CN111225923A

CN111225923A - 结合活性α突触核蛋白的抗体

Info

Publication number: CN111225923A
Application number: CN201880051765.4A
Authority: CN
Inventors: 阿瑞尔·劳维尔
Original assignee: Sinomec Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sinomec Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2018-08-02
Publication date: 2020-06-02
Also published as: WO2019023809A1; KR20200033880A; EP3661961A1; JP2020529473A; US11098108B2; EP3661961A4; JP7204235B2; US20210355202A1; US20210139569A1; US11919947B2; AU2018312441A1; IL272361A; BR112020001970A2; CA3071634A1; SA520411188B1

Abstract

提供了结合α‑突触核蛋白和结合tau纤丝的单克隆抗体及其使用方法。单克隆抗体可以是杂交瘤单克隆2F11。还提供了包含单克隆抗体2F11和可接受的药学载体、佐剂、溶媒或赋形剂的组合物。还公开了在有需要的受试者中减少活性α‑突触核蛋白的方法。该方法包括向受试者施用一定量的包含2F11的组合物。单克隆抗体2F11也可用于测定生物样本中的α‑突触核蛋白或tau纤丝的水平。

Description

结合活性α突触核蛋白的抗体

技术领域

本发明涉及结合α-突触核蛋白的抗体。还描述了使用抗体的方法。

背景技术

帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病，影响全球约1000万人，其中约15％的帕金森病患者还患有路易体(DLB)痴呆。这些代表涉及α-突触核蛋白的核心病理学，该蛋白是一种与各种疾病有关的蛋白，但迄今为止，对于其在体内的主要功能仍所知甚少。这些疾病本身的特征是症状范围很广，包括主要运动症状：静止性震颤、运动迟缓、强直、姿势不稳；以及非运动症状，包括嗅觉丧失、便秘、REM行为障碍、情绪障碍和健忘。最近，α-突触核蛋白的聚合也被证明其涉及多***萎缩(MSA)。除路易体以外，蛋白质蓄积还可导致路易体神经轴突和树突伸长和营养不良。α-突触核蛋白的蓄积和最终沉积可形成路易体的聚合体，在神经元组织中可以显示为10-20μm的包涵体。DLB中，这些形成是广泛的，从而导致与疾病相关的症状。

Tau是一种微管相关蛋白，参与维持轴突转运和神经元完整性，在树突中具有生理作用。Tau蛋白在胶质细胞中也有低水平表达。在成人大脑中，通过MAPT基因的选择性剪接表达6种tau亚型。MAPT基因突变导致与病理性tau蛋白蓄积相关的遗传性疾病。tau病(taupathy)是一种神经退行性疾病，特征为异常tau蛋白在大脑中沉积。神经病理学表型包括阿尔茨海默病、皮克(Pick)病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病(argyrophilic grain disease)、原发性年龄相关tau病(以前称为仅神经元纤维缠结性痴呆)、球状胶质tau病(Kovacs，G.G，2015，Neuropathol.App.Neurobiol.，41，3-23).阿尔茨海默病的特征是淀粉样斑块和神经元纤维缠结，tau蛋白是主要的缠结成分(Congdon，E.E.和Sigurdsson，E.M.，Nat.Rev.Neurol.，2018年6月12日在线发表，Nature.com/nrneurol)。

传统意义上讲，含α突触核蛋白的路易体与帕金森病相关，含Tau的神经元纤维缠结与阿尔茨海默病和额颞叶痴呆的各种综合征相关。然而，在一系列神经退行性疾病中，α-突触核蛋白和tau病理显著重叠和共存。例如，在较高百分比(60％)的家族性和散发性阿尔茨海默病中发现了α-突触核蛋白聚合体(路易体)，而在帕金森病中观察到了tau聚合体(神经元纤维缠结，NFT)。此外，还观察到路易体和神经元纤维缠结的共定位，因为这些蛋白在体内彼此的聚合产物中发现(Li，X.，等人，2016，J.Mol.Neurosci.60：298-304)。

已知α突触核蛋白可直接结合tau并诱导tau纤丝化(Benussi，L.等人，2005，Exp.Cell Res.308：78-84；Li，X.等人，J.Mol.Neurosci.2016年，分子神经科学期刊60：298-304)。因此，α-突触核蛋白和tau蛋白是易于发生病理性错误折叠和聚合的蛋白。错误折叠启动同源寡聚和聚集级联，最终导致多种神经退行性疾病中聚合的α-突触核蛋白和不溶性蛋白包含物中的Tau在大脑蓄积。(Yan，X等人，2018，Seminars Cell Devel.Biol.可访问网址：doi.org/10.1016/j.semcdb.2018.05.005)。

α-突触核蛋白以三种主要亚型存在，最长为140个氨基酸。虽然小囊泡内含有少量蛋白，并且可以发生胞吐作用，但是α-突触核蛋白是一种细胞质蛋白。该蛋白已在血液和脑脊液中被检测到(Borghi等人，2000；El-Agnaf等人，2006；Kasuga等人，2010)。细胞外α-突触核蛋白可能参与了疾病在脑部的扩散，并导致神经元死亡和炎症(Desplats等人，2009)。

α-突触核蛋白成为具有朊病毒样特征的疾病形成实体的过程尚不清楚。α-突触核蛋白可以通过未知数量的中间体和/或从单体可溶性蛋白(无蛋白聚糖样活性)到不溶性蛋白聚糖样活性的中间体采取复杂的途径(见图1：Roberts H.L.，Brown D.R.，2015，Biomolecules 5：282-305)。具有朊病毒样活性的不溶性聚合体能够募集可溶性α-突触核蛋白，并通过从包括膜和细胞质中发现的螺旋构象(Bartels等人，2011；Wang等人，2011)至β-折叠结构的过程将其转化为聚合体。然而，生成α-突触核蛋白聚合体的过程(能够募集相同蛋白的单体并促进其纤丝化)始于一组未知的低聚体形成。

人类α-突触核蛋白中的12个氨基酸肽序列(残基71-82；在β-突触核蛋白中不存在)似乎是必需的，并足以使蛋白质纤丝化。这种肽对蛋白水解有抵抗性，它可能成为α-突触核蛋白纤维的核心。对应于71-82个氨基酸序列的合成肽能够在体外自聚形成纤维，并共同组装和促进组装全长度α-突触核蛋白(Giasson等人，2001)。这种多肽可可逆性形成分子间β-折叠，证实了单体和寡聚形式之间的平衡(Bédard等人，2014)。当与阴离子囊泡接触时，多肽发生构象变化，涉及不可逆的自聚合，主要特征为β-折叠形成。这反映了天然α-突触核蛋白的结构和一般性质。

阴离子膜囊泡显示，仅α-突触核蛋白71至82肽迅速形成聚合体。此外，天然α-突触核蛋白在与膜(Jo等人，2000；Lee等人，2002)和多不饱和脂肪酸(Perrin等人，2001)相互作用时可发生错误折叠或构象变化，导致寡聚化。可直接将阴离子磷脂膜上的螺旋α-突触核蛋白转化为含有β-片层的纤丝(Comellas等人，2012)。生成能够募集相同蛋白质单体的α-突触核蛋白聚合体的方案(Volpicelli-Daley等人，2014)存在一个缺陷，即小瓶速度、小瓶尺寸和形状(含有α-突触核蛋白)的微小变化可能影响小瓶中形成的气泡大小，因此，用于纤丝化过程的可用表面积直接干扰界面活化步骤。US 2004/0143093讲授使用特殊设备和浓度依赖性疏水界面处理与界面活化相关的问题。此外，在原生野生型α-突触核蛋白不存在的条件下，α-突触核蛋白的羧基末端突变体表现出原纤维化。(Murray等人，2003)。

尚不清楚α-突触核蛋白纤丝的内在毒性程度。成熟的α-突触核蛋白纤丝以动态平衡的形式存在，由纤丝组装和拆分生成低聚体群体。在接近生理条件下可形成低聚体(大和小)的异质混合物(Cremades等人，2012)。当纤丝分解时，产物能够在单体存在的情况下形成新的纤丝。细胞培养中(Desplats等人，2009)和突触核蛋白病模型(Hansen等人，2011)中，α-突触核蛋白聚合体传输期间，体内可发生纤丝分解。

朊病毒样活性可能是由低聚体种群直接引起，或由纤丝分解产生的低聚体种群引起，例如，纤丝断裂加速α-突触核蛋白纤丝化(Shvadchak等人，2015)，具有不同结构的低聚体群体抑制纤丝形成或激活纤丝形成(Horvath等人，2013)。这些结果表明低聚体人群可能在“通路上”或“通路外”，向纤丝组装转变。两种通路上的低聚体(Lashuel等人，(2002)，Kostka等人，(2008)，Zhang等人(2013))和通路外低聚体(Lorenzen等人，(2014)，Cherny等人(2005))均已经过鉴定。

用于基于路易体研究(使用Volpicelli-Daley等人的方法，2014)的α-突触核蛋白聚合体(也称为预形成纤丝或PPF)的制备过程，可能会减少既存的α-突触核蛋白低聚体(Ariesandi等人，2013)，并且导致在α-突触核蛋白聚合体制剂中的毒性低聚体人群或聚合体水平(相比无毒性的其他低聚体人群或聚合体)的不确定性。

已经制备了抗重组α-突触核蛋白及其部分肽的多克隆和单克隆抗体(Giasson，B.I.等人，2000；Luk等人，2009)。Masliah等人，2005，2011认为，抗α-突触核蛋白抗体的抗α-突触核蛋白的主动和被动免疫，减少了突触核蛋白病转基因模型中的α-突触核蛋白沉积和突触缺失。Bae等人(2012)表明，细胞外α-突触核蛋白的传递可通过免疫抗体减少或停止，并且这种减少的传递主要由小神经胶质细胞进行的，且提供了蛋白清除的机制。在这些研究中，抗体(产生重组单体人类α-突触核蛋白)是线性序列的特异性抗体，并识别出出变性单体。抗体不具有结合结构，α-突触核蛋白低聚体的三维构象。例如，单克隆抗体274(Bae等人，2012)或9E4(和其他单克隆抗体；Masliah等人2011)，观察到的α-突触核蛋白聚集形式以及单体的线性序列，因此无法区分α-突触核蛋白的聚集形式和单体形式。

Lee等人(2011)鉴别出两个单克隆抗体克隆169和171，它们与变性α-突触核蛋白的亲和力降低(蛋白印迹法)，并鉴定出完整长度的变性重组α-突触核蛋白。

US 8,809,506产生了抗化学变化的α-突触核蛋白原纤丝和寡聚物(经4-氧代-2-壬烯酸和4-羟基-2-壬烯酸化学修饰)的单克隆抗体。未对单克隆抗体进行检测以确定其是否结合了具有毒性的α-突触核蛋白亚群，或其是否结合了由具有毒性的多聚体α-突触核蛋白群体产生的线性或3维抗原表位。

