该GCase多肽催化胆酸3-O-葡糖苷的水解(作为内源性化合物)。这一蛋白在肝脏中的亚细胞定位说明，该酶主要富集在微粒体部分，在微粒体中，其好像局限于内质网。这一假定的跨膜蛋白被认为在碳水化合物转运和代谢中起重要作用。
在一些实施方式中，本发明教导了，增加的GBA2蛋白和/或GBA3蛋白的水平和/或活性也可能在某些蛋白质病的治疗和/或预防中有用。
GCase多肽缺陷导致Gaucher病(GD)。基于临床进展的速度和神经***的牵连，已描述了三种类型的GD(Grabowski,The Lancet 372(9645):1263,2008)。I型GD是经典定义的非神经性，并典型地以肝脾肿大(hepatosplenomegaly)、骨骼和造血***异常为特征。在I型GD中的表型变异已被观察到，并且在整个疾病的进程中患者的小子集在不同年龄发展为帕金森氏综合征(Bultron等，J.Inherit.Metab.Dis.33:167,2010；Tayebi等，Mol.Genet.Metab.79:104,2003)。II型和III型由中枢神经***的神经退行性变由I型分化，急性进展为II型、慢性进展为III型；然而，这些形式还显示出一些表型变异。所有三种类型的共有特征为在受影响组织中的GlcCer的积聚。
最近的研究暗示了溶酶体酶的突变和除溶酶体贮积病外的神经障碍之间的关联。例如，Gaucher病(GD)和帕金森氏综合征间的临床关联(Sidransky等，Mol.Genet.Metab.84:302,2005)暗示葡糖脑苷脂酶(GCase)基因(GBA1)中的突变和鞘脂代谢中的改变有助于突触核蛋白病的发病。GD为罕见的、常染色体隐性LSD，GD由GCase多肽中的功能丧失性突变造成，所述GCase多肽切割GlcCer的β-葡糖键(glucosyl linkage)(Brady等，J.Biol.Chem.240:39,1965)。
在成人期发病的I型GD患者的子集中经常观察到帕金森氏综合征(Neudorfer等，QJM 89:691,1996；Sidransky等，Mol.Genet.Metab.84:302,2005；Tayebi等，Mol.Genet.Metab.,2003)。这些患者的神经病理分析揭示出α-突触核蛋白阳性路易体的存在(Wong等，Mol.Genet.Metab.82:192,2004)。还注意到患有GD和帕金森氏综合征的患者通常有患有为GBA1突变杂合体的帕金森氏综合征的亲属(Goker-Alpan等，J.Med.Genet.41:937,2004)。在大患者群(cohorts)中进行的若干其它遗传研究表明，患有帕金森氏综合征的患者具有增加的GBA1突变发生率(Lill等，The PDGene Database,Alzheimer ResearchForum,2008；Sidransky等，N.Engl.J.Med.361:1651,2009)，使得GBA1成为迄今为止最常见的已知的PD遗传风险因子。还已在诊断为DLB的患者中鉴定到GBA1突变(Goker-Alpan等，Neurology 67:908,2006；Neumann等，Brian 132:1783,2009)。此外，已证明GCase多肽功能的抑制剂调整α-突触核蛋白水平(Manning-Bog等，Neurotoxicology 30:1127,2009)。
其中，本发明表明，溶酶体酶GCase的耗竭或GD相关的突变的表达引起α-突触核蛋白的积聚，并导致神经退行性变(参见，例如，实施例1和2)。
另外，本发明表明GlcCer积聚通过稳定可溶性中间体的水平特异性地影响α-突触核蛋白的构象和可溶性(参见，例如，实施例3)。
本发明还表明，GlcCer能够延长纤丝生长的停滞期(lag phase)并稳定酸性pH下的低聚中间体(参见，例如，实施例4)。在所述停滞期后，GlcCer促进淀粉样蛋白形成，并形成看起来似乎是从GlcCer脂质小管(tubules)中伸出的纤丝。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明提出，GlcCer小管提供了用于形成低聚中间体的支架或平台，一旦饱和便进入纤丝的快速聚合。这一能力可为发病机制中的关键步骤，因为α-突触核蛋白低聚体的记载(documentation)好像与神经元培养、小鼠模型和人神经性GD脑中的神经退行性变有关。
因此，本发明表明，GCase多肽功能丧失性突变使人多巴胺神经元中溶酶体蛋白水解减少，因此，暗示GlcCer代谢作为溶酶体活性的主要调节物。
在一些实施方式中，本发明表明，α-突触核蛋白积聚抑制GCase多肽的溶酶体活性，因此建立起α-突触核蛋白和GCase多肽之间的双向正反馈回路(包含自蔓延(self-propagating)疾病机制)。根据本发明，α-突触核蛋白组装的提高和/或形成进一步抑制正常GCase多肽或野生型GCase多肽的溶酶体成熟和活性，这导致额外的GlcCer积聚和增高的α-突触核蛋白低聚体形成(参见例如，实施例7)。因此，本发明教导了，溶酶体GCase的耗竭不仅在GCase多肽中携带突变的患者中发生，而且也在患有散发性(sporadic)PD及其它突触核蛋白病和/或蛋白质病的患者中发生。
在一些实施方式中，本发明教导了，通过增强GCase多肽功能或降低底物水平使得细胞中的GlcCer水平下降将导致脑中α-突触核蛋白水平的减少。这一治疗策略将中断致病反馈回路，并使神经退行性变停止或甚至可能反转。根据本发明，增强GCase多肽的功能在以α-突触核蛋白积聚为特征的所有神经退行性障碍中均提供了治疗益处。
在一些实施方式中，本发明表明，非神经元Hela细胞中GCase多肽的过表达使溶酶体蛋白水解增加约40％(参见例如，实施例8)。
其中，本发明表明，变构剂(allosteric agents)导致GCase多肽活化。本发明教导了用变构活化剂对来自PD患者的多巴胺神经元进行处理增加溶酶体降解的能力(参见例如，实施例8)。
酶上的变构位点为物理上不同于其活性位点的位点。变构位点在细胞环境中结合至分子(例如称为辅酶的酶或其它称为辅因子的非有机物质)以与这些分子形成弱的非共价键，这导致所述酶的构象变化。在构象上的这一变化转化至活性位点，然后影响酶的反应速率。变构相互作用既可抑制酶、也可活化酶。
变构活化剂结合至变构位点，而并不与底物竞争活性位点。
在本发明的一些实施方式中，变构剂增加溶酶体酶的稳定性。在本发明的一些实施方式中，变构剂增加溶酶体酶与底物之间的结合。在本发明的一些实施方式中，变构剂增加溶酶体酶的运输。
本发明还教导了，用GCase多肽的变构活化剂对过表达α-突触核蛋白的PD多巴胺神经元进行处理导致α-突触核蛋白的剂量依赖性降低。另外，本发明表明，用GCase多肽活化剂进行处理增加总野生型GCase和后-ER形式的水平，表明至溶酶体的通量增强(参见例如，实施例10)。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明提出，不干扰GCase酶活性位点的变构活化剂提供了通过增加突变型GCase多肽和/或野生型GCase多肽的水平和溶酶体运输来对蛋白质病神经退行性障碍(例如，与α-突触核蛋白积聚有关)进行治疗的方法。
因此，本发明提供了如下方法：所述方法通过增加GCase多肽的水平和/或活性和/或通过减少GCase多肽底物(例如GlcCer)的水平和/或可用性来对蛋白质病神经退行性障碍(例如，与α-突触核蛋白积聚有关)及以神经元蛋白积聚或非神经元蛋白积聚为特征的其它疾病进行治疗。
2.鞘脂代谢多肽
鞘脂(sphingolipids)代表脂质的一个主要种类，其在真核生物中是膜的普遍组成成分。鞘脂被认为在膜形成中起到主要结构性作用。然而，关于鞘脂代谢和功能的深入研究揭示了，鞘脂家族成员(包括神经酰胺、鞘氨醇(sphingosine)、鞘氨醇-1-磷酸盐/酯和神经酰胺-1-磷酸盐/酯)作为生物活性分子发挥如下作用：从细胞转导通路调节、蛋白分选定向到介导细胞-细胞相互作用和识别。还报道了，鞘脂与甾醇动态聚簇(cluster)以形成脂质微结构域或脂筏，所述脂质微结构域或脂筏起到用于有效信号转导和蛋白分选的枢纽的作用(Bartke等，Journal of Lipid Research S91-6,2009)。
鞘脂合成从L-丝氨酸和棕榈酰(palmitoyl)辅酶A(棕榈酰-CoA)缩合(condensation)成3-酮二氢鞘氨醇(3-ketosphinganine)起始，然后在内质网中其还原成二氢鞘氨醇(sphinganine)。丝氨酸棕榈酰转移酶(serine palmitoyltransferase，SPT)(由两种基因产物(长链碱(long-chain base，LCB)1和LCB2)构成的膜相关异二聚体)为鞘脂合成的限速酶(Hanada,2003)。神经酰胺为用作所有主要鞘脂(即，鞘磷脂(SM)、葡糖神经酰胺以及真核细胞中更复杂的鞘脂)的前体的中心分子，而且鞘脂代谢涉及不同的关键酶(Hannun等，Biochemistry 40:4893,2001；Gault等，Adv Exp Med Biol.688:1,2010)。
已知为鞘糖脂(GSL)的复杂脂质组包括在它们的头基(headgroups)连接的糖残基的顺序和类型上均有差异的数十种不同的鞘脂种类。
神经节苷脂为具有一个或多个唾液酸(例如，n-乙酰神经氨酸，NeuNAc)的复合鞘糖脂(神经酰胺和寡糖)，所述一个或多个唾液酸连接在糖链上。神经节苷脂的结构多样性由糖残基的组成和序列中的变化造成。在所有神经节苷脂中，神经酰胺通过其C-1连接至β-葡糖(glucosyl)残基，所述葡糖残基随之结合至β-半乳糖基残基。GM1(单唾液酸四己糖神经节苷脂)含有一个唾液酸残基(单唾液酸化)并影响神经元可塑性和修复机制，其还参与脑中神经营养素(neurotrophins)的释放。GM2为已被表征的第二种单唾液酸神经节苷脂。
神经节苷脂为细胞膜的重要成分，并与过多的生物功能有关，包括细胞识别和粘附、信号转导、生长调节和分化。虽然它们存在于大多数脊椎动物细胞和组织中，神经节苷脂在神经***中也特别丰富，在神经***中，它们最常表达作为神经细胞和神经胶质细胞的质膜外小叶(outer leaflet)的成分。神经节苷脂代谢异常与多种神经退行性疾病有关。例如，神经节苷脂水平失衡可导致Ca2+信号传递破坏和细胞凋亡，这二者与亨廷顿氏病有关(Desplats等，Neurobiol Dis.27(3):265,2007)。
其中，本发明表明神经节苷脂在体外引起α-突触核蛋白的积聚(参见，例如，实施例12)。
另外，本发明表明神经节苷脂稳定并增加可溶性α-突触核蛋白低聚体的形成。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明提出，神经节苷脂水平的下降提供了通过增强神经节苷脂代谢酶的活性和/或水平来治疗蛋白质病神经退行性障碍(例如，与α-突触核蛋白积聚有关)的策略。
因此，本发明提供了如下方法和组合物：所述方法和组合物通过增加溶酶体鞘脂代谢多肽(例如，β-氨基己糖苷酶A/B/S和β-半乳糖苷酶亚型1多肽)和/或通过减少鞘脂代谢酶底物(包括但不限于神经节苷脂GM1、GM2和GM3)的水平和/或可用性，用于对以神经元蛋白积聚和非神经元蛋白积聚为特征的其它疾病以及某些蛋白质病疾病、障碍和/或病症、特别是神经退行性蛋白质病疾病、障碍和/或病症(例如，与α-突触核蛋白积聚有关)进行治疗和/或预防。
膜运输
本发明表明，在某些蛋白质病中蛋白运输缺陷可能有助于蛋白积聚。膜运输对将蛋白或其它高分子转运至细胞内或细胞外的多个目的地至关重要。膜运输也是细胞在维持细胞内稳态以及在满足信号感知(signal perception)和转导期间的具体要求方面的基本需要。
膜蛋白运输的途径(从内质网(ER)开始)是长的、分支的、并间或甚至是双向的。膜运输***的蓝图(blueprint)在真核生物间是保守的，并包含ER、高尔基体、内体和溶解区室(lytic compartments)(例如，溶酶体)。研究表明，蛋白病理性地大量积聚或具有增强的膜缔合和低聚化作用的蛋白突变体形式可导致神经元死亡(demise)，伴有氧化应激加剧的表现、线粒体变性、脂质代谢缺陷以及受损的膜运输(Chua等，Brain Res Rev.67(1-2):268,2011)。已表明，真核生物的膜运输机器的某些组分(包括例如Rab多肽和可溶性N-乙基马来酰亚胺(ethylmaleimide)敏感因子附着蛋白受体(SNARE))在膜运输损伤中扮演着重要的角色。
GTPase的大Rab家族调节真核生物细胞的细胞内膜***间的脂质和蛋白运输。像其它GTPase一样，Rab多肽进行构象之间的转换，结合至二磷酸鸟苷(guanosinediphosphate，GDP)的失活形式和结合至三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)的活性形式。GDP/GTP交换因子(GEF)催化从GDP结合形式至GTP结合形式的转化，并且GTP水解成GDP由GTPase活化蛋白(GAP)进行催化。在Rab护卫蛋白(Rab escort protein)的帮助下，通过Rab香叶酰香叶基转移酶(geranylgeranyl transferase，RabGGT)经由C末端脂质锚的添加对Rab多肽进行修饰，因此使它们能够进行膜定位和附着。相反地，Rab鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(guanine nucleotide dissociation inhibitors，Rab GDI)从膜中提取出Rab-GDP并将它们保留在胞浆。活化的Rab多肽招募大量效应蛋白来介导囊泡运输/载体运输。在人中存在约70种鉴定出的Rab多肽。
已通过蛋白质组学鉴定出Rab1a多肽与早期和晚期胞吞囊泡均相关(Mukopadhyay等，J Cell Sci 124:765，2011)。存在两种Rab1多肽亚型：Rab1a和Rab1b，所述两种Rab1多肽亚型共享92％的氨基酸序列同源性并被认为在哺乳细胞中是功能冗余的(functionallyredundant)。已确定了Rab1多肽特别是在分泌途径的ER-高尔基体步骤中发挥功能(Duvernay等，Cell Signal 17:1457,2005)。具体而言，Rab1多肽将栓系因子(tetheringfactor)p115招募进顺式-SNARE复合体(cis-SNARE complex)中，借助于复合至GRASP65的顺式-高尔基体栓系蛋白GM130，所述复合体对来自ER的外壳蛋白II(COPII)囊泡出芽进行规划(program)，用于与高尔基体融合。最近，已报道了Rab1a多肽在早期内体-高尔基体运输中的作用，并已将Rab1a多肽描述为胞转小泡(transcytotic vesicles)的组分。已表明Rab1a多肽对于早期内吞囊泡(endocytic vesicles)沿微管的转运非常重要。
本发明表明，在过表达α-突触核蛋白的人PD多巴胺神经元中Rab1a多肽的过表达导致所述神经元中α-突触核蛋白水平的大幅度减少(参见例如，实施例9)。另外，本发明表明，Rab1a多肽通过增加组织蛋白酶B的活性而增强溶酶体功能。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明提出了，膜运输或分泌途径的刺激提供对溶酶体酶运输的活化。本发明还教导了，溶酶体酶运输的刺激导致增加的溶酶体功能，这导致在神经元细胞和非神经元细胞中α-突触核蛋白水平减少。
如本文所说明的，本发明教导了，提高的α-突触核蛋白导致GCase多肽的溶酶体运输破坏、降低的GCase多肽活性，以及由此的受损的溶酶体蛋白水解。根据本发明，GCase多肽活性不仅有助于具有GBA1突变的患者中的毒性，而且影响PD和突触核蛋白病(在GBA1基因中不具有突变)的更常见的散发性形式的发展。
本发明还表明了，健康对照受试者中α-突触核蛋白的变异(variation)还可改变GCase多肽的ER-高尔基体通量(ER-Golgi flux)(可通过α-突触核蛋白低聚化而增效(potentiated)的特性)。这一事实进一步在本发明中通过如下证明：在表达无法聚集的Δ71-82-α-突触核蛋白的神经元中正常的GCase多肽活性以及在对照中对syn303增加的免疫反应性(对照在ER中含有较高水平的GCase多肽)。
因此，本发明提供了通过刺激膜运输或分泌途径使正常GCase多肽的细胞内溶酶体运输增加以对具有野生型GCase多肽的受试者中的蛋白质病神经退行性障碍(例如，与α-突触核蛋白积聚有关)进行治疗的方法。
氧化应激
本发明提供了与导致蛋白质病的氧化应激或硝化应激(nitrative stress)有关的方法。损伤的线粒体功能、氧化应激、蛋白质聚集体的积聚和自噬应激在许多蛋白质病(包括但不限于神经退行性疾病)中是共有的(Lee等，Biochem.J.441:523,2012)。
氧化应激可导致蛋白的非特异性翻译后修饰，并有助于蛋白聚集。因为脑使用了20％的吸入氧和90％的耗氧量在氧化磷酸化期间产能，因此神经元细胞对氧化应激特别敏感也不足为奇了。在氧化磷酸化期间，脑中的神经元由于其高代谢活性、低抗氧化能力和非复制性质，因此很容易受到氧化伤害。脑中高丰度的线粒体为活性氧种类(ROS)/活性氮种类(RNS)生成和作用的主要位点。ROS和RNS的具体形式包括过氧化氢(H2O2)、超氧化物(O2 ·-)、一氧化氮(NO)、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite)(ONOO-)和活性脂质种类(RLS)。脂质过氧化是神经退行性疾病的一致特征，并且，在患有帕金森氏病或阿尔兹海默氏病的个体的脑中有生物活性RLS(例如HNE(4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal)))积聚。蛋白修饰的其它机制为NO依赖的。例如，NO与O2 ·-反应并生成ONOO-，这能够进一步起始蛋白氧化和硝化。二氧化氮自由基(由NO与氧的反应或从ONOO-分解而生物形成的)与酪氨酸残基反应，引起3-硝基酪氨酸形成。还在神经退行性疾病中报道了向蛋白上的硫醇基添加NO(S-亚硝化(也被称为S-亚硝基化(nitrosylation))。这一加合物已在广泛的病理学(包括帕金森氏病)中检测到，其与硝化α-突触核蛋白和S-亚硝基化parkin都相关。同样地，蛋白的ONOO-依赖性修饰在患有阿尔兹海默氏病的个体的脑中普遍存在。研究表明，在患有各种突触核蛋白病的患者脑中的路易体和神经突中存在氧化α-突触核蛋白(Giasson等，J.NeurosciRes.59(4):528,2000)。氧化应激与线粒体机能障碍紧密联系，因为线粒体是活性种类的产生器和靶标。线粒体机能障碍(导致氧化物增加)与PD发病有关联(Banerjee等，Biochem.Biophys.Acta 1792:651,2009)。线粒体周转(turnover)依赖于自噬，其随着年龄衰退并在神经退行性疾病中常常是机能障碍的。因此，在神经退行性疾病中存在自噬、氧化还原信号传递和线粒体机能障碍之间的通讯(crosstalk)。
本发明表明，氧化应激可有助于某些蛋白质病中蛋白聚集的存在、性质和/或程度。例如，其中，本发明通过尺寸排阻色谱(SEC)分析表明，死后的(postmortem)GD和PD脑样品具有提升水平的先前未公开(undocumented)的大小的低聚α-突触核蛋白种类，该α-突触核蛋白种类的存在和/或水平与神经学表型有关联(参见例如实施例5和6)。
另外，本发明表明可溶性α-突触核蛋白低聚体与单克隆抗体(mAb)syn303(针对氧化/硝化的α-突触核蛋白生成的抗体，所述抗体优先检测表现出毒性的蛋白的病理性构象)发生显著的反应(参见例如，实施例6)。(Tsika等，J.Neurosci.30:3409,2010)。
本发明还表明，还在婴儿神经元病GD病例和患有III型GD的儿童中检测到了病理性α-突触核蛋白低聚体(参见例如，实施例6)，这有力地说明了在GlcCer代谢途径中的特定改变和GBA1突变影响α-突触核蛋白低聚化(这不一定是年龄依赖的)。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明提出，在来自不具有帕金森氏综合症的I型GD的样品中低聚α-突触核蛋白的缺失表明除GCase多肽缺乏外，其它因素可能有助于神经元病GD中α-突触核蛋白的低聚化。例如，已证明α-突触核蛋白的氧化和硝化在体外阻碍清除(clearance)并稳定α-突触核蛋白低聚体(Hodara等，J.Biol.Chem.279:47746,2004)，并且，已证明分子伴侣消除了α-突触核蛋白的毒性和聚集(Auluck等，Science 295:865,2002)。
在一些实施方式中，本发明表明，仅在患有GD的患者的脑中存在氧化α-突触核蛋白低聚体的水平增加，所述患者还表现出疾病的神经元病形式或帕金森氏综合征。
本发明表明，相比于仅利用以下各试剂之一的治疗，用GCase多肽的分子伴侣异法戈明(IFG)和抗氧化剂(n-乙酰基-半胱氨酸(NAC))联合进行治疗的PD神经元中后内质网(ER)GCase多肽或成熟GCase多肽的量呈现3倍增加。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明提出了，使用用于增加GCase多肽成熟的抗氧化剂来对PD进行治疗。本发明还表明，除抗氧化剂外，进一步联合稳定和活化GCase多肽的小分子导致对由α-突触核蛋白积聚起源的致病反馈回路(pathogenic feedback loop)的有效破坏。
因此，本发明提供了通过使用联合疗法增加GCase多肽的水平和/或活性来对蛋白质病神经退行性障碍(例如，与α-突触核蛋白积聚相关)进行治疗的方法。根据本发明，靶向导致蛋白质病的两种以上关键途径的联合疗法相比于单独靶向各个途径的治疗而言提供了更高的益处。在一些实施方式中，本发明教导了靶向导致蛋白质病的两种关键途径的疗法。在一些实施方式中，本发明教导了靶向导致蛋白质病的3种关键途径的疗法。不希望受任何理论束缚，本发明提出了在治疗蛋白质病中靶向以下3中关键途径中的一种或多种的疗法：溶酶体酶活化(水平或功能增加)、膜运输途径的增强、和/或抗氧化功能。在本发明的一些实施方式中，所述溶酶体酶为GCase。
钙离子介导的信号传递
Ca2+离子为细胞中普遍且重要的信号传递离子。Ca2+信号传递通过各种途径影响多种细胞功能，而且是ER功能的主要调节者(Berridge等，Nat Rev Mol Cell Biol.4:517,2003；Gorlach等，Antioxid Redox Signal 8:1391,2006)。Ca2+通道的活化允许细胞外Ca2+进入胞浆，其接着进一步通过活化RyR和/或ER膜内的Ca2+离子通道使Ca2+离子从细胞内的Ca2+存储器(例如ER)中释放。抑制这一钙诱导的钙释放途径使ER Ca2+存储的耗竭最小化，这是一种可能通过使缓解细胞应激的信号转导通路(例如，HSR、UPR)活化来好像上调胞浆和ER分子伴侣的子集表达的过程。因此，阻断Ca2+通道活性可能通过适度上调分子伴侣的子集(包括Bip 和Hsp40)来增强ER对有错误折叠倾向蛋白进行折叠的能力。
ER Ca2+水平可通过过表达SERCA2b Ca2+流入泵(influx pump)或通过抑制RyR ERCa2+流出通道进行提升。这继而可提高分子伴侣功能并增强突变的、错误折叠的和易于降解的溶酶体酶的折叠、运输和功能。例如，由提升的ER钙浓度进行的钙联蛋白折叠途径的翻译后调节可增强这一分子伴侣***对突变的倾向于错误折叠的酶进行折叠的能力，增加折叠的突变溶酶体酶群体(其可以ER相关的降解为代价来利用运输受体)，增加溶酶体酶的浓度和活性。
已知钙联蛋白(和钙网蛋白)通过对Glc1Man9GlcNAc2具有特异性的凝集素位点和/或通过识别折叠中间体中暴露的疏水表面的多肽结合位点结合至糖蛋白。生化和X射线结晶研究在钙联蛋白的N末端β-三明治上鉴定出单个ER腔低亲和Ca2+结合位点(Kd～0.15±0.05mM)，其可能发挥结构作用。这一Ca2+结合位点的占用增强钙联蛋白与N-连接的糖蛋白的寡糖亚结构的结合，并增强了其阻抑非糖基化荧火虫荧光素酶聚集的能力，这使得ERCa2+增加为什么似乎增加了钙联蛋白和部分折叠的溶酶体酶突变体之间相互作用的亲和力或特异性合理化。在钙联蛋白的C末端结构域中存在另一个假定的中等亲和Ca2+结合位点，但是它的胞质定位表明，它不可能影响钙联蛋白-溶酶体酶相互作用。钙网蛋白的功能似乎是受类似地调节，因为在其ER腔N末端结构域上存在假定Ca2+结合位点(Schrag等，Mol.Cell8:633,2001；Brockmeier等，Biochemistry45:12906,2006；Corbett等，J Biol.Chem.275:27177,2000)。
文献报道了，使用小分子对细胞内钙稳态进行的操作(用于治疗功能丧失性疾病、障碍和/或病症(例如溶酶体贮积病))(Tong Ong等，Nat Chem Biol.6:424,2010；Mu等，PLoS Biology 6(2):e26,2008)使与不同溶酶体贮积病相关的多个细胞系在内源性突变溶酶体酶的折叠、运输和功能方面显示出增强。这些小分子以翻译后的形式调节钙联蛋白的功能，并且不像未折叠蛋白应答活化剂，这一类蛋白质内稳态调节物并不诱导应激应答基因转录。因此，所述小分子通过改变钙稳态来修复(而不是替换)破坏的酶，从而恢复功能。
本发明提供了如下见地：钙通道阻断剂可提供对某些蛋白质病的有效治疗和/或预防。不希望受任何特定理论的束缚，本发明认识到，钙通道阻断剂可能对增加一种或多种溶酶体酶的水平和/或活性、特别是GCase的水平和/或活性有用。与文献形成对比，本发明特别教导了，钙通道阻断剂提供了功能获得性蛋白质病的有效治疗和/或预防。此外，本发明提供了如下具体见地：钙通道阻断剂提供了用于蛋白质病神经退行性疾病、障碍或病症的有效治疗和/或预防，特别包括与α-突触核蛋白积聚或聚集相关的蛋白质病神经退行性疾病、障碍或病症。
saposin多肽
saposin A多肽、saposin B多肽、saposin C多肽和saposin D多肽为来源于共同前体蛋白(prosaposin)的小型热稳定糖蛋白。这些成熟的saposin多肽以及prosaposin多肽活化涉及多种鞘脂的代谢的几种溶酶体水解酶(Morimoto等，PNAS 87(9):3493,1990；Kishimoto等，The Journal Lipid Research 33:1255,1992)。
所有四种saposin多肽在结构上彼此类似，包括在相同位置中六个半胱氨酸、糖基化位点和保守脯氨酸的放置。虽然结构相似，在各个saposin多肽中对鞘脂水解酶的活化特异性和模式并不相同。saposin多肽好像是溶酶体蛋白，发挥它们在溶酶体水解酶上的作用。
Prosaposin为含有串联放置的4个结构域(每个saposin一个)的70kDa糖蛋白。Prosaposin明显在溶酶体内被蛋白水解(proteolytically)加工成saposin A、saposin B、saposin C和saposin D。然而，Prosaposin还作为整合膜蛋白存在而未被运往溶酶体入口，并在许多生物流体(例如，***(seminal plasma)、人乳和脑脊液(cerebrospinal fluid))中以未切割形式存在，在此处，它看起来具有不同的功能。
saposin的生理学意义通过如下来强调：它们在溶酶体贮积病患者的组织中的积聚和由于prosaposin基因中的突变而来的鞘脂沉积病的发生。
本发明提供了如下见地：saposin多肽可提供对某些蛋白质病的有效治疗和/或预防。不希望受任何特定理论的束缚，本发明认识到，saposin多肽可能对增加一种或多种溶酶体酶、特别是GCase的活性有用。此外，本发明提供了特别的见地：saposin多肽提供了对蛋白质病神经退行性疾病、障碍或病症(特别包括与α-突触核蛋白积聚或聚集相关的疾病、障碍或病症)的有效治疗和/或预防。
溶酶体活化剂
如本文所述，本发明提供了用于通过活化溶酶体活性对蛋白质病进行治疗的方法和试剂(reagent)。在一些此类实施方式中，活化通过给予一种或多种溶酶体活化剂实现。在一些实施方式中，此类溶酶体活化剂增加一种或多种溶酶体组分(例如，其溶酶体酶或活化剂)的水平和/或活性。在一些实施方式中，此类溶酶体活化剂减少一种或多种溶酶体组分(例如，溶酶体酶的抑制剂或底物)的水平和/或活性。
底物抑制疗法(也被成为底物减少或剥夺(deprivation)疗法)可用作治疗某些蛋白质病疾病的替代疗法。这一策略寻求通过对所述酶进行抑制以减轻底物的积聚，所述酶催化该疾病诱导底物的合成。在一些实施方式中，本发明提供了溶酶体活化剂，所述溶酶体活化剂阻滞(arrest)质病的底物的积聚并使得这些底物的总体水平降低。在一些此类实施方式中，溶酶体活化剂减少鞘糖脂生物合成途径。例如，GlcCer合成为鞘糖脂生物合成途径中的第一步，通过减少GlcCer底物合成，可对与各种蛋白质病疾病、障碍和/或病症有关的更复杂的鞘糖脂的水平产生影响。
本领域普通技术人员阅读了本公开将立即能够了解到，根据本发明的各种化学实体和试剂的任何一种作为溶酶体活化剂均有用。仅为了给出几个实例，在一些实施方式中，溶酶体活化剂为小分子试剂或包含小分子试剂。在一些实施方式中，溶酶体活化剂为多肽试剂或包含多肽试剂(例如，酶多肽，调节性多肽、抗体等)。在一些实施方式中，溶酶体活化剂为核酸试剂或包含核酸试剂。在一些实施方式中，溶酶体活化剂为碳水化合物试剂或包含碳水化合物试剂。在一些实施方式中，溶酶体活化剂为脂质试剂或包含脂质试剂。
在一些实施方式中，根据本发明使用的溶酶体活化剂为作为药理学分子伴侣的溶酶体活化剂，例如，帮助错误折叠酶正确折叠和/或将其从内质网运输至溶酶体。在一些实施方式中，溶酶体活化剂与溶酶体酶直接进行相互作用。
在一些实施方式中，溶酶体活化剂通过这些溶酶体酶的活性位点或底物结合位点与溶酶体酶直接进行相互作用。在一些实施方式中，溶酶体活化剂却通过这些溶酶体酶的活性位点或底物结合位点以外的位点与溶酶体酶直接进行相互作用。在一些实施方式中，溶酶体活化剂并不与溶酶体酶直接进行相互作用。在一些实施方式中，不与溶酶体酶直接进行相互作用的溶酶体活化剂调整蛋白的蛋白质内稳态。在一些实施方式中，不与溶酶体酶直接进行相互作用的溶酶体活化剂调整钙稳态。在一些实施方式中，不与溶酶体酶直接进行相互作用的溶酶体活化剂调整ER的生物折叠能力。在一些实施方式中，溶酶体活化剂为钙阻断剂。在一些实施方式中，溶酶体活化剂，特别是与溶酶体酶直接进行相互作用的溶酶体活化剂，抑制所述酶的活性。在一些实施方式中，溶酶体活化剂，特别是与溶酶体酶直接进行相互作用的溶酶体活化剂，不抑制所述酶的活性。在一些实施方式中，溶酶体活化剂为溶酶体酶的变构活化剂(allosteric activators)。
在一些实施方式中，根据本发明使用的溶酶体活化剂增加野生型溶酶体酶的水平和/或活性。可替代地或额外地，在一些实施方式中，根据本发明使用的溶酶体活化剂增加突变溶酶体酶的水平和/或活性。在一些实施方式中，根据本发明使用的特定的溶酶体活化剂增加野生型靶溶酶体酶和一种或多种该靶溶酶体酶的突变体二者的水平和/或活性。