US 8,940,276指出提高抗α-突触核蛋白的抗体。抗体无法区分毒性和非毒性α-突触核蛋白群。蛋白印迹鉴定出α-突触核蛋白为单体，表明抗体不与由毒性低聚体(在蛋白印迹中使用的SDS、还原、煮沸样本中不存在)产生的3-二聚抗原表位结合。

US 9,084,832使用ELISA技术表征了α-突触核蛋白抗体，显示α-突触核蛋白抗体对纤丝前群体具有更高的亲和力，但没有迹象表明α-突触核蛋白群体是朊病毒样还是具有毒性。此外，抗体结合特异性短线性表位，而不是(毒性)低聚体的特异性三维构象。

Ariesandi等人(2013)指出，用于制备PPF的热处理包含工艺可降低预先存在的低聚体浓度。该结果进一步提出质疑，在上述现有技术中描述的抗体是否以“通路上”的α-突触核蛋白低聚物毒性种群或“通路外”的无毒性低聚体为靶标。

α-突触核蛋白的生理功能尚不清楚。该蛋白质的毒性被认为与文献中未确定的α-突触核蛋白低聚体(而不是纤丝)亚群相关。这些亚群类型和浓度是动态的，需要在体内组装和拆卸。需要产生能够结合强效、朊病毒样(有毒)α-突触核蛋白形式的抗体。

发明内容

根据本发明，提供了一种单克隆抗体或分离的单克隆抗体，2F11与活性α-突触核蛋白结合，该单克隆抗体是由具有登记号ATCC#PTA-124174(由ATCC接收，2017年5月11日)的杂交瘤生成。本文还描述了一种分离的多核苷酸，用于编码由具有登记号ATCC#PTA-124174(接收于2017年5月11日)的杂交瘤生成的单克隆抗体的可变轻链、可变重链、或可变轻链和可变重链两者。还提供了一种由单克隆抗体2F11组成的组合物或疫苗，其在药学上可接受的载体、佐剂、溶媒或赋形剂也在本文中进行了描述。

还提供了减少有需要的受试者中的活性α-突触核蛋白或tau纤丝的方法，包括向受试者施用一定量的上述组合物或疫苗。该组合物或疫苗可以经口服、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用于受试者。如果需要，在施用步骤前，可以测定受试者中的活性α-突触核蛋白或tau纤丝水平，在施用步骤后的一段时间之后，可以测定一个或多于一个的活性α-突触核蛋白或tau纤丝的第二水平。

本文件还描述了一种单克隆抗体2F11，结合α-突触核蛋白、tau纤丝或其组合，包括以下定义互补决定区(CDR)的氨基酸序列：

重链：

DYYMF(序列号：14)；

WNDPENGDTEYAPKFQG(序列号：15)；

NAWDGNYV(序列号：16)；

轻链：

TASSSVSSSYLH(序列号：17)

STSNLAS(序列号：18)

HQYHRSPPMYT(序列号：19)。

还提供了编码单克隆抗体2F11 CDR的核酸序列，通过序列号：14-19定义。编码单克隆抗体2F11 CDR的核酸序列可包括以下核苷酸序列：

重链：

GACTACTATATTTT(序列号：20)

TGGATGATCCTGAGTGTGATGCCGAAGGC(序列号：21)

AATGCATGGGATGGTAACTATGTT(序列号：22)

轻链：

ACTACTACTACTCAAGTGTAAGTTTTACGCAC(序列号：23)

AGCACATCCAACCTGGCTTCT(序列号：24)

CACCAGTATCATCGTTCCCCACCCATGTACACG(序列号：25)

本文还描述了一种单克隆抗体，或分离的单克隆抗体，与人类α-突触核蛋白或tau纤丝结合，并包括一个重链可变区(VH)，三个VH互补决定区(CDR)，其中包含氨基酸序列设定见序列号：14-16，以及一个轻链可变区(VL)，其中包含氨基酸序列设定见序列号：17-19。该单克隆抗体的氨基酸序列可由一个或多个由序列号：20-25定义的核苷酸序列组成的核酸序列编码。此外，单克隆抗体的特征为与α-突触核蛋白活性聚合体结合，或与tau聚合体结合，或与其二者结合。本文还描述了在药学上可接受的载体、佐剂、溶媒或赋形剂中由单克隆抗体组成的组合物或疫苗。

本文还描述了编码单克隆抗体一个重链可变区(VH)CDR的单个多核苷酸序列，包含三个VH互补决定区(CDR)，包含序列号14-16中定义的氨基酸序列。还描述了包含该多核苷酸序列的表达载体。

此处还描述了用于转移血脑屏障的多特异性抗体。多特异性抗体由一个或多个载体分子，其连接到由具有登记号ATCC#PTA-124174(接收自ATCC，2017年5月11日)的杂交瘤生成的单克隆抗体2F11上。多特异性抗体可以是三特异性或双特异性抗体，例如一种单价-双特异性抗体或一种双价-双特异性抗体。此外，多特异性或双特异性抗体的一种或多种载体分子可源自转运蛋白受体(TfR)-结合抗体或源自***1受体(IGF1R)-结合抗体。本文还描述了在药学上可接受的载体、佐剂、溶媒或赋形剂中包含多特异性、三特异性或双特异性抗体的组合物或疫苗。

还提供了减少有需要的受试者中的活性α-突触核蛋白或tau纤丝的方法，包括向受试者施用一定量的上述组合物或疫苗。该组合物或疫苗可以口服、经鼻、肌内、腹膜内、静脉内或皮下给药。如果需要，在给药步骤前，可以测定受试者中的活性α-突触核蛋白或tau纤丝水平，在施用步骤后的一段时间之后，可以测定一个或多于一个的活性α-突触核蛋白或tau纤丝的第二水平。

本文还描述了一种测定样本中活性寡聚α-突触核蛋白存在的方法。该方法包括：

i.将样本的一部分与不和活性α-突触核蛋白单体结合的对照抗体预混合，然后加入重组的活性α-突触核蛋白单体，以产生对照治疗，

ii.将样本的第二部分与单克隆抗体2F11(ATCC#PTA-124174，接收日期2017年5月11日)预混合，然后加入重组的活性α-突触核蛋白单体，以产生活性治疗，

iii.使用硫磺素试验测定对照治疗和活性治疗两者中β-折叠结构形成的量，其中，与对照治疗相比，活性治疗中的硫磺素荧光下降表明样本中存在活性寡聚α-突触核蛋白。

提供了一种测定样本中是否存在tau聚合体的方法。方法包括：

i.将样本的一部分与对照抗体预混合，然后加入tau单体，以形成对照治疗，

ii.将样本的第二部分与单克隆抗体2F11(ATCC#PTA-124174)预混合，然后加入tau单体，以产生活性治疗，以及

iii.测定对照治疗和活性治疗两者中β-折叠结构形成的量。其中，与对照治疗相比，活性治疗中的β-折叠结构形成的量减少表明样本中存在tau蛋白聚合体。

还描述了测定样本中存在的活性寡聚α-突触核蛋白的替代方法。该方法包括将样本暴露于单克隆抗体2F11(ATCC#PTA-124174，接收日期2017年5月11日)，并测定单克隆抗体2F11是否与样本中的蛋白结合，其中结合表明存在活性寡聚α-突触核蛋白。在暴露步骤前，可使用非变性电泳分离样本，并经由Western分析使用单克隆抗体2F11对分离的蛋白进行探测，其中结合一个或多个高分子量蛋白表明样本中存在活性寡聚α-突触核蛋白。或者，可使用单克隆抗体2F11探测非变性样本的斑点印迹，单克隆抗体2F11与样本结合表明存在活性寡聚α-突触核蛋白。

还描述了测定样本中是否存在tau聚合体的方法。该方法包括将样本暴露于单克隆抗体2F11(ATCC#PTA-124174，接收日期2017年5月11日)中，并测定单克隆抗体2F11是否与样本中的蛋白质结合，其中结合表明存在tau聚合体。在暴露步骤前，可使用非变性电泳分离样本，并经由Western分析使用单克隆抗体2F11对分离的蛋白进行探测，其中结合一个或多个高分子量蛋白表明样本中存在活性寡聚α-突触核蛋白。或者，可采用单克隆抗体2F11探测非变性样本的斑点印迹，单克隆抗体2F11与样本结合表明存在tau聚合体。

提供了测定样本中活性寡聚α-突触核蛋白的存在、浓度或同时测定其浓度的其他方法。该方法包括将样本应用于使用单克隆抗体2F11(ATCC#PTA-124174)制备的表面，并测定与单克隆抗体结合的活性α-突触核蛋白聚合体的出现次数、数量或出现次数及数量，从而确定样本中活性α-突触核蛋白聚合体的存在、浓度或存在及浓度。

还提供了测定样本中tau聚合体的存在、浓度或同时测定其存在和浓度的方法。该方法包括将样本应用于使用单克隆抗体2F11(ATCC#PTA-124174)制备的表面，并测定与单克隆抗体结合的tau聚集体的出现次数、数量或出现次数和数量，从而确定样本中tau聚合体的存在、浓度，或存在及浓度。

还描述了一种在诊断为以下的受试者中诱导免疫反应的方法：突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病或家族性阿尔茨海默病、tau病，以神经元纤维缠结为特征的病理状况、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关性tau病、仅神经元纤维缠结性痴呆、球状胶质tau病。该方法包括向受试者施用上述单克隆抗体2F11、含单克隆2F11的药物组合物或含2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体。

本发明还公开了一种治疗以下的方法：突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病或家族性阿尔茨海默病、tau病、神经元纤维缠结、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关tau病、仅神经元纤维缠结性痴呆、球状胶质tau病，该方法包括向受试者施用上述定义的单克隆抗体2F11，其中药物组合物包括单克隆抗体2F11，或包含2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体。

本发明概要可能未描述本发明的所有特征。

附图说明

为详细阐述本发明的上述特征及其他特征，下文将对其进行详细说明，并附以图片作为参考：

图1显示了在“有毒α-突触核蛋白”通路上导致淀粉样蛋白纤丝形成的途径。现有技术(Roberts H.L.，Brown D.R.，2015，Biomolecules 5：282-305；可访问网址：mdpi.com/2218-273X/5/2/282).