可替代地或额外地，在一些实施方式中，溶酶体活化剂包含用于除了GCase外的溶酶体酶的药理学分子伴侣。例如，表11中列出了用于某些溶酶体酶的可能的分子伴侣。
在一些实施方式中，将分子伴侣给予在给予的分子伴侣所针对的任意溶酶体酶中均不具有任何突变的个体。在一些实施方式中，所述个体在给予的分子伴侣所针对的任意溶酶体酶中具有突变。
在一些实施方式中，在特定疾病、障碍和/或病症的治疗中使用的溶酶体活化剂为之前并非用于此类疾病、障碍和/或病症的试剂。
表11：溶酶体酶和相应的药理学分子伴侣。(由SEQ ID NO表示的溶酶体酶的示例性氨基酸序列示于序列表中)
1.小分子试剂
在一些实施方式中，溶酶体活化剂是小分子。在一些实施方式中，与该试剂不存在时观察到的结果相比，小分子溶酶体活化剂提高溶酶体酶的水平和/或活性(包括通过提高运输)。在一些实施方式中，与该试剂不存在时观察到的结果相比，小分子溶酶体活化剂降低溶酶体酶抑制剂的水平和/或活性(包括通过减少或另外妨碍运输)。凡是活化酶或活化正调节因子或抑制负调节因子(包括底物，例如，抑制催化底物合成的酶的试剂)。
在一些实施方式中，小分子溶酶体活化剂是糖类、或者包含糖类，例如，亚氨基糖(iminosugar)(例如，异法戈明、N-丁基-脱氧野尻霉素、N-壬基-脱氧野尻霉素、环己烯四醇-β-环氧化物(conduritol-β-epoxide))。
在一些这样的实施方式中，基于亚氨基糖的溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Ashe等，PLoS ONE 6(6)：e21758，2011中所示出的化合物AMP-DMP或Genz-529468或它们的类似物。
在一些实施方式中，小分子溶酶体活化剂是或者包含1-苯基-2-癸酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇(PDMP)。在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在McEachern等，Mol.Genetics and Metabolism，91：259，2007中所示出的化合物N-((1R,2R)-1-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)-1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-2-基)辛酰胺(Genz-112638)或其类似物。在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Larsen等，J.Lipid Res.，53：282，2012中所示出的化合物2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-2-基)乙酰胺(CCG-203586)或其类似物。
在一些实施方式中，小分子溶酶体活化剂是非亚氨基糖化合物、或者包含非亚氨基糖化合物。在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Richards等，J.Med.Chem.，55：4322，2012中所示出的化合物EXEL-0346或其类似物。
在一些实施方式中，小分子溶酶体活化剂是非亚氨基糖化合物、或者包含非亚氨基糖化合物。在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Marugan等，Med.Chem Commun.，3：56，2011中所示出的化合物ML156或其类似物。
在一些实施方式中，小分子溶酶体活化剂是非亚氨基糖化合物、或者包含非亚氨基糖化合物。在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Goldin等，PLoS ONE，7(1)：e29861，2012中所示出的化合物MLS000674724、NCGC00182292、NCGC00159568、NCGC00182186、NCGC00182510或它们的类似物。
在一些实施方式中，小分子溶酶体活化剂是非亚氨基糖化合物、或者包含非亚氨基糖化合物。在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Zheng等，PNAS104：32，2007中所示出的化合物N-(4-甲基-2-吗啉代喹啉-6-基)环己甲酰胺、N-(5-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)-4-(苯磺酰氨基)苯甲酰胺和2-(4-(5-氯-2-甲氧苯基氨基)-6-(吡咯烷-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基氨基)乙醇，或它们的类似物。
在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Huang等，Biorg.Med.Chem.Lett.，17，2007中所示出的N2-(2-羟基)乙基-6-(吡咯烷-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的N4-苯基修饰的化合物，或其类似物。
在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Tropak等，ChemBioChem，9(16)：2650，2008中所示出的化合物5-((4-甲基苯基)硫基)喹唑啉-2,4-二胺和5-(3,5-二氯苯氧基)-N-(4-吡啶基)-2-呋喃甲酰胺(furamide)，或其类似物；和/或例如在Marugan等，J Med.Chem.，54(4)：1033，2011中所示出的具有喹唑啉核心的化合物。
在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Tropak等，ChemBioChem，9(16)：2650，2008中所示出的化合物5-((4-甲基苯基)硫基)喹唑啉-2,4-二胺和5-(3,5-二氯苯氧基)-N-(4-吡啶基)-2-呋喃甲酰胺，或其类似物。
在一些这样的实施方式中，溶酶体活化剂是或者包含例如，如在WO2012/061597中所示出的式I或II的化合物，或其类似物。
在一些具体实施方式中，小分子溶酶体活化剂是或者包含例如，如在Patnaik等，JMed.Chem.，2012和/或Marugan等，WO2012/078855中所示出的取代的吡唑并嘧啶，通过引用将其整体并入本文。
在一些实施方式中，这样的小分子溶酶体活化剂具有式(I)的结构：
其中，环是式或者式的环***，
在(i)中，R5是任选取代的乙烯基团，R6和R7采用下文的定义；
在(ii)中，R5、R6和R7采用下文的定义；
R1是(单环碳环或双环碳环)C0-C4烷基或(单环杂环或双环杂环)C0-C4烷基，其各自是未取代的或取代有一个或多个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、-CHO、-COOH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烷酰基(alkanoyl)、单(C1-C6)烷基氨基或二(C1-C6)烷基氨基、单(C1-C6)烷基甲酰胺或二(C1-C6)烷基甲酰胺、C1-C6烷基酯、C1-C6烷硫基(alkylthio)、C1-C6烷基磺酰基、C1-C2卤代烷基和C1-C2卤代烷氧基；以及取代有0或1个取代基，所述取代基选自于Y-Z-，其中Z为共价键、C1-C4亚烷基、-S-、-O-、-NR-、-C(O)-、-NHC(O)-、或-C(O)NH-，其中R是氢或C1-C4烷基，Y是苯基或吡啶基，其各自为未取代的或取代有1至3个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、三氟甲基、二氟甲基和三氟甲氧基；以及R2是氢、C1-C6烷基、C3-C7环烷基、(苯基)C0-C2烷基；或者
R1和R2连接形成具有0或1个选自于N、O和S的额外杂原子的5元至7元杂环烷基环，其中，所述5元至7元杂环烷基环任选地与苯基或吡啶基稠合；所述5元至7元杂环烷基环是未取代的或取代有一个或多个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、C1-C2烷基和C1-C2烷氧基；R3是氢或C1-C2烷基；R5是卤素、羟基、氨基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、二氟甲基、三氟甲基或苯基；R6是氢、卤素、羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；以及R7是卤素、羟基、氨基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、二氟甲基、或三氟甲基、或苯基。在某些实施方式中，当R6为氢，R5和R7均为甲基，或者当R6为氢，R5和R7中一个是甲基、另一个是苯基，R1不是未取代的苯基、二氢茚基、苯并[b][1,4]间二氧杂环戊烯基(dioxolyl)、苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯基-5-基、环己基、吡啶基、或取代有1或2个取代基的苯基，所述取代基独立地选自于氯、氟、C1-C4烷基、C1-C2烷氧基、乙酰基、三氟甲基；以及当R6为氢，R5和R7中一个是甲基、另一个是苯基，R1不为1-(4-氟苄基)-1H-吡唑-4-基。
在一些实施方式中，用于本发明的小分子溶酶体活化剂具有式II或式III的结构(式II或式III是式I的子式(subformulae))，并且还公开了其中的变量例如，R1-R7具有以下定义的化合物。
在式III中，R5a是氢、C1-C4烷基、C3-C7环烷基、或具有1或2个独立地选自于N、S和O的杂原子的4元至7元碳连接杂环烷基。
在式III的某些实施方式中，R5a是氢或环丙基。
在式I和式II的某些实施方式中：R2是氢或甲基；R5是C1-C4烷基、二氟甲基或苯基；R7是C1-C4烷基、二氟甲基或苯基；并且R5和R7不同时为苯基。
在式I和式II的某些实施方式中：R5和R7均为甲基；或R5和R7之一是甲基、另一个是苯基；或R5和R7之一是甲基、另一个是二氟甲基。
在式I、式II和式III的某些实施方式中：R1是(苯基)C0-C4烷基、(吡啶基)C0-C4烷基、(嘧啶基)C0-C4烷基、(C3-C7环烷基)C0-C4烷基、(吡唑基)C0-C2烷基、(吡咯基)C0-C2烷基、(咪唑基)C0-C2烷基、(噻吩基)C0-C2烷基、(呋喃基)C0-C2烷基、(噁唑基)C0-C2烷基、(噻唑基)C0-C2烷基、吡咯烷基、萘基、喹啉基、异喹啉基、四氢萘基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、四氢呋喃基、哌嗪基、吗啉基、哌啶基、硫代吗啉基、二氢茚基、苯并[b][1,4]dioxinyl或苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯基，其各自是未取代的或取代有一个或多个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、-CHO、-COOH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烷酰基、单(C1-C6)烷基氨基或二(C1-C6)烷基氨基、单(C1-C6)烷基甲酰胺或二(C1-C6)烷基甲酰胺、C1-C6烷基酯、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基磺酰基、C1-C2卤代烷基和C1-C2卤代烷氧基；以及取代有0或1个取代基，所述取代基选自于Y-Z-，其中Z是共价键、C1-C4亚烷基、-S-、-O-、-NR-、-C(O)-、-NHC(O)-、或-C(O)NH-，其中R是氢或C1-C4烷基，Y是苯基或吡啶基，其各自是未取代的或取代有1至3个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基。
在式I、式II和式III的一些实施方式中：R1和R2连接形成具有0个或额外的选自于N、O和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其中，所述5元至7元杂环烷基环任选地与苯基或吡啶基稠合；所述5元至7元杂环烷基环是未取代的或取代有一个或多个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、C1-C2烷基和C1-C2烷氧基。
在式I、式II和式III的一些实施方式中：R1是取代有至少一个取代基的(苯基)C0-C2烷基，所述取代基选自于氰基、三氟甲基、CH3C(O)NH-；或R1是取代有至少一个三氟甲基的环己基、C3-C6烷基；或R1是二氢茚基、喹啉基或异喹啉基；其中各R1可取代有一个或多个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、-CHO、-COOH、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C2-C4烷酰基、单(C1-C4)烷基氨基或二(C1-C4)烷基氨基、C1-C2卤代烷基和C1-C2卤代烷氧基。
在式I、式II和式III的一些实施方式中：R2是氢或甲基；并且R7是C1-C4烷基、二氟甲基或苯基。在一些实施方式中，R7是二氟甲基。
在式I、式II和式III的一些实施方式中：R2是氢或甲基；R7是甲基或二氟甲基；R1是(苯基)C0-C2烷基、(吡啶基)C0-C2烷基、(环己基)C0-C2烷基、吡唑基、呋喃基萘基、喹啉基、异喹啉基、四氢萘基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、四氢呋喃基、吗啉基、哌啶基、哌嗪基、硫代吗啉基、二氢茚基、苯并[b][1,4]dioxinyl、或苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯基，其各自是未取代的或取代有一个或多个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、-CHO、-COOH、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C2-C4烷酰基、单(C1-C4)烷基氨基或二(C1-C4)烷基氨基、单(C1-C4)烷基甲酰胺或二(C1-C4)烷基甲酰胺、C1-C4烷基酯、C1-C2烷基磺酰基、三氟甲基、三氟甲氧基和二氟甲基；以及取代有0或1个取代基，所述取代基选自于Y-Z-，其中Z是共价键、C1-C4亚烷基、-S-、-O-、-NR-、-C(O)-、-NHC(O)-、或-C(O)NH-，其中R是氢或C1-C4烷基，Y是苯基或吡啶基，其各自是未取代的或取代有1至3个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、C1-C2烷基和C1-C2烷氧基。
式I的化合物具有以下互变异构式：
在一些实施方式中，式I、式II和/或式III的化合物可以以每日每公斤体重约0.1mg至约140mg范围内的剂量使用(每日每受试者约0.5mg至约7g)。可与载体材料联合以生成单一剂型(dosage form)的化合物的量将根据所治疗的患者及特定的给予方式而变化。通常，单位剂型(dosage unit forms)将含有约1mg至约500mg的各活性化合物。在某些实施方式中，每日向患者提供25mg至500mg、或25mg至200mg式I的小分子溶酶体活化剂。剂量的频率也可根据所使用的小分子溶酶体活化剂和所治疗的特定疾病而变化。然而，为了治疗大多数疾病、障碍和/或病症，可以使用每日4次以下的给药方案，在某些实施方式中，使用每日1次或2次的给药方案。在一些实施方式中，取代的吡唑并嘧啶化合物以剂量范围为10ng/kg体重至约100mg/kg体重、给予频率为每日1次至每月1次来使用。
小分子溶酶体活化剂可以含有如一个或多个不对称元件(asymmetricelements)，例如立体异构中心(stereogenic centers)、立体异构轴(stereogenic axes)等，例如不对称碳原子，使得化合物可以以不同立体异构形式存在。这样的化合物可以以外消旋体或光学活性形式使用。在一些实施方式中，这样的化合物可以以立体异构上纯的形式使用。本领域技术人员将会理解的是，光学活性形式可以通过不对称合成、由光学纯的前体合成或通过外消旋体的拆分而获得。还可以例如，通过常规方法完成外消旋体的拆分，所述方法如在拆分剂的存在下结晶、或使用例如手性HPLC柱的色谱法。对于具有两个或多个不对称元件的化合物，化合物可以以非对映异构体混合物的形式使用。
本领域技术人员将会理解的是，小分子化合物通常可以制备为多种不同的形式(例如溶剂化物、光学异构体、对映体形式、多晶型物(polymorph)、游离化合物和盐)。根据本发明可以使用任何适当的形式。
本领域普通技术人员将进一步了解的是，可以以盐形式提供小分子溶酶体活化剂。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，碱性残基(如胺)的矿物盐或有机酸盐；酸性残基(如羧酸)的碱金属盐或有机盐等。在一些实施方式中，药学上可接受的盐包括常规的无毒盐，并具体包括例如，由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的季铵盐。例如，常规的无毒酸盐包括由从无机酸衍生的盐和由有机酸制备得到的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸等；所述有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇(glycolic)酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、帕莫(pamoic)酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、乙磺(esylic)酸、苯磺(besylic)酸、对氨基苯磺(sulfanilic)酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺(isethionic)酸、HOOC-(CH2)n-COOH(其中n是0-4)等。例如，在Remington'sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第1418页(1985年)中可以找到额外的合适的盐的列表。
在一些实施方式中，小分子溶酶体活化剂是钙通道阻断剂、或者包含钙通道阻断剂，例如地尔硫和/或维拉帕米，或其类似物。
在一些实施方式中，小分子溶酶体活化剂是RyR的抑制剂、或者包含RyR的抑制剂，例如丹曲林(dantrolene)。
在一些实施方式中，小分子溶酶体活化剂是抗氧化剂、或者包含抗氧化剂，例如N-乙酰基-半胱氨酸。
在一些实施方式中，根据本发明，活化溶酶体GCase酶的小分子作为溶酶体活化剂特别有效。在一些这样的实施方式中，小分子溶酶体活化剂结合至变构位点并活化溶酶体GCase酶。
2.多肽试剂
在一些实施方式中，根据本发明使用的溶酶体活化剂为多肽、或者包含多肽。在一些此类实施方式中，溶酶体活化剂为抗体或其片段、或者包含抗体或其片段。在一些此类实施方式中，溶酶体活化剂为酶(例如，溶酶体酶)。在一些此类实施方式中，溶酶体活化剂为调节一种或多种溶酶体酶的水平和/或活性的多肽(包括通过影响此类溶酶体酶的运输)。
在一些实施方式中，溶酶体活化剂为溶酶体酶多肽或包含溶酶体酶多肽，和/或为编码溶酶体酶的核酸或包含编码溶酶体酶的核酸。在一些实施方式中，溶酶体活化剂为如下多肽或包含该多肽：该多肽是其活性使溶酶体酶的底物水平降低的酶，和/或溶酶体活化剂为编码其活性使溶酶体酶的底物水平降低的酶的核酸或包含该核酸；在一些此类实施方式中，所述溶酶体活化剂为溶酶体酶多肽、或包含溶酶体酶多肽，和/或为编码溶酶体酶的核酸或包含编码溶酶体酶的核酸。本领域技术人员将了解到，在一些实施方式中，向受试者供应作为酶的溶酶体活化剂可被称为“酶替代疗法”，相比在正常个体的群体中观测到的相关酶的平均水平，所述受试者缺乏所述酶或显示出所述酶减少的活性水平。本领域技术人员将了解到，如下所述的多肽溶酶体活化剂(所述多肽溶酶体活化剂为多肽、或包含多肽)的供应可被称为“基因疗法”：通过给予编码所述多肽的核酸，以使得在此类给予后所述多肽的水平增加。
在一些实施方式中，多肽溶酶体活化剂是Rab多肽、或者包含Rab多肽。Rab多肽构成Ras GTPase超家族最大的分支(Grosshans等,PNAS103(32):11821,2006)。如上文所解释的，Rab多肽使用鸟嘌呤核苷酸-依赖的开关机制调节膜运输中四个主要步骤的每一步(即，囊泡出芽、囊泡递送、囊泡栓系、以及囊泡膜与靶区室膜的融合)。Rab多肽这些不同的活性由效应分子的不同集合进行调节，所述效应分子在它们的GTP结合状态下结合至特异的Rab。已知Rab效应物的一些非限制性实例列于表12和表13中。
表12：酵母Rab多肽GTPase效应物。
表13：哺乳动物Rab多肽GTPase效应物。
在一些具体实施方式中，多肽溶酶体活化剂包含鸟嘌呤核苷酸交换因子。鸟嘌呤核苷酸交换因子的一些非限制性实例为GEF和/或GAP。
Rab多肽还经受膜***和提取周期(extraction cycle)，其与核苷酸循环部分结合。膜***要求用异戊二烯脂质(香叶酰香叶基)部分对两个羧基末端半胱氨酸进行不可逆修饰。称作GDP解离抑制剂(GDI)的蛋白结合至GDP结合形式下的异戊二烯化Rab多肽，掩盖(masking)它们的异戊二烯锚，进而维持胞浆中的Rab多肽。因此，Rab多肽的膜附着需要GDI移位因子(GDF)的功能。一旦从GDI中分离，Rab多肽可用于GEF刺激的GTP结合。有活性的膜结合Rab多肽然后通过结合至它们特异的效应物，能够实现它们在膜运输中的各种功能。在由它们特异的GAP活化后，通过GDI可将GDP结合的Rab多肽从膜中提取出来，然后再循环回胞浆。
在一些具体的实施方式中，多肽溶酶体活化剂包含GDI和/或GDF。
在一些实施方式中，多肽溶酶体活化剂包含Rab多肽的效应物。
在一些具体的实施方式中，多肽溶酶体活化剂为Rab1a多肽、或包含Rab1a多肽。
在一些具体的实施方式中，多肽溶酶体活化剂活化参与多种鞘脂代谢的溶酶体水解酶。在一些此类实施方式中，所述溶酶体活化剂为saposin多肽、或包含saposin多肽。在一些此类实施方式中，所述saposin多肽为saposin C多肽、或包含saposin C多肽。
3.核酸试剂
在一些实施方式中，根据本发明使用的溶酶体活化剂为核酸、或包含核酸。在一些此类实施方式中，溶酶体活化剂为RNA和/或DNA、或包含RNA和/或DNA。在一些此类实施方式中，溶酶体活化剂为RNAi试剂(例如，miRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、核酶(ribozymes))和/或基因疗法载体、或包含RNAi试剂和/或基因疗法载体。
RNA干扰或RNAi指通过至少部分双链的RNA(包含基本上与靶RNA互补的部分)介导的基因表达的序列特异性抑制和/或靶RNA水平减少。典型地，基本上互补的部分的至少一部分在所述RNA的双链区域内。在一些实施方式中，RNAi可经由RNA的选择性细胞内降解而发生。在一些实施方式中，RNAi可通过翻译阻遏而发生。
RNAi试剂为RNA，任选包含一种或多种核酸类似物或修饰，该RNA具有以能够通过RNAi机制介导基因表达抑制的分子为特征的结构。在一些实施方式中，RNAi试剂通过引起靶转录本的降解来介导对基因表达的抑制。在一些实施方式中，RNAi试剂通过抑制靶转录本的翻译来介导对基因表达的抑制。一般而言，RNAi试剂包含基本上与靶RNA互补的部分。在一些实施方式中，RNAi试剂为至少部分双链的。在一些实施方式中，RNAi试剂为单链的。在一些实施方式中，示例性RNAi试剂可包括siRNA、shRNA和/或miRNA。在一些实施方式中，RNAi试剂可完全由天然RNA核苷酸(即，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶)组成。在一些实施方式中，RNAi试剂可包含一种或多种非天然RNA核苷酸(例如，核苷酸类似物、DNA核苷酸等)。纳入非天然RNA核酸残基可用于使RNAi试剂比RNA更耐细胞降解。在一些实施方式中，术语“RNAi试剂”可指诱导RNAi效应(例如，靶RNA的降解和/或抑制翻译)的任何RNA、RNA衍生物、和/或编码RNA的核酸。在一些实施方式中，RNAi试剂可包括平末端(即，没有悬突(overhangs))dsRNA，所述平末端dsRNA可作为Dicer底物。例如，此类RNAi试剂可包括长度≥25碱基对的平末端dsRNA，可任选对其进行化学修饰以消除免疫应答。
术语microRNA或miRNA指长约21-23个核苷酸(nt)的RNAi试剂。miRNA的长度可为18-26个核苷酸。典型地，miRNA为单链。然而，在一些实施方式中，miRNA可为至少部分双链的。在某些实施方式中，miRNA可包含RNA双链体(duplex)(在本文中被称为“双链体区域”)，并可任选进一步包含一个或两个单链悬突。在一些实施方式中，RNAi试剂包含长为15-29bp的双链体区域，并任选进一步包含一个或两个单链悬突。miRNA可由2个杂交在一起的RNA分子形成，或者可选地可由包含自杂交部分的单个RNA分子生成。通常而言，miRNA分子的游离5’端具有磷酸基，游离3’端具有羟基。miRNA的双链体部分通常(但不一定都)包含一个或多个凸起(bulges)，所述凸起由一个或多个非配对核苷酸组成。miRNA的一条链包含与靶RNA进行杂交的部分。在本发明的某些实施方式中，miRNA的一条链并不与靶RNA的区域精确互补，意思是所述miRNA以具有一个或多个错配的方式与所述靶RNA杂交。在本发明的其它实施方式中，所述miRNA的一条链与所述靶RNA的区域精确互补，意思是所述miRNA以不具有错配的方式与所述靶RNA杂交。典型地，miRNA被认为通过抑制靶转录本的翻译来介导基因表达的抑制。然而，在一些实施方式中，miRNA可通过引起靶转录本的降解来介导对基因表达的抑制。
术语“短干扰RNA”(或“siRNA”)指含有长度为约19个碱基对(bp)的RNA双链体(本文中被称为“双链体区域”)的RNAi试剂，并任选进一步含有一个或两个单链悬突。在一些实施方式中，RNAi试剂包含长度为15-29bp的双链体区域，并任选进一步包含一个或两个单链悬突。siRNA可由杂交在一起的两个RNA分子形成，或可选地可由包含自杂交部分的单个RNA分子生成。一般而言，siRNA分子的游离5’端具有磷酸基，游离3’端具有羟基。siRNA的双链体部分可(但一般不)含有一个或多个凸起，所述凸起由一个或多个非配对核苷酸构成。siRNA的一条链包含与靶RNA进行杂交的部分。在本发明的某些实施方式中，siRNA的一条链与所述靶RNA的区域精确互补，意思是所述siRNA以不具有任何错配的方式与所述靶RNA杂交。在本发明的其它实施方式中，所述siRNA和所述靶RNA的靶标部分之间可存在一个或多个错配。在未达到完全互补的本发明的一些实施方式中，任何错配通常位于siRNA末端或接近siRNA末端。在一些实施方式中，siRNA通过引起靶转录本的降解而介导对基因表达的抑制。
术语“短发夹RNA”(或“shRNA”)指含有如下RNA的RNAi试剂：所述RNA具有杂交或能够杂交的至少两个互补部分，以形成足够长的双链(双链体)结构，来介导RNAi(一般长至少约19bp)；以及形成环的至少一个单链部分，所述单链部分一般长为约1-10个核苷酸(nt)。在一些实施方式中，shRNA包含双链体部分(长度约为15-29bp)和形成环的至少一个单链部分(一般长度为约1-10nt)。所述双链体部分可(但一般不)含有一个或多个凸起，所述凸起由一个或多个非配对核苷酸构成。在一些实施方式中，siRNA通过引起靶转录本的降解来介导对基因表达的抑制。shRNA被认为是通过保守的细胞RNAi机器被加工成siRNA。因此，shRNA可能是siRNA的前体。无论如何，shRNA通常能够抑制靶RNA的表达，类似于siRNA。
已表明，某些被称为核酶或脱氧核酶(deoxyribozymes)的核酸分子催化RNA分子的序列特异性切割。切割位点通过RNA酶或DNA酶中的核苷酸与靶RNA中的核苷酸的互补配对决定。因此，RNA酶和DNA酶可设计用于切割任何RNA分子，由此增加其降解的速度(Cotten等,EMBO J.8:3861,1989；Usman等，Nucl.Acids Mol.Biol.10:243,1996；Usman等，Curr.Opin.Struct.Biol.1:527,1996；Sun,等，Pharmacol.Rev.,52:325,2000。还参见例如，Cotton等，EMBO J.8:3861,1989)。
在一些实施方式中，根据本发明使用的核酸溶酶体活化剂具有对应于或杂交于编码溶酶体酶的多核苷酸部分的核苷酸序列。在一些实施方式中，根据本发明使用的核酸溶酶体活化剂具有如下核苷酸序列：所述核苷酸序列包含基因表达调节子的结合位点，所述基因表达调节子控制溶酶体酶或其调节子的表达。
药物组合物
本领域的技术人员将会理解的是，根据本发明的溶酶体活化剂通常作为药物组合物的一部分来使用，所述药物组合物配制成用于通过合适的途径进行递送，和/或包含用于治疗方案(例如，与特定的生物学效应或结果相关的治疗方案)的溶酶体活化剂的单一单位剂量。
根据本发明使用的药物组合物可以配制成用于给予和/或治疗性应用的特定预期模式。根据所期望的制剂，这样的组合物可包含一种或多种药学上可接受的、无毒的载体或稀释剂，所述载体或稀释剂被定义为通常用于配制用于给予动物或人的药物组合物的辅料。通常，对稀释剂进行选择，以便不影响组合的生物学活性。这样的稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和Hank氏溶液。此外，所述药物组合物或制剂还可以包含其它载体、佐剂或者非治疗性且非免疫原性的无毒稳定剂等。
在一些实施方式中，根据本发明使用的药物组合物包含至少一种溶酶体活化剂和至少一种药学上可接受的赋形剂。这样的药物组合物可任选地包含一种或多种其它治疗活性物质，和/或与一种或多种其它治疗活性物质结合给予。在一些实施方式中，所提供的药物组合物在医学上是有效的。在一些实施方式中，所提供的药物组合物作为预防试剂在蛋白质病的治疗或预防中是有效的。在一些实施方式中，所提供的药物组合物在治疗性应用中有效的(例如在患有PD的个体中)。在一些实施方式中，配制药物组合物用于对人给予。