图2A显示了与各种无活性单体、无活性聚合体、活性单体、活性聚合体及其组合孵育之后的α-突触核蛋白β折叠结构形成相关联的硫磺素分析结果。左边条注：孵育1小时后(37℃)测定荧光值；右边条注：孵育24小时后(37℃)测定荧光值(详情见实施例)。图2B显示了用无活性聚合体(在没有内毒素的情况下用α突触核蛋白单体制备)或活性聚合体(在有内毒素的情况下制备)孵育的大鼠原代皮质细胞的共聚焦图像。使用丝氨酸129磷酸化特异性抗体测定的用于检测路易体病理的荧光。Hoechst：DAPI染色；pser129：FITC标记的丝氨酸129磷酸化特异性抗体。图2C显示了活性人类α-突触核蛋白纤丝(上图)和无活性人类α-突触核蛋白纤丝(下图)的电子显微镜图像。条柱：100nm。

图3A显示了用克隆2F11探测的小鼠脑裂解物的蛋白印迹分析。左通路：标记物(kDa)；右通路克隆2F11。使用克隆2F11鉴定小鼠脑裂解物中的高分子量条带。图3B显示了用克隆4F1探测的小鼠脑裂解物的蛋白印迹分析。左通路：标记物(kD)；右通路克隆4F1使用克隆4F1鉴定小鼠脑裂解物中的低分子量条带。图3C显示了用克隆3F8探测的小鼠脑裂解物的蛋白印迹。左通路：标记物(kDa)右通路克隆3F8。使用克隆3F8鉴定小鼠脑裂解物中的低分子量条带。图3D显示了HeLa裂解物蛋白印迹分析(已知可产生α-突触核蛋白，见URL：proteinatlas.org/ENSG00000145335-SNCA/cell)，用克隆2F11进行探测。左通路：标记物(kDa)；右通路克隆2F11。使用克隆2F11鉴定小鼠脑裂解物中的高分子量条带。

图4显示了图3A-3C中使用的小鼠脑裂解物的蛋白质染色。左通路：标记物(kDa)；小鼠脑裂解物的Ponceau染色。

图5A显示了使用克隆2F11探测的免疫沉淀的小鼠脑裂解物的蛋白印迹分析。α-突触核蛋白的寡聚条带分子量大约为60-70kDa。左通路：标记物(kDa)；中间通路：空白；右通路：小鼠脑裂解物。图5B显示了使用克隆2F11探测的免疫沉淀小鼠脑裂解物流出物的蛋白印迹分析。显示了约60-70kDa的α-突触核蛋白的寡聚条带、α-突触核蛋白的一个三聚体条带和α-突触核蛋白的单体条带。左通路：标记物(kDa)；右通路：小鼠脑裂解物。

图6显示了小鼠α-突触核蛋白(上序列；055043；序列号：1)和人类α-突触核蛋白(下序列；P37840；序列号：2)的核酸序列比对。

图7显示了采用克隆2F11进行探针分析的来自帕金森病的人类大脑、人类大脑和小鼠大脑的变性样本的蛋白印迹分析。从左至右：标记kDa；患帕金森病的人类大脑；人类对照；小鼠大脑。在伴或不伴帕金森病的人类大脑和小鼠样本中存在一系列分子量范围内的多通路，包括高分子量。

图8A显示了对使用克隆2F11检测的帕金森病人类大脑、人类大脑和小鼠大脑样本的天然Western分析。从左至右：标记物：kDa；人类脑(对照)；帕金森病人脑；小鼠脑；空白；标记物kDa；小鼠脑(样本2)；空白；α-突触核蛋白聚合体(活性)；α-突触核蛋白单体(活性)。图8B显示了对使用克隆4F1检测的帕金森病人类大脑、人类大脑和小鼠大脑样本的天然Western分析。从左至右：标记物kDa；人类脑(对照)；帕金森病人脑；小鼠脑；空白；标记物kDa；小鼠脑(样本2)；空白；α-突触核蛋白聚合体(活性)；α-突触核蛋白单体(活性)。小鼠脑和小鼠脑2的裂解物来源不同，均用同样的方法制备。图8C显示了活性和无活性α-突触核蛋白聚合体(纤丝)与2F11(左图)和SPC-506(A11；右图)结合的点印迹分析。顶部印迹：2μg活性α-突触核蛋白聚合体；上中印迹：0.5μg活性α-突触核蛋白聚合体；低中印迹：2μg无活性α-突触核蛋白聚合体；底部印迹：0.5μg无活性α-突触核蛋白聚合体。图8D显示了2F11纳米金偶联(黑点)与人类活性α-突触核蛋白结合的电子显微镜分析。条柱：100nm。

图9A显示了硫磺素活性测定的时间过程。从上到下分别为：α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)α-突触核蛋白活性聚合体(10nM)；α-突触核蛋白活性单体(100μM)；硫磺素对照(25μM)。图9B显示了存在抗体时硫磺素活性测定的时程(2F11；3F8；4F1；SMC-104)。反应开始时(时间0)，向反应中加入抗体。样本(从上到下)：α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)；α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)+SMC-104；α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)+4F1；α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)+3F8；α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)+2F11；活性聚合体10nM；活性单体(100μM)；硫磺素对照(25μM)。图9C显示了存在抗体时硫磺素活性测定的时程(2F11；3F8；4F1；SMC-104)。反应开始前，将抗体与样本进行预孵育。样本(从上到下)：α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)；α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)+3F8；α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)+SMC-104；α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)+4F1；活性聚合体(10nM)；α-突触核蛋白活性单体(100μM)+活性聚合体(10nM)+2F11；活性单体(100μM)；硫磺素对照(25μM)。图9D显示了Sprague-Dawley大鼠原代大脑细胞的共聚焦图像。左上图：对照，使用DAPI和pSer129α-突触核蛋白抗体进行探针检测(仅识别DAPI染色细胞核)；右上图：添加活性α-突触核蛋白纤丝，并使用DAPI和pSer129α-突触核蛋白抗体进行探针检测(显示DAPI和pSer129染色表明与α-突触核蛋白抗体结合，指示α-突触核蛋白病理)；下图：添加活性α-突触核蛋白纤丝+2F11，并使用DAPI和pSer129α-突触核蛋白抗体进行探针检测(显示DAPI染色和pSer129染色背景水平)。放大20倍；条柱：250μm。图9E显示了存在或不存在2F11抗体的情况下，存在活性α-突触核蛋白低聚体、无活性α-突触核蛋白低聚体、活性α-突触核蛋白单体时，人类SHSY-5Y细胞的细胞死亡。细胞死亡(％)：死细胞/正常细胞核总数x 100。

图10显示了各种抗体与α-突触核蛋白的重叠肽的结合。肽：1-30aa(序列号：3)；21-50aa(序列号：4)；41-70aa(序列号：5)；61-90aa(序列号：6)；81-100aa(序列号：7)；101-130aa(序列号：8)；121-140(序列号：9)。使用ELISA、点印迹法(DB)和/或蛋白印迹法(WB)测定结合力。

图11A显示了2F11的共同核酸序列(序列号：10)和可变区(重链-IgG1同种型)氨基酸序列(序列号：11)。2F11的轻链可变区(Kappa)的共同核酸序列(序列号：12)和氨基酸序列(序列号：13)见图11B。下划线表示互补决定区域(CDR)；前导序列用斜体字表示。

图12显示了多特异性抗体示例的示意图。在此非限制性实施例中，显示了包括各种载体分子的双特异性抗体以及2F11示意图(左图)。双特异性抗体包括胰岛素生长因子1受体的单个结构域(sd-IFG1R-BB；分子下半部分)，为双价(中图)或单价右图)变体，共价附着于包含小鼠Fc(分子中间部分)和α-突触核蛋白抗体(分子上部)的货物分子。

图13显示了tau的硫磺素活性测定的时间过程。将抗体与tau纤丝预孵育，然后加入tau单体开始启动。孵育1、24或48小时后测定荧光。样本(从左到右)：tau单体+tau纤丝+2F11；tau单体+tau纤丝+SMC-104；tau单体+tau纤丝；tau单体；和tau纤丝。

具体实施方式

以下描述了优选实施方案。

本文所用的词语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”其以及其相应的语法变体是包含性的或开放性的，不排除其他未列举的元素和/或方法步骤。当在本文中与组成、用途或方法结合使用时，术语“主要由......组成”表示可存在其他的元素、方法步骤，或者可同时存在其他的元素和方法步骤，但这些添加不会对列举的方法或使用的功能方式产生重大影响。当在本文中与组成、用途或方法结合使用时，“由......组成”意为不存在其他元素和/或方法步骤。在此处描述为包括某些元素和/或步骤的用途或方法，在某些实施例中也可能主要包括这些元素和/或步骤，在其他实施例中包括这些元素和/或步骤，无论是否具体提及这些实施例。此外，除非另有说明，单数的使用包括复数，“or”是指“和/或”。本文所用术语“多个”是指一个以上，例如两个或两个以上、三个或三个以上、四个或四个以上等。除非本文中另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本领域中一项普通技能的通用含义相同。这里所使用的术语“大约”指与给定值有大约+/-10％误差。需要理解的是，所述误差总是包括在这里提供的任何给定值中，无论是否特别指出。在本文中，“一”或“一个”与“包括”搭配使用时，意为“一个”，但其亦可表示“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或不止一个”之意。

在本文中，“蛋白水平”或“活性蛋白水平”是指从受试者或受试者中获得的样本中的蛋白质量或相对量。蛋白水平可与参考或对照蛋白水平进行比较，以确定样本的状态。受试者的蛋白水平可以是绝对量，例如，纳克/ml或微克/ml，或者可以是相对量，例如，相对于对照蛋白水平的信号强度；百分比或“倍数”或“倍数变化”增加。

受试者转录本的“表达水平”是指受试者未确诊的生物样本中的转录本数量。表达水平可与参考表达水平进行比较，以确定样本的状态。受试者的表达水平可以是绝对量(例如，纳克/ml或微克/ml)或相对量(例如，信号的相对强度；百分比或“倍数”或“倍数变化”增加)。

如图1所示，α-突触核蛋白可通过未知数量的中间体和/或由单体可溶性蛋白形成的大量中间体(无朊病毒样活性)至具有朊病毒样活性的不溶性聚合体的复杂途径(见图1：现有技术；Roberts H.L.，Brown D.R.，2015，Biomolecules 5：282-305，通过引用纳入本说明书)。具有朊病毒样活性的不溶性聚合体能够招募可溶性α-突触核蛋白，并导致α-突触核蛋白聚合过程。

与α-突触核蛋白纤丝形成或突触核蛋白病相关的疾病或病理状况示例，包括但不限于以路易体(Lewy bodies)为特征的病理状况，如帕金森病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病和阿尔茨海默病家族性病例。与tau纤丝形成或tau病相关的疾病或病理状况示例，包括但不限于以下特征的病理状况：神经元纤维缠结、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、帕金森氏病、皮克病、嗜银颗粒病、原发性年龄相关tau病、仅神经元纤维缠结型痴呆和球状胶质tau病。

“α-突触核蛋白单体种属”，或“α-突触核蛋白单体种属”包括一组α-突触核蛋白单体(也可称为非活性或无活性的α-突触核蛋白单体)和活性α-突触核蛋白单体(也可称为毒性α-突触核蛋白单体)。

“α-突触核蛋白低聚体种属”或“α-突触核蛋白低聚体种属”包括一种非活性α-突触核蛋白低聚体(也称为“途径外”低聚体)、一种活性α-突触核蛋白低聚体或毒性α-突触核蛋白低聚体(也称为“途径内”α-突触核蛋白低聚体)。

“非活性的α-突触核蛋白单体”，或“无活性的α-突触核蛋白单体”是指α-突触核蛋白的无毒单体。α-突触核蛋白单体的混合物不会结合形成活性α-突触核蛋白低聚体。然而，α-突触核蛋白单体(无活性)和活性α-突触核蛋白单体的混合物可能结合，形成活性α-突触核蛋白低聚体。

“活性α-突触核蛋白种属”是指一种或多种活性α-突触核蛋白单体、毒性α-突触核蛋白单体、活性α-突触核蛋白聚合体、毒性α-突触核蛋白聚合体、活性α-突触核蛋白低聚体、毒性α-突触核蛋白低聚体、通路低聚体、β-折叠结构包括α-突触核蛋白和α-突触核蛋白纤丝。

在此使用的“活性α-突触核蛋白单体”或“毒性α-突触核蛋白单体”是指α-突触核蛋白单体的一种，当与其他活性α-突触核蛋白单体或活性α-突触核蛋白聚合体结合时，形成活性或毒性α-突触核蛋白低聚体，形成包含α-突触核蛋白、活性或毒性α-突触核蛋白聚合体或α-突触核蛋白纤丝的β-折叠结构。活性α-突触核蛋白单体能够与其他活性α-突触核蛋白低聚体、活性α-突触核蛋白聚合体或其组合结合，并沿淀粉样蛋白纤丝形成的途径进行。

本文中使用的“活性寡聚α-突触核蛋白”、“毒性α-突触核蛋白低聚体”或“在通路上的α-突触核蛋白低聚体”是指具有募集活性α-突触核蛋白单体的能力或能够产生原纤丝低聚体的活性聚合体的α-突触核蛋白单体群体，它们能够伸长和产生α-突触核蛋白纤丝(淀粉样纤丝；见图1)。

“活性聚合体”或“活性α-突触核蛋白聚合体”可与“预形成纤丝”(PFF)交替使用。PFF或活性聚合体是指活性α-突触核蛋白低聚体，包含两种或多种活性α-突触核蛋白低聚物的前纤丝，包含两种或多种活性α-突触核蛋白低聚物的纤丝或其组合的集合。可使用PFF或活性聚合体促进反应(见示例，图2B、9B-9D)。与“无活性聚合体”相比，活性α-突触核蛋白聚合体的β-折叠含量更多，α-螺旋更少(见表1；实施例2)。

“无活性聚合体”用于指无活性α-突触核蛋白低聚体、含有无活性α-突触核蛋白低聚体的前纤丝、含有无活性α-突触核蛋白低聚体的纤丝或其组合。无活性聚合体不形成β-折叠结构(见图2)，而且不引起反应(例如见图2B、9B-9D)。

氨基酸小鼠和人类α-突触核蛋白的识别百分比(或百分比相似性)为95％(见图6)。

使用术语“百分比相似性”、“序列相似性”、“百分比同一性”或“序列同一性”，当提到特定序列时，如University of Wisconsin GCG软件程序中所述，或通过人工比对和目视检查(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人，eds.1995年增补)。序列比对方法在该领域众所周知。可以进行最佳序列比对，例如使用Smith&Waterman算法(1981，Adv.Appl.Math.2：482)，通过Needleman&Wunsch的比对算法，(1970，J.Mol.Biol.48：443)，通过Pearson&Lipman相似度搜索法，(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)，通过计算机化实施这些算法(例如：遗传学电脑集团(GCG)575 Science Dr.，Madison，Wis.的Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)。

用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例为BLAST和BLAST 2.0算法，这些都在Altschul等人，(1977，Nuc.Acids Res.25：3389-3402)和Altschul等人(1990，J.Mol.Biol.215：403-410)的相关描述中。使用了BLAST和BLAST 2.0，以及此处描述的参数，以确定发明的核酸和蛋白质的序列同源性百分比。例如，BLASTN程序(用于核苷酸序列)可默认使用11个字长(W)、10个预期字长(E)、M＝5、N＝-4以及两个链的比较。用于氨基酸序列的BLASTP程序可默认使用字长为3，预期(E)为10，和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff&Henikoff，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)为50，预期(E)为10，M＝5，N＝-4，两种链进行比较。通过国家生物技术信息中心可公开获取用于进行BLAST分析的软件(见网址：ncbi.nlm.nih.gov/)。

本文中使用的“参考水平”、“参考蛋白水平”或“对照蛋白水平”是指在正常个体或群体中测定的α-突触核蛋白量或一系列α-突触核蛋白量，而没有任何指示表明受试者患有与α-突触核蛋白纤丝形成相关的疾病状态或病理状况，例如，表现为路易体的病理状况，例如但不限于帕金森氏病。例如，可以根据从一个或多个正常个体中获得的样本中鉴定出的α-突触核蛋白(一种活性α-突触核蛋白单体或一种活性寡聚α-突触核蛋白)的水平或含量，确定参考水平为一种或一种以上活性物质，例如，活性α-突触核蛋白单体或活性寡聚α-突触核蛋白。参考水平可以是绝对量(例如，纳克/ml或微克/ml)或相对量(例如，信号的相对强度；与对照水平或量相比，百分比或“倍数”增加)。

在本文中，“阈值水平”、“阈值量”或“阈值表达水平”是指生物样本中α-突触核蛋白的量或水平，它在参考量或水平的一种或一种以上活性α-突触核蛋白种属、活性α-突触核蛋白单体或活性寡聚α-突触核蛋白之间，变化范围约在1.5倍至20倍之间的任意量，例如在与对照样本或对照受试者中确定的α-突触核蛋白量或水平进行比较时。阈值水平的α-突触核蛋白可能提示一种与α-突触核蛋白纤丝形成相关的疾病状态，一种以路易体为特征的病理状况，例如但不限于帕金森病。

在受试者中，“基线水平”是指在任何治疗之前或任何治疗期间测定的第一种生物样本中的α-突触核蛋白的量或水平，该水平用于与第二种生物样本的第二种表达水平进行比较，第二种生物样本是在获得第一种生物样本之后同一时间从受试者中获得的。该基线水平可用于，例如，监测受试者中与α-突触核蛋白纤丝形成相关的疾病状态或病理状况的进展，例如，以路易体为特征的病理状况，例如，但不限于帕金森病，监测受试者中与α-突触核蛋白纤丝形成相关的疾病状态或病理状况的治疗方案或治疗方式，确定受试者中是否应考虑一种治疗方案或治疗方式，确定受试者中是否应中止一种治疗方案或治疗方式，或确定受试者中是否应改变一种治疗方案或治疗方式。

在本文中，“正常个体”是指使用本文中描述的一种或多种诊断方法(包括硫磺素试验、Western分析、ELISA或点印迹分析)组合检测α-突触核蛋白纤丝形成，并确定没有任何活性α-突触核蛋白单体或活性寡聚α-突触核蛋白的个体。

本文中可互换使用的术语“治疗(therapy)”和“疗法(treatment)”是指旨在改善接受者状态的干预措施。改善可以是主观的，也可以是客观的，与正在治疗的疾病、病症或病理状态的相关、预防疾病的发生或改变的症状改善有关。因此，最广泛使用术语“治疗”和“疗法”，包括在不同阶段防治(预防)、缓解、减少和治愈一种疾病、病症或病理状况。该术语还包含防止接受者状态恶化的内容。需要治疗的人包括那些已经患有疾病、障碍或状况，以及容易或有发生疾病、障碍或状况风险的人和需要预防疾病、障碍或状况的人。在当前发明的背景下，该疾病、病症或病理状况与以下相关联：

α-突触核蛋白纤丝形成，或突触核蛋白病，包括但不限于以路易体为特征的病理状况，如帕金森病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病、阿尔茨海默病家族性病例，tau纤丝形成(聚合)，或tau病，包括但不限于以神经元纤维缠结为特征的病理状况、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关性tau病、仅有神经元纤维缠结的痴呆和球状胶质tau病，或其组合。

此处使用的术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物，例如，受试者可以是人类。或者，受试者可以是非人灵长类动物、家畜或农业动物。

本文中使用的“有效量”是指产生预期效果的化合物量。例如，可将细胞群或细胞提取物与有效量的化合物接触，以研究其体外作用或在离体或体外产生预期的治疗效果。有效量的化合物可在受试者中产生治疗效果，例如预防或治疗目标疾病、缓解疾病相关症状或产生预期的生理效应。在这种情况下，化合物的有效量是“治疗有效量”、“治疗有效浓度”或“治疗有效剂量”。在某一特定受试者中，有效剂量或治疗有效剂量是指会产生最有效治疗结果的组合物的量。该量取决于多种因素，包括但不限于化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)或细胞、制剂中药学上可接受的载体或载体的性质以及给药途径。适当载体的非限制性实例包括缓冲剂、稳定剂、盐、抗氧化剂、络合剂、冷冻保护剂、冷冻剂、悬浮剂、乳化剂、抗菌剂、防腐剂、螯合剂、结合剂、表面活性剂、润湿剂、非水溶液载体(如油)或用于缓释或控释的聚合体。例如，见Berge等人1977(J.PharmSci.66：1-19)。根据化合物单独给药或与另一种化合物、药物、治疗或其他治疗方法或方式联合给药，可能存在进一步的有效或治疗效果差异。通过常规实验，即通过监测细胞或受试者对化合物给药的反应并相应调整剂量，掌握临床和药理学技能的人员将能够确定有效剂量或治疗有效量。更多指南，例如参见Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第21版，宾夕法尼亚州费城科学大学(USIP)，Lippincott Williams&Wilkins，2005，本文对此进行引用合并，如同在此充分陈述。

“生物样本”或“样本”是指从受试者中获得或以其他方式衍生的任何物质、生物液体、组织或细胞，包括但不限于血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆和血清)、脑脊液、组织提取物和细胞提取物。也包括上述所有经实验分离的组分。例如，血液样本可分为血清或含有特定类型血细胞的组分，如红细胞或白细胞(白血球)。如果需要，样本可以是个体样本的组合，例如组织的组合和液体样本的组合。生物样本还可包括含有均质固体材料的材料，如来自组织样本或组织活检；或来自组织培养物或细胞培养物的材料。组织可以是正常组织，也可以是病变组织

对无活性和有活性α-突触核蛋白单体和聚合体进行了评价，以确定可溶性单体和不溶性聚合体是否具有活性(朊病毒样)，是否能够种植或被α-突触核蛋白聚合过程接种(通过β-折叠结构形成确定)。如图2(实施例2)所示：

a.无活性的α-突触核蛋白单体，无活性的聚合体，或结合了有活性的α-突触核蛋白聚合体的无活性的α-突触核蛋白单体无法种植聚合过程，且未观察到β-折叠结构形成；

b.活性单体或与无活性聚合体结合的活性单体能够自身传种，活性单体和活性聚合体(或预先形成的纤丝；PFF)能够形成朊病毒样聚合反应，且能够观察到β-折叠结构形成增加。