如本文所述，用于本发明的药物组合物可以特别配制用于以固体或液体形式进行给予，包括适于以下途径的给予形式：口服给予，例如，顿服药(drenches，水性或非水性的溶液或混悬液)、片剂(例如，用于口腔、舌下和全身吸收的片剂)、大丸剂(boluse)、散剂、颗粒剂、用于施用至舌的糊剂；胃肠道外给予，例如，作为无菌溶液或悬浮液或缓释制剂通过皮下注射、肌内注射、静脉内注射或硬膜外注射进行给予；局部应用，例如，作为霜剂、软膏剂、或控释贴剂或喷雾剂施用于皮肤、肺部或口腔；***内或直肠内给予，例如，作为***栓剂、霜剂或泡沫剂；舌下给予；眼部给予；透皮给予；或经鼻腔、肺部及其它粘膜表面给予。
本文所述的溶酶体活化剂的药学上可接受的盐包括化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如，来源于无毒的有机酸或无机酸。例如，这种常规无毒盐包括由无机酸衍生而来的盐和由有机酸制备的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等，所述有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸(isothionic)等。
在一些实施方式中，所述溶酶体活化剂可包含一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。这些盐也可以在给药辅料中或在剂型制造过程中原位制备，或者通过单独地使处于游离酸形式的纯化的化合物(例如，小分子溶酶体活化剂)与合适的碱反应制备(例如氢氧化物、药学上可接受的金属阳离子的碳酸盐或碳酸氢盐)，与氨反应制备，或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺反应制备。具有代表性的碱或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。有效用于形成碱加成盐的、具有代表性的有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺和哌嗪等。
润湿剂、乳化剂、润滑剂(例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、隔离剂(release agent)、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于药物组合物的一些实施方式中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
根据本发明所使用的制剂包括适合于口服给予、鼻腔给予、局部(包括口腔和舌下)给予、直肠给予、***给予和/或胃肠外给予的制剂。制剂可以方便地处于单位剂量形式，并且可以通过药学领域所公知的任何方法来制备。
与载体材料相结合以生产单一剂量形式的活性成分的量可以根据所治疗的主体和特定给药模式而变化。当根据合适的治疗方案给予时，与载体材料相结合以生产单一剂量形式的活性成分的量通常是产生治疗效果的溶酶体活化剂的量。通常，该量将构成总药物组合物的质量百分比，即在该组合物中含有约1％至约99％、优选约5％至约70％、最优选约10％至约30％的活性成分。
在一些实施方式中，本文所述的制剂包含赋形剂以及本发明的溶酶体活化剂，所述赋形剂选自于由环糊精、脂质体、胶束形成剂(例如，胆汁酸)和聚合物载体(例如，聚酯和聚酸酐)组成的组。在一些实施方式中，上述制剂使得本发明所述的溶酶体活化剂可以经口服生物利用。
为适合于所期望的特定剂量形式，药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂，如本文所使用的赋形剂可以是或者包括：溶剂、分散介质、稀释剂或其它液态辅料、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂和润滑剂等。Remington的The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro，(Lippincott，Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2006年)公开了用于配制药物组合物及其已知的制备技术中所使用的各种赋形剂。除非任何常规赋形剂介质与底物或其衍生物不相容(诸如通过产生任何不期望的生物学效应或以有毒害的(deleterious)方式与药物组合物中的任何其它组分产生相互作用)，否则其用途将涵盖在本发明的范围内。
制备包含所述溶酶体活化剂的制剂或组合物的方法通常包括将本发明的溶酶体活化剂与载体以及任选地一种或多种辅助成分相关联的步骤。在许多实施方式中，制剂可以通过将本发明的溶酶体活化剂与液态载体、或细碎的固态载体、或两者均匀且紧密地结合在一起而制备，然后，如果需要的话，将产品成型。
本文所述的适合于口服给予的制剂可以处于以下形式：胶囊、扁囊剂(cachets)、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常为蔗糖和***胶或西黄蓍胶)、散剂、颗粒剂；或作为处于水性或非水性液体的溶液或悬浮液；或作为水包油或油包水的液态乳剂；或作为酏剂(elixir)或糖浆；或作为软锭剂(pastilles，使用惰性基质、如明胶和甘油，或使用蔗糖和***胶)和/或漱口剂等；每个剂型都包含预先确定量的本发明的溶酶体活化剂的作为活性成分。本文所述的溶酶体活化剂也可作为大丸剂、药糖剂(electuary)或糊剂给予。
在用于口服给予的固体剂量形式(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣剂(dragees)、散剂和颗粒剂等)中，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或任何以下物质混合：填充剂或扩充剂(extenders)，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐/酯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或***胶；湿润剂，例如甘油；崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐/酯和碳酸钠；溶液阻滞剂，如石蜡；吸收加速剂，如季铵化合物；润湿剂，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；吸收剂，如高岭土和膨润土；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、月桂基硫酸钠和它们的混合物；以及着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，该药物组合物还可包含缓冲剂。相似类型的固态组分也可以在软壳明胶胶囊和硬壳明胶胶囊(使用该赋形剂、如乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等)中用作填充剂。
可任选地与一种或多种辅助成分通过压制或模制来制备片剂。可使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压制片剂。可以在合适的机器中，用惰性液态稀释剂将粉状溶酶体活化剂的混合物润湿，制备模制片剂。
可任选地使用包衣和壳来定量(scored)或制备片剂和其它固体剂型(如糖衣剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂)，所述包衣和壳例如肠溶包衣和在药物制剂领域中公知的其它包衣。可以替代地或额外地将片剂和其它固体剂型进行配制，以使得其中的活性成分缓释或控释，所述缓释和控释使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素(以获得所需的释放曲线)、其它聚合物基质、脂质体和/或微球。可将片剂和其它固体剂型配制用于快速释放，例如，冷冻干燥。片剂和其它固体剂型可以通过以下方式灭菌：例如通过细菌滞留过滤器过滤，或通过在临近使用前加入处于无菌固体组合物形式的灭菌剂(所述灭菌剂可溶于无菌水或一些其它无菌可注射介质)。这些组合物还可以任选地含有乳浊剂(opacifying agents)，并且可以是仅在或优先在胃肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋(embedding)组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果合适，所述活性成分也可与一种或多种上述赋形剂处于微囊化形式。
用于将本发明的溶酶体活化剂进行口服给予的液态剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分以外，液态剂型可含有在本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨糖醇脂肪酸酯、以及上述物质的混合物。
除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除了活性溶酶体的活化剂以外，混悬液可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶、以及上述物质的混合物。
用于直肠或***给予的制剂可以是栓剂，栓剂可通过将一种或多种本发明的溶酶体活化剂与一种或多种适当的无刺激性赋形剂或载体混合而制备，所述赋形剂或载体包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐/酯，并且所述栓剂在室温下是固体，而在体温下是液体，因此，所述栓剂会在直肠中或***腔中融化，并释放出活性溶酶体活化剂。
用于本发明的溶酶体活化剂的局部或透皮给予的剂型包括：散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。在无菌条件下，可以将活性溶酶体活化剂同药学上可接受的载体以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
除本发明的活性溶酶体活化剂以外，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶组合物可以含有赋形剂，如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌、或上述物质的混合物。
除本发明的溶酶体活化剂以外，散剂和喷雾剂组合物可含有赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末、或上述物质的混合物。喷雾剂可以额外含有常用的推进剂，如氯氟烃和挥发性未取代的烃类，如丁烷和丙烷。
透皮贴剂具有额外的优点，使得将本发明的溶酶体活化剂控制的递送至身体。将化合物溶解或分散于适当的介质中可以生产这样的剂型。也可以使用吸收促进剂增加溶酶体活化剂穿过皮肤的通量。无论是提供速率控制膜，还是将溶酶体活化剂分散在聚合物基质或凝胶中，均可以控制该通量的速率。
可用于本发明的药物组合物中的、合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及它们适当的混合物、植物油(例如，如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。可以通过以下方式保持适当的流动性：例如，使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散剂情况下维持所需粒径，以及使用表面活性剂。
这样的组合物还可以包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。在一些实施方式中，可期望包含一种或多种抗细菌剂和/或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇，山梨酸苯酯等。可替代地或额外地，期望在组合物中包含等渗剂，如糖和氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在一些情况下，为了延长药物的作用，期望能够减缓来自皮下注射或肌内注射的药物吸收。上述情况可以通过使用水溶性差的结晶材料或无定形材料的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率取决于其溶解速率，而其溶解速率又可能取决于晶体大小和晶型。或者，通过将药物溶解或悬浮在油辅料中来实现胃肠外给予的药物形式的延迟吸收。
通过在可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成所述溶酶体活化剂的微囊基质来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比例、以及所使用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物滞留(entrapping)在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库可注射制剂。
在一些实施方式中，所述溶酶体活化剂或药物制剂经口服给予。在其它实施方式中，所述溶酶体活化剂或药物制剂经静脉内给予。给予的替代途径包括舌下给予、肌内给予和透皮给予。
当本文所描述的溶酶体活化剂作为药物给予人类和动物时，可将其本身或作为药物组合物进行给予，所述药物组合物含有：例如，0.1％至99.5％(更优选0.5％至90％)的活性成分；同时结合有药学上可接受的载体。
本文所述的制剂可以口服给予、胃肠外给予、局部给予或直肠给予。当然，它们以适合于有关给予途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊形式给予，通过注射剂、吸入剂、眼用洗剂、软膏剂、栓剂等以注射、输注(infusion)或吸入进行给予；通过洗剂或软膏局部给予；以及通过栓剂经直肠给予。优选口服给予。
该溶酶体活化剂可以通过任何合适的给予途径给予人和其它动物用于治疗，包括口服、鼻腔(通过例如喷雾)、直肠、***内、胃肠外、脑池内和局部给予(如通过散剂、软膏剂或滴剂，包括经颊和舌下途径)。
不管所选择的给予途径如何，通过本领域技术人员已知的常规方法，将本文所述的、可以以合适的水合形式使用的溶酶体活化剂和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。
在本发明的药物组合物中，活性成分的实际剂量水平是可以改变的，以获得活性成分的有效量，从而实现对于特定患者、组合物和给予模式所需的治疗响应，而不对患者产生毒害作用。
所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的本发明的特定溶酶体活化剂或其酯、盐或酰胺的活性；给予途径；给予时间；所采用的特定溶酶体活化剂的***或代谢速率；治疗持续时间；与所采用的特定溶酶体活化剂结合使用的其它药物、化合物和/或材料；所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和既往病史；以及在医学领域公知的类似因素。
具有本领域普通技能的医师或兽医可容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于所需的、达到期望治疗效果的水平的剂量开始给予在药物组合物中所述的化合物，然后逐渐增加剂量，直至达到所期望的效果。
在一些实施方式中，将一种或多种所述溶酶体活化剂或其药物组合物慢性(chronically)提供给蛋白质病受试者。慢性治疗包括在长时间段内任何形式的重复给予，例如在1个月或数月、一个月至一年、一年或数年或更长时间重复给予。在许多实施方式中，慢性治疗包括在受试者的一生中重复给予一种或多种所述溶酶体活化剂或其药物组合物。优选的慢性治疗包含定期给予，例如每日一次或多次、每周一次或多次、或者每月一次或多次。通常情况下，合适的剂量(例如一种或多种所述溶酶体活化剂或其药物组合物的每日剂量)是一种或多种所述溶酶体活化剂产生治疗效果的最低有效剂量的量。该有效剂量通常将取决于上述因素。通常，对于患者而言，本发明的溶酶体活化剂的剂量(当用于指定的效果时)范围为每日每公斤体重约0.0001mg至约100mg。优选地，每日剂量的范围为每公斤体重0.001mg至50mg化合物，甚至更优选每公斤体重0.01mg至10mg化合物。然而，可以使用更低或更高的剂量。在一些实施方式中，给予受试者的剂量可以随归因于年龄、疾病进程、体重或其它因素的受试者的生理机能而改变。
如果需要，可将一种或多种所述溶酶体活化剂的有效每日剂量任选以单位剂型在全天内以适当的间隔分别给予，分为两个、三个、四个、五个、六个或多个亚剂量。
虽然可以单独给予所述溶酶体活化剂，但是优选将所述化合物作为如上所述的药物制剂(组合物)来给予。
通过类比其它药物，可以将所述溶酶体活化剂配制为在人用药物或兽用药物中以任何方便的形式进行给予的剂型。
根据本发明，用于治疗神经***病症或疾病的所述溶酶体活化剂可使用帮助溶酶体活化剂穿过血-脑屏障(BBB)的方法进行配制或给予。脊椎动物脑(和CNS)具有不同于身体任何其它器官的、独特的毛细血管***。所述独特的毛细血管***具有构成血-脑屏障(BBB)的形态学特征。血-脑屏障作为全***的由细胞组成的膜，将脑间质空间与血液隔开。
构成BBB的脑毛细血管的独特形态特征是：(a)上皮样高抗紧密连接，其将脑毛细血管的所有内皮细胞准确地接合在一起，以及(b)稀疏的胞饮或跨内皮通道，其在外周器官的内皮细胞中是丰富的。由于血-脑屏障的独特特性，阻止了容易进入身体其它组织的亲水性药物和肽进入大脑，或者它们进入大脑的速率和/或在大脑中的积累速率非常低。
在本发明的一个方面，穿过BBB的所述溶酶体活化剂用于治疗蛋白质病是特别有效的。在一个实施方式中，穿过BBB的所述化合物用于治疗帕金森氏病(PD)是特别有效的。因此，本领域普通技术人员将会理解的是，本发明的一些溶酶体活化剂能够容易地穿过BBB。或者，可以修饰本发明的溶酶体活化剂，例如，通过加入能够使得它们不太亲水、并允许它们更容易穿过BBB的各种取代基。
已经开发用于将这些药物引入大脑的各种策略，否则所述药物将不能穿过血-脑屏障。广泛使用的策略包括侵入性方法，其中将药物直接递送到大脑。该方法之一是将导管植入脑室***以绕过血-脑屏障，并将药物直接递送至大脑。这些方法已经被用于治疗倾向于脑膜的脑部疾病，例如涉及大脑的白血病(参见US 4,902,505)。
尽管用于直接将药物递送至大脑脑室的侵入性方法经历了一定的成功，但它们的局限在于它们可能只能将药物分散在脑组织的浅表区域，并且不能深入到大脑内的结构。另外，侵入性方法可能有害于患者。
绕过血-脑屏障的其它方法利用了基于药理学的方法，所述方法包括将药物潜伏化或将亲水性药物转化成脂溶性药物。大部分潜伏化方法包括阻断药物中的羟基、羧基和伯胺基团，使其更具脂溶性，因而更能够更容易地穿过血-脑屏障。
提高BBB对药物的通透性的另一种方法包括高渗性物质的动脉内输注，所述高渗性物质瞬时打开血-脑屏障，以允许亲水性药物的通过。然而，高渗性物质具有潜在毒性，并可能损坏血-脑屏障。
抗体是用于递送本发明的组合物的另一种方法。例如，可以将与存在于脑毛细血管内皮细胞上的转铁蛋白受体反应的抗体缀合至神经药剂，以产生抗体-神经药剂缀合物(参见US 5,004,697)。该方法在以下条件下进行：通过将抗体结合至脑毛细血管内皮细胞上的转铁蛋白受体，并且将所述神经药剂以药物活性形式传送穿过血-脑屏障。还可以通过将抗体阳离子化，以形成等电点为约8.0至11.0的阳离子化抗体，极大地增加了抗体在大脑中摄取或递送(参见US 5,527,527)。
配体-神经药剂融合蛋白是有效用于将组合物递送至主体的另一种方法(参见US5,977,307)。配体与脑毛细血管内皮细胞受体反应。该方法在以下条件下进行：通过将配体结合至脑毛细血管内皮细胞的受体上，并且将神经药剂以药物活性形式传送穿过血-脑屏障。在一些实施方式中，同时具有配体结合和神经药物特性的配体-神经试剂融合蛋白可以作为连续蛋白，通过使用基因工程技术来生产。可以将基因结构制备为含有对配体进行编码的DNA，所述DNA融合至对蛋白、多肽或肽进行编码的DNA，从而传送穿过血-脑屏障。以适当的方式，将配体编码序列和药剂编码序列***至表达载体中，以使得所需的融合蛋白正确地表达。基因融合作为同时含有配位体部分和神经药剂部分的邻接蛋白分子而表达。
可以通过给予血脑屏障激动剂来增加血脑屏障的渗透性，所述激动剂例如缓激肽(参见US 5,112,596)、或者被称为受体介导渗透剂(RMP)的多肽(参见US 5,268,164)。可以通过皮下注射、静脉内注射或肌内注射，将外源分子经胃肠外给予至主体的血液中，或者通过身体组织(例如消化道、呼吸***或皮肤)进行吸收而给予至主体的血液中。其中，给予分子的形式(例如，胶囊剂、片剂、溶液剂和乳剂)取决于、至少部分取决于其所给予的途径。可以同时或随时间依次将外源分子给予至主体血液中，以及将血-脑屏障渗透性激动剂进行静脉内注射。例如，治疗药物可以以片剂形式口服给予，而稍后(例如，30分钟之后至数小时之后)静脉内给予血-脑屏障渗透性激动剂。这段时间使得在给予激动剂增加血-脑屏障对药物的渗透性之前，允许在胃肠道内吸收并由血液摄取所述药物。另一方面，可以在静脉注射药物之前或同时给予血-脑屏障渗透性激动剂(例如，缓激肽)。因此，本文使用术语“共同给予”意味着以在血液中达到显著浓度的时间给予血-脑屏障的激动剂和外源分子，从而产生增加血-脑屏障的渗透性及允许外源分子从血液中至中枢神经***细胞的最大通过的同步作用。
在一些实施方式中，所述溶酶体活化剂可以与脂肪酸载体(以及任选地与另一种神经活性药物)配制成前药。所述前药在胃和血液环境中是稳定的，并且可以通过摄入而被递送。前药容易通过血脑屏障。优选地，前药的脑渗透指数为药物单独使用时脑渗透指数的至少2倍。一旦在中枢神经***中，前药(优选为无活性的)将被水解成脂肪酸载体和所述化合物或其类似物(以及任选的另一种药物)。优选地，所述载体是中枢神经***的正常组分，并且是无活性且无害的。一旦从脂肪酸载体中释放，溶酶体活化剂和/或药物具有活性。优选地，所述脂肪酸载体是具有约16至26个碳原子(更优选20至24个碳原子)的部分饱和直链分子。在美国专利4,939,174、4,933,324、5,994,932、6,107,499、6,258,836和6,407,137中提供了脂肪酸载体的实例。
本发明的试剂的给予可以是用于预防性目的或治疗性目的。当预防性地提供时，所述溶酶体活化剂在疾病症状发生之前提供。试剂的预防性给予用来防止或减少以下疾病的症状的发生率：例如帕金森氏病(包括特发性(idiopathic)帕金森氏病(PD))、还被称作路易体痴呆症(DLB)的弥漫性路易体病(DLBD)、阿尔茨海默氏病和帕金森氏病的组合、以及多***萎缩(MSA)。当治疗性地提供时，所述溶酶体活化剂在实际疾病的症状出现发作时(或不久之后)提供。在一些实施方式中，溶酶体活化剂的治疗性给予用于降低疾病的严重程度和缩短持续时间。
在一些实施方式中，药物组合物可以包含大型的、代谢缓慢的大分子，如蛋白、多糖(如脱乙酰壳多糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如胶乳官能化Sepharose.TM.、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。此外，这些载体可以用作免疫刺激剂(即佐剂)。
对于非肠道给予，本发明的溶酶体活化剂可以在具有药物载体的、生理上可接受的稀释剂中作为物质的溶液或分散液的可注射剂量给予，所述药物载体可以是无菌液体，例如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，组合物中可存在辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其它组分石油、动物、植物或合成来源的组分，例如花生油、豆油和矿物油。通常情况下，二元醇(如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液态载体，特别是对于可注射溶液的情况。抗体可以以储库注射剂或植入制剂的形式给予，所述制剂以使得活性成分持续释放的方式进行配制。示例性的组合物包含单克隆抗体5mg/mL，在由50mM的L-组氨酸、150mM的氯化钠组成的、用HCl将pH调至6.0的水性缓冲液中配制。通常，用于胃肠外给予的组合物基本上是无菌的、基本上是等渗的，并且是在FDA或类似机构的GMP条件下生产的。
通常，组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；还可以制备为在注射之前适合溶解于或悬浮于液态辅料的固体形式。该制剂也可被乳化或封装在脂质体或微粒中，例如上面所讨论的聚丙交酯、聚乙交酯或者用于增强佐剂效果的共聚物(参见Langer，Science，249:1527，1990年，以及Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews，28：97，1997年)。本发明的溶酶体活化剂可以以储库注射剂或植入制剂的形式给予，所述制剂以使得活性成分持续释放或脉冲释放的方式进行配制。
适用于其它给予模式的额外制剂包括口服制剂、鼻内制剂和肺部制剂、栓剂和透皮敷剂。对于栓剂，粘合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这样的栓剂可以由含有0.5％至10％、优选1％至2％的活性成分的混合物制备。口服制剂包含赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采取溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂的形式，并且含有10％至95％、优选25％至70％的活性成分。
局部应用可实现经皮或皮内递送。溶酶体活化剂与霍乱毒素、或其去毒衍生物、或其亚基、或其它类似的细菌毒素共同给予可促进局部给予(参见Glenn等，Nature，391:851，1998年)。通过使用组分作为混合物来实现共同给予，或作为通过化学交联得到的或作为融合蛋白表达的连接的分子来实现共同给予。或者，可以使用皮肤途径或使用转递体(transferosomes)实现经皮递送(Paul等，Eur.J.Immunol.，25：3521，1995年；Cevc等，Biochem.Biophys.Acta，1368：201，1998年)。
在一些实施方式中，药物组合物以能够冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施方式中，药物组合物以不能够冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施方式中，复原溶液(reconstituted solution)和/或液态剂型可在复原后存放一定时间(例如，2小时、12小时、24小时、2天、5天、7天、10天、2周、一个月、两个月或更长的时间)。
液态剂型和/或复原溶液在给予前可包含颗粒物质和/或污点(discoloration)。在一些实施方式中，如果变色或浑浊、和/或如果在过滤后仍留有颗粒物质，则不应使用该溶液。
在一些实施方式中，使用对经计量的组合物剂量进行递送的装置给予本发明的组合物。
用于递送本文所述的皮内药物组合物的合适的装置包括短针装置，例如在U.S.4,886,499、U.S.5,190,521、U.S.5,328,483、U.S.5,527,288、U.S.4,270,537、U.S.5,015,235、U.S.5,141,496、U.S.5,417,662中描述的装置。还可以通过限制针进入皮肤的有效穿透长度的装置递送皮内组合物，例如在WO99/34850中描述的装置，通过引用将其以及其功能等同物并入本文。还适用的是射流注射装置，所述装置通过液体喷射注射器或通过刺穿角质层的针(并产生到达真皮的喷射)将液态组合物递送至真皮。例如，在U.S.5,480,381、U.S.5,599,302、U.S.5,334,144、U.S.5,993,412、U.S.5,649,912、U.S.5,569,189、U.S.5,704,911、U.S.5,383,851、U.S.Pat.No.5,893,397、U.S.5,466,220、U.S.5,339,163、U.S.5,312,335、U.S.5,503,627、U.S.5,064,413、U.S.5,520,639、U.S.4,596,556、U.S.4,790,824、U.S.4,941,880、U.S.4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537中对射流注射装置进行了描述。还适用的是弹道粉末/颗粒递送装置，所述装置使用压缩气体将处于粉末形式的组合物加速，穿过皮肤的外层，到达真皮。此外，在皮内给予的经典曼托法中可以使用常规注射器。
根据本发明的药物组合物以适合于相关活性药剂和/或递送途径的剂型和/或样式(format)来提供。对于特定类别的试剂，既定样式和制剂是本领域已知的。
例如，核酸试剂(例如，基因疗法试剂、RNAi剂等)可以在以下物质中提供或者用以下物质来提供：核酸载体***和/或阳离子聚合物；各种肽分子转运蛋白，包括富含精氨酸的肽、富含组氨酸的肽、以及阳离子和中性脂质；各种非阳离子聚合物；脂质；碳水化合物；以及表面活性剂材料(参见例如US公开号2002/0150626和2004/242518；以及US专利5,574,142、5,925,628、6,383,814、6,410,517、7,101,995和7,109,173)。
本文所使用“载体”是指能够介导第二核酸分子进入(例如转移、递送等)细胞的核酸分子。所转移的核酸通常连接至(例如，***至)载体核酸分子。载体可以包含指导自主复制的序列，或者可以包含足以使其整合至细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(虽然RNA质粒是已知的，但通常为DNA分子)、粘粒和病毒载体。如本领域中所公知的，术语“病毒载体”可以指核酸分子(如质粒)或指病毒或病毒颗粒，所述核酸分子包括病毒来源的核酸元件，所述元件通常促进核酸分子的转移或整合(实例包括逆转录病毒载体或慢病毒载体)，所述病毒或病毒颗粒介导核酸转移(实例包括逆转录病毒或慢病毒)。对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，除了核酸之外，病毒载体可以包含各种病毒组分。