制备抗活性α-突触核蛋白聚合体和活性α-突触核蛋白单体的鼠单克隆抗体。选择了分泌针对α-突触核蛋白单体活性形式(而不是无活性形式)的抗体的杂交瘤。使用蛋白印迹分析，观察到一种抗体2F11(ATCC#PTA-124174，接收日期2017年5月11日)在小鼠脑裂解物和HeLa裂解物中出现高分子量α-突触核蛋白聚合体(＞150kDa；见图3A和3D)，而其他α-突触核蛋白单克隆抗体(也可通过结合α-突触核蛋白单体的活性形式进行选择)，仅鉴定出15kDa条带(4F1，图3B；3F8，图3C)。

图11A和11B提供了2F11的重链(序列号：10和11)和轻链(序列号：12和13)的核酸和氨基酸序列。单克隆抗体2F11由以下氨基酸序列组成，该序列定义了互补决定区(CDR)：

重链：

DYYMF(序列号：14)；

WNDPENGDTEYAPKFQG(序列号：15)；

NAWDGNYV(序列号：16)；

轻链：

TASSSVSSSYLH(序列号：17)；

STSNLAS(序列号：18)；

HQYHRSPPMYT(序列号：19)。

编码单克隆抗体2F11的CDR的核酸序列包括以下核苷酸序列：

重链：

GACTACTATATTTT(序列号：20)；

TGGATGATCCTGAGTGTGATGCCGAAGGC(序列号：21)；

AATGCATGGGATGGTAACTATGTT(序列号：22)；

轻链：

ACTACTACTACTCAAGTGTAAGTTTTACGCAC(序列号：23)；

AGCACATCCAACCTGGCTTCT(序列号：24)；

CACCAGTATCATCGTTCCCCACCCATGTACACG(序列号：25)。

天然胶体电泳条件下，单克隆抗体2F11与α-突触核蛋白低聚体结合，但不与α-突触核蛋白单体(活性)结合。在天然条件下，使用2F11免疫沉淀脑裂解物(从小鼠中获得)，并使用变性蛋白印迹法分析沉淀和流穿组份。免疫沉淀的天然脑裂解物中的2F11抗体结合的α-突触核蛋白低聚体(变性后在60-70kDa下运行)，但不结合α-突触核蛋白单体(活性)，表明2F11未从天然样本中免疫沉淀出单体条带(图5A)。然而，当在变性条件下分离该组份时，观察到流穿组份的三个组份与2F11结合：α-突触核蛋白单体(活性)约为15kDa；推定的α-突触核蛋白三聚体约为40kDa；α-突触核蛋白低聚物60-70kDa(图5B)，证明在变性条件下(如蛋白印迹分析中使用的)，2F11能够结合稳定的低聚体和单体α-突触核蛋白。由于2F11选择性结合tau聚合体(见图13)，这种方法也可用于确定是否存在tau聚合体。

在变性条件(图7)或天然条件(图8A和8B)下使用蛋白印迹分析观察到小鼠单克隆抗体2F11与人类大脑裂解物、帕金森氏患者人类大脑裂解物和小鼠大脑裂解物中的人类α-突触核蛋白结合。例如，2F11在变性条件下(图7)与中高分子量人和小鼠α-突触核蛋白低聚体结合。在天然、非还原性条件下(图8A)，2F11与来自人类脑裂解物、帕金森氏病脑裂解物和小鼠脑裂解物的大约60kDa到250kDa的高分子量α-突触核蛋白低聚体结合。因此，2F11在天然条件下识别α-突触核蛋白低聚体或聚合体。

在天然条件下，还观察到4F1抗体与更高分子量的低聚体结合(图8B)。但是，4F1不能识别纯化的致病性(活性)α-突触核蛋白单体或聚合体。

因此，在天然***2F11中，识别出人类和小鼠的α-突触核蛋白，但2F11抗体不能结合α-突触核蛋白单体(活性)。这些结果表明，2F11与α-突触核蛋白聚合体结合，使其能够结合致病的α-突触核蛋白低聚体，或直接参与产生路易体病理学途径的低聚体。

由于2F11能够结合人和小鼠的α-突触核蛋白，并且由于小鼠和人α-突触核蛋白间氨基酸的百分比识别(或百分比相似性)为95％(图6)，因此2F11能够识别α-突触核蛋白，其中约95％至100％或之间的任何数量与序列号1或序列号2的氨基酸序列具有相似性。例如，如在本文所述的天然或变性条件下确定的，2F11可识别α-突触核蛋白90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或之间任何数量与序列号1或序列号2的氨基酸序列相似性。

在体外还观察到单克隆抗体2F11阻断β-折叠结构形成。α-突触核蛋白反应的进展可如图9A所示。在本试验中，在存在活性α-突触核蛋白聚合体的情况下，“接种”一种活性α-突触核蛋白单体，并从α螺旋结构变化β-折叠结构(即观察到硫磺素荧光增加；(第一条)。活性α-突触核蛋白聚合体导致β-折叠结构形成轻微增加(从上到下第二条)，但这一增加小于活性α-突触核蛋白聚合体与活性α-突触核蛋白单体的混合物增加(第一条)。随着时间的推移，活性α-突触核蛋白单体可以缓慢自身传种(从上至下第三条)。

观察到当单克隆抗体2F11存在的情况下，α-突触核蛋白反应的进展被阻断，无论是当2F11加入到反应开始时(图9B)，还是当2F11在反应开始之前与各种α-突触核蛋白种属预孵育时(图9C)。与2F11的作用相比，4F1或3F8单克隆抗体不会以相同程度抑制α-突触核蛋白反应的进展。对照抗体SMC-104(小鼠单克隆至hsp70)对α-突触核蛋白反应几乎没有影响。

这些结果清楚地表明，2F11抗体与α-突触核蛋白聚合和纤颤反应所需的成分或结构结合，形成β-折叠结构。因此，2F11抗体显示了对该反应的中和作用。

这些结果表明，天然样本中的2F11与具有毒性的寡聚α-突触核蛋白结合，可用于确定来自帕金森病脑与非帕金森病脑中的人类脑裂解物中的具有毒性的α-突触核蛋白低聚体的量，并确定人类脑裂解物中更大量的具有毒性的α-突触核蛋白低聚体是否来自帕金森病脑。

因此，提供了一种测定样本中是否存在活性寡聚α-突触核蛋白的方法。方法包括：

i.将样本的一部分与对照抗体预混合，然后加入重组活性α-突触核蛋白单体，以产生对照治疗，

ii.将样本的第二部分与单克隆抗体2F11预混合，然后加入重组活性α-突触核蛋白单体，以产生活性治疗，以及

iii.测定对照治疗和活性治疗中β-折叠结构形成的量。其中，与对照治疗相比，活性治疗中β-折叠结构形成的量减少表明样本中存在活性寡聚α-突触核蛋白。

此外，从天然人体样本中分离出的可传播路易体(DLB)疾病的α-突触核蛋白低聚体可用于种植活性α-突触核蛋白单体，并使用硫磺素分析方法(使用实施例5中描述的方法)监测β-折叠结构形成的时程动力学。本试验可用于测定样本中的强效α-突触核蛋白低聚体的量，例如，脑脊液(CSF)、血液、人类脑裂解物或其他可能含有α-突触核蛋白低聚体的样本。本试验可用于从疑似帕金森氏病脑中获得的样本(试验样本)，并将结果与从非帕金森氏病脑中获得的样本(对照样本)获得的结果进行比较，其中与对照样本相比，人类脑裂解物样本中强效α-突触核蛋白低聚体数量的增加表明试验样本中存在帕金森氏病。

由于tau蛋白和α-突触核蛋白之间的已知相互作用(Li，X.等人，2016，J.Mol.Neurosci.60：298-304)，单克隆抗体2F11对tau蛋白诱导的β-折叠结构形成的影响也通过硫磺素试验进行检测。如图13所示，在体外观察到2F11阻断Tau纤丝、β-折叠结构的形成。当单独分析tau纤丝或单独分析tau单体时，观察到背景荧光信号。然而，tau单体和tau纤丝的混合导致产生表明β-折叠结构形成的强效荧光信号。在反应开始前2F11与tau纤丝预孵育时，发现在单克隆抗体2F11存在的情况下，tau反应的进展被中断。单克隆抗体SMC-104(小鼠hsp70单克隆)对tau反应几乎没有影响。体外阻断Tau纤丝、β-折叠结构形成所需的2F11抗体量高于体外阻断α-突触核蛋白、β-折叠结构形成所需的量。

因此，提供了确定样本中是否存在tau聚合体的方法。方法包括：

i.将样本的一部分与对照抗体预混合，然后加入tau单体，以产生对照治疗，

ii.将样本的第二部分与单克隆抗体2F11预混合，然后加入tau单体，以产生活性治疗，以及

iii.测定对照治疗和活性治疗中β-折叠结构形成的量。与对照治疗相比，活性治疗中β-折叠结构形成量减少表明样本中存在tau蛋白聚合体。

这些结果清楚地表明，2F11抗体与α-突触核蛋白聚合和纤颤反应以及tau反应所需的成分或结构结合，从而形成β-折叠结构。因此，2F11抗体显示了对该反应的中和作用。

这些结果表明，天然样本中的2F11与毒性形式的寡聚α-突触核蛋白结合可用于确定来自帕金森病脑与非帕金森病脑中的人类脑裂解物中的具有毒性的α-突触核蛋白低聚体的量，并确定人类脑裂解物中更大量的具有毒性的α-突触核蛋白低聚体是否来自帕金森病脑。

这些结果还表明，2F11与样本中tau蛋白的纤丝形式结合可用于确定来自病脑(如阿尔茨海默病)的人脑裂解物中是否存在tau聚合体，或其存在的数量，并确定在病脑裂解物中是否存在更大量的tau聚合。

2F11的表位结合表现为一系列重叠的α-突触核蛋白肽，每个长度约为30个氨基酸。与也被鉴定为结合α-突触核蛋白活性形式的其他单克隆抗体(例如4F1、3F8)相比，2F11克隆显示出独特的表位结合模式(图10)。在本分析中，观察到2F11在61-90和101-130位置与α-突触核蛋白的两个C末端片段结合。2F11的表位结合特性使其能够结合并中和α-突触核蛋白聚合和纤丝化反应的核心组分。

大鼠皮质细胞内2F11抗体的经纹状体注射观察到可减少路易体的生成。使用α-突触核蛋白特异性抗体pSer129，将α-突触核蛋白纤丝施用到皮质组织中，促进α-突触核蛋白反应。通过将α-突触核蛋白纤丝与单克隆抗体2F11预孵育，减少了局部α-突触核蛋白聚合位点的数量和聚合体的尺寸。从接受PBS中α-突触核蛋白纤丝处理的大鼠中获得的皮质组织切片显示出表明α-突触核蛋白抗体(pSer129)与α-突触核蛋白纤维以及与α-突触核蛋白聚合体组分(核周聚合体或包含物)的出局部荧光。在对照组(PBS)大鼠中未观察到荧光(表明无α-突触核蛋白聚合体形成)。在用α-突触核蛋白纤丝和抗体3D10处理的大鼠皮质细胞中也观察到局部荧光，表明抗体(pSer129)与α-突触核蛋白纤丝和α-突触核蛋白聚合体形成结合。接受α-突触核蛋白纤维和抗体3D10的皮质细胞中的局部结合量与仅施用α-突触核蛋白纤丝的大鼠皮质组织切片中观察到的量相似。虽然在用α-突触核蛋白纤维和抗体2F11处理的大鼠大脑获得的皮质细胞中观察到局部荧光，但局部结合位点(核周聚集)的数量和局部结合位点的大小，与单纯用α-突触核蛋白纤丝或α-突触核蛋白纤丝和抗体3D10处理的皮质细胞中观察到的结合位点的数量和大小相比，结合位点的数量和大小均减少，表明用2F11抗体处理脑组织在体内可减少大鼠皮质细胞中路易体的生成。因此，使用2F11治疗可能会阻止或延缓路易体(Lewy body)样包涵体的形成。在体内，施用到皮质细胞中的2F11的量可能进一步阻碍、减少和/或延迟大鼠皮质细胞中路易体的生成，但理论上不希望被结合。

单克隆抗体可用于受试者的免疫接种以及减少或抑制体内α-突触核蛋白的寡聚化反应。例如，可使用2F11免疫接种α-突触核蛋白转基因(tg)小鼠(PD模型；Masliah等人，2011)和非tg小鼠，随时间推移评价α-突触核蛋白转基因(tg)小鼠和非tg小鼠的行为反应(记忆恢复)。免疫接种2F11的tg小鼠可能有更好的记忆恢复，并能以与非tg小鼠相似的方式完成任务，从而证明2F11抗体治疗可逆转学习障碍。

因此，本项发明考虑了一种由单克隆抗体2F11或多特异性抗体组成的组合物或疫苗。三特异性或双特异性抗体包括2F11(见下文)，在药学上可接受的载体、佐剂、溶媒或赋形剂中。此外，还提供了在有需要的受试者中减少活性α-突触核蛋白或tau聚合的方法。该方法包括向受试者施用一定量的组合物或疫苗。该组合物或疫苗可经口服、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用于受试者。

还公开了药物组合物，其包含本说明书中描述的抗体，例如2F11，或由2F11组成的多特异性、三特异性或双特异性抗体，以及药物上可接受的载体(如下所述)、佐剂或赋形剂。可采用本研究中已知的各种机制进行给药，包括裸给药，或可通过静脉、腹膜内、皮下或直接注射给药，例如2F11或组成2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体的治疗药物给药。治疗药物也可以作为药物组合物或制剂的一部分施用，所述药物组合物或制剂包含合适的药学上可接受的载体，所述载体包括赋形剂和助剂，所述赋形剂和助剂有助于将治疗药物加工成可药用的制剂。

本文件还提供了一种在受试者中诱导免疫反应的方法，该受试者被诊断为突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森病、路易体痴呆、多***萎缩、阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病或家族性阿尔茨海默病、tau病(tauopathy)，以神经元纤维缠结为特征的病理状况、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关性tau病、仅神经元纤维缠结性痴呆和球状胶质tau病，该方法包括施用单克隆抗体2F11，含有2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体，含有单克隆2F11的药物组合物，含有2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体的药物组合物，含有单克隆2F11的疫苗，含有2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体的疫苗。

还公开了单克隆抗体2F11，含有2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体，含有2F11的药物组合物，或含有2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体的药物组合物的用途，用以在被诊断为以下的受试者中诱导免疫反应：突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森氏病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病、家族性阿尔茨海默病、tau病、以神经元纤维缠结为特征的病理状况、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关tau病、仅神经元纤维缠结型痴呆和球状胶质tau病。

还公开了一种治疗以下的方法：突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森氏病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病或家族性阿尔茨海默病、或tau病，以神经元纤维缠结为特征的病理状况、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关痴呆、仅神经源性缠结性痴呆和球状胶质tau病。该方法包括向受试者施用单克隆抗体2F11，含有2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体，或含有单克隆抗体2F11的药物组合物，或含有2F11的包括多特异性、三特异性或双特异性抗体的药物组合物。还公开了单克隆抗体2F11，含有2F11多特异性、三特异性或双特异性抗体，含有单克隆抗体2F11的药物组合物，含有2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体的药物组合物的用途，用于治疗受试者的突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病或家族性阿尔茨海默病。

还公开了单克隆抗体2F11或含有2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体的用途，用于制造治疗以下的药物：突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森氏病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病、或家族性阿尔茨海默病，或用于治疗tau病、以神经元纤维缠结为特征的病理状况、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关tau病、仅神经元纤维缠结性痴呆和球状胶质tau病。还公开了单克隆抗体2F11，或包含2F11的多特异性、三特异性或双特异性抗体，用于制造用于治疗以下的药物：突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病、阿尔茨海默病或家族性阿尔茨海默病，或用于制造治疗以下的药物：tau病、以神经元纤维缠结为特征的病理状况、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关性tau病、仅神经元纤维缠结性痴呆和球状胶质tau病。

抗体可能是单克隆抗体。抗体可以为非人类的、灵长类的、人源化的或完全人化的。人或初生非人体抗体的方法在本领域中是广为人知的，例如通过以啮齿动物的互补决定区(CDR)或其他氨基酸或其序列替代人抗体(例如见，Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)；以上所有引用方式均为全文纳入)。此处使用的“抗原结合域”是指任何具有抗原结合活性的抗体衍生物或片段。抗原结合域包括抗体轻链和重链可变域(即VL区和VH区)。抗体片段和衍生物的非限制性实例为Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv(即单链Fv)、scFv-Fc、微抗体、纳米抗体、双链抗体、三链抗体、多特异性抗体、三特异性抗体、双特异性抗体等。已知许多其他抗体片段和衍生物，其中许多非限制性实例已在Deyev和Lebedenko(2008，BioEssays 30：904-918，通过引用全文纳入)中披露。在方法或用途的某些实施例中，抗原结合域为Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、scFv-Fc、微抗体、纳米抗体、双链抗体或三链抗体。

目前已知使用多特异性抗体(例如，双特异性或三特异性抗体，包括一个或多个载体分子和一个或多个货物分子)，通过受体介导的转运细胞作用，通过血脑屏障运输治疗性抗体的方法。例如，可使用转运蛋白受体(TfR)-结合抗体(及其变体)作为载体，当与货物分子融合时，例如2F11，产生能够穿过血脑屏障的双特异性抗体(例如见Zuchero，Y.J，Y.等人，2016，Neuron 89：70-82；Bien.Ly，N.等人，2014 J.Exp.Med.211：233-244；US 2018/8002433；CA 3,000,560；通过引用并纳入本文)。或者，可使用***1受体(IGF1R)-结合抗体作为载体，与货物分子2F11融合，产生一种穿过血脑屏障的双特异性抗体(例如，见WO 2015/131256；WO 2015/131257；WO 2015/131258；通过引用并纳入本文)。如图12所示，组成2F11的一价或二价IGF1R双特异性抗体能够转移血脑屏障。绝对抗体(见网址：absoluteantibody.com/custom-services/antibody-engineering/)描述制备多特异性抗体。

因此，当前披露也提供了多特异性抗体，例如，一种三特异性或双特异性抗体，用于转移血脑屏障，而双特异性抗体包括连接到单克隆抗体2F11上的载体分子。例如，双特异性抗体的载体分子可以是单价-双特异性抗体或双特异性抗体。双特异性抗体可能是转运蛋白受体(TfR)-结合抗体或***1受体(IGF1R)-结合抗体。

本项发明将在下面的实施例中做进一步说明。

实施例1：材料和方法

α-突触核蛋白免疫原生成：

根据Volpicelli-Daley等人，2014(并入本文供参考)进行了无活性人类α-突触核蛋白单体和聚合体研究，进行了微小修订。合并含有单体形式α-突触核蛋白的组分，根据供应商提供的手册，使用Pierce High Capacity内毒素去除旋转柱(Thermo Scientific，#88276)进行内毒素去除程序。使用ToxinSensor显色LAL内毒素检测试剂盒(GenScript，#L00350)测定内毒素水平。LAL法测定的内毒素水平低于1EU/μg蛋白质。使用无活性单体形成无活性的聚合体。

从Lee实验室(地址：Center for Neurodegenerative Disease Research，3rdFloor，Maloney Building，3600 Spruce Street，Philadelphia，PA 19104-4283，USA)获得了活性小鼠种子α-突触核蛋白聚合体(预形成纤丝-PFFs)和活性α-突触核蛋白单体。小鼠脑裂解物由维多利亚大学(地址：3800Finnerty Rd，Victoria，BC V8P 5C2，Canada)捐赠。从Novus Biologicals#NB820-59177获得了人脑全组织裂解物(5mg/mL)。从NovusBiologicals#NB820-59407获得了帕金森病人脑全组织裂解物(5mg/mL)。从RocklandImmunochemicals Inc.#W09-000-364获得了HeLa裂解物。

硫磺素测定：

硫磺素测定基于Murray等人，2003(通过引用并纳入本文)。本试验测定了不同时间的β-折叠含量。荧光增强表明，由于种子反应期间聚合的纤丝增多，导致β-折叠结构增加。

在PBS中稀释硫磺素T贮备液(1mM)至25μM的最终浓度(1∶40稀释)。向384孔的每个孔中加入95μL稀释的硫磺素T，向每个孔中加入一份样本(2.5μL)，然后混合溶液。对于对照，将2.5μL PBS单独添加至稀释的硫磺素T中，将2.5μL单体α-突触核蛋白添加至稀释的硫磺素T中。将混合物在室温下孵育2分钟至1小时，然后测定每个孔的硫磺素T荧光(激发波长450nm，发射波长500nm)。上述硫磺素T分析的变更如下：从1小时至88小时在37℃下孵育后，测定每个孔中的硫磺素T荧光(激发450nm，发射485nm)。

对于预孵育研究，将30μg抗体与10nMα-突触核蛋白聚合体在4℃条件下震摇1小时。将混合物在10000rpm下离心5min，然后用1mL PBS冲洗。该步骤额外重复4次。取出上清液，并将α-突触核蛋白聚合体(及结合的抗体)重新混悬于10μL的PBS中。