使用“RNAi诱导载体”可以诱导RNAi，RNAi诱导载体是指存在于细胞中，导致产生一种或多种自杂交或彼此杂交的RNA，以形成RNAi试剂(例如siRNA、shRNA和/或miRNA)的载体。在本发明的各种实施方式中，该术语涵盖存在于细胞中，导致产生一种或多种自杂交或彼此杂交的RNA，以形成RNAi试剂的质粒或病毒(不同于天然存在的、未经过人工修饰的病毒或质粒)，所述质粒例如DNA载体(其序列可包含衍生自病毒的序列元件)。通常情况下，载体包含可操作地连接至表达信号的核酸，从而使得当载体存在于细胞中时，杂交或自杂交以形成RNAi试剂的一种或多种RNA得以转录。因此，载体为RNA或多种RNA或其前体的细胞内合成提供了模板。出于诱导RNAi的目的，在细胞中存在的病毒基因组(例如，病毒包膜与细胞膜融合后)被认为是足以在细胞内构成病毒的存在。此外，出于诱导RNAi的目的，如果载体被导入至细胞内、进入细胞或者是从亲代细胞继承，不管它随后在细胞内是否被修饰或加工，该载体被认为存在于细胞中。如果载体在细胞内的存在导致产生一种或多种彼此杂交或自杂交的RNA，以形成靶向于转录物的RNAi试剂(即，如果载体在细胞内的存在导致产生一种或多种靶向于转录物的RNAi试剂)，则RNAi诱导载体被认为靶向于转录物。
在一些实施方式中，用于根据本发明(例如，在联合疗法中)的药物组合物可以包括疫苗组合物。疫苗组合物通常包含一种或多种抗原以及一种或多种佐剂。
联合疗法
在一些实施方式中，联合疗法包括给予两种以上溶酶体活化剂。
在一些实施方式中，本发明利用至少一种溶酶体活化剂与一种或多种其它治疗剂联合，所述其它治疗剂例如包括当前用于治疗蛋白质病的药物，和/或降低相关蛋白质病的一种或多种副作用、和/或一种或多种治疗中的副作用的药物。
在一些实施方式中，溶酶体活化剂和额外治疗剂以单一药物组合物的形式共同给予，在一些实施方式中，溶酶体活化剂和额外治疗剂以各自的药物组合物的形式给予。在一些实施方式中，共同给予溶酶体活化剂和其它治疗剂的一个或多个单独剂量；在一些实施方式中，根据不同的治疗方案给予溶酶体活化剂和其它治疗剂。
在一些实施方式中，相比于各试剂在与一些治疗益处相关的参考治疗方案中单独给予的情况，当两种试剂联合使用时，一个或多个单独剂量的溶酶体活化剂和/或其它治疗剂在量和/或频率方面有所降低。通常，根据本发明，溶酶体活化剂和/或另一种治疗剂将以这样的参考治疗方案中的剂量和/或暴露(exposures)的50-100％的范围内使用(如果存在用于相关试剂的治疗方案)。
本文所使用的术语“联合(combination)”、“联合的(combined)”以及相关术语是指同时或相继(sequential)给予根据本发明的治疗剂。
当患者或个体同时暴露于两种试剂时，通常认为两种以上试剂被“联合”给予。在许多实施方式中，当患者或个体同时在特定的靶组织或样本(例如，在脑中、在血清中等)中示出试剂的治疗性相关水平，则认为两种以上试剂被“联合”给予。
给出几个非限制性的实例，当所关心的蛋白质病是PD时，用于根据本发明的联合疗法中的合适试剂包括，例如，左旋多巴、卡比多巴、金刚烷胺(amantidine)抗胆碱能药(苯海索(trihexyphenidyl)、甲磺酸苯扎托品(benztropine mesylate)、丙环定(procyclidine)、安坦(artane)、苯甲托品(cogentin))、COMT(儿茶酚-O-甲基转移酶)、MAOI(单胺氧化酶抑制剂)、外周脱羧酶抑制剂、多巴胺受体激动剂(例如，溴隐亭(bromocriptidine)(Parlodel)、培高利特(pergolide)(Permax)、罗匹尼罗(ropinirol)(Requip)、普拉克索(pramipexole)(Mirapex)、麦角内酯(Ergolide)。
在所关注的蛋白质病是DLBD的情况下，用于根据本发明的联合疗法中的合适试剂包括例如，左旋多巴、D2-受体拮抗剂和胆碱酯酶抑制剂。
在所关注的蛋白质病是Niemann-Pick C型疾病的情况下，用于根据本发明的联合疗法中的合适试剂包括例如，别孕烷醇酮(allopregnanolone)、低胆固醇饮食或降胆固醇剂，如他汀类(例如，LIPITOR，批准用于降低某些LDL水平和/或在某些群体中降低中风风险，以10-80mg/日范围内的剂量给药，推荐的起始剂量为每日一次、每次10mg或20mg，或者如果需要大量(>45％)降低LDL-C的情况下，每日一次、每次40mg，或者对于儿科受试者每日一次、每次10mg)；贝特类，例如非诺贝特(LIPIDIL)、烟酸、依泽替米贝(ezetimibe)(ZETIA)和/或结合树脂，如消胆胺(cholestyramine)(QUESTRAN)。
在一些实施方式中，所述组合物和制剂可以与一种或多种用于帕金森氏病的治疗联合给予，例如ACR-343、罗替戈汀(rotigotine)(Schwarz)、罗替戈汀贴剂(UCB)、阿朴***(Amarin)、阿朴***(Archimedes)、AZD-3241(Astra Zeneca)、肌酸(Avicena)、AV-201(Avigen)、麦角乙脲(Axxonis/Biovail)、硝苄卡朋(nebicapone)(BIAL Group)、阿朴***(Mylan)、CERE-120(Ceregene)、甲基左旋多巴+卡比多巴(Cita Neuropharmaceuticals)、piclozotan(Daiichi)、GM1神经节苷脂(Fidia Farmaceutici)、Altropane(哈佛大学)、Fluoratec(哈佛大学)、fipamezole(Juvantia Pharma)、伊曲茶碱(istradefylline)(Kyowa Hakko Kogyo)、GPI-1485(MGI GP)、Neu-120(Neurim Pharmaceuticals)、NGN-9076(NeuroGeneration Inc)、NLX-P101(Neurologix)、AFQ-056(Novartis)、arundic酸(Ono/Merck&Co)、COMT抑制剂(Orion)、ProSavin(Oxford Biomedica)、safinamide(Pharmacia&Upjohn)、PYM-50028(Phytopharm)、PTX-200(Phytix)、123I-iometopane(ResearchTriangle Institute)、SYN-115(Roche Holding)、preladenant(Schering Plough)、ST-1535(Sigma-Tau Ind.Farm)、罗匹尼罗(SmithKline Beecham)、帕多芦诺(pardoprunox)(Solvay)、SPN-803(Supernus Pharmaceuticals)、尼替西农(Syngenta)、TAK-065(Takeda)、细胞疗法(Titan Pharmaceuticals)、PD基因疗法(University of Auckland/Weill Medical College)、18F-AV-133(密歇根大学)、mitoquinone/mitoquinol氧化还原混合物(Antipodean Pharmaceuticals)、99m-TC-tropantiol(宾夕法尼亚大学)、阿朴***(Vectura)、BIIB-014(Vernalis Group)、aplindore(Wyeth)、以及XP-21279(XenoPortInc)、ABT-126(Abbott Laboratories)、pozanicline(Abbott Laboratories)、MABT-5102A(AC Immune)、Affitope AD-01(AFFiRiS GmbH)、Affitope AD-02(AFFiRiS GmbH)、davunetide(Allon Therapeutics Inc)、尼伐地平衍生物(Archer Pharmaceuticals)、Anapsos(ASAC Pharmaceutical International AIE)、ASP-2535(Astellas Pharma Inc)、ASP-2905(Astellas Pharma Inc)、11C-AZD-2184(AstraZeneca plc)、11C-AZD-2995(AstraZeneca plc)、18F-AZD-4694(AstraZeneca plc)、AV-965(Avera PharmaceuticalsInc)、AVN-101(Avineuro Pharmaceuticals Inc)、免疫球蛋白静脉内(BaxterInternational Inc)、EVP-6124(Bayer AG)、尼莫地平(Bayer AG)、BMS-708163(Bristol-Myers Squibb Co)、CERE-110(Ceregene Inc)、CLL-502(CLL Pharma)、CAD-106(CytosBiotechnology AG)、mimopezil(Debiopharm SA)、DCB-AD1(Development Centre forBiotechnology)、EGb-761((Dr Willmar Schwabe GmbH&Co)、E-2012(Eisai Co Ltd)、ACC-001(Elan Corp plc)、bapineuzumab(Elan Corp plc)、ELND-006(Elan PharmaceuticalsInc)、阿托西汀(atomoxetine)(Eli Lilly&Co)、LY-2811376(Eli Lilly&Co)、LY-451395(Eli Lilly&Co)、m266(Eli Lilly&Co)、semagacestat(Eli Lilly&Co)、solanezumab(EliLilly&Co)、AZD-103(Ellipsis Neurotherapeutics Inc)、FGLL(ENKAM PharmaceuticalsA/S)、EHT-0202(ExonHit Therapeutics SA)、塞来昔布(celecoxib)(GD Searle&Co)、GSK-933776A(GlaxoSmithKline)、罗格列酮XR(GlaxoSmithKline)、SB-742457(GlaxoSmithKline)、R-1578(Hoffmann-La Roche AG)、HF-0220(Hunter-Fleming Ltd)、奥拉西坦(oxiracetam)(ISF Societa Per Azioni)、KD-501(Kwang Dong PharmaceuticalCo Ltd)、NGX-267(Life Science Research Israel)、石杉碱甲(Mayo Foundation)、Dimebon(Medivation Inc)、MEM-1414(Memory Pharmaceuticals Corp)、MEM-3454(MemoryPharmaceuticals Corp)、MEM-63908(Memory Pharmaceuticals Corp)、MK-0249(Merck&CoInc)、MK-0752(Merck&Co Inc)、辛伐他汀(Merck&Co Inc)、V-950(Merck&Co Inc)、美金刚(memantine)(Merz&Co GmbH)、neramexane(Merz&Co GmbH)、Epadel(MochidaPharmaceutical Co Ltd)、123I-MNI-330(Molecular Neuroimaging Llc)、gantenerumab(MorphoSys AG)、NIC5-15(Mount Sinai School of Medicine)、石杉碱甲(Neuro-HitechInc)、OXIGON(纽约大学)、NP-12(Noscira SA)、NP-61(Noscira SA)、利凡斯的明(rivastigmine)(Novartis AG)、ECT-AD(NsGene A/S)、arundic酸(Ono PharmaceuticalCo Ltd)、PF-3084014(Pfizer Inc)、PF-3654746(Pfizer Inc)、RQ-00000009(PfizerInc)、PYM-50028(Phytopharm plc)、Gero-46(PN Gerolymatos SA)、PBT-2(PranaBiotechnology Ltd)、PRX-03140(Predix Pharmaceuticals Inc)、Exebryl-1(ProteoTechInc)、PF-4360365(Rinat Neuroscience Corp)、HuCAL抗β淀粉样蛋白单克隆抗体(RocheAG)、EVT-302(Roche AG)、尼伐地平(Roskamp Institute)、加兰他敏(galantamine)(Sanochemia Pharmazeutika AG)、SAR-110894(sanofi-aventis)、INM-176(Scigenic&Scigen Harvest)、mimopezil(中国科学院上海药物研究所)、NEBO-178(StegramPharmaceuticals)、SUVN-502(Suven Life Sciences)、TAK-065(TakedaPharmaceuticals)、ispronicline(Targacept Inc)、雷沙吉兰(rasagiline)(TevaPharmaceutical Industries)、T-817MA(Toyama Chemical)、PF-4494700(TransTechPharma Inc)、CX-717(University of California)、18F-FDDNP(University ofCalifornia Los Angeles)、GTS-21(佛罗里达大学)、18F-AV-133(密歇根大学)、18F-AV-45(密歇根大学)、四硫钼酸盐(密歇根大学)、123I-IMPY(宾夕法尼亚大学)、18F-AV-1/ZK(宾夕法尼亚大学)、11C-6-ME-BTA-1(匹兹堡大学)、18F-6-OH-BTA-1(匹兹堡大学)、MCD-386(University of Toledo)、醋酸亮丙瑞林植入物(Voyager Pharmaceutical Corp)、aleplasinin(Wyeth)、begacestat(Wyeth)、GSI-136(Wyeth)、NSA-789(Wyeth)、SAM-531(Wyeth)、CTS-21166(Zapaq)和ZSET-1446(Zenyaku Kogyo)。
在一些实施方式中，所述组合物和制剂可以与一种或多种用于帕金森氏病的治疗联合给予，例如ARICEPT和EXCELON。
在一些实施方式中，所述组合物和制剂可以与一种或多种用于运动神经元障碍的治疗联合给予，例如AEOL-10150(Aeolus Pharmaceuticals Inc)、利鲁唑(riluzole)(Aventis Pharma AG)、ALS-08(Avicena Group Inc)、肌酸(Avicena Group Inc)、arimoclomol(Biorex Research and Development Co)、甲钴胺(mecobalamin)(Eisai CoLtd)、他仑帕奈(talampanel)(Eli Lilly&Co)、R-7010(F Hoffmann-La Roche Ltd)、依达拉奉(edaravone)(Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals Inc)、arundic酸(OnoPharmaceutical Co Ltd)、PYM-50018(Phytopharm plc)、RPI-MN(ReceptoPharm Inc)、SB-509(Sangamo BioSciences Inc)、奥利索西(olesoxime)(Trophos SA)、苯丁酸钠(UcyclydPharma Inc)和R-普拉克索(弗吉尼亚大学)。
在一些实施方式中，所述组合物和制剂可以与一种或多种钙通道阻断剂联合给予，包括限速剂(如维拉帕米和地尔硫)和钙通道阻断剂的二氢吡啶基团(Meredith等，Jof Hypertension，22：1641，2004年)。钙通道阻断剂的其它实例是氨氯地平、非洛地平、依拉地平、拉西地平、尼卡地平、硝苯地平、尼古地平、尼鲁地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、尼伐地平、瑞西丁、阿尼帕米、芬地林、氟桂利嗪、加洛帕米、米贝拉地尔、普尼拉明、噻帕米、马来酸哌克昔林、芬地林和普尼拉明，以及它们中任一种的盐、酯、酰胺、前药或其它衍生物。
在一些实施方式中，本文使用溶酶体活化剂与一种或多种L-型Ca2+通道阻断剂联合，治疗PD和除溶酶体贮积病以外的神经退行性疾病、障碍和/或病症。
在一些实施方式中，所述组合物和制剂可以与一种或多种RyR的一种或多种抑制剂联合给予，包括给予受体拮抗剂以及抑制该受体的表达，例如，通过给予反义核酸，或通过使用siRNA或shRNA。示例性的RyR受体拮抗剂为丹曲林、兰尼碱、阿珠莫林(azumolene)、calquestrin和普鲁卡因(procaine)。
在一些实施方式中，本文使用溶酶体活化剂与一种或多种在先用于治疗特定疾病、障碍和/或病症的试剂联合，治疗该疾病、障碍和/或病症。在一些此类实施方式中，本文使用溶酶体活化剂与一种或多种批准用于治疗特定疾病、障碍和/或病症的试剂联合，治疗该疾病、障碍和/或病症。
在一些实施方式中，本发明的方法与一种或多种外科手术疗法联合使用。例如，对于药物治疗PD失败的患者，目前建议手术治疗。单侧丘脑切开术可以用来减少震颤。对于患有单侧震颤而对药物无应答的患者，偶尔可以考虑。通常不建议将双侧方法用于PD的治疗。用于治疗震颤的丘脑单侧深度脑刺激也可能有益于治疗震颤。单侧苍白球切开术是用于降低对侧药物引起的运动障碍的有效技术。伽玛刀手术(丘脑切开术或苍白球切开术)可以作为传统手术的放射性替代而进行。然而，目前优选的用于PD的神经外科干预是双侧丘脑下核刺激。神经移植策略仍然处于实验阶段。除了外科手术和药物以外，在帕金森氏综合征中的物理疗法维持肌肉张力、弹性，并且改善姿势和步态。
当所关注的蛋白质病是炎性疾病、障碍和/或病症时，根据本发明在联合疗法中使用的合适试剂包括例如，抗炎剂、免疫调节剂、免疫阻抑剂以及它们的联合。抗炎剂的非限制性实例包括类固醇、非甾体类抗炎剂(NSAIDS)(例如，如水杨酸盐/酯、非诺洛芬、萘普生、吡罗昔康、托美丁、吲哚美辛、舒林酸(sulindac)、甲氯灭酸盐/酯(meclofenamate)等)以及改善病情的抗风湿药物(DMARDS)(例如，如D-青霉胺、金盐、羟氯喹、硫唑嘌呤、氨甲喋呤和环磷酰胺等)。
在一些实施方式中，本发明的方法可以与GCase多肽的底物抑制剂联合使用。仅给出一个实例，对于突触核蛋白病的治疗，此类GCase多肽的底物抑制剂是N-丁基-脱氧野尻霉素(ZAVESCA)。
测定对疗法的应答
患有特定蛋白质病疾病、障碍和/或病症的受试者表现出特征性症状。例如，患有帕金森氏病的患者经受震颤、强直、动作迟缓以及姿态失衡。除了智力下降，如记忆力减退和无法进行简单任务以外，患有路易体痴呆的患者经受强烈的精神病性症状(视幻觉)。用溶酶体活化剂疗法的症状的可观察到的改善、或处于发展为疾病的风险中的患者某些症状的发作延迟、或疾病进展延迟，将是对疗法具有良好应答的证据。
可替代地或额外地，可测量的替代标志物也可以有效用于评估对溶酶体活化剂疗法的应答。例如，一些研究者报道了，在患有帕金森氏病的患者的血浆中，检测到较高水平的α-突触核蛋白或α-突触核蛋白低聚体形式(Lee等，J Neural Transm.，113(10)：1435，2006年；El-Agnaf等，FASEB J.，20：419，2006年)；而一些报道了，在患有帕金森氏病的患者中，与正常对照相比，血浆α-突触核蛋白降低(Li等，Exp Neurol.，204(2)：583，2007年)。
在本发明的一些实施方式中，可以使用来源于帕金森氏病患者的多巴胺神经元中的α-突触核蛋白的监测水平或溶酶体降解能力作为用于测定或表征对溶酶体活化剂疗法的应答的标志物。
溶酶体活化剂的鉴别和/或表征分析法
其中，本发明提供了用于鉴别和/或表征溶酶体活化剂的***。如本文所指出的，在一些实施方式中，用于根据本发明的特别有用的溶酶体活化剂是提高了一种或多种溶酶体酶的稳定性和/或运输的溶酶体活化剂。
在一些实施方式中，用于根据本发明的特别有用的溶酶体活化剂是提高了在神经元细胞和/非神经元细胞中的一种或多种溶酶体酶的稳定性和/或运输的溶酶体活化剂。
在一些实施方式中，用于根据本发明的特别有用的溶酶体活化剂是直接结合至靶溶酶体酶的溶酶体活化剂。
在一些实施方式中，用于根据本发明的特别有用的溶酶体活化剂是未显著抑制它们的靶溶酶体活化酶活性的溶酶体活化剂。
在一些实施方式中，用于根据本发明的特别有用的溶酶体活化剂是提高了野生型溶酶体酶的水平和/或活性的溶酶体活化剂。
本发明提供了用于鉴别和/或表征此类试剂的***。在一些实施方式中，本发明提供了用于鉴别和/或表征相比于参考溶酶体活化剂而言的感兴趣的溶酶体活化剂的等同剂量的***。
根据本发明，可利用多种分析法来鉴别和/表征溶酶体活化剂，和/或另一方面来评估溶酶体活性。例如，可以采用监控蛋白质运输，特别是溶酶体酶和/或运输至溶酶体的蛋白质(例如，溶酶体酶)的分析法。可替代地或额外地，可以采用监控蛋白质的积聚(例如，如在蛋白质病中所观察到的)的分析法；在一些实施方式中，可以利用这样的分析法作为溶酶体活性和/或一种或多种潜在或已知的溶酶体活化剂的作用的间接读出结果(read-outs)。
仅给出几个具体实例，在一些实施方式中，可以使用检测微管囊泡谱(tubulovesicular profiles)的核周定位(与ER驻留蛋白(如BiP)共定位)的技术，来测定和/或可视化在ER中的蛋白质积聚。在细胞中的天然位置，这些蛋白质还会减少或缺失，例如在细胞表面或在另一细胞隔室中，例如溶酶体。用胞浆蛋白质，采用类似共定位方法可以测定细胞质中蛋白质的积聚。
用于检测和/或分析蛋白质运输(例如，溶酶体酶的运输)的示例性的方法包括，例如在高尔基体中N-糖基化和O-糖基化蛋白质的脉冲追踪代谢标记(例如，利用放射性或其它可检测的标记)，例如与糖苷酶处理和免疫沉淀联合，以评估这些蛋白质在高尔基体中是否充分糖基化，或者它们是否驻留于ER中、而不是运输至高尔基体进行进一步糖基化。
用于可视化检测蛋白质的细胞定位的灵敏方法还包括，荧光显微镜法(例如，使用荧光蛋白质和/或荧光抗体)。用于这样的方法中的适当荧光部分包括，例如，多肽部分(例如，能够与待检测蛋白融合的部分)(包括例如，来源于绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白(YFP)和/或红色荧光蛋白的适当部分)；也可以使用小分子或其它可检测的荧光标志物(例如，染料、量子点等)。在一些实施方式中，双标记研究(例如，其中，溶酶体和靶向至溶酶体的感兴趣的蛋白质均有待评估)对于共定位研究特别有用。对于蛋白质运输中使用荧光成像进的综述，参见Watson等，Adv Drug Deliv Rev.，57(1)：43，2005年。对于使用共聚焦显微镜用于蛋白质的细胞内共定位的描述，请参见Miyashita等，Methods MolBiol.，261：399，2004年。
荧光相关光谱(FCS)是能够单分子实时分辨的超灵敏、非侵入性检测方法(Vukojevic等，Cell Mol Life Sci.，62(5)：535，2005年)。单粒子荧光成像(SPFI)使用荧光的高灵敏性来将选择性地用小荧光粒子标记的单个分子进行可视化(Cherry等，BiochemSoc Trans.，31(Pt 5)：1028，2003年)。对于脂筏中蛋白质的定位，参见Latif等，Endocrinology.，144(11)：4725，2003年)。对于活细胞成像的综述，参见Hariguchi，CellStruct Funct.，27(5)：333，2002年)。荧光共振能量转移(FRET)显微术也被用来研究生理条件下蛋白质的结构和定位(Periasamy，J Biomed Opt.，6(3)：287，2001年)。
在一些实施方式中，可以采用如ELISA和/或蛋白质印迹分析的技术，例如用于监测蛋白质的运输和/或积聚。
在一些实施方式中，可以采用质谱法和/或色谱法(例如，薄层色谱法)技术，例如通过评估酶底物或其它相关实体的水平，例如用于监测溶酶体酶活性。
在一些实施方式中，采用监测低聚体形成的技术，例如监测在突触核蛋白病中的多肽低聚体形成的技术。例如，α-突触核蛋白以低聚体形式积聚。根据本发明，可以监测α-突触核蛋白单体和/或特定低聚体(例如，二聚体和/或四聚体)的水平，和/或任选地检测它们的比例，以评估溶酶体活性和/或推定的或已知溶酶体活化剂的效果。在一些实施方式中，例如通过使用脑切片分析法，这样的技术监测体内低聚体水平。
在一些实施方式中，溶酶体活性和/或推定的或已知溶酶体活化剂的效果可以通过评价神经元中的形态学异常(例如，形态测定分析)进行监测。仅给出几个实例，在一种样式中，在用tau-GFP转染的神经元中神经元形态的变化包括不对称、前部和后部凸出中轴突数量的减少、异常轴突束、轴突起泡(blebbing)以及末端树突分支(arborisations)减少。可替代地或额外地，可评估细胞形态的改变，包括聚集、细胞尺寸(细胞面积或细胞密度)、巨多形化(polymegathism)(细胞尺寸的变化，例如平均细胞面积的变异系数)、多形性(pleomorphism)(细胞形状的变化，例如六角形细胞的百分数或细胞形状的变异系数)、细胞周长、平均细胞边长、细胞形状等。例如，根据如在Ventimiglia等，J NeurosciMethods.，57：63，1995年，以及Wu等，Cerebral Cortex.，14：543，2004年中所描述的方法，例如使用定量形态测定分析可以对形态进行评估(高通量分析)；任选地，与图像分析软件(如Image Pro-Plus软件)一起使用。
细胞中蛋白质的运输沿pH梯度发生(即，ER的pH值约为7.0、高尔基体的pH值约为6.2-7.0、反面高尔基体网络的pH值约为6.0、早期和晚期内体的pH值约为6.5、溶酶体的pH值约为4.5)。在一些蛋白质病中，运输、溶酶体/内体形态以及腔pH也被破坏(Ivleva等，Biomed Sci.，2：398，1991年；Futer-man和van Meer，Nat Rev Mol Cell Biol.，5：554，2004年)；并且，内体中升高的pH值已显示出促进了囊泡由内体运输至高尔基体的逆转。使用荧光读板仪(plate reader)，可以测量并比较暴露于不同pH范围内的细胞(例如，野生型的、未经治疗的患者细胞以及溶酶体活化剂治疗的患者细胞)的生长速率。细胞凋亡和细胞死亡分析法可用于评估细胞活力(viability)的pH敏感性。可替代地或额外地，使用共聚焦显微镜可以评估溶酶体pH以及pH对运输的影响。由细胞内吞的pH敏感的荧光探针可用于测量溶酶体和内体的pH值范围(即，荧光素在pH5.0时是红色的，而在pH5.5-6.5时是蓝色至绿色的)。在野生型的、以及溶酶体活化剂治疗的和未治疗的患者细胞中，可以对溶酶体形态和pH值进行比较。在一些实施方式中，该分析法可以与读板仪分析法并行进行，以测定pH敏感性。在一些实施方式中，使用如上所述的双标记实验，可以在细胞中不同pH值下评估酶至溶酶体的运输，可以用量子点或Dextran Blue测量暴露于不同pH值的细胞(野生型、分子伴侣治疗的和未治疗的患者细胞)的内吞率。在一些实施方式中，在Pagano，Phil Trans RSoc Lond B.，358-885-91，2003年中对描述使用荧光脂质类似物(例如，BODIPY-LacCer、-GM1神经节苷脂等)的分析法进行了描述。
在本发明的一些实施方式中，生化分析法可用于评估蛋白质功能，和/或测定蛋白质是否是功能性的，以及评估功能回复的效果、回复或破坏功能的效果。在一些这样的实施方式中，此类分析法在运输过程中的一个或多个不同的点(例如，从ER释放后、进入溶酶体后等)进行。
在许多实施方式中，将蛋白质活性分析法设计为在存在测试试剂或不存在测试试剂的情况下，测量感兴趣的蛋白质的活性。这样的分析法的细节将取决于被评估活性的具体蛋白质。例如，当所述蛋白质是酶时，使用底物进行的细胞内酶活性分析法是本领域常规的，可用于评估酶活性。可以使用正常动物和疾病状态动物模型进行酶活性的离体(exvivo)和体内(in vivo)评估。
本公开中已经使用不同的分析法证明GCase多肽的内源性突变影响其溶酶体运输，反过来又影响溶酶体蛋白水解，导致α-突触核蛋白的优先积聚。参见例如实施例1，实施例1描述了：经内切糖苷酶H(endo H)处理检测溶酶体中的成熟GCase多肽水平；经全细胞裂解物分析监测GCase活性；经BODIPY 493和免疫染色监测细胞脂质；经神经丝(NF)免疫染色监测神经毒性；和/或经由LAMP1免疫荧光分析监测溶酶体介导的通路中GCase多肽功能丧失的影响。实施例1进一步描述了如下分析法：使用以溶酶体酶抑制剂氯化铵和亮抑酶肽处理的神经元、以及利用放射性脉冲追踪实验，监测神经元中长寿命蛋白质的蛋白水解。实施例1还描述了通过使用免疫荧光和蛋白质印迹分析，用于监测α-突触核蛋白在原代和iPS神经元细胞中的积聚的方法。
本公开描述了使用不同分析法来描绘α-突触核蛋白介导的神经毒性的机制。参见例如实施例3，实施例3描述了通过使用尺寸排阻色谱、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹分析和免疫染色分析，监测α-突触核蛋白的可溶性高分子量低聚体。
本公开描述了使用不同分析法来描绘溶酶体酶底物(例如，GlcCer)介导的蛋白质(例如，α-突触核蛋白)的特异性聚集。参见例如实施例4，实施例4描述了使用电子显微镜(EM)和免疫EM、生物化学方法(如离心沉降分析、非变性凝胶电泳)、并通过使用8-苯胺基-1-萘磺酸盐结合(用于检测具有聚集倾向的构象的中间体的荧光染料)，在酸性条件下分析α-突触核蛋白的纤丝形成与GlcCer的脂质分散体混合物(Stryer，J.Mol.Biol.，13：482，1965年)。
多种***可用于监测蛋白质(例如，α-突触核蛋白)的体内积聚。参见例如实施例5，实施例5描述了使用组织病理学、免疫荧光以及与神经元特异性标志物共染色，以鉴别神经元内和神经元外的α-突触核蛋白积聚，对来源于GD小鼠模型的脑组织进行分析。实施例5还描述了使用C.elegans模型来证明在体内的GCase耗竭介导的α-突触核蛋白的积聚。此外，实施例6描述了使用由患有GD的患者获得的人死后脑样本来分析可溶性低聚α-突触核蛋白聚集的水平提高与神经退行性变之间的关系。
本公开描述了如下分析法：证明在蛋白质病(例如，PD)中作为蛋白质(例如，α-突触核蛋白)聚集/积聚的结果的野生型溶酶体酶(例如，GCase)的降低的运输和活性。参见例如实施例7，实施例7描述了通过使用SDS-PAGE评估GCase多肽的各种糖基化形式、蛋白质印迹、在溶酶体富集部分和微粒体富集部分中测定酶活性、以及endo H处理，监测过表达α-突触核蛋白的体外和体内模型的野生型GCase溶酶体酶的细胞内运输。