在共同孵育研究中，在加入硫磺素T之前，将30μg抗体加入单体α-突触核蛋白和α-突触核蛋白聚合体中。

小鼠单克隆抗体生成：

在位于4464 Markham Street#3204，Victoria，BC V8Z 7X8，Canada的ImmunoPrecise Antibodies Ltd(IPA)使用其专有的RapidPrime技术生产小鼠单克隆抗体。RapridPrime包含5只雌性BALB/c小鼠的免疫接种。

通过间接ELISA在α-突触核蛋白纤丝抗原上的杂交瘤筛查：

ELISA条件：在通宵4℃下用100μl/孔CCB(pH 9.6)中的活性α-突触核蛋白聚合体或活性α-突触核蛋白单体0.1μg/孔包被Corning Costar ELISA板，在室温下用溶于PBS的3％脱脂奶粉阻断1小时。

第一抗体：杂交瘤TC sup纯品(在IPA生成)，100μL/孔，在37℃条件下孵育1小时，同时振摇；第二抗体1∶10,000羊抗鼠IgG/IgM(H+L)-HRP(Jackson ImmunoResearch，#115-035-068)，100μL/孔，在PBS-Tween中，在37℃温度条件下孵育1小时，同时振摇。使用PBS-Tween进行30分钟的所有冲洗步骤。加入50μL/孔的TMB底物(BioFxt#TMBW-1000-01)，使用等体积的1M HCl终止反应。开发时间：8.5分钟。在450nm处读取平板。

同种型抗体捕获ELISA条件：

用碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)以1∶10,000的比例包被抗小鼠IgG/IgM(H&L；Jackson ImmunoResearch，#115-035-068)的ELISA板，通宵4℃，无阻断。

第一抗体：在100μL/孔板上，在室温下振荡1小时的杂交瘤组织培养上清液(纯的；与上述间接ELSIA相同的抗体)。第二抗体1∶5000山羊抗鼠IgGΥ-HRP(5个亚同种型特异性抗体的等份混合物，Jackson ImmunoResearch，#115-035-205，115-035-206，115-035-207，115-035-208，115-035-209)或1∶10,000山羊抗鼠IgMμ-HRP(Thermo Scientific，#31440)，100μL/孔，在PBS-Tween中，室温振摇1小时。所有清洗步骤均使用PBS-Tween进行30分钟。以50μL/孔加入TMB底物，以等体积1M HCl终止反应。开发时间：5.5分钟。在450nm处读取平板。

通过间接ELISA检测在α-突触核蛋白活性单体、α-突触核蛋白活性聚合体(或预形成的纤丝；PFF)、α-突触核蛋白无活性单体和α-突触核蛋白无活性聚合体抗原上的小鼠抗α-突触核蛋白杂交瘤。

ELISA条件：Corning Costar ELISA板涂有以下材料：

a.α-突触核蛋白活性单体以0.1μg/孔在100μl/孔CCB(碳酸盐包被缓冲液)中，pH9.6，在通宵4℃条件下；

b.α-突触核蛋白活性聚合体(PFF)以0.1μg/孔在100μl/孔CCB(pH 9.6)中，在通宵4℃条件下；

c.α-突触核蛋白无活性单体以0.1μg/孔在100μl/孔CCB(pH 9.6)中，在通宵4℃条件下；或

d.α-突触核蛋白无活性聚合体以0.1μg/孔在100μl/孔CCB(pH 9.6)中，在通宵4℃条件下，以及

在室温下，封闭1小时的含3％脱脂奶粉的PBS溶液。

第一抗体：将杂交瘤组织培养物上清液(纯净)在DMEM完全培养基加5％低IgG FBS中生长，直至消失(＞90％细胞死亡)。收获培养物，并以400xg转速旋转，将上清液转移至新的无菌管中。加入(100μL/孔)组织培养上清液，在37℃条件下振荡培养1小时。第二抗体1∶10,000羊抗鼠IgG/IgM(H+L)-HRP 100μL/孔PBS-Tween，37℃振荡1小时。所有清洗步骤均使用PBS-Tween进行30分钟。以50μL/孔加入TMB底物溶液，用等体积1M HCl终止反应。开发时间：1分钟在450nm处读取平板。

蛋白印迹法：

在印迹法和使用各种抗体进行探针检测之前，在变性(SDS)和非变性(原生)条件下运行凝胶，如下面的实施例所述。

对于图3A-3D，使用tris-borate盐水(TBS)1∶2稀释的第一抗体(上一节中定义的抗α-突触核蛋白上清液)；孵育温度：4℃，孵育时间：18小时。第二抗体为羊抗鼠抗体：HRP偶联物，稀释：1∶2000。封闭缓冲液(5％脱脂乳TBST)，孵育温度：室温；孵育时间：1hr。开发方案：Amersham ECL底物(GE，#RPN2232)，开发时间：6分钟。裂解物：每个通道中含有20μg小鼠脑裂解物或HeLa裂解物。向样本中加入5X Laemmli样本缓冲液，在上样至Licor C位可视化凝胶或GE ImageQuant LAS 500上之前在90℃下孵育10分钟。

对于图7(和肽Western)，第一抗体为抗α-突触核蛋白G纯化的上清液(GE，#29-0485-81)；在TBS中以1∶1000的比例稀释；孵育温度：室温；孵育时间：1hr。第二抗体为羊抗鼠抗体：HRP偶联物，稀释：1∶2000。封闭缓冲液(5％脱脂乳TBST)，孵育温度：室温；孵育时间：1hr。开发方案：SuperSignal^TM West Pico化学发光底物(ThermoFisher Scientific，#34080)，开发时间：6分钟。向样本中加入5X Laemmli样本缓冲液，在上样之前在90℃下孵育10分钟。对于天然样本，在装载到凝胶上之前加入5％甘油，而不是5X Laemmli样本缓冲液。在GE ImageQuant LAS 500上可视化。

对于点印迹分析，将5μl(0.1mg/mL)的每种肽加入到硝酸纤维素(ABM，#B500)中，在室温下干燥15分钟。然后将点印迹作为标准蛋白印迹进行处理(参考图7，如上所示)。

原始细胞实验(图2A和9D)

通过解剖大鼠幼仔脑获得Sprague-Dawley原代皮质细胞。解剖后，使用手术剪刀将脑机械切片，并使用0.25％胰蛋白酶溶液分离。胰蛋白酶处理45分钟，获得细胞悬液。通过两轮离心(20分钟，750rpm)冲洗掉胰蛋白酶，将细胞悬液置于与层粘连蛋白预孵育的60mm细胞培养皿中，加入DMEM+10％FBS+Pen/Strep，静置24小时。第二天，从60mm细胞培养皿(含神经元)取上清液，重新悬浮于相同的生长培养基(DMEM，10％FBS，Pen/Strep)中，并通过离心冲洗2次(500rpm，20分钟)。将悬浮的神经元置于与层粘连蛋白预孵育的22x22cm的盖玻片(NaOH和95％乙醇预处理)中。将成对的glastole放入60mm细胞培养皿(每皿2块glastole)或单独放入35mm细胞培养皿中，并用DMEM+0.5％FBS+Pen/Strep填充。允许神经元沉降和生长2天，然后启动其特定的实验条件。细胞制备好后，用调节培养基替换细胞培养基。参照图9D调节介质如下：

- 对照实验：DMEM+0.5％FBS+Pen/Strep+等量超声DPBS+等量DPBS；

- 活性α-突触核蛋白仅添加：DMEM+0.5％FBS+Pen/Strep+4μg/mL超声处理的活性α-突触核蛋白纤丝+等量BPBS；

- 2F11-治疗神经元：DMEM+0.5％FBS+Pen/Strep+4μg/mL超声处理的活性α-突触核蛋白纤丝+10μL2F11抗体，以1∶400的比例用DPBS稀释(2F11抗体量相当于10μg)。

将对照组与DPBS一起孵育，仅将添加的活性α-突触核蛋白组与活性α-突触核蛋白纤丝一起孵育，将2F11组与活性α-突触核蛋白纤丝和2F11抗体一起孵育。每周一次用新鲜培养基(DMEM+0.5％FBS+Pen/Strep)代替50％培养基。

与条件培养基培养14天后，将细胞在2％PFA中固定40分钟，在0.05％Triton-X中透化10分钟，并用PBS-BSA2％封闭24小时。用StressMarq公司的一种抗α-Syn-pSer129(SPC-742)的兔多克隆一抗按1∶100染色过夜，α-Syn-pSer129的二抗为羊抗兔Alexa-488(绿色)孵育2小时。所有样本均用DAPI复染。

用于表位作图的肽合成(图10)

利用Fmoc chemistry和HCTU作为活化剂，在Rainin Symphony合成仪上(右侧为残差数)生成下列肽类(美国)，反映了人类α-突触核蛋白(Uni Prot P37840)的重叠序列。N端连接一个C-6联接基团(Ahx)，该联接基团又与N-端半胱氨酸残基结合。通过C-18色谱柱的反相HPLC法纯化肽。使用电喷雾进行质量分析，使用分析LC进行纯度分析。使用的BSA是Fishers Scientific产品77110，使用的偶联物遵循产品提供的方案。

AA 1-30：MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA(序列号：3)；

AA 21-50：KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH(序列号：4)；

AA 41-70：GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV(序列号：5)；

AA 61-90：EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA(序列号：6)；

AA 81-110：TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE(序列号：7)；

AA 101-130：GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE(序列号：8)；

AA 121-140：DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA(序列号：9)。

用于表位定位的ELISA条件：

MaxiSorp^TM 98孔板ELISA板包被有与BSA结合的肽，浓度为0.1μg/孔，溶于100μl/孔的CCB中(pH 9.6)，通宵4℃。然后在室温下，用含3％脱脂乳粉的PBS溶液将这些平板封闭3小时。加入100μL/孔抗体(1μg/mL)，并在37℃条件下孵育1小时。在PBS-Tween中以100μL/孔加入第二抗体1∶10,000羊抗鼠IgG/IgM(H+L)-HRP，在室温条件下孵育1小时。所有清洗步骤均使用PBS-Tween进行30分钟。以100μL/孔加入TMB底物溶液，用等体积1M HCl终止反应。开发时间：15分钟。在450nm处读取平板。

免疫沉淀和流动分析(图5A和5B)

根据生产商的方案，将1.2mg 2F11与溴化氢活化的琼脂糖凝胶(Sigma，#C9142-1G)偶联。将2mg小鼠脑裂解物与树脂在4℃条件下振荡培养48小时。用PBS冲洗色谱柱，然后用0.1M，pH为2.7的甘氨酸洗脱。

电子显微镜(图2C、8C)