多种分析法可用于鉴别稳定和/或提高溶酶体酶的运输、导致酶的蛋白水解活性增强的候选溶酶体活化剂。参见例如实施例8，实施例8描述了对神经元细胞处理之后继以清洗(washout)(以通过除去活性位点结合物来活化溶酶体酶)，其利用溶酶体活化剂，即GCase药理学分子伴侣活化剂(例如，IFG)进行；通过蛋白质印迹和密度分析监测GCase多肽水平的升高；以及通过放射性脉冲追踪实验监测GCase多肽提高的蛋白水解活性。实施例8还描述了鉴别溶酶体活化剂的分析法，其中，与对照细胞相比，GCase在非神经元细胞中的过表达增强了溶酶体的蛋白水解(通过放射性脉冲追踪评估)。溶酶体抑制剂(如，亮抑酶肽和氯化铵)完全逆转这种作用，表明了GCase过表达导致主要溶酶体降解途径的增强(如候选溶酶体活化剂应该的)。实施例8进一步描述了通过测量GCase过表达对组织蛋白酶B活性的影响来鉴别候选溶酶体活化剂的分析法。在该分析法中，GCase过表达导致组织蛋白酶B对其底物降解的活性提高(如候选溶酶体活化剂应该的)。
本公开还描述了鉴别和/或表征刺激分泌途径的用于对蛋白质病进行治疗的潜在溶酶体活化剂的分析法。参见例如实施例9，实施例9描述了在过表达α-突触核蛋白(导致溶酶体运输缺陷)的人PD神经元细胞中过表达Rab1a多肽的效果。Rab1a多肽过表达导致α-突触核蛋白显著降低(如候选溶酶体活化剂应该的)。同样，通过监测组织蛋白酶B活性，Rab1a多肽介导的溶酶体功能的增强在以Rab1a多肽转染的非神经元细胞中可见。
本公开还描述了鉴别和/或表征在溶酶体酶中结合至变构位点的潜在溶酶体活化剂的分析法。参见例如实施例8和实施例10，后者描述了在以变构酶体活化剂处理后，在过表达α-突触核蛋白的人PD神经元中，α-突触核蛋白的剂量依赖性降低。这类化合物无需清洗步骤来活化溶酶体酶。
本公开还描述了证明某些候选溶酶体活化剂联合在一起时，示出/达到对溶酶体更强的稳定化和活化的分析法。参见例如实施例11，实施例11描述了当神经元由两种溶酶体调节剂联合处理时，与利用任一试剂单独处理相比，PD神经元中GCase多肽的成熟更显著地提高。
本公开还描述了测试溶酶体活化剂在物理上是否与溶酶体酶相互作用、和/或用于选择候选溶酶体活化剂用于体内评价的分析法，参见实施例13。
本领域技术人员将理解的是，任何种类的试剂均可在此类提供的分析法中进行测试和/或研究，以评估其作为根据本发明的溶酶体活化剂的特性和/或适宜性。例如，使用如本文所述的此类***，可以对上面所讨论的化学类型的作为溶酶体活化剂的试剂进行筛选、测试和/或确认作为用于根据本发明的适宜的溶酶体活化剂。
可以将本发明的一些实施方式定义为任意以下编号的段落：
1.一种方法，所述方法包括以下步骤：
对患有或易感神经退行性蛋白质病疾病、障碍和/或病症的受试者给予药物组合物，所述药物组合物包含：
溶酶体活化剂；以及
药学上可接受的载体，
所述溶酶体活化剂以一定的量、并根据给药方案给药，当依照预先确定的给药方案给予时，所述给药方案与预先确定的治疗益处相关联。
2.如段1所述的方法，其中，所述神经退行性蛋白质病疾病、障碍和/或病症选自于由以下疾病、障碍和/或病症所组成的组：
肾上腺脑白质营养不良、AIDS及AIDS相关的痴呆、嗜银颗粒病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(关岛型帕金森氏痴呆综合症或Lytico-Bodig疾病)、主动脉内侧淀粉样变性、情感淡漠、动脉粥样硬化、注意力缺失障碍(ADD)、注意力缺失多动障碍(ADHD)、自闭症、自身免疫性血管炎、B12缺乏症、双极型障碍、牛海绵状脑病、脑肿瘤、脑损伤、心律失常、脑血管疾病、脑淀粉样血管病(和冰岛型)、归因于电惊厥休克疗法的认知功能减退、归因于化疗的认知功能减退、归因于药物滥用史的认知功能减退、归因于睡眠呼吸暂停的清醒时的认知功能减退、缺氧后并发症、来自于脑内出血的并发症、皮质基底节变性、路易体痴呆、拳击员痴呆、齿状核-红核-苍白球-丘脑底核萎缩、抑郁、2型糖尿病、透析相关淀粉样变性、弥漫性路易体病、唐氏综合征、失读症、癫痫、家族性淀粉样多发性神经病、芬兰淀粉样变性、叶酸缺乏症、脆性X染色体综合征、脆性X染色体相关的震颤/共济失调综合征、脆性XE智力低下、额叶综合征、17号染色体连锁性额颞痴呆伴帕金森氏综合征、额颞叶变性、Friedrich共济失调、神经节神经胶质瘤、hallervorden-spatz病、肝性病症、遗传性非神经性全身性淀粉样变性、亨廷顿氏病、低血糖症、高血钙症、甲状腺功能减退症、脑积水、包涵体肌炎、感染性脉管炎、Kufs病、Kufor Rakeb病、孤立心房淀粉样变性(isolatedatrial amyloidosis)、格子状角膜营养不良、铅毒性脑病、路易体病、阿尔茨海默氏病的路易体突变、脂褐质沉积症、Lyme病、营养不良、枫糖尿病、甲状腺髓样癌、脑膜血管瘤病、代谢性疾病、轻度认知功能减退、多发梗塞性痴呆、多发性硬化、多***萎缩、重症肌无力、强直性肌营养不良症、神经纤维瘤病、神经性梅毒、伴随脑铁沉积I型的神经退行性变、烟酸缺乏症、帕金森氏病和帕金森氏病痴呆、Pick病、苯丙酮尿症、风湿性多肌痛、创伤后应激障碍、朊病毒病(Creutzfeldt-Jakob病)、泌乳素瘤(prolactinomas)、后冠状动脉旁路移植术、进行性核上麻痹、归因于正常衰老的蛋白质和脂质积聚、Rett综合征、类风湿性关节炎、精神***症、全身性红斑狼疮、脊髓小脑共济失调(1-8型、10-14型、16-29型)、脊髓延髓肌萎缩症(肯尼迪氏病)、散发性包涵体肌炎、贮积病、中风、亚急性硬化性全脑炎、梅毒、全身性AL淀粉样变性、硫胺素缺乏症、创伤性脑损伤、Tourette综合征、传染性海绵状脑病、结节性硬化症以及血管性痴呆。
3.如段1所述的方法，其中，所述神经退行性蛋白质病疾病、障碍和/或病症是突触核蛋白病。
4.如段3所述的方法，其中，所述突触核蛋白病疾病、障碍和/或病症是帕金森氏病。
5.如段3所述的方法，其中，所述突触核蛋白病疾病、障碍和/或病症是多***萎缩。
6.如段3所述的方法，其中，所述突触核蛋白病疾病、障碍和/或病症是弥漫性路易体病。
7.如段3所述的方法，其中，所述突触核蛋白病疾病、障碍和/或病症是路易体痴呆。
8.如段3所述的方法，其中，所述突触核蛋白病疾病、障碍和/或病症是伴随脑铁沉积I型的神经退行性变。
9.如段3所述的方法，其中，所述突触核蛋白病疾病、障碍和/或病症是关岛型帕金森氏痴呆综合症。
10.如段1所述的方法，其中，所述神经退行性蛋白质病疾病、障碍和/或病症是淀粉样蛋白病。
11.如段10所述的方法，其中，所述淀粉样蛋白病疾病、障碍和/或病症选自于由以下疾病、障碍和/或病症所组成的组：
肾上腺脑白质营养不良、AIDS及AIDS相关的痴呆、嗜银颗粒病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(关岛型帕金森氏痴呆综合症或Lytico-Bodig疾病)、主动脉内侧淀粉样变性、情感淡漠、动脉粥样硬化、注意力缺失障碍(ADD)、注意力缺失多动障碍(ADHD)、自闭症、自身免疫性血管炎、B12缺乏症、双极型障碍、牛海绵状脑病、脑肿瘤、脑损伤、心律失常、脑血管疾病、脑淀粉样血管病(和冰岛型)、归因于电惊厥休克疗法的认知功能减退、归因于化疗的认知功能减退、归因于药物滥用史的认知功能减退、归因于睡眠呼吸暂停的清醒时的认知功能减退、缺氧后并发症、来自于脑内出血的并发症、皮质基底节变性、路易体痴呆、拳击员痴呆、齿状核-红核-苍白球-丘脑底核萎缩、抑郁、2型糖尿病、透析相关淀粉样变性、弥漫性路易体病、唐氏综合征、失读症、癫痫、家族性淀粉样多发性神经病、芬兰淀粉样变性、叶酸缺乏症、脆性X染色体综合征、脆性X染色体相关的震颤/共济失调综合征、脆性XE智力低下、额叶综合征、17号染色体连锁性额颞痴呆伴帕金森氏综合征、额颞叶变性、Friedrich共济失调、神经节神经胶质瘤、hallervorden-spatz病、肝性病症、遗传性非神经性全身性淀粉样变性、亨廷顿氏病、低血糖症、高血钙症、甲状腺功能减退症、脑积水、包涵体肌炎、感染性脉管炎、Kufs病、Kufor Rakeb病、孤立心房淀粉样变性、格子状角膜营养不良、铅毒性脑病、路易体病、阿尔茨海默氏病的路易体突变、脂褐质沉积症、Lyme病、营养不良、枫糖尿病、甲状腺髓样癌、脑膜血管瘤病、代谢性疾病、轻度认知功能减退、多发梗塞性痴呆、多发性硬化、多***萎缩、重症肌无力、强直性肌营养不良症、神经纤维瘤病、神经性梅毒、伴随脑铁沉积I型的神经退行性变、烟酸缺乏症、帕金森氏病和帕金森氏病痴呆、Pick病、苯丙酮尿症、风湿性多肌痛、创伤后应激障碍、朊病毒病(Creutzfeldt-Jakob病)、泌乳素瘤、后冠状动脉旁路移植术、进行性核上麻痹、归因于正常衰老的蛋白质和脂质积聚、Rett综合征、类风湿性关节炎、精神***症、全身性红斑狼疮、脊髓小脑共济失调(1-8型、10-14型、16-29型)、脊髓延髓肌萎缩症(肯尼迪氏病)、散发性包涵体肌炎、贮积病、中风、亚急性硬化性全脑炎、梅毒、全身性AL淀粉样变性、硫胺素缺乏症、创伤性脑损伤、Tourette综合征、传染性海绵状脑病、结节性硬化症以及血管性痴呆。
12.如段10所述的方法，其中，所述淀粉样蛋白病疾病、障碍和/或病症是阿尔茨海默氏病。
13.如段10所述的方法，其中，所述淀粉样蛋白病疾病、障碍和/或病症是血管性痴呆。
14.如段10所述的方法，其中，所述淀粉样蛋白病疾病、障碍和/或病症是认知功能减退。
15.如段1所述的方法，其中，所述神经退行性蛋白质病疾病、障碍和/或病症是tau蛋白病。
16.如段15所述的方法，其中，所述tau蛋白病疾病、障碍和/或病症选自于由以下疾病、障碍和/或病症所组成的组：
肾上腺脑白质营养不良、AIDS及AIDS相关的痴呆、嗜银颗粒病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(关岛型帕金森氏痴呆综合症或Lytico-Bodig疾病)、主动脉内侧淀粉样变性、情感淡漠、动脉粥样硬化、注意力缺失障碍(ADD)、注意力缺失多动障碍(ADHD)、自闭症、自身免疫性血管炎、B12缺乏症、双极型障碍、牛海绵状脑病、脑肿瘤、脑损伤、心律失常、脑血管疾病、脑淀粉样血管病(和冰岛型)、归因于电惊厥休克疗法的认知功能减退、归因于化疗的认知功能减退、归因于药物滥用史的认知功能减退、归因于睡眠呼吸暂停的清醒时的认知功能减退、缺氧后并发症、来自于脑内出血的并发症、皮质基底节变性、路易体痴呆、拳击员痴呆、齿状核-红核-苍白球-丘脑底核萎缩、抑郁、2型糖尿病、透析相关淀粉样变性、弥漫性路易体病、唐氏综合征、失读症、癫痫、家族性淀粉样多发性神经病、芬兰淀粉样变性、叶酸缺乏症、脆性X染色体综合征、脆性X染色体相关的震颤/共济失调综合征、脆性XE智力低下、额叶综合征、17号染色体连锁性额颞痴呆伴帕金森氏综合征、额颞叶变性、Friedrich共济失调、神经节神经胶质瘤、hallervorden-spatz病、肝性病症、遗传性非神经性全身性淀粉样变性、亨廷顿氏病、低血糖症、高血钙症、甲状腺功能减退症、脑积水、包涵体肌炎、感染性脉管炎、Kufs病、Kufor Rakeb病、孤立心房淀粉样变性、格子状角膜营养不良、铅毒性脑病、路易体病、阿尔茨海默氏病的路易体突变、脂褐质沉积症、Lyme病、营养不良、枫糖尿病、甲状腺髓样癌、脑膜血管瘤病、代谢性疾病、轻度认知功能减退、多发梗塞性痴呆、多发性硬化、多***萎缩、重症肌无力、强直性肌营养不良症、神经纤维瘤病、神经性梅毒、伴随脑铁沉积I型的神经退行性变、烟酸缺乏症、帕金森氏病和帕金森氏病痴呆、Pick病、苯丙酮尿症、风湿性多肌痛、创伤后应激障碍、朊病毒病(Creutzfeldt-Jakob病)、泌乳素瘤、后冠状动脉旁路移植术、进行性核上麻痹、归因于正常衰老的蛋白质和脂质积聚、Rett综合征、类风湿性关节炎、精神***症、全身性红斑狼疮、脊髓小脑共济失调(1-8型、10-14型、16-29型)、脊髓延髓肌萎缩症(肯尼迪氏病)、散发性包涵体肌炎、贮积病、中风、亚急性硬化性全脑炎、梅毒、全身性AL淀粉样变性、硫胺素缺乏症、创伤性脑损伤、Tourette综合征、传染性海绵状脑病、结节性硬化症以及血管性痴呆。
17.如段15所述的方法，其中，所述tau蛋白病疾病、障碍和/或病症是阿尔茨海默氏病。
18.一种在受试者中降低α-突触核蛋白水平的方法，所述方法包括以下步骤：
对所述受试者给予药物组合物，所述药物组合物包含：
溶酶体活化剂；以及
药学上可接受的载体，
所述溶酶体活化剂以一定的量、并根据给药方案给药，当依照预先确定的给药方案给予时，所述给药方案与预先确定的治疗益处相关联。
19.如段18所述的方法，所述方法进一步包括在所述给予步骤之前确定个体中的α-突触核蛋白水平的步骤，如果所述α-突触核蛋白水平相对于参考值升高，则对所述受试者给予所述溶酶体活化剂以及药学上可接受的载体。
20.如段1、18或19所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂增加至少一种溶酶体酶的运输。
21.如段1、18或19所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂提高至少一种溶酶体酶的稳定性。
22.如段20或21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂提高溶酶体酶在溶酶体中的水平。
23.如段21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂提高溶酶体酶在溶酶体中的活性。
24.如段21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂增加溶酶体酶与其底物的结合。
25.如段1、18、19、20或21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂直接结合至溶酶体酶。
26.如段1、18、19、20或21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂不直接结合至溶酶体酶。
27.如段25所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂结合至除溶酶体酶催化位点或活性位点之外的位点。
28.如段25所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂以不与溶酶体酶底物竞争的方式结合。
29.如段20或21所述的方法，其中，所述溶酶体酶是β-葡糖脑苷脂酶。
30.如段29所述的方法，其中，所述β-葡糖脑苷脂酶为野生型。
31.如段29所述的方法，其中，所述β-葡糖脑苷脂酶为突变体。
32.如段1、18、19、20或21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂活化β-葡糖脑苷脂酶。
33.如段20或21所述的方法，其中，所述溶酶体酶是β-氨基己糖苷酶A/B。
34.如段33所述的方法，其中，所述β-氨基己糖苷酶A/B为野生型。
35.如段33所述的方法，其中，所述β-氨基己糖苷酶A/B为突变体。
36.如段1、18、19、20或21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂活化β-氨基己糖苷酶A/B。
37.如段20或21所述的方法，其中，所述溶酶体酶是β-半乳糖苷酶亚型1。
38.如段37所述的方法，其中，所述β-半乳糖苷酶亚型1为野生型。
39.如段37所述的方法，其中，所述β-半乳糖苷酶亚型1为突变体。
40.如段1、18、19、20或21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂活化β-半乳糖苷酶亚型1。
41.如段20所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是Rab1a多肽、或包含Rab1a多肽。
42.如段20所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是编码Rab1a多肽的核酸、或包含编码Rab1a多肽的核酸。
43.如段20所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂活化Rab1a多肽。
44.如段20所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂抑制Rab1a多肽的抑制剂。
45.如段21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是saposin多肽、或包含saposin多肽。
46.如段45所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂活化saposin多肽。
47.如段45所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂抑制saposin多肽的抑制剂。
48.如段45所述的方法，其中，所述saposin多肽是saposin C、或包含saposin C。
49.如段1、18、19、20或21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是小分子。
50.如段49所述的方法，其中，所述小分子直接结合至靶溶酶体酶。
51.如段49所述的方法，其中，所述小分子以不与酶底物竞争的方式结合至靶溶酶体酶。
52.如段49所述的方法，其中，所述小分子不抑制靶溶酶体酶的活性。
53.如段50、51或52所述的方法，其中，所述溶酶体酶是β-葡糖脑苷脂酶。
54.如段50、51或52所述的方法，其中，所述溶酶体酶是β-氨基己糖苷酶A/B。
55.如段50、51或52所述的方法，其中，所述溶酶体酶是β-半乳糖苷酶亚型1。
56.如段49所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是具有下式的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，环是式或者式的环***，
在(i)中，R5是任选取代的乙烯基团，R6和R7采用下文的定义；
在(ii)中，R5、R6和R7采用下文的定义；
R1是(单环碳环或双环碳环)C0-C4烷基或(单环杂环或双环杂环)C0-C4烷基，其各自是未取代的或取代有一个或多个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、-CHO、-COOH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烷酰基、单(C1-C6)烷基氨基或二(C1-C6)烷基氨基、单(C1-C6)烷基甲酰胺或二(C1-C6)烷基甲酰胺、C1-C6烷基酯、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基磺酰基、C1-C2卤代烷基和C1-C2卤代烷氧基；以及取代有0或1个取代基，所述取代基选自于Y-Z-，其中Z为共价键、C1-C4亚烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、-S-、-O-、-NR-、-C(O)-、-NHC(O)-、或-C(O)NH-，其中R是氢或C1-C4烷基，Y是苯基、嘧啶基、5元或6元杂环烷基、或吡啶基，其各自取代有0至3个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、单(C1-C4)烷基氨基或二(C1-C4)烷基氨基、三氟甲基、二氟甲基、三氟甲氧基和苯基；
R2是氢、C1-C6烷基、C3-C7环烷基、(苯基)C0-C2烷基；或者
R1和R2连接形成具有0或1个选自于N、O和S的额外杂原子的5元至7元杂环烷基环，其中，所述5元至7元杂环烷基环任选地与苯基或吡啶基稠合；所述5元至7元杂环烷基环是未取代的或取代有一个或多个取代基，所述取代基独立地选自于卤素、羟基、C1-C2烷基和C1-C2烷氧基；
R3是氢或C1-C2烷基；
R5是卤素、羟基、氨基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、二氟甲基、三氟甲基或苯基；
R6是卤素、羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；以及
R7是卤素、羟基、氨基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、二氟甲基或三氟甲基，或R7是苯基或具有1或2个选自于N、O和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，各R7通过共价键直接连接、或通过C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4烷基氨基连接，以及各R7是未取代的或取代有1至3个取代基，所述取代基独立地选自于C1-C4烷基、(单(C1-C2)烷基氨基或二(C1-C2)烷基氨基)C0-C4烷基；或者
R6和R7合在一起形成不具有额外不饱和位点的5元或6元碳环，所述环是未取代的或取代有1至3个取代基，所述取代基独立地选自于C1-C2烷基和C1-C2烷氧基；
其中，当R6为氢，R5和R7均为甲基，或者当R6为氢，R5和R7中一个是甲基、另一个是苯基，R1不是未取代的苯基、二氢茚基、苯并[b][1,4]间二氧杂环戊烯基、苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯基-5-基、环己基、吡啶基、或取代有1或2个取代基的苯基，所述取代基独立地选自于氯、氟、C1-C4烷基、C1-C2烷氧基、乙酰基、三氟甲基；以及当R6为氢，R5和R7中一个是甲基、另一个是苯基，R1不为1-(4-氟苄基)-1H-吡唑-4-基。
57.如段1、18、19、20或21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是药理学分子伴侣。
58.如段57所述的方法，其中，所述药理学分子伴侣直接结合至靶溶酶体酶。
59.如段57所述的方法，其中，所述药理学分子伴侣以不与酶底物竞争的方式结合至靶溶酶体酶。
60.如段57所述的方法，其中，所述药理学分子伴侣不抑制靶溶酶体酶的活性。
61.如段58、59或60所述的方法，其中，所述溶酶体酶是β-葡糖脑苷脂酶。
62.如段58、59或60所述的方法，其中，所述溶酶体酶是β-氨基己糖苷酶A/B。
63.如段58、59或60所述的方法，其中，所述溶酶体酶是β-半乳糖苷酶亚型1。
64.如段57所述的方法，其中，所述药理学分子伴侣是异法戈明。
65.如段1、18、19、20或21所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是蛋白质内稳态调节剂。
66.如段65所述的方法，其中，所述蛋白质内稳态调节剂不直接结合至靶溶酶体酶。
67.如段65所述的方法，其中，所述蛋白质内稳态调节剂是Ca2+通道阻断剂。
68.如段65所述的方法，其中，所述蛋白质内稳态调节剂是RyR的抑制剂。
69.如段67所述的方法，其中，所述Ca2+通道阻断剂是小分子。
70.如段69所述的方法，其中，所述小分子是地尔硫
71.如段69所述的方法，其中，所述小分子是维拉帕米。
72.如段68所述的方法，其中，所述RyR的抑制剂是小分子。
73.如段72所述的方法，其中，所述小分子是丹曲林。
74.如段1、18或19所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂以配制成用于口服给药的药物组合物的形式给予。
75.一种方法，所述方法包括以下步骤：
对患有或易感蛋白质病疾病、障碍和/或病症的受试者给予如下试剂的组合：
溶酶体活化剂；以及
至少一种第二治疗剂，
其中，所述溶酶体活化剂和至少一种第二治疗剂以单位剂量、并根据与预先确定的治疗益处相关联的治疗方案给予。
76.如段75所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是如段56所述的化合物，并且所述第二治疗剂用于帕金森氏病的治疗。
77.如段75所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是Rab1a多肽，并且所述第二治疗剂用于帕金森氏病的治疗。
78.如段75所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是编码Rab1a多肽的核酸，并且所述第二治疗剂用于帕金森氏病的治疗。
79.如段75所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是saposin C多肽，并且所述第二治疗剂用于帕金森氏病的治疗。
80.如段76、77、78或79所述的方法，其中，在帕金森氏病治疗中使用的所述第二治疗剂选自于由以下治疗剂所组成的组：
左旋多巴、卡比多巴、金刚烷胺、抗胆碱能药、儿茶酚-O-甲基转移酶、单胺氧化酶抑制剂、外周脱羧酶抑制剂、溴隐亭、培高利特、罗匹尼罗、普拉克索以及麦角内酯。
81.如段75所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是Rab1a多肽，并且所述第二治疗剂用于溶酶体贮积病的治疗。
82.如段75所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是编码Rab1a多肽的核酸，并且所述第二治疗剂用于溶酶体贮积病的治疗。
83.如段81或82所述的方法，其中，在溶酶体贮积病治疗中使用的所述第二治疗剂选自于由以下治疗剂所组成的组：
别孕烷醇酮、他汀、非诺贝特、烟酸、依泽替米贝以及消胆胺。
84.如段75所述的方法，其中，所述第二治疗剂是溶酶体活化剂。
85.如段75或84所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是小分子，并且所述第二治疗剂是多肽溶酶体活化剂。
86.如段75或84所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是小分子，并且所述第二治疗剂是抗氧化溶酶体活化剂。
87.如段75或84所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是抗氧化剂，并且所述第二治疗剂是多肽溶酶体活化剂。
88.如段85或86所述的方法，其中，所述小分子是如段56所述的化合物。
89.如段85或86所述的方法，其中，所述小分子是如段64所述的药理学分子伴侣。
90.如段85或86所述的方法，其中，所述小分子是葡糖神经酰胺合酶多肽的抑制剂。
91.如段90所述的方法，其中，所述葡糖神经酰胺合酶多肽的抑制剂选自于由以下抑制剂所组成的组：
N-丁基-脱氧野尻霉素、AMP-DMP、N-((1R,2R)-1-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)-1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-2-基)辛酰胺(Genz-112638)、2-(2,3-二氢-1-H-茚-2-基)-1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-2-基)乙酰胺(CCG-203586)以及EXEL-0346。
92.如段85或86所述的方法，其中，所述小分子是Ca2+通道阻断剂。
93.如段92所述的方法，其中，所述Ca2+通道阻断剂选自于由以下阻断剂所组成的组：
钙通道阻断剂的二氢吡啶基团、氨氯地平、非洛地平、依拉地平、拉西地平、尼卡地平、硝苯地平、尼古地平、尼鲁地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、尼伐地平、瑞西丁、阿尼帕米、地尔硫芬地林、氟桂利嗪、加洛帕米、米贝拉地尔、普尼拉明、噻帕米、维拉帕米、马来酸哌克昔林、芬地林、普尼拉明、盐、酯、酰胺以及前药。
94.如段85或86所述的方法，其中，所述小分子是RyR的抑制剂。
95.如段94所述的方法，其中，所述RyR的抑制剂选自于由以下抑制剂所组成的组：
丹曲林、兰尼碱、阿珠莫林、calquestrin以及普鲁卡因。
96.如段85或86所述的方法，其中，所述多肽是Rab1a多肽。
97.如段85或86所述的方法，其中，所述多肽是saposin C多肽。
98.如段75或84所述的方法，所述方法进一步包括至少一种第三溶酶体活化剂。
99.如段98所述的方法，其中，所述第三溶酶体活化剂选自于由以下活化剂所组成的组：
如段58所述的化合物、异法戈明、Rab1a多肽、编码Rab1a多肽的核酸、saposin C多肽、抗氧化剂、如段93所述的化合物、如段95所述的化合物以及如段97所述的化合物。
100.如段86、87或99所述的方法，其中，所述抗氧化剂是N-乙酰基-半胱氨酸。
101.如段75、84或98所述的方法，其中，单位剂量中的至少一个小于相同试剂单独给予时的参考单位剂量。
102.如段75、84或98所述的方法，其中，所述治疗方案包含以低于参考治疗方案中的剂量的给予频率给予的剂量，所述参考治疗方案中相同试剂单独给予。
103.一种降低细胞中蛋白聚集或积聚毒性的方法，所述方法包括以下步骤：对所述细胞给予治疗有效量的溶酶体活化剂。
104.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是如段56所述的化合物。
105.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是如段64所述的药理学分子伴侣。
106.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是如段91所述的葡糖神经酰胺合酶多肽的抑制剂。
107.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是如段93所述的Ca2+通道阻断剂。
108.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是如段95所述的RyR的抑制剂。
109.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是Rab1a多肽、或含有Rab1a多肽。
110.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是编码Rab1a多肽的核酸。
111.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是Rab1a多肽的活化剂。
112.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是Rab1a多肽的抑制剂的抑制剂。
113.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是saposin C多肽、或含有saposin C多肽。
114.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是saposin C多肽的活化剂。
115.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是saposin C多肽的抑制剂的抑制剂。
116.如段103所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是抗氧化剂。
117.如段116所述的方法，其中，所述抗氧化剂是n-乙酰基-半胱氨酸。
118.如段103所述的方法，其中，所述给予包括对***中的细胞进行给予。
119.如段118所述的方法，其中，所述***是体外***。
120.如段118所述的方法，其中，所述***包含有机体。
121.如段103所述的方法，其中，所述细胞是神经元细胞。
122.如段103所述的方法，其中，所述细胞是非神经元细胞。
123.如段103所述的方法，其中，所述细胞表达α-突触核蛋白。
124.如段103所述的方法，其中，所述细胞表达淀粉样蛋白。
125.如段103所述的方法，其中，所述细胞表达tau。
126.一种方法，所述方法包括以下步骤：
对患有或易感非溶酶体贮积病蛋白质病的受试者给予药物组合物，所述药物组合物包含：
溶酶体活化剂；以及
药学上可接受的载体，
所述溶酶体活化剂以一定的量、并根据给药方案给予，当依照预先确定的给药方案给予时，所述给药方案与预先确定的治疗益处相关联。
127.如段126所述的方法，其中，所述蛋白质病疾病、障碍和/或病症是增生性疾病。
128.如段126所述的方法，其中，所述蛋白质病疾病、障碍和/或病症是炎性疾病。
129.如段126所述的方法，其中，所述蛋白质病疾病、障碍和/或病症是心血管疾病。
130.一种方法，所述方法包括以下步骤：
对患有或易感溶酶体贮积疾病、障碍和/或病症的受试者给予药物组合物，所述药物组合物包含：
溶酶体活化剂；以及
药学上可接受的载体，
所述溶酶体活化剂以一定的量、并根据给药方案给予，当依照预先确定的给药方案给予时，所述给药方案与预先确定的治疗益处相关联。
131.如段130所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂提高Rab1a多肽的水平和/或活性。
132.如段130所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是抗氧化剂。
133.如段130所述的方法，其中，所述抗氧化剂是n-乙酰基-半胱氨酸。
134.如段130所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是如段56所述的化合物。
135.如段130所述的方法，其中，所述溶酶体活化剂是如段64所述的药理学分子伴侣。
136.如段130所述的方法，其中，所述溶酶体贮积疾病、障碍和/或病症选自于由以下疾病、障碍和/或病症所组成的组：
α-甘露糖苷贮积病I/II型、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、Batten病、Batten病(晚期婴儿型)、β-甘露糖苷贮积病、心律失常、胱氨酸贮积病、Danon病、Fabry病、Farber病、岩藻糖苷贮积病、Gaucher病、GM1-神经节苷脂贮积病I/II/III型、GM2-神经节苷脂贮积病I/II型、半乳糖唾液酸贮积病I/II型、Hunter综合征、Hurler综合征、Krabbe病、Kufs病、I-细胞病、粘脂贮积病IV型、Morquio综合征、粘多糖贮积病IX型、多硫酸酯酶缺乏症、Maroteaux-Lamy综合征、异染性脑白质营养不良、Niemann-Pick病、Pompe病、假性Hurler多营养不良、致密性成骨不全、Sandhoff病、Sanfilippo综合征A、Sanfilippo综合征B、Sanfilippo综合征C、Sanfilippo综合征D、Schindler病、scheie综合征、唾液酸尿症、Salla病、唾液酸贮积病I/II型、Sly综合征、Tay-Sachs病、Vogt-Spielmeyer病以及Wolman病。
137.如段130所述的方法，其中，所述溶酶体贮积疾病、障碍和/或病症是Gauche病。
138.一种鉴别和/或表征溶酶体活化剂的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含至少一种溶酶体酶的***；
使所述***与测试溶酶体活化剂接触；
当存在测试溶酶体活化剂时，测定溶酶体酶的水平或活性；
将测定的水平或活性与参考水平或活性相比较，从而相对于参考对所述测试溶酶体活化剂进行鉴别或表征。
139.如段138所述的方法，其中，所述***包含溶酶体。
140.如段138所述的方法，其中，所述***包含细胞。
141.如段138所述的方法，其中，所述***包含有机体。
142.如段138所述的方法，其中，所述***包含神经元细胞。
143.如段138所述的方法，其中，当存在参考溶酶体活化剂时，所述参考包括在其它可比条件下观察到的水平或活性。
144.如段138所述的方法，其中，所述方法进一步包括如下步骤：当不存在参考溶酶体活化剂时，将测定的水平或活性与在其它可比条件下观察到的水平或活性进行比较。
145.如段144所述的方法，其中，测定水平或活性的步骤包括测定运输的程度。
146.如段144所述的方法，其中，测定水平或活性的步骤包括测定聚集类型的程度。
实施例
结合下列实施例将更好地理解本发明。然而，应该了解的是，这些实施例仅用于说明性目的，并不意味着限制本发明的范围。对所公开的实施方式的各种改变和修饰对于本领域技术人员将是显而易见的，并且此类改变和修饰可在不背离本发明的精神和所附权利要求的范围的情况下做出，所述改变和修饰不受限制地包括涉及本发明的化学结构、取代基、衍生物、制剂和/或方法的改变和修饰。
实施例1:GCase多肽的耗竭损伤了蛋白降解能力并增加了神经元中的α-突触核蛋白水平
在这一实施例中的实验阐明了，神经元中GCase多肽的敲减(KD)导致溶酶体降解能力降低，进而α-突触核蛋白的水平增加。此外，在这一实施例中的实验还证实，GCase多肽中的内源性突变影响溶酶体蛋白水解，并引起α-突触核蛋白优先积聚。
为了测试神经元中GCase多肽KD的生物效果，shRNA介导的GCase多肽的KD通过慢病毒感染实现。这导致相比非转导神经元或对照杂乱(scrb)shRNA感染的神经元，GCase多肽水平减少50％(图1A和图1B)。在shRNA处理后，对GCase多肽的水平和活性进行监测。通过内切糖苷酶H(endo H)(切割内质网(ER)蛋白的高甘露糖部分的酶)处理对成熟的溶酶体GCase多肽的水平进行分析。这一分析揭示出，在用GCase多肽shRNA构建体感染后，具有较低水平的耐endo H GCase多肽，这表明溶酶体形式耗竭(图2A)。对全细胞裂解物的进一步分析显示出GCase多肽活性的下降(图1B)，以BODIPY 493观察到增加的细胞脂质，并通过免疫荧光观测到增加的GlcCer(图1C和图1D)。还通过质谱确证了GlcCer积聚，揭示出在GCase多肽耗竭神经元中GlcCer增加4倍，而神经酰胺及其它鞘脂的水平保持不变(图1B和图2D)。其它溶酶体蛋白和活性的分析表明，所述构建体特异性降低了GCase多肽(图2C-图2F)。通过神经丝(NF)免疫染色对GCase多肽KD时的神经毒性进行评价，所述神经丝免疫染色是在更严重的核毒性发生前对细胞培养中的神经炎变性进行检测的灵敏方法(Zala等，Neurobiol.Dis.20:785，2005)。这一分析揭示，当在转染后的7天(dpi)进行评价时并无神经毒性变化，这表明神经元在这一时段内有能力忍受GlcCer代谢途径中的改变。
在这一实施例中，还分析了活神经元中的长寿命蛋白的蛋白水解，并发现GCase多肽KD将这些蛋白的蛋白水解速度显著减少了40％(图1E和图2B)。在这一实施例中，进行了测试来确定GCase多肽KD是否影响了溶酶体降解途径。在这一测试中，将神经元用大家公认的溶酶体抑制剂氯化铵(NH4Cl)和亮抑酶肽进行处理。这些化合物在GCase多肽shRNA处理的细胞中并不附加地抑制蛋白水解，这说明GCase多肽KD影响溶酶体介导的途径(图1E)。还通过LAMP1(溶酶体标志物)的免疫荧光分析对此加以了证实，其揭示了神经元中LAMP1阳性色斑的积聚和增大(图2G)。
在这一实施例中，证明了GCase多肽的KD使α-突触核蛋白的稳定状态水平相对于对照增加了1.8倍，而另一疾病相关的有聚集倾向的蛋白tau的水平在这一具体研究中并未有改变(图1F)。在α-突触核蛋白的mRNA水平方面也不存在变化，这表明所观测到的α-突触核蛋白蛋白水平的增加由受损的蛋白降解造成(图1F)。在这一实施例中，还在人神经胶质瘤细胞系(H4)中进行了GCase多肽KD后的α-突触核蛋白水平分析，所述人神经胶质瘤细胞系在四环素可诱导启动子(“tet-off”)的控制下表达野生型(WT)α-突触核蛋白。将α-突触核蛋白表达通过Dox进行关闭以测定α-突触核蛋白降解速度，这揭示了GCase多肽KD阻碍α-突触核蛋白的清除(图1G)。
在这一实施例中，为了证实从上述原代细胞培养中获得的结果，由源自于GD患者的皮肤成纤维细胞的诱导多能干(iPS)细胞生成多巴胺能神经元。对GD iPS细胞的分析显示出Oct4、Tra-1-60、SSEA-4和nanog的表达，这表明GD iPS细胞包含必要的多能因子，以及正常的染色体数目、大小和基因组结构(图3A和图3B)。通过之前建立的方案(Seibler等，J.Neurosci.31:5970，2011)从iPS细胞诱导多巴胺能神经元，从而产生～80％的表达神经元特异性βIII微管蛋白的细胞以及～10％表达多巴胺能标志物酪氨酸羟化酶(TH)的细胞(图4A)。基因分型分析证实GDiPS神经元而不是WT iPS神经元在GCase多肽中藏有预期突变(N370S/84GG***)，并具有较低的GCase多肽水平和活性(图4B，表14)。另外，WT细胞和GD细胞并不含有之前示出的引起PD的其它突变(表14)。在GD iPS神经元中的放射性脉冲追踪实验显示出，相比WT细胞长寿命蛋白的蛋白水解下降，并且溶酶体抑制剂的加入并不进一步影响蛋白水解(图4C)。对短寿命蛋白的蛋白水解测量揭示出相比于WT细胞无变化(图4C，插图)。免疫荧光和蛋白印迹分析揭示出，相比于WT细胞，GD iPS神经元中的α-突触核蛋白蛋白水平剧增(图4D和图4E)。在这一研究中，在GD iPS神经元中并未观察到亨廷顿蛋白水平的变化，tau仅轻微变化，这表明GCase多肽突变主要影响α-突触核蛋白水平(图4E和图4F)。
表14：对从由iPS细胞生成的GD神经元和wt神经元中分离的基因组DNA进行的Sequenom MassARRAY基因分型分析
实施例2：GCase多肽的耗竭通过聚集依赖机制增强α-突触核蛋白介导的神经毒性
在这一实施例中的实验证明，GCase多肽KD通过聚合依赖机制促进α-突触核蛋白的积聚和神经毒性。
在这一实施例中，通过慢病毒转导使人α-突触核蛋白过表达。用人特异性抗α-突触核蛋白单克隆抗体(mAb)syn211和LB509进行的免疫染色揭示出，在神经元延伸(neuronal extensions)中预期的色斑染色模式与α-突触核蛋白的突触富集一致(图5A)(Maroteaux等，J.Neurosci.8:2804,1988)。在这一实施例中，为了调查α-突触核蛋白错误折叠对神经毒性的贡献，将PD相关的A53Tα-突触核蛋白突变体以及人工纤丝化无能突变体(artificial fibrillization-incompetent mutant)Δ71-82α-突触核蛋白(Giasson等，J.Biol.Chem.276:2380，2001)在原代神经元中进行表达，并观察到在7dpi时所有三种突变体的水平增加而不具有神经毒性(图6和图5B)。相反，伴以GCase多肽KD的人WTα-突触核蛋白的表达导致相比于对照，由NF强度测量和神经元体积测量(neuronal volumemeasurement)而来的活力(viability)具有～25％下降(图6A和图6B)。用mAb syn211进行的Triton X-100可溶性(T-sol)裂解物的蛋白质印迹分析表明，α-突触核蛋白蛋白水平增加了1.8倍，伴随着增强的毒性(图6C)。重要地，GCase多肽的KD还以相同于WTα-突触核蛋白的程度增强了滴度匹配的A53Tα-突触核蛋白感染的细胞的毒性，然而，在表达Δ71-82α-突触核蛋白的神经元中未观察到毒性(图6A和图6B)。通过对致密核的测量进一步确证了由WTα-突触核蛋白表达/GCase多肽KD而来的毒性(图5H，右)。在这一实施例中，还在感染后的稍后的时间点(10dpi)对神经元活力进行了测定，发现毒性在WTα-突触核蛋白/GCase多肽耗竭细胞中进一步增强(通过NF强度评估的～50％活力)(图5C)。由于GCase多肽KD导致A53T和Δ71-82α-突触核蛋白具有类似于WTα-突触核蛋白程度的增加(图6C)，毒性似乎依赖于α-突触核蛋白的第71-82位氨基酸，这是α-突触核蛋白聚合所需的主要疏水区域(Giasson等，J.Biol.Chem.276:2380,2001)。
实施例3：通过GCase多肽耗竭而来的增强的α-突触核蛋白介导的神经毒性取决于不同α-突触核蛋白种类的形成
这一实施例中的实验表明，GCase多肽介导的GlcCer代谢途径的改变影响有毒的可溶性和不可溶性α-突触核蛋白种类的形成，使得α-突触核蛋白的可溶性高分子量(HMW)形式稳定。
在这一实施例中，直接测定了GCase多肽KD是否影响神经元中α-突触核蛋白聚合。对裂解物进行连续提取，并将其分成T-sol部分和T-不溶部分，接着用mAb LB509进行蛋白质印迹。这揭示出，在GCase多肽KD的情况下，T-sol单体α-突触核蛋白种类(18kDa)增加，以及在大小为14kDa和39kDa之间迁移的T-不溶性α-突触核蛋白种类增加(图6D和图6E)。在这一实施例中，对所收集的部分利用非变性尺寸排阻色谱(SEC)继以SDS-PAGE/蛋白质印迹，对T-sol低聚α-突触核蛋白种类的存在进行确认。除洗脱为大小颗粒的正常单体形式以外，GCase多肽KD还引起分子半径为的HMW组装体形成(图6F)。有趣的是，对表达Δ71-82α-突触核蛋白的神经元的分析揭示出，在GCase多肽KD的情况下，洗脱谱没有变化(图6G)，这进一步表明GCase多肽KD诱导了可溶性HMW低聚α-突触核蛋白的形成(其取决于残基71-82)。这些结果进一步表明，α-突触核蛋白形成可溶性低聚体和不溶性种类的能力是由GCase多肽KD诱导的神经毒性的关键决定因素。
如上所论述的，与GCase多肽耗竭一起发生的增加的α-突触核蛋白水平和毒性可能由普遍的溶酶体抑制产生，或可能由于GlcCer脂质代谢的改变。为了区别这两种可能性，在这一实施例中，在表达WTα-突触核蛋白的神经元中用亮抑酶肽对溶酶体蛋白降解进行抑制，并对神经毒性进行评价。据发现，亮抑酶肽处理并未增强α-突触核蛋白介导的神经毒性(图5D和图5H)。生化分析揭示了在亮抑酶肽处理的细胞中T-不溶性α-突触核蛋白增加，但可溶性α-突触核蛋白的量无变化(图6D和图6E)。这通过免疫染色分析予以印证，所述免疫染色分析示出相比于对照细胞，亮抑酶肽处理细胞中具有增加的总α-突触核蛋白免疫染色强度(图5F)。SEC分析还示出在亮抑酶肽处理后，可溶性HMWα-突触核蛋白在神经元中是不可检测到的(图6H)，这与它们快速消耗变成不溶性种类一致。另外，在这一实施例中，当对由亮抑酶肽处理或GCase多肽KD得到的总α-突触核蛋白(可溶性的和不溶的)的增加进行比较时，发现这两种方法具有类似的效果(图5F)。蛋白质印迹分析还指出通过亮抑酶肽或GCase多肽KD，LC3-II(公知的溶酶体底物)的水平具有可比的增长(图5E)。因此，虽然亮抑酶肽或GCase多肽KD对总α-突触核蛋白水平有类似的作用，仅GCase多肽KD增加了稳定状态的可溶性HMWα-突触核蛋白的水平。在这一实施例中，将连续提取继以SDS-PAGE/考马斯亮蓝(CBB)染色用于对亮抑酶肽处理在总细胞蛋白可溶性方面的效果进行测定。有趣的是，发现虽然亮抑酶肽处理使总不溶蛋白的水平增加了2倍，但GCase多肽KD没有效果(图5G)。这一实施例表明，GCase多肽KD优先影响α-突触核蛋白的可溶性。
实施例4：GlcCer通过稳定可溶性低聚中间体而在体外影响α-突触核蛋白的聚集
这一实施例中的实验表明，GlcCer选择性地稳定on-pathway可溶性低聚中间体的形成以形成淀粉样蛋白纤丝，并且当GlcCer的浓度随这些可溶性on-pathway中间体的积聚持续而过量(surpassed)，它使得thioT阳性淀粉样蛋白纤丝迅速形成。
在这一实施例中，将由纯化的GlcCer和脑磷脂酰胆碱(PC)组成的脂质分散体在生理条件(pH 7.4，37℃)下与α-突触核蛋白进行孵育。电镜(EM)分析指出形成由聚合的GlcCer组成的小管(图7G-图7I)，类似于之前在患者和小鼠模型的Gaucher细胞中观察到的情况(Lee,PNAS 61:484,1968)。在生理条件下进行的α-突触核蛋白聚集的分析示出，GlcCer对纤丝形成无影响(图8)，这与以前观察到的结果一致(Martinez等，Biochemistry46:1868,2007)。
接着，在这一实施例中，在酸性条件(pH 5.0，37℃)下，对GlcCer对α-突触核蛋白纤丝形成的作用进行评定，以在体外模拟类溶酶体环境，因为神经元培养数据指出在GCase多肽KD的情况下α-突触核蛋白和LAMP1的共定位增加(图5H和图5I)。图组H和图组I中的数据表明，在GCase多肽敲减的情况下，增加的点状α-突触核蛋白结构与LAMP1(溶酶体标志物)共定位(图组H)。相比WTα-突触核蛋白/scrb shRNA细胞，WTα-突触核蛋白/GC耗竭细胞中致密核频率的增加(图组H)与神经元活力的下降一致。虽然证明了在7dpi进行评价时，相比未处理的对照细胞，对于亮抑酶肽处理的细胞，含有α-突触核蛋白/LAMP1共定位色斑的细胞的百分比显著增加(～90％)，并且未改变具有致密核的细胞的百分比(图组H)。然而，亮抑酶肽处理在之后的时间点(>12dpi)确实引起神经毒性。表达WTα-突触核蛋白的裂解物的亚细胞分级分离表明，相比scrb shRNA对照感染细胞，GCase多肽耗竭神经元的溶酶体富集部分(P2)含有更多的α-突触核蛋白；然而，在上清液部分观察到增加的可溶性α-突触核蛋白(图组I)。在P2中检测到的α-突触核蛋白处于T-sol 18kDa单体形式(图组I，左)、以及T-不溶性单体和多聚体(multimers)形式(图组I，右)。因此，这些数据证明，GCase多肽敲减增强了溶酶体富集的P2部分中积聚的LAMP1与α-突触核蛋白的共定位，并表明α-突触核蛋白可在GCase多肽耗竭神经元的溶酶体内积聚。
这一实施例中的实验揭示出，相比仅含有α-突触核蛋白的对照反应，含有脂质分散体(由90％PC和10％GlcCer(PC90/GlcCer10)组成)的酸式反应并未显著地影响α-突触核蛋白的纤丝形成(图7A和图8A)。然而，将GlcCer的量增加至75％但总脂质量保持不变(PC25/GlcCer75)，通过推迟不溶性thioT阳性α-突触核蛋白纤丝的形成(使停滞时间从2hr延长至16hr)(图7A)改变α-突触核蛋白纤丝形成的动力学谱。
如上所论述的，来自细胞培养实验的生化数据表明，GlcCer选择性地增加了α-突触核蛋白的可溶性HMW形式(图6)。因此，在这一实施例中，假定在体外所观察到的纤丝形成的推迟由可溶性低聚中间体种类的动力学稳定所引起。为了对此进行测试，对在含有PC25/GlcCer75的反应的停滞期(1hr-16hr)中形成的种类的性质通过生化分析方法进行表征。通过100,000×g离心获得反应混合物的可溶性部分，并在加入脂质后1hr和5hr时通过SEC/SDS-PAGE对其进行分析。这揭示出，在含有PC25/GlcCer75脂质分散体的样品中，HMW低聚α-突触核蛋白的量增加，所述HMW低聚α-突触核蛋白在和间洗脱，并且通过SDS-PAGE迁移到18kDa处(图7B)。另外，检测的结果是，相比对照，在含有PC25/GlcCer75的反应中SDS可溶性和热稳定二聚体(36kDa)、三聚体(54kDa)以及更高低聚种类(以大小颗粒洗脱)的量增加(图7B)。GlcCer诱导的可溶性低聚种类好像在1hr和5hr间增加，而在对照反应中低聚体和单体降低，这与它们消耗成为不溶性纤丝一致(图7B和图7C)。非变性凝胶电泳还揭示出720-1048kDa大小α-突触核蛋白种类的量增加(图8C和图8D)。另外，在这一实施例中发现，其它鞘脂并不显著地改变可溶性低聚体的量，这表明是GlcCer的特异性作用(图8E和图8F)。用syn505抗体(优先检测错误折叠的α-突触核蛋白)进行的免疫EM证明直径为～25-50nm的独立球状结构形成，所述球状结构有时好像合并形成更大的无定形结构(图7G，iii)。Syn505还在GlcCer管状结构上直接检测了α-突触核蛋白(图7G，i和iii)，而不是在仅GlcCer的反应(图7I)上直接检测，这表明了错误折叠的α-突触核蛋白与GlcCer的关联。通过8-苯胺基-1-萘磺酸盐(ANS)(用于检测具有聚集倾向的构象的中间体的荧光染料)结合(Stryer，1965)对α-突触核蛋白-GlcCer反应进一步进行分析。相比于对照反应，在与PC25/GlcCer75进行孵育的可溶性α-突触核蛋白样品中观测到增强的ANS荧光，这表明GlcCer的添加引起构象改变，所述构象改变使暴露于溶剂的疏水区域增加(图7D)。因为蛋白疏水性的变化与聚集倾向相关，这一观测结果表明，GlcCer在纤丝形成反应的停滞期中稳定了能够进行可溶性组装的中间体种类的形成。
另外，在这一实施例中，对动力学谱的检验表明，虽然GlcCer将纤丝形成的起始从2hr推迟至16hr，但一旦这一阶段开始它也促进纤丝组装(图7A)。相比于对照反应(组装发生在2hr-24hr)，含有PC25/GlcCer75的反应的纤丝组装期发生在16hr-24hr。此外，相比对照反应，在反应的最终阶段最大的thioT信号有2倍-3倍高(图7A)。对在组装完成并达到平衡后、在纤丝形成反应的最后阶段形成的聚集种类(在28hr时)进行进一步分析。100,000×g的离心沉降分析(对在可沉淀(pelletable，P)部分中的淀粉样聚集体和非淀粉样聚集体这二者进行检测)揭示出，GlcCer对可沉淀α突触核蛋白的量没有影响(图7E)。在用于沉降分析的相同反应混合物中，以thioT对促淀粉样α-突触核蛋白的测量揭示出，在含有PC25/GlcCer75的反应中检测出淀粉样蛋白的量存在3倍增加(图7E，下)。对α-突触核蛋白/GlcCer反应在24hr进行的免疫EM分析证实了～14nm宽的纤丝状结构的存在(似乎是从GlcCer小管中伸出)(图7H)，而仅α-突触核蛋白的反应含有纤丝状聚集体(图7F，i-iii)以及无定形聚集体(图7F，iv和v)这两者。综合来讲，这些数据表明GlcCer选择性地稳定了on-pathway可溶性低聚中间体的形成，以形成淀粉样纤丝。然而，由于这些可溶性on-pathway中间体的持续积聚(在体外在2hr-16hr发生)，GlcCer的浓度可能最终超过界限，并引起thioT阳性淀粉样纤丝的快速形成。
实施例5：可溶性α-突触核蛋白种类和不溶性α-突触核蛋白种类的积聚在GD小鼠中发生
这一实施例中的实验证明，GCase多肽耗竭促进了体内可溶性低聚α-突触核蛋白和不溶性α-突触核蛋白的形成，这与上述所述的细胞培养和体外数据一致。
在这一实施例中，对来自之前描述的GD小鼠模型(4L/PS-NA)的脑组织进行分析，以测定内源表达的α-突触核蛋白水平是否提升。对这一小鼠模型进行的在先分析指出了低水平的GCase多肽活性、GlcCer的神经元积聚、以及到20周龄时严重的神经学退化(Sun等，J.Lipid Res.46:2102,2005)。除GlcCer外，还对其它鞘脂的水平进行了测定，显示出乳糖神经酰胺、GM2、和GD3的积聚，但神经酰胺水平仍保持不变(图9A和图9B)。此处的神经病理学分析揭示出嗜酸性球状体的存在，这表明相比呈现出正常神经元构造的WT小鼠，在GD小鼠的多个脑区域(包括黑质(SN)和皮层(Ctx))中存在退化的神经元(图10A和图10D)。这些退行性变化发生，伴随在这些区域中α-突触核蛋白的水平增加(图10B)。免疫荧光分析揭示出存在点状结构形式(直径为<5μm)的α-突触核蛋白积聚，而WT小鼠显示出预计的α-突触核蛋白的正常神经纤维网(neuropil)染色图案(图10B-图10D)。这些变化并不局限在SN和Ctx，因为还在其它神经区域(包括小脑、海马和脑干)中观测到α-突触核蛋白积聚(Xu等，Mol.Genet.Metab.102:436,2010)。
另外，在这一实施例中，通过用神经元特异性标志物NeuN对神经元内(intraneuronal)α-突触核蛋白积聚和神经元外(extraneuronal)α-突触核蛋白积聚二者进行鉴定(图10C)，然而定量分析并未显示出显著的神经元缺失(图10D)。通过依次在Triton X-100缓冲液和2％SDS缓冲液中进行连续提取，在4L/PS-NA中对α-突触核蛋白的溶解度进行分析。syn202和SNL-1(对总α-突触核蛋白进行检测的抗体)都揭示出，相比WT小鼠，在4L/PS-NA小鼠中的T-solα-突触核蛋白水平增加(图10E，左，和图10F)。根据用syn202和syn505二者进行的检测，T-不溶性部分在WT小鼠中显示出预期的低水平α-突触核蛋白，并在4L/PS-NA小鼠中显示出更聚集的α-突触核蛋白(图10E，右，和图10F)。通过SEC进行的T-sol水平分析显示出假定低聚体形式(大小种类和 大小种类)的水平增加，而单体类似于对照小鼠(图10G和图10H)。对可溶性HMWα-突触核蛋白的定量揭示出相比对照小鼠，在4L/PS-NA小鼠中存在4倍增加(图10F和图10H)。α-突触核蛋白的分析已在之前另外描述的良好表征的GD小鼠模型(GCase多肽怀有GD相关的D409H功能丧失型突变)中予以证实(Xu等，Am.J.Pathol.163:2093,2003)。这揭示出，如通过免疫染色分析所观察到的，D409H小鼠在α-突触核蛋白点状结构方面具有类似增加(图9C)，并具有较高水平的可溶性低聚体和不溶性α-突触核蛋白种类(图9D)。最后，将良好建立的秀丽隐杆线虫模型用于进一步证明GCase多肽的耗竭引起体内α-突触核蛋白的积聚(图9E)。
实施例6：在GD脑中提升水平的可溶性HMWα-突触核蛋白与神经退行性变有关
在这一实施例中的实验表明，GCase多肽的不足促进低聚α-突触核蛋白的形成，并且在II型和III型GD脑中这些低聚体的发生表明它们还在年龄依赖的婴儿GD形式的发病中起作用。这一实施例中的数据还证明，有毒的低聚α-突触核蛋白在怀有GBA1突变的患者中提升并优选与疾病的神经性形式有关。
如上述所论述的，体外、细胞培养和GD动物模型数据表明，GlcCer积聚引起提升的可溶性α-突触核蛋白低聚体水平。因此，在这一实施例中，重点在于对从GD患者中获得的死后脑样品中的这些种类进行鉴定。通过非变性SEC对皮质样品的T-sol部分进行分析，然后使用mAb syn211对所收集的部分进行SDS-PAGE/蛋白质印迹。对不具有GBA1突变的健康对照进行的分析(表15)揭示出一般观察单体人α-突触核蛋白所得到的预期洗脱谱，其通过SEC主要以大小颗粒洗脱，通过SDS-PAGE迁移至18kDa(图11A-图11C)。对来自两个在病理上和临床上证实的非神经元病I型GD患者的皮质T-sol裂解物进行的分析揭示出类似于对照的α-突触核蛋白洗脱谱(图11D和图11E)，虽然单体α-突触核蛋白的总水平提升了(α-突触核蛋白水平，对照的％：对照＝100±12.6，GD I型(无PD)＝*243±53，值为平均值±平均值的标准误(SEM)，*p<0.05，n＝3对照，n＝2GD I型)。当对来自之前记载的诊断患有非典型帕金森氏病(APD)的GD患者的脑裂解物进行分析时(Tayebi等，Mol.Genet.Metab.73:313,2001)，观察到α-突触核蛋白水平显著增加(图11F)。α-突触核蛋白类似于对照作为大小颗粒洗脱，并通过SDS-PAGE迁移至18kDa，但是也有很大的比例(总T-sol的50％)作为较大的假定低聚种类在洗脱(或110-140kDa球状蛋白)。当通过变性SDS-PAGE进行分析时，在这一低聚部分中的α-突触核蛋白解析为22kDa、44kDa和75kDa的热稳定种类(图11F)。此处的数据表明，提升的低聚种类形式的T-solα-突触核蛋白主要在GD/APD脑中存在。
另外，在这一实施例中，在诊断为路易体痴呆(DLB)的患者中检测到提升的α-突触核蛋白低聚体水平，所述患者为GCase多肽突变纯合子或GCase多肽突变杂合子(图11G和图11K)。对从诊断为II型GD的婴儿和诊断为III型GD的3岁儿童中获得的死后脑裂解物进行的分析还显示出增加的在以上洗脱的低聚α-突触核蛋白(图11H-图11J)，不过在样品间观察到一些变化。对用syn211mAb检测到的低聚α-突触核蛋白的水平进行定量，发现具有神经元病表型的GBA1突变的纯合子携带者和杂合子携带者相比对照都含有显著较高水平的低聚体(图12C)。还检验出，这些GD样品含有较低的GCase多肽和活性水平(图12A、图12B和图12E)。
同时，在这一实施例中分析了尺寸为的低聚部分。用mAb syn303对此进行分析，所述mAb syn303为优先检测病理性的低聚α-突触核蛋白(Duda等，Ann.Neurol.52：205，2002)并可将潜在的有毒的α-突触核蛋白种类与无毒的α-突触核蛋白种类区分开来的抗体(Tsika等，J.Neurosci.30:3409,2010)。发现syn303免疫反应性在所有神经元病GD样品中均增加(图11L，图12D)。在大多数情况下，syn303与还用syn211检测的22kDa、44kDa和75kDa的种类发生反应(图11L)。
表15：对照和GD患者的临床数据
*各全细胞裂解物进行3次重复活性测量(值为平均值±SEM)；NA，不可得；WC，全细胞匀浆；P2，溶酶体富集部分；DLB，路易体痴呆。
实施例7：α-突触核蛋白的过表达抑制GCase多肽的细胞内运输，使得GCase多肽活性降低
这一实施例中的实验说明，α-突触核蛋白水平的正常变异在体内调制溶酶体成熟和GCase多肽的活性。这一实施例中的数据同时表明，在PD及其它突触核蛋白病中观察到的提升水平的α-突触核蛋白导致正常GCase多肽的降低的溶酶体活性，这可能反过来有助于低聚α-突触核蛋白的进一步增长和稳定。
大多数患有特发性PD的患者一定具有提升的α-突触核蛋白水平，但是它们在GBA1基因中并不怀有突变，因此有望具有GCase多肽的正常溶酶体功能。在这一实施例中，使α-突触核蛋白在表达WT GCase多肽的H4细胞和原代皮质神经元中过表达，并对后-ER形式进行测量以测定α-突触核蛋白是否破坏了GCase多肽的溶酶体成熟活性。通过SDS-PAGE/蛋白质印迹，经由对各种GCase多肽形式(由蛋白糖基化造成)的分子量(MW)分析来对GCase多肽的细胞内运输进行评价。GCase多肽的ER形式迁移至60kDa，而后-ER GCase多肽形式迁移至大于60kDa(Erickson等，1985)。对来自可诱导H4细胞的全细胞裂解物进行的分析表明，通过加入Dox 24hr或32hr使α-突触核蛋白表达水平降低，导致后-ER GCase多肽形式随之增加但使60kDa ER形式降低(图13A)。同样地，在原代皮质神经元中人WTα-突触核蛋白和A53Tα-突触核蛋白的过表达通过引起ER形式的积聚以及迁移至大于60kDa的后-ER形式的降低，还使后-ER GCase多肽/ER GCase多肽的比发生改变(图13B)。包含质粒的WTα-突触核蛋白和A53Tα-突触核蛋白的滴度匹配感染导致后-ER GCase多肽/ER GCase多肽比几乎相等的改变，虽然A53T的蛋白表达较低，这表明相比WT蛋白A53T更有效力地抑制了GCase多肽运输(图13B)。有趣的是，以比WTα-突触核蛋白稍微高的水平表达的Δ71-82α-突触核蛋白仅引起后-ER GCase多肽/ER GCase多肽比轻微改变(其相比空载体对照未有显著不同)(图13B)。为了验证通过蛋白质印迹观察到的GCase多肽糖基化模式中的改变与较低的GCase多肽的溶酶体活性相对应，对原代神经元培养的溶酶体富集部分(P2)和微粒体富集部分(P3)(图14A和图14B)中的酶活性进行测量。在P2部分，WTα-突触核蛋白和A53Tα-突触核蛋白的表达都导致相比对照GCase多肽活性显著降低，且P3活性随之增加(图13C)。相反地，Δ71-82α-突触核蛋白的表达并不影响GCase多肽溶酶体活性(图13C)。通过对裂解物的endo H处理证实所述结果，其揭示出，相比对照条件，在表达WTα-突触核蛋白的细胞的endo H处理样品中具有较高水平的endo H敏感GCase多肽(迁移低于60kDa)(图14C)。另外，对另一形成淀粉样形式的蛋白(poly Q扩展的亨廷顿蛋白片段548-72Q)抑制GCase多肽成熟的能力进行了测试，在这一研究中并未观察到变化(图14C)。另外，证实由α-突触核蛋白引起的ERGCase多肽积聚发生在蛋白水平，因为测量的表达α-突触核蛋白的神经元中的GBA1mRNA相比对照条件并未有不同(图14D)。感染神经元的P2部分中其它溶酶体蛋白的酶活性揭示出通过α-突触核蛋白表达仅有微小改变，这表明α-突触核蛋白优先对GCase多肽活性产生作用(图14E)。
另外，在这一实施例中，通过经GCase多肽蛋白质印迹对人皮质材料进行分析，测定了GCase多肽糖基化模式在体内是否对α-突触核蛋白的蛋白水平敏感。在对来自不具有常见GBA1突变并且年龄在65-80岁之间的几个被报道的健康对照的脑组织进行分析后(表16和表17)，在受试者间注意到α-突触核蛋白表达水平的自然变异。注意到对照样品1、2、4和6相对于样品3和5具有中等水平至高水平的α-突触核蛋白，所述样品3和5含有极低水平的α-突触核蛋白(图13D)。当通过蛋白质印迹对GCase多肽糖基化模式进行分析时，观测到与α-突触核蛋白水平有关的后-ER GCase多肽/ER GCase多肽比中的显著不同。虽然所有样品似乎具有类似水平的后-ER GCase多肽，具有低水平α-突触核蛋白的样品(样品3和样品5)含有少得多的60kDa ER形式(图13D)。Endo H消化还证实较高水平的ER含有的GCase多肽，其在endo H处理后迁移低于60kDa(图14F)。对来自所有含有低α-突触核蛋白的样品和含有高α-突触核蛋白的样品的全细胞裂解物的皮质组织中的GCase多肽活性水平进一步进行分析，并未观察到活性差异(图14H，左)。然而，当对P2GCase多肽活性和P3GCase多肽活性进行测定，发现“高”α-突触核蛋白样品的微粒体富集的P3部分含有显著较高的活性水平，但在P2部分未观察到变化(图14H)。用syn303进行的蛋白质印迹还揭示出，相比C5，在“高”α-突触核蛋白样品C6中具有较高水平的低聚氧化α-突触核蛋白(图14G)。这些发现表明，α-突触核蛋白蛋白水平的正常变化调制体内溶酶体成熟和GCase多肽活性。
上述数据中的观测结果(提升的α-突触核蛋白水平影响神经元中GCase多肽运输)引出如下假设：溶酶体GCase多肽功能可能在特发性PD脑中减弱。在这一实施例中，进一步观测到当与年龄和死后时间匹配的对照相比，在来自PD脑的扣带皮质(cingular cortex)的T-sol裂解物中总GCase多肽水平具有～40％下降(图13E)。另外，相对于年龄匹配的对照，在P2部分中的GCase多肽活性具有～50％下降，而在P3部分中未观测到变化(图13E，下)。基因分型分析揭示出，除含有杂合子突变N370S的一个样品外，这些患者在GBA1中并不怀有突变(表18)。一个样品(PD4)的GCase多肽活性具有低于所预期的50％的下降(对照的30％)，这可能表明通过α-突触核蛋白积聚额外抑制了GCase多肽(表18)。表19与图13相关。
表16：对照的临床数据。
C1 C2 C3 C4 C5 C6
种族 c NA c c c c
死亡年龄 65 NA 76 80 79 73
PMI NA NA 24 54 NA 22
C，白种人；PMI，死后间隔时间(postmortem interval)；NA，不可得
表17：对照的Sequenom MassARRAY基因分型分析
等位基因 蛋白
SNP ID 次要/主要 基因 突变 C1 C2 C3 C4 C5 C6
GBA--84GG G/DEL GBA1 L84TER DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL
GBA-N370S G/A GBA1 N370S A/A A/A A/A A/A A/A A/A
rs2230288 A/G GBA1 E326K G/G G/G G/G G/G G/G G/G
rs421016 A/C/G/T GBA1 L444P G/G G/G G/G G/G G/G G/G
表18：对照和PD样品的Sequenom MassARRAY基因分型分析
等位基因 蛋白
SNP ID 次要/主要 基因 突变 O.R. Ctrl1 Ctrl2 Ctrl3 PD1 PD2 PD3 PD4 PD5 PD6
GBA--84GG G/DEL GBA1 L84TER DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL DEL/DEL
GBA-N370S G/A GBA1 N370S 3.28 A/A A/A A/A A/A A/A A/A G/A A/A A/A
rs2230288 A/G GBA1 E326K G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G
rs421016 A/C/G/T GBA1 L444P G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G NC G/G
rs104893877 A/G SNCA A53T G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G
rs104893878 C/G SNCA A30P G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G
rs104893875 A/G SNCA E46K G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G
rs55774500 A/C PARKIN A82E C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C
rs5030732 A/C UCHL1 S18Y A/C C/C C/C C/C A/A C/C C/C A/A C/C
rs45539432 T/C PINK1 Q456TER C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C
PINK1 A344T T/A PINK1 A344T A/A A/A A/A A/A A/A NC A/A A/A A/A
rs28938172 C/T PARK7/DJ1 L166P T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T
rs74315351 A/G PARK7/DJ1 M26I G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G
rs74315353 C/G PARK7/DJ1 E64D G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G
rs35801418 G/A LRRK2 Y1669C A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A
rs34778348 A/G LRRK2 G2385R G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G G/G
rs356221 T/A SNCA NA 1.35 T/A T/A T/A A/A T/A A/A T/A T/T T/A
rs356219 G/A SNCA NA 1.28 A/A G/A G/A A/A G/A G/G G/A G/A G/A
rs2736990 T/C SNCA NA 1.27 T/C T/C T/C T/T T/C C/C T/C C/C T/C
rs823128 G/A NUCKS1 NA 0.76 G/A A/A A/A A/A A/A G/A A/A A/A A/A
rs11240572 A/C PM20D1 NA 0.75 A/C C/C C/C C/C C/C A/C C/C C/C C/C
rs11012 A/G PLEKHM1 NA 0.77 G/G G/G G/G G/G G/G G/G A/A G/G G/G
rs823156 A/G SLC41A1 NA 0.83 A/G G/G A/A A/G A/A A/G A/A A/A A/A
rs1564282 T/C GAK NA 1.29 C/C C/C C/C C/C C/C C/C T/C T/C C/C
rs4538475 G/A BST1 NA 0.88 A/A A/A A/G A/A A/G A/A A/A A/A A/A
O.R.，比值比；NC，无细胞
表19.对照和PD患者的临床数据
C，白种人；m，男性；f，女性；PMI，死后间隔时间；NA，不可得
实施例8：作为治疗神经元蛋白质病和非神经元蛋白质病的GCase多肽活化
这一实施例中的实验证明，通过药理学分子伴侣处理或GCase多肽过表达而增强的GCase多肽功能使溶酶体降解途径活化。因此，这一实施例中的数据还表明，GCase多肽功能的活化不仅在以α-突触核蛋白积聚为特征的疾病中、而且在以神经元蛋白积聚和非神经元蛋白积聚为特征的其它疾病中具有治疗上的益处。
在这一实施例中，用GCase多肽的药理学分子伴侣活化剂(异法戈明(IFG))对由未受影响的对照的iPS细胞生成的人多巴胺神经元进行处理。通过基因分型分析，证实这些细胞不怀有最常见的GBA1突变中的任何一个，所述最常见的GBA1突变包括N370S、L444P、L84TER和E326K。用100μM IFG对野生型神经元处理5天然后清洗一天使GCase多肽的水平增加(图15A和图15B)。这一增加可能是由于如下事实：野生型GCase多肽在ER中偶而错误折叠并被降解(在ER中制造的总量的约30％)，而IFG看来似乎还稳定了该野生型错误折叠形式。然后通过如下所述的放射性脉冲追踪对蛋白水解速率进行测定，揭示出相比对照所述蛋白水解速率在IFG处理的神经元中具有3倍增加(图15C)。这表明GCase多肽活性与增强的降解能力有关。
上述论述表明，由IFG进行的GCase多肽活性的调制加强了溶酶体蛋白水解。在这一实施例中，进一步测定了上述论述的效果是否还能够用非天然位点结合化合物进行重复，该化合物可作为GCase多肽的变构活化剂，因此不像IFG那样，不需要清洗来使GCase多肽活化。对来自最近鉴定出的一系列变构GCase多肽活化剂(Goldin等，PLoS One 7：e29861，2012)中的此类化合物进行测试，并在化合物处理后观察到溶酶体降解能力的显著增强(图16A-图16B)。
另外，在这一实施例中，评价了GCase多肽过表达是否具有在非神经元细胞系中直接增强溶酶体蛋白水解的能力。用myc标记的GCase多肽表达构建体对Hela细胞进行转染，然后通过放射性脉冲追踪对溶酶体蛋白水解进行评价(图17A)。相比GFP对照转染的细胞，GCase多肽过表达引起蛋白水解～40％增加。这一效果通过添加公知的溶酶体抑制剂(亮抑酶肽和氯化铵)被完全反转。这表明，GCase多肽过表达使得主要为溶酶体介导的降解途径加强。还通过如下不同分析法证实了这一效果：通过测量GCase多肽过表达对溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B的活性的影响。向转染的Hela细胞中加入细胞渗透性荧光标记的组织蛋白酶B底物(MAGIC RED组织蛋白酶检测试剂盒，Immunochemistry Technologies，www.immunochemistry.com)，并在底物清洗后对活细胞中这一底物的降解进行测定。这揭示出相比表达GFP的转染细胞，GCase多肽转染细胞中的组织蛋白酶B活性增加(图17C)。
实施例9：作为治疗神经元蛋白质病和非神经元蛋白质病的分泌途径刺激
这一实施例中的实验证明，通过Rab1a多肽过表达对分泌途径的增强增强了溶酶体功能，并且，重要的是，减少了人中脑多巴胺神经元中的α-突触核蛋白水平。这一实施例中的数据说明，Rab1a多肽通常具有刺激溶酶体蛋白水解的能力，类似于GCase多肽过表达的效果。因此，这一实施例中的数据表明，Rab1a多肽活性的刺激还能在以蛋白积聚为特征的其它疾病中提供治疗益处。同时，由于Rab1a和GCase多肽二者均广泛表达，这一效果应该在神经元组织和非神经元组织中均明显。
如上所论述的，蛋白积聚破坏GCase多肽的溶酶体运输，这导致GCase多肽活性降低，并因此造成受损的溶酶体蛋白水解。在这一实施例中，研究了通过刺激分泌途径增强溶酶体酶运输是否会导致增加的溶酶体功能和α-突触核蛋白的减少。因此，在这一实施例中，通过慢病毒感染使小GTPase Rab1a多肽在iPS神经元中过表达，从而刺激酶运输。已确定了Rab1a多肽在分泌途径的ER-高尔基体步骤处特异性发挥功能(Duvernay等，Cell Signal17:1457,2005)。对来源于PD患者的重编程成纤维细胞(Coriell系ND27760)的人iPS多巴胺神经元中的Rab1a多肽的作用进行测定。这些细胞在含有SNCA(编码α-突触核蛋白)的基因组区域中怀有三体化(triplication)突变，导致蛋白过表达和溶酶体运输缺损。当以5感染复数(moi)进行感染，Rab1a多肽在人PD多巴胺神经元中的过表达引起α-突触核蛋白水平显著减少(图18A)。在这一实施例中，进一步通过对组织蛋白酶B活性进行监测，测定了Rab1a多肽是否增强了溶酶体功能。如上所述对感染的Hela细胞中的组织蛋白酶B的活性进行测定，揭示出组织蛋白酶B活性增加，这表明通过Rab1a多肽增强了溶酶体功能(图18B)。
实施例10：由变构结合化合物(allosteric binding compounds)引起的溶酶体GCase多肽活化减少了来自PD患者的人中脑神经元中的α-突触核蛋白水平
这一实施例中的实验证明，变构结合化合物导致GCase多肽活化和减少的α-突触核蛋白水平。因此，这一实施例中的数据表明，不干扰GCase酶活性位点的变构化合物代表了用于治疗以蛋白聚集体的积聚为特征的突触核蛋白病及其它神经退行性疾病的新治疗策略。
在这一实施例中，人中脑iPS多巴胺神经元从健康对照以及从怀有SNCA基因组区域三体化的PD患者生成，并如本发明所论述地在GCase多肽变构活化剂NCGC00188758存在的情况下进行培养，其中NCGC00188758的结构式为：通过蛋白质印迹分析对α-突触核蛋白水平进行测定，并证明在来自健康的未受影响对照的神经元中以及从PD患者中生成的神经元中的α-突触核蛋白中的剂量依赖性降低(图19A)。在这一实施例中还表明，用GCase多肽活化剂进行的处理增加了总GCase蛋白的水平并增加了后-ER形式，这表明入溶酶体的通量提高(图19B)。
实施例11：用GCase多肽的分子伴侣和抗氧化剂的联合对神经元进行处理增加了后-ER形式的GCase
在这一实施例中的实验表明，将稳定和活化GCase多肽的化合物与抗氧化剂联合，产生对致病反馈回路更有效的破坏，所述致病反馈回路起源于如上所述的α-突触核蛋白积聚。这一实施例中的数据还表明，相比单独靶向三种途径(包括GCase多肽活化、分泌途径增强、以及抗氧化功能)中任意一种的疗法，靶向神经元中这三种关键途径的联合疗法将提供更大的益处。
在这一实施例中，测试了将GCase多肽药理学分子伴侣IFG与抗氧化剂n-乙酰基-半胱氨酸(NAC)联合对PD iPS神经元中GCase多肽成熟的影响。将神经元用IFG、NAC中任一种、或者IFG和NAC一起进行处理，并通过蛋白质印迹对GCase多肽成熟进行分析。这表明，相比单独进行的处理，用IFG和NAC二者一起的处理引起后-ER(成熟的)GCase多肽出现3倍增加(图20A-图20B)。
实施例12：神经节苷脂影响α-突触核蛋白聚集
在这一实施例中的实验证明，神经鞘脂(即，神经节苷脂)稳定并增强了可溶性α-突触核蛋白低聚体。
相比于仅α-突触核蛋白的对照，使用10:1的脂质:蛋白比将α-突触核蛋白与神经节苷脂GM1或总脑神经节苷脂孵育15hr导致可溶性α-突触核蛋白低聚体显著稳定和提高(图21)。
除了患有神经节苷脂贮积病的患者脑中α-突触核蛋白积聚的文件记载(Suzuki等，Acta Neuropathol 114:481，2007)外，这一实施例中的数据表明，通过增强神经节苷脂代谢酶使神经节苷脂水平降低将在帕金森氏病以及其它突触核蛋白病中提供益处。这些酶包括但不限于溶酶体β-氨基己糖苷酶A/B/S和β-半乳糖苷酶亚型1。
实施例13：对由溶酶体活化剂进行的溶酶体酶活性调制进行监测的示例性分析法
高效液相色谱-质谱(LC-MS)水解分析法：这一分析法使用与质谱联系的液相色谱对样品(脾脏匀浆)中的溶酶体酶(例如，GCase)切割亲荧光(pro-fluorescent)底物4-甲基伞形酮-β-d-吡喃葡萄糖苷(4MU-Glc，蓝色产荧光底物)或C12-BODIPY-GlcCer的能力进行评价。然后，使用HPLC对停止的酶反应进行色谱法。可使用这一分析法，通过对底物周转的剂量依赖活性进行监测，来对溶酶体活化剂的活性进行分析。
微尺度热泳(Microscale thermophoresis，MST)分析法：MST为最近开发出的在可控温度梯度下对分子运动进行测量的技术。这一分析法可用于测定溶酶体活化剂是否在物理上与GCase多肽相互作用。MST使用荧光标记的多肽靶标，结合至配体后，所述荧光标记的多肽靶标可示出该多肽分子沿温度梯度运动中的变化。由于这一技术的低蛋白要求及其灵敏度，其最适于结合分析。
吸收、分布、代谢及***(ADME)分析法和药物动力学：对用于体内评估的可能的溶酶体活化剂候选物的选择可通过在这些药剂上进行ADME研究来完成。可在小鼠肝微粒体中对代表性溶酶体活性剂的稳定性进行检查。可在标准caco-2渗透性分析法中对最强溶酶体活化剂的渗透性进行分析。例如，0.3的外排比(efflux ratio)表明所述化合物不能被caco-2单层中表达的ABC转运蛋白识别，因此预期所述化合物具有较好的口服吸收并可能渗透通过血脑屏障。
基于从ADME研究而来的溶酶体活化剂效力，可开始小鼠PK研究以进行体内原理论证(proof-of-principle)研究。
材料和方法：
抗体
使用了以下抗α-突触核蛋白抗体：Syn202(mAb,Covance,http://www.covance.com,#MMS-529R,1:1000蛋白质印迹[WB])、Syn505(mAb,Invitrogen,http://www.invitrogen.com,#35-8300,1:500WB)、SNL-1(pAb,Benoit I.Giasson的礼物,University of Pennsylvania,1:1000WB)、syn211(mAb,Sigma-Aldrich,http://www.sigma-aldrich.com,#S_5566,1:1000WB,1:400免疫细胞化学(ICC))、LB509(mAb,Invitrogen#18-0215,1:500WB,1:100ICC)、Syn303(mAb,Harry Ischiropoulos的礼物,TheChildren's Hospital of Philadelphia,1:500WB)、抗α-突触核蛋白C末端(pAb,Abcam,http://www.abcam.com,#ab85862,1:200IHC，图10B中)、抗α-突触核蛋白(pAb,Abcam,#ad52168,1:250IHC,图10C中)。
其它抗体：抗神经特异性烯醇化酶(neural specific enolase)(pAb,Polysciences,http://www.polysciences.com,#16625,1:2000WB,47kDa)、抗波形蛋白(mAb,BD PharMingen,http://www.bdbiosciences.com,#550513,1:500WB,57kDa)、抗葡糖脑苷脂酶(pAb,Sigma-Aldrich,#G4171,1:1000WB,在Tris甘氨酸中为55-70kDa,在MOPS/Bis-Tris中为51-70kDa)、抗α-微管蛋白(mAb,Sigma-Aldrich,#T-6074,1:5000WB,50kDa)、抗LC3(pAb,Abgent,http://www.abgent.com,#AP 1802a,1:500WB,14-16kDa)、抗LC3(pAb,Cell Signaling,http://www.cellsignal.com,#2775,1:50ICC)、抗神经丝(neurofilament)(mAb,Developmental Studies Hybridoma Bank,University of Iowa,http://dshb.biology.uiowa.edu,#2H3,1:1000ICC)、抗LAMP 2(pAb,Invitrogen,#51-2200(Igp96),1:500WB,90-100kDa Tris甘氨酸,70-95kDa MOPS/Bis-Tris)、抗LAMP 1(大鼠mAb,Developmental Studies Hybridoma Bank,University of lowa，，#ID4B,1:50ICC)、抗LAMP1(mAb,Santa Cruz Biotechnology,http://www.scbt.com,#sc-20011,1:500WB,110kDa)、抗组织蛋白酶D(山羊pAb,Santa Cruz Biotechnology,#sc-6487,1:500WB,50、44、28kDa)、抗酸性神经酰胺酶(山羊pAb,Santa Cruz Biotechnology,#sc-28486,1:500WB,60kDa)。抗葡糖神经酰胺(pAb,Glycobiotech,http://www.glycobiotech.com,#RAS_0011,1:50ICC)、抗Oct4(pAb,Abcam,#ab19857,1:400ICC)、抗Tra-1-60(mAb,Millipore,http://www.millipore.com,#MAB4360,1:400ICC)、抗SSEA-4(mAb,Millipore,#MAB4304,1:200ICC)、抗Nanog(pAb,Abcam,#ab21624,1:200ICC)、抗神经元III类β-微管蛋白(TUJ1)(Covance,http://www.covance.com,#MMS-435P,1:2000ICC)。抗酪氨酸羟化酶(pAb,EMD chemicals,http://www.emdchemicals.com,#657012,1:1000ICC)、抗NeuN(mAb,Millipore,#MAB377,1:100IHC)、抗GRP78BiP(4E3)(mAb,Abcam,#ab96483,1:500WB,66kDa)、抗钙联蛋白(pAb,Enzo Life Sciences,http://www.enzolifesciences.com,#ADI-SPA-865,1:500,WB,90kDa)、抗Tau(pAb,Dako,http://www.dako.com,#A0024,1:1000WB)、抗亨廷顿蛋白(mAb,Millipore,#MAB5490,1:1000WB)。
质粒
表达针对小鼠GCase多肽的shRNA或杂乱序列对照的慢病毒质粒处于pLKO.1载体骨架中，并从Open Biosystems获得(http://www.openbiosystems.com,item#RMM3981-98834484，小鼠：5’-cga ctt cca gtt atc caa ctt-3’)，在具有100μg/ml羧苄青霉素的DH5-α感受态细胞(Sigma-Aldrich#C-9231)中增殖。表达人WTα-突触核蛋白或突变α-突触核蛋白的pCDNA质粒为之前所描述的(Mazzulli等，J.Biol.Chem.282:31621,2007)。将α-突触核蛋白编码序列亚克隆进pENTR1A(Invitrogen#A10462)中的Kpnl/Xhol位点，并在25μg/ml卡那霉素(Fisher Scientific,http://www.fisherscientific.com,#BP906-5)存在的情况下在One Shot TOP10感受态细胞(Invitrogen#C4040-10)中增殖。使用gateway克隆***(Invitrogen,LR recombination reaction,#11791-020)，通过重组将来自pENTR1A-α-突触核蛋白构建体的α-突触核蛋白编码序列转入含有小鼠磷酸甘油酸激酶启动子的SIN-W-PGK慢病毒载体骨架(Deglon等，Hum.Gen Ther.11:179,2000)，然后用Psil进行消化以降低pENTR1A背景。SIN-W-PGK-α-突触核蛋白构建体在具有100μg/ml羧苄青霉素的情况下在TOP10细胞中增殖。
原代皮质培养、慢病毒感染和亮抑酶肽处理
原代皮质培养过程已在之前被详细描述(Tsika等，J.Neurosci.30:3409,2010)。用表达GCase多肽shRNA的慢病毒和表达α-突触核蛋白的慢病毒以感染复数(moi)3来感染细胞。关于亮抑酶肽处理，在体外(days in vitro，DIV)5天时用表达α-突触核蛋白的慢病毒感染细胞，然后在DIV 8时用50μM亮抑酶肽(EMD chemicals,http://www.emdchemicals.com)进行处理，在DIV 12(或dpi 7)时收获。
神经毒性评价
将皮质细胞以50,000细胞/孔接种于96孔板，在DIV 5进行感染，并在指定的时间点将其固定于4％多聚甲醛中。染色和分析过程已被描述(Tsika等，J.Neurosci.30:3409,2010)。
对细胞培养物和组织的连续生化提取(Sequential biochemicalextraction)
将细胞收获在Triton X-100裂解缓冲液中。将提取物以100,000×g离心30min。在2％SDS缓冲液中对沉淀进行提取。对小鼠脑组织和人脑组织采用类似的过程，使用20体积的Triton X-100裂解缓冲液。如下所述，将样品加载于SDS-PAGE凝胶，或使样品经历非变性SEC继以蛋白质印迹分析(Mazzulli等，J.Neurosci.26:10068,2006)。
非变性SEC
如之前所述，将感染的皮质细胞(8,000,000细胞/10cm板)收获在Triton X-100裂解缓冲液中，并将100,000×g Triton X-100可溶性裂解物加载于Superdex 200HR 10/300柱(GE healthcare,http://www.gelifesciences.com)中(Mazzulli等，J.Neurosci.26:10068,2006)。在以前已对α-突触核蛋白低聚体的定量进行了详细的描述(Tsika等，J.Neurosci.30:3409,2010)。
α-突触核蛋白纯化和淀粉样蛋白的测量
如以前所述，从BL21CodonPlus(DE3)-RIL感受态大肠杆菌(E.coli)(Agilent)中纯化重组人α-突触核蛋白(Mazzulli等，J.Biol.Chem.282:31621,2007)。如下所述，将纯化的α-突触核蛋白与脂质分散体混合，并通过硫代黄素T结合对淀粉样蛋白的形成进行测定。
亚细胞分级分离
将感染的皮质细胞(8,000,000细胞/10cm板)收获于含有10mMHEPES(pH 7.4)和0.1M EDTA(SHB)的0.25M蔗糖缓冲液中，均质化(homogenized)，然后在4℃、6,800×g下离心5min。保存余留的沉淀(P1)。将上清液在4℃以17,000×g离心10min，移去上清液(S)，保存余留的溶酶体富集的沉淀(P2)。将S部分在100,000×g下离心1hr以获得P3。如上所述，将沉淀依次在1％Triton X-100裂解缓冲液和2％SDS缓冲液中进行提取。如下所述，通过蛋白质印迹分析或通过对GCase多肽活性进行测量来对这些部分进行分析。
统计分析
将单因素ANOVA与Tukey's post-hoc检验用于如下分析：蛋白水解、神经毒性、LC3和α-突触核蛋白的免疫染色定量、P2和P3的GCase多肽活性分析法、ANS以及硫代黄素T测定。将单因子ANOVA与Dunnet's post-hoc检验用于皮质神经元的后-ER GCase多肽/ERGCase多肽比。双尾学生t检验用于如下分析：生化分析、α-突触核蛋白和GCase蛋白水平的定量、BODIPY 493荧光分析以及脂质组(lipidomic)分析。p值小于0.05被认为显著。用GraphPad Prism软件4.0版(http://www.graphpad.com)进行统计计算。
Gaucher病小鼠模型的组织学分析
在以前，已描述了与次形态(hypomorphic)prosaposin突变小鼠(PS-NA)杂交的表达V394L(4L)纯合点突变的gba1小鼠(Sun等，2005)。关于组织学分析，对12周龄的4L/PS-NA小鼠脑进行灌注，并将其固定于4％多聚甲醛中，然后通过苏木精和伊红染色对黑质(SN)和皮质(Ctx)的8μm切片的神经退行性变进行分析。关于α-突触核蛋白免疫荧光分析，将切片在具有0.4％Triton X-100的10％山羊血清/PBS中进行封闭，然后依次与抗α-突触核蛋白抗体(1:200,abcam#ab85862)和抗山羊缀合Alexa610二抗进行孵育。图像用Zeiss ApotomeAxioV 200显微镜(400×)捕获。关于NeuN/α-突触核蛋白共定位，将一抗稀释于1×PBS(兔抗α-突触核蛋白[Abcam,ad52168]，1:250和鼠抗NeuN[Millipore,MAB377]，1:100)，然后施加于所述脑切片4℃过夜。用1×PBS-0.2％Triton X-100洗涤(10min 3次)后，将切片分别与相应的处于封闭液中的二抗进行孵育[生物素化的山羊抗兔(Vector Labs,http://www.vectorlabs.com,#BA-1000)，1:1000和山羊抗小鼠-Alexa488(Invitrogen,#A11001)，1:1000]。在用1×PBS-0.2％Triton X-100洗涤后，加入链霉亲和素-Alexa610(1:1500处于1×PBS中)，并孵育至使α-突触核蛋白信号显色。
4L/PS-NA脑中α-突触核蛋白聚集体和嗜酸性球状体的定量
通过来自黑质(SN)和皮质(Ctx)的切片的H&E染色，对12周大的4L/PS-NA小鼠的神经退行性变进行分析。图10A中的箭头指出存在嗜酸性球状体，这表示轴突肿胀并表明神经元退化。对来自4L/PS-NA(n＝3)小鼠和WT(n＝2)小鼠的3个脑冠状切片中的球状体数量进行计数。所述切片(4μm)是连续的，并将每个第三个切片用于实验。对于SN(4视野/切片)和Ctx(20视野/切片)，图像取自左右半球。
小鼠脑的连续生化提取
使用来自有症状的4L/PS-NA(12周龄至14周龄)小鼠或42周的D409H纯合小鼠的皮质。用Teflon杵将脑样品匀浆于10体积的1％Triton X-100缓冲液(1％Triton X-100、20mMHEPES pH 7.4、150mM NaCI、10％甘油、1mM EDTA、1.5mM MgCl2、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、50mM NaF、2mM原钒酸钠、以及蛋白酶抑制剂混合物(Roche diagnostics,http://www.roche.com,#11-836-170-001))中，然后在4℃、100,000×g下离心30min。将沉淀在另一10体积的Triton X-100缓冲液中进行如上的再提取，离心，然后将上清液合并得到Triton可溶性部分。使所述Triton可溶性部分经受4个冷冻/解冻循环以破坏潜在的蛋白-脂质相互作用。将余留的沉淀在5体积的2％SDS、50mM Tris-CI,pH 7.4中通过煮沸10min进行提取，用探头声波仪以50％功率进行超声(4×3s脉冲)，然后再煮沸10min。将SDS提取物在25℃以20,000×g离心20min。通过微BCA分析法(Pierce,www.piercenet.com,#23235)对Triton X-100可溶性部分的蛋白浓度进行测定。
秀丽隐杆线虫实验
根据标准过程对线虫(Nematodes)进行维持(Brenner,1974)。通过用表达dsRNA(Geneservice,http://www.geneservice.co.uk)的细菌喂养UA50[balnl3；Punc-54::α-突触核蛋白::gfp,Punc-54::tor-2,rol-6(sul006)]线虫，以进行所述的RNAi和荧光显微镜法(Hamamichi等，2008)，所述dsRNA靶向具有以下修饰的GBA(C33C12.8)的线虫直向同源物(ortholog)。使线虫在RNAi细菌上进行生长，以得到另外的一代，然后在L4期对错误折叠进行评分。对α-突触核蛋白积聚的分析以两次重复进行，如果RNAi处理显著增强色斑(80％的线虫表现出α-突触核蛋白聚集体的量以及大小增加)，候选物被评为阳性。
慢病毒的生成
在以前，已对这些过程进行了详细描述(Mazzulli等，2006)。将来自转染的HEK-FT细胞的上清液浓缩500倍(在含有10％胎牛血清的neurobasal培养基中)。使用p24ELISA试剂盒对病毒滴度进行测定(Zeptometrix,http://www.zeptometrix.com,#801111)。
诱导多能干细胞的生成和神经元分化
如以前所描述的，通过用OCT4、SOX2、cMTC和KLF4进行感染来对来自GD患者的皮肤成纤维细胞(GM00852)进行重编程(Seibler等，J.Neurosci.31:5970,2011)。在1-2月后，挑取iPS细胞集落，并在MEF饲养细胞上扩增。通过OCT4、Tra-1-60、SSEA4和Nanog的表达来对多能性进行测定。由Cell Line Genetics(http://www.clgenetics.com)进行由G带所进行的核型分析。如之前所述进行神经元分化(Seibler等，J.Neurosci.31:5970,2011)。通过添加如下物质起始分化：脑源性神经营养因子(BDNF)、抗坏血酸、音猬因子(sonic hedge hog(SHH))、以及成纤维细胞生长因子8(FGF8)。10天后，通过添加如下物质5周使细胞进行分化：BDNF、抗坏血酸、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、转化生长因子β-3(TGFβ-3)、以及环AMP。将iPS神经元固定于4％PFA中，并通过Triton可溶性部分的免疫荧光和蛋白质印迹来对其神经元标志物和儿茶酚胺能标志物以及α-突触核蛋白水平进行分析。
患者和细胞系的基因分型
将Sequenom MassARRAY方法用于对iPS神经元、对照或PD脑进行基因分型(在表14、表17以及表18中)。使用DNeasy试剂盒(QIAGEN,http://www.qiagen.com)提取基因组材料。使用sequenom方法，用MALDI-TOF质谱(由Harvard Partners Center for Geneticsand Genomics作为服务提供(http://pcpgm.partners.org/))对DNA样品进行基因分型，。通过以前所述的基因测序(Stone等，Hum.Mutat.15:181,2000)对表15中示出的样品的GBA1突变进行基因分型分析。
对来自神经元培养物的mRNA的测量
依次使用1ml Trizol/氯仿(Invitrogen)和RNeasy mini试剂盒(QIAGEN)，从以moi 3用适当的慢病毒构建体感染后7dpi时的6.6×105神经元中提取总RNA。使用SuperScript III First-Strand synthesis SuperMix(Invitrogen#11752-050)通过逆转录生成cDNA。通过实时PCR使用如下引物组对cDNA的量进行定量(小鼠SNCA：FW 5’-ggc agctgg aaa gac aaa ag-3’，REV 5’-cag ctc cct cca ctg tct tc-3’；小鼠GBA1：FW 5’-gccagg ctc atc gga ttc ttc-3’，REV 5’-cac ggg gtc aag aga gtc ac-3’)。基于引物以与归一化(normalizing)基因(肌动蛋白(小鼠肌动蛋白引物：FW 5’-agc cat gta cgt agccat cc-3’，REV 5’-ctc tca gct gtg gtg gtg aa-3’))相同的速度扩增靶序列的能力，对引物进行选择。使用如下组分来进行实时PCR：500nm各引物、cDNA反应的1:100稀释、以及2×SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems#4309159)。将靶转录本的循环阈值(Ct)归一化至肌动蛋白Ct值并标绘成对照的％。
蛋白质印迹分析
用于SDS-PAGE的大多数材料获得自Invitrogen(NuPAGE system)。将蛋白裂解物在样品缓冲液(20mM Tris、1％(v/v)甘油、180mMβ-硫基乙醇、0.003％(w/v)溴酚蓝和2％(w/v)SDS，pH 6.8)中煮沸，在处于MOPS-SDS运行缓冲液中的4％-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺预制胶、或者4％-12％Tris-甘氨酸凝胶上进行分辨。10％Tris-甘氨酸凝胶用于一些GCase多肽的蛋白质印迹(图13B、图13D和图13E，以及图14C和图14F)。对于多数分析，Triton X-100可溶性部分使用50μg/道，而SDS部分根据Triton X-100可溶性部分中存在的量进行加载(10-20μl/道)。在含有20％甲醇的转移缓冲液(Boston Bioproducts,www.bostonbioproducts.com,#BP-190)中于4℃、以12-16hr将凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜(0.45mM-pore immobilon FL；Millipore,http://www.millipore.com,#IPFL 00010)上。在含有0.05％Tween、或处于TBS-T 0.2％中的5％脱脂奶粉的Odyssey封闭缓冲液(Li-Corbiosciences,www.licor.com,#927-40000)中对印迹进行封闭，然后与一抗(稀释度见上文)进行孵育，并用缀合至IRDye 680或800的抗小鼠IgG或抗兔IgG进行检测(1:10,000,Li-Cor biosciences)。关于对照，在封闭步骤后对印迹进行扫描以测定自发荧光带，同时在仅加入二抗后也进行测定。在密度分析中没有出现检测到的任何非特异性条带。使用Odyssey软件v 2.1(Li-Cor biosciences)进行密度分析和MW分析。
糖苷酶处理
将30-50μg T-sol裂解物在10μl的糖蛋白变性缓冲液中变性，并根据制造商的说明用500U Endo H或PNGase F(New England Biolabs,http://www.neb.com,#P0702S[endoH],#P0704S[PNGase F])消化1hr。对照反应在不具有糖苷酶的情况下平行进行。将30-50μg样品加载于具有bis-tris缓冲液的4％-12％MOPS NuPAGE凝胶上(图2)或10％Tris-甘氨酸凝胶上(图14)。
对培养细胞的免疫染色分析
将在12孔集群(12well clusters)中的聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片上生长的皮质细胞在温的PBS中进行很简单的洗涤，然后快速固定于PBS缓冲的4％多聚甲醛(w/v)中15min。将细胞与含有0.3％(v/v)Triton X-100的PBS在4℃孵育过夜，然后在处于PBS-Triton X-100中的2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,#A-7906)和10％正常羊血清(Jackson Immunoresearch Laboratories,http://www.jacksonimmuno.com,#005-000-121)中封闭1hr。将一抗稀释进封闭缓冲液中(稀释度见上文)，在4℃孵育过夜，然后在PBS-Triton X-100中彻底进行洗涤。在封闭缓冲液中对二抗(抗小鼠或抗兔-缀合Alexa488(1:400)或Alexa 568[1:200]，Invitrogen)进行稀释，并孵育1hr，然后在PBS-TritonX-100中彻底进行洗涤。将盖玻片安装在具有10μl含4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的Fluoromount G(Southern Biotech,http://www.southernbiotech.com,#0100-20)的载玻片上，然后用荧光显微镜进行可视化。关于α-突触核蛋白和LC3免疫染色的定量，使用Adobe Photoshop软件CS2(Adobe Systems,http://www.adobe.com)对来自等时曝光图像的像素进行定量，并相对于DAPI归一化。
神经节苷脂GM1和LAMP1免疫荧光色斑的定量
将感染的神经元培养物固定，并用如下方式进行染色：用于GM1分析的缀合至AlexaFluor 488的霍乱毒素亚基B(Invitrogen#34775)，或者抗LAMP1抗体(1D4B-c)继以抗大鼠IgG缀合的AlexaFluor 488。以等时曝光获取来自20×和100×物镜的图像，然后使用Image J软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/)对阈值匹配的图像中的颗粒尺寸和数量进行测定。还对DAPI染色进行了定量，并将其用于对总细胞数/视野进行测定。对各重复评估了3-10视野，每种条件进行3重复。
由荧光染色进行的中性脂质定量
通过引入4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省(indacene)(BODIPY 493/503)染料(在活培养物中检测中性脂质(Invitrogen#D-3922)的荧光染料)对细胞内中性脂质进行定量。如上所述，使皮质细胞生长在聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片上，然后用表达针对GCase多肽的shRNA的慢病毒进行感染。在dpi 6.5时，将BODIPY493(1mg/ml储液，乙醇中)以10μg/ml的终浓度加入处于完全neurobasal培养基中的活培养物，并在37℃、5％CO2中孵育30min。然后将细胞用温PBS洗涤，固定于PBS缓冲的4％多聚甲醛(w/v)中，在荧光显微镜下进行可视化。使用Adobe Photoshop软件CS2(Adobe Systems)对图像中来自BODIPY荧光的总像素进行定量，然后相对于核染色归一化。
通过SFC/MS/MS分析进行的GlcCer定量
将在6孔集群中生长的皮质细胞用如上所述表达GCase多肽shRNA的慢病毒载体进行感染，并在dpi 6.5时收获于PBS中。通过200×g离心5min来收获细胞，将细胞沉淀快速保存于-80℃直到进行分析。对脂质的定量作为由Medical University of South Carolina的脂类组学核心设施(lipidomics core facility)提供的服务而进行(http://hcc.musc.edu/research/sharedresources/lipidomics/lipidomicsanalytics.htm)。通过超临界流体色谱/质谱(SFC/MS/MS)对糖基神经酰胺进行分析。将样品(每种条件n为3)相对于总细胞磷酸水平(P)归一化，并表示为飞摩尔/纳摩尔Pi。
通过放射性脉冲追踪进行的细胞蛋白水解测定
使用3H-亮氨酸，通过放射性脉冲追踪对长寿命蛋白的蛋白水解进行测定。这一过程根据以前的描述进行(Kaushik等，Methods Enzymol.452:297,2009)。简而言之，皮质细胞生长在以33000细胞/孔接种的24孔集群中，并以moi 3用表达scrb或GCase多肽shRNA的慢病毒载体进行感染。在dpi 4，将3H-亮氨酸(PerkinElmer,http://www.perkinelmer.com,#NET460A001MC，终为5μCi/m1)加入含有B27的标准neurobasal培养基2天以追踪标记蛋白。在dpi 6，将细胞用含有过量的冷亮氨酸(终为2.8mM)的条件neurobasal培养基(conditioned neurobasal medium)洗涤两次(10min)，然后再洗涤1次(2hr)，以移除由短寿命蛋白释放出的游离氨基酸。将细胞在冷培养基中孵育，并在洗涤完成后0hr和8hr时移出50μl培养基，将其置于100μl的20％三氯乙酸中。加入BSA(0.5mg/ml，最终)以促进蛋白从培养基中沉淀，然后将样品在4℃孵育8-16hr。将样品在4℃以20,000×g离心20min，并使用Beckman LS 1701液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)(Beckman Instruments,http://www.beckmancoulter.com)对5ml闪烁混合液中的放射性进行测量。将沉淀出的蛋白沉淀在200μl脱氧胆酸钠、0.1M NaOH中进行提取，然后对放射性进行测定。根据在别处所做的详细描述，对蛋白水解百分比进行计算(Kaushik等，MethodsEnzymol.452:297,2009)。
关于亮抑酶肽/NH4Cl处理，如上所述对细胞进行感染，然后在dpi 2时加入50μM亮抑酶肽，随后在dpi 4时加入3H-亮氨酸。在dpi 5时加入NH4Cl(5mM，最终)，然后如上所述将细胞在冷培养基中进行追踪。在生长因子(BAGTC)处理2.5周后，如上所述进行iPS神经元的蛋白水解分析。
脂质分散体的配制
从Avanti Polar lipids(http://www.avantilipids.com)获得纯化的脂质，包括脑磷脂酰胆碱(PC，#840053P)、葡糖基(β)神经酰胺(18:1，GlcCer，#860547)、乳糖神经酰胺(#86057P)、半乳糖神经酰胺(#860521)以及葡糖鞘氨醇(#860535)。将PC以25mg/ml溶于含有1％乙醇稳定剂的HPLC级氯仿，并在-20℃保存于具有氮气覆盖物(overlay)的Teflon加盖的玻璃小瓶。将GlcCer及其它鞘脂以10mg/ml溶于氯仿:甲醇:水(80:20:2，v:v)，并立即使用。将脂质分装并在玻璃试管中混合彻底(PC:GlcCer混合物的摩尔比为90:10或25:75)，然后在氮气流下进行干燥。发现PC的混合为水溶液中的鞘脂分散体的溶解度和稳定性所需。将脂质薄膜在PBS中与水化合(hydrated)，转移至聚丙烯微型离心管，并在超声波清洁槽(Cole-Parmer Instruments，http://www.coleparmer.com，#_EW-08895-04)中25℃超声30min。然后使样品经历2个冷冻/解冻循环，随后进行10-60min的额外声波处理直至溶液清澈(不清澈的溶液给出可变结果)。如下所述，将所述脂质分散体直接加入纯化的α-突触核蛋白，并进行孵育。用于每个独立实验的脂质分散体均是新制作的。
在脂质分散体存在的情况下对α-突触核蛋白聚集的体外评价
如以前所述，在大肠杆菌中表达α-突触核蛋白，并通过煮沸继以HPLC进行纯化(Mazzulli等，2007)。将纯化的α-突触核蛋白在0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.0)或0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)中稀释至138μM(2mg/ml)。将1.38mM的脂质加入等体积的稀释α-突触核蛋白，以使最终浓度为69μMα-突触核蛋白和690μM脂质体(最终脂质:蛋白比为10:1)。然后对pH进行测定，发现脂质分散体的加入并未改变样品的最终pH。用矿物油覆盖层来控制蒸发，并使用Eppendorf恒温混匀器(thermomixer compact)(http://www.eppendorf.com,#022670000)将样品在37℃孵育，伴以1000rpm的恒定摇动。将样品孵育各种时间，并移出等量小份，以经由硫代黄素T进行动力学分析。将10微升样品与处于100mM甘氨酸缓冲液(pH8.5)中的190μl的10μM硫代黄素T(Sigma-Aldrich，#T-3516)混合，并在25℃孵育5min。在黑色FluorNunc Maxisorp 96孔板(Nunc，http://www.nuncbrand.com，475515)中，在WallacVictor2酶标仪(Perkin Elmer)中对荧光(ex＝430nm，em＝510，0.1s)进行测定。该分析法用3个单独的脂质体制剂进行重复，每次的n为3-4个反应。
通过8-苯胺基-1-萘磺酸盐荧光进行的低聚α-突触核蛋白评价
还通过8-苯胺基-1-萘磺酸盐(ANS)(Acros#401220050)对低聚体进行检测。在1hr孵育后，将2μlα-突触核蛋白-脂质反应混合物与100μM ANS(水中稀释)以100μl的终体积进行孵育。将样品在白色FuorNunc Maxicorp 96(Nunc，#437591)中孵育15min，然后在Wallace Victor2酶标仪中对相对荧光单位进行测定(ex＝355，em＝460，1.0s)。通过对照实验(仅含有脂质)对仅从脂质分散体中观测到的ANS信号的贡献进行测定，然后将其从α-突触核蛋白/脂质反应中减去。另外的对照包括仅α-突触核蛋白以及仅缓冲液，这些对照都经历与实验反应相同的孵育时间和条件。
体外形成的α-突触核蛋白聚集体的沉降分析
将来自28hr孵育的反应物在100,000×g离心20min，移除上清液，并将沉淀溶于相同量的PBS。通过SDS-PAGE对5μl的各部分进行分析，并用CBB进行染色。将凝胶在Odyssey红外成像仪上进行扫描，并用Odyssey软件V2.1(Li-Cor)进行定量。可沉淀蛋白百分比由n＝3实验计算出。
体外形成的可溶性α-突触核蛋白聚集体的非变性凝胶电泳
在指定时间点移出重组α-突触核蛋白/脂质混合物，并使用NativePAGE NovexBis-Tris凝胶***(Invitrogen)通过非变性凝胶电泳对200ng进行分析。将凝胶转移至PVDF膜，并与mAb syn 211进行孵育，然后与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗进行孵育。通过增强的化学发光(Pierce#32106)对HRP进行检测，并曝光至膜。
负染色免疫电镜分析
将α-突触核蛋白/脂质孵育物吸附至碳涂覆的300目铜网上，用PBS进行洗涤，并用1％BSA/PBS封闭10min。将Syn505(1:100)加入处于封闭溶液中的网30min，然后用PBS进行充分洗涤。在封闭液中加入15nm金缀合的二抗30min。将样品用1％醋酸铀酰(uranylacetate)进行染色，并用设在Massachusetts General Hospital膜生物学项目的JEOL1011透射电子显微镜进行可视化。
葡糖脑苷脂酶多肽及其它溶酶体活性分析法
根据描述进行对GCase多肽的分析法(Marshall等，2002)。如上所述，将来自12孔培养的皮质细胞用scrb或GCase多肽shRNA进行感染，并在dpi 6.5时收获于50μl活性分析缓冲液(0.25％(v/v)Triton X-100(Sigma-Aldrich#T-8787)、0.25％(w/v)牛磺胆酸(Sigma-Aldrich，#T9034)、1mM EDTA，处于柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中，pH 5.4)中，冷冻/解冻2次，并在冰上孵育30min。将样品20,000×g离心20min，并将10μl上清液用于在1％BSA(具有1mM 4-甲基伞形酮β-吡喃葡萄糖苷(4-MU，Sigma-Aldrich，#M3633))中测定GCase多肽活性，总体积为50μl。在37℃孵育40min(该分析法被测定为在整个90min中为线性)后，通过加入等体积1M甘氨酸(pH 12.5)停止反应。将100μl反应物加载至用于荧光的白色96孔板(Nunc，#136101)中，并在Wallac Victor2酶标仪(Perkin Elmer)中对荧光(ex＝355nm，em＝460，0.1s)进行测定。用类似的方式进行对来自神经元培养和人脑的P2部分和P3部分的GCase多肽活性的分析，除了将5μl样品用于总100μl的反应体积。关于人PD分析，对来自3种不同对照和6种不同PD样品的提取物进行测试。
关于GD脑(表15)和慢病毒感染的原代培养(图13C)中的GCase多肽活性测量，通过测定并未被环己烯四醇-b-环氧化物(CBE)抑制的活性量，将非溶酶体GCase多肽活性(GBA2)从总活性中减去。
以与GCase多肽相同的方式，使用原代神经元培养的P2部分进行下列分析法：如以前所述(Tropak等，J.Biol.Chem.279:13478，2004)，使用4-MU-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷(Sigma#M2133)进行氨基己糖苷酶A/B/S活性分析。用4-MU-D-葡糖醛酸苷(Sigma#M9130)测定β-葡糖醛酸苷酶(GUSB)活性。用4-MU-磷酸盐(Sigma#M8168)测定溶酶体酸式磷酸盐活性。
LC-MS水解分析法
可使用Agilent 1200LC，所述Agilent 1200LC装备有4元泵、G1315二极管阵列检测器以及G1321荧光检测器。可在环境温度使用4.6mm×250mm Agilent Eclipse Plus C18(5μm)，以1.8mL/min的流速，梯度为在10min从85/15(甲醇/0.1％甲酸(水中))至100％甲醇。可使用用于4MU的Ex＝365nm、Em＝440nm或用于C12-BODIPY的Ex＝506nm、Em＝540nm的荧光检测对溶酶体活化剂进行监测。通过与预期的底物峰和反应产物峰相匹配，可证实荧光峰的质量(mass)。可使用不同浓度的溶酶体活化剂(例如，从0、20nM-50μM、由50μM的1:2稀释，9个浓度)。可使用食物搅拌器以最大速度将人脾组织匀浆5min，然后在电动50mL玻璃-Teflon均质器中过10遍。可将匀浆物以1000g离心10min。然后可使用40μm滤器对上清液进行过滤，将所产生的脾匀浆分装物在-80℃冷冻储存直至使用。可将140μg/孔的脾匀浆物用于该分析法。用于脾匀浆物的分析缓冲液(pH 5)为50mM柠檬酸、115mM K2HPO4、110mMKCl、10mM NaCl、1mM MgCl2以及0.01％Tween-20。用于纯化的酶的缓冲液为50mM柠檬酸、KH2PO4(对于重组野生型酶滴定至pH5.9，而对于N370S突变体滴定至pH 7)和0.01％Tween-20。自动针工具站(automated pin-tool station)(Kalypsys，San Diego，CA)可用于将23nL/孔的化合物转移至分析板。在室温孵育5min后，通过加入2μL/孔底物起始酶反应。可使用终浓度为2mM的4-MU-Glc和终浓度为25μM的C12-BODIPY-Cer。可将酶和底物在37℃孵育30-45min，然后可通过加入2μL/孔的停止液(1M NaOH和1M甘氨酸混合物，pH 10)终止该反应。
微粒体稳定性
可以两个平行试验将测试溶酶体活化剂与CD-1小鼠肝微粒体在37℃孵育。该反应会在100mM磷酸钾、2mM NADPH、3mM MgCl2(pH7.4)中含有微粒体蛋白。运行省略NADPH的各个测试试剂的对照，以检测无NADPH的降解。在指定时间，应从各实验反应和对照反应中移出等份样品，并将其与等体积冰冷停止液(处于MeCN中的0.3％AcOH，含有氟哌啶醇(haloperidol)、双氯芬酸(diclofenac)或其它内标)混合。然后将停止的反应在-20℃孵育至少10分钟，并加入额外体积的水。将样品离心以除去沉淀蛋白，然后将上清液通过LC/MS/MS进行分析以对余留蛋白进行定量。数据以通过除以零点浓度值而来的余留百分比报告。
Caco-2渗透性(permeability)
对在组织培养烧瓶中培养的CaCo-2细胞用胰蛋白酶消化，悬浮于培养基中，并将悬浮液以24,500细胞每孔施加于24孔样式的胶原涂覆的BioCoat Cell Environment(BDBiosciences)的孔。允许所述细胞生长并分化3周，以2天的间隔喂养。为了验证CaCo-2细胞单层合适地形成，可通过荧光对细胞缓冲液的等份进行分析，以测定不能渗透的染料荧光黄(Lucifer Yellow)的转运。对于渗透性，将测试试剂加入顶侧(A)或基底侧(B)，并通过LC/MS/MS对渗透至另一侧的量进行测定。A侧缓冲液在转运缓冲液(处于10mM HEPES中的1.98g/L葡萄糖，1×Hank’s平衡盐溶液)(pH 6.5)中含有100μM荧光黄染料，而B侧缓冲液为pH7.4的转运缓冲液。将CaCo-2细胞与这些缓冲液孵育2h。数据以渗透性(Papp)表示：其中dQ/dt为渗透速率。在双向渗透研究中，还计算了不对称指数(asymmetry index，AI)或外排比：AI>1表明对于PGP或其它主动运输的潜在底物。
药代动力学
可使用自由接近食物和水的C57BL/6小鼠(18-26g，雄性，N＝36)。可在20％PEG400+80％(20％HP-β-CD)中制备IP给药溶液。可在样品提取前，用3体积的PBS(pH 7.4)对脑、肝样品进行匀浆。可用稀释系数4对终浓度进行调整，假定1g湿脑等于1mL。然后可用Acquity UPLC BEH C18柱完成样品的LC-MS/MS分析，流速0.6mL/min，流动相由溶剂A：H2O-0.2％FA，10mM NH4OAC，溶剂B：MeOH-0.2％FA，10mM NH4OAC组成。
序列表
葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶
70kDα-葡糖苷酶
葡糖脑苷脂酶
α-半乳糖苷酶A前体
β-半乳糖苷酶前体
半乳糖脑苷脂酶
溶酶体酸性α-甘露糖苷酶
β-甘露糖苷酶
α-L-岩藻糖苷酶前体
α-N-乙酰氨基葡糖苷酶
α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶
β-氨基己糖苷酶亚基α前蛋白原(PREPROPROTEIN)
β-氨基己糖苷酶亚基β前蛋白原
α-L-艾杜糖苷酸酶前体
β-葡糖醛酸酶前体
溶酶体唾液酸酶
艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶
酸性鞘磷脂酶

Claims (3)

1.小分子NCGC00188758在制备用于治疗或预防神经退行性蛋白质病的药物中的用途，所述小分子NCGC00188758具有如下结构式：
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述神经退行性蛋白质病为突触核蛋白病并选自于由以下疾病所组成的组：帕金森氏病、路易体病、路易体痴呆、多***萎缩、伴随脑铁沉积I型的神经退行性变、关岛型帕金森氏痴呆综合症、Hallervorden-Spatz病和额颞痴呆。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述神经退行性蛋白质病为帕金森氏病。
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