将超声处理的160μl等份α-突触核蛋白纤丝悬浮于DMEM+10％FBS中，最终体积为1mL。然后在每一试管中，将重悬剂分离至2个微型离心管中，得到最终体积为0.5mL的原始重悬剂，并以17,000rpm的转速离心40分钟。弃去80％上清液，将剩余体积重溶于最终体积为0.5mL的DMEM+10％FBS+2F11(1∶400稀释度[1.25μg抗体])或DMEM+10％FBS+等量DPBS中。允许用一抗(或仅用于阴性对照的DPBS)孵育24小时。第2天，将两个试管以17,000rpm离心40分钟，并将80％的上清液保留在旁边，其余体积再次悬浮于0.5mL DMEM+10％FBS中，然后以17,000rpm冲洗并离心40分钟。将80％的上清液保留在旁边，将剩余体积再次悬浮于两管中的DMEM+10％FBS+偶联18nm金颗粒的山羊抗鼠IgG中。二抗孵育2小时，然后管以17,000rpm离心40分钟。80％清液的80％保留在一侧，其余体积重悬于DMEM+10％FBS中。以17,000rpm离心40分钟，冲洗混悬液。最后，将80％的体积放在旁边，将约4μl的体积(约100μl)置于金属网格上的透射电子显微镜下，并用醋酸双氧铀染色。

实施例2：无活性和活性α-突触核蛋白单体和聚合体的生成

如实施例1所述，获得了无活性和活性α-突触核蛋白单体和聚合体。为了评价可溶性单体和不溶性聚合体是否具有活性(朊病毒样)并能够种子或通过α-突触核蛋白聚合过程接种，使用实施例1中描述的硫磺素试验联合检测两组单体和聚合体，并在37℃条件下孵育1小时或24小时。测定活性和无活性聚合体以及单体的含量。对照包括硫磺单药、PBS单药和无活性单体。结果见图2A。本试验中，α-突触核蛋白聚合增加导致β-折叠结构形成相应增加。当在450nm激发时，此构型中的硫磺素荧光(在485nm处)与β-折叠结构结合。485nm处的荧光量取决于硫磺素的结合量，结合量与β-折叠结构形成量相关。因此，硫磺素荧光增加表明β-折叠结构形成的增加。

孵育1小时或37小时后，未观察到指示β-折叠结构形成的无活性单体或无活性聚合体的荧光增加。然而，活性单体能够在24h内自身传种和生成β-折叠结构。活性聚合体(PFF)也导致1小时和24小时后荧光增加，但这种增加在缺乏生成β-折叠所需的单体构建模块时达到平台期。

无活性聚合体和无活性单体的结合没有导致荧光增加，表明无活性聚合体不能接种无活性单体，以及无活性单体不能进行自接种。无活性单体和活性聚合体(PFF)的组合产生的荧光水平与单独添加PFF(活性聚合体)时相似，因为无活性单体不能作为构建模块来生成β-折叠结构。然而，当活性单体与无活性聚合体结合时，在24小时内观察到荧光大幅增加。这与活性单体可自身传种形成的结果一致。最后，当活性单体和聚合体一起使用时，在1小时和24小时后，荧光读数大幅增加，表明通过活性单体上的PFF(活性聚合体)的种子接种过程发生聚合。

α-突触核蛋白圆二色谱分析

Alliance Protein Laboratories(美国圣地亚哥)采用Jasco-J-1500光谱旋光仪(0.1cm比色皿)进行圆二色谱远紫外检测。计算二级结构依据以下进行：CDNN版本2.1，Guid223；Bohm，G.、Muhr，G.和Jaenicke，R(1992)Quantitative Analysis of Protein farUV Circular Dichroism Spectra by Neural Networks.Protein Eng.5，191-195。

按照实施例1生产的非活性或无活性单体呈现具有与活性单体相似的二级结构。另一方面，通过使用圆二色谱测量测量二级结构，发现有活性的α-突触核蛋白聚合体似乎比无活性的聚合体具有更多的β-折叠含量和更少的α-螺旋(表1)。

表1：使用圆二色谱测定的活性和无活性单体以及活性或无活性聚合体的二级结构含量。

体内活性聚合体催生α-突触核蛋白聚合

如图2B所示，使用丝氨酸129磷酸化特异性抗体检测路易体病理学(实施例1中的方法)，在不含内毒素的情况下，由α-突触核蛋白单体制成的无活性聚合体未显示任何pSer129染色(无活性聚合体-pSer129)，表明无活性聚合体未在大鼠原代皮质细胞中形成内源性α-突触核蛋白聚合。然而，经活性α-突触核蛋白聚合体预处理的细胞pSer129染色证明，在存在内毒素的情况下产生的活性聚合体确实会引起α-突触核蛋白聚合(见活性聚合体-pSer129)。

为进一步确定无活性和活性聚合体之间的差异，两种类型均在电子显微镜下观察。无活性的α-突触核蛋白纤丝形成的纤维比活性的α-突触核蛋白纤维更细，无活性的α-突触核蛋白纤丝的包装也不那么紧密。此外，无活性α-突触核蛋白纤丝相当长，长度达到几微米。另一方面，活性α-突触核蛋白纤丝长度约为55-75nm，宽度约为6-8nm(见图2C)。

这些结果表明，α-突触核蛋白单体和聚合体有两个群体：活性α-突触核蛋白群体和无活性α-突触核蛋白群体。

实施例3：抗活性α-突触核蛋白人群的单克隆抗体的生成

使用RapidPrime技术将小鼠单克隆抗体制备成活性α-突触核蛋白聚合体和活性α-突触核蛋白单体(实施例1)，详见实施例1。使用间接ELISA在活性单体或活性聚合体(PFF)上进行第一轮克隆的初步筛选试验(其中将抗原被包被在平板上，筛选的抗体允许与之结合，然后通过以下来检测该结合：添加对小鼠单克隆具有特异性的第二抗体，但也与辣根过氧化物酶连接，以催化与TMB的检测显色反应；实施例1)，以识别阳性克隆。通过抗体滴度鉴定选定的分泌抗体的杂交瘤，然后按照实施例1的描述进行分型。选择了分泌针对α-突触核蛋白单体活性形式(而不是无活性形式)的抗体的杂交瘤。总共鉴定出20种与α-突触核蛋白单体活性形式结合的单克隆抗体。

通过对变性小鼠脑样本和HeLA裂解物使用蛋白印迹分析，对选定单克隆抗体进行进一步表征。鉴别出一种抗体(2F11)，与其他抗α-突触核蛋白抗体克隆相比，产生独特的区带模式。2F11的序列见序列号：10-13；图11A和B)。

如图3A所示，2F11识别出高分子量条带(＞150kDa)，与通常与单体α-突触核蛋白相关的15kDa条带相反。观察包括4F1(图3B)和3F8(图3C)在内的其他α-突触核蛋白单克隆抗体，鉴定15kDa条带。从大约20种单克隆抗体库中随机选择克隆4F1和3F8，均显示相同的特异性。此外，2F11在HeLa裂解物中发现了一个高分子量条带(＞150kDa)(图3D；已知产生α-突触核蛋白，见网址：proteinatlas.org/ENSG00000145335-SNCA/cell)，

2F11在蛋白印迹中发现的强阳性信号并不显现为高水平蛋白的结果，因为蛋白水平低于使用Ponceau染色或考马斯蓝(Coomassie Blue)染色的检测水平。不愿受理论束缚，该结果表明2F11识别的蛋白可能是低聚体，由许多α-突触核蛋白分子组成(建议分子量至少为10)，其可以为单克隆抗体提供多个结合位点，并在浓度低的情况下产生高的蛋白印迹反应。

图11提供了2F11重链和轻链的核酸和氨基酸序列。

2F11抗体的pI测定有2条IgG1带，表观pI分别为7.23和7.27(在美国的FocusProteomics公司进行分析，使用Biorad ReadyStrip***进行测定)。

2F11抗体的质谱分析显示其具有质量为24，139的轻链和质量为50，155的重链(分析在加拿大维多利亚大学蛋白质组中心进行)。

使用2F11免疫沉淀法

鉴于在蛋白印迹中2F11对单体α-突触核蛋白几乎少有或没有亲和力，使用2F11在天然条件下免疫沉淀小鼠脑裂解物，如实施例1所述。获得沉淀物和流穿组份，并使用蛋白印迹分析再次检测(运行蛋白印迹法之前，将抗体中的蛋白从树脂上洗脱下来，而抗体仍与树脂共价连接)。结果如图5A和5B所示。

如果2F11抗体仅与天然裂解物中的α-突触核蛋白低聚体结合，则预期免疫沉淀物的Western分析将显示稳定的低聚体，而不是单体，这就是所观察到的(图5A)。如图5A、2F11所示，在免疫沉淀的小鼠脑裂解物中发现了α-突触核蛋白的60-70kDa低聚体。

预计在从免疫沉淀的低聚体(流穿组份)洗脱的材料中存在蛋白质的单体形式，并观察到这一点(图5B)。参考图5B，观察到2F11结合三个部分：α-突触核蛋白单体(大约15kDa)、假定的α-突触核蛋白三聚体(大约40kDa)和α-突触核蛋白低聚体(60-70kDa)。

2F11不与活性α-突触核蛋白单体结合

为了评价2F11在体内的结合，使用活性α-突触核蛋白低聚体或与2F11抗体预孵育的活性α-突触核蛋白单体处理BV-2小神经胶质细胞。

将100,000个细胞/孔的小鼠小神经胶质BV-2细胞接种到覆盖聚L-赖氨酸的24孔玻璃载玻片上，持续24小时。活性50μg/mlα-突触核蛋白低聚体与5μg/ml单克隆α-突触核蛋白预孵育；抗体(2F11)或对照IgG在无血清的DMEM中在RT振荡器上预孵育1小时。在无血清DMEM中，使用5μg/ml单克隆α-突触核蛋白抗体(2F11)在RT条件下与活性50μg/mlα-突触核蛋白单体预孵育1小时。将250μl含α-突触核蛋白免疫复合物的培养基加入指定的孔中，并37℃下孵育1小时。处理后，用10％的中性缓冲的***固定细胞，然后进行双免疫细胞化学(ICC)。使用与Alexa 488偶联的抗小鼠IgG抗体检测α-突触核蛋白免疫复合物中的2F11抗体。使用兔多克隆LAMP-1(ab24170，1∶200)检测内化途径；使用与Cy5偶联的抗兔IgG检测LAMP-1。使用Hoechst 33258将细胞核复染。

低聚体结合的2F11很容易检出，并发现主要位于细胞表面。然而，2F11未与α-突触核蛋白单体形成免疫复合物(数据未显示)。

这些结果表明，在天然样本的天然条件下，2F11可结合α-突触核蛋白低聚体，但不与单体结合，在变性条件下(在蛋白印迹分析中使用)，通过2F11鉴定出稳定的低聚体和单体α-突触核蛋白。

实施例4：小鼠单克隆抗体结合人类α-突触核蛋白

小鼠和人类α-突触核蛋白的相似性为95％(见图6)。用于免疫小鼠的α-突触核蛋白是鼠起源。为了确定2F11是否能识别人类样本中的高分子量α-突触核蛋白低聚体，在变性条件下(图7)和在天然条件下(图8A和8B)，使用蛋白印迹分析比较人类大脑裂解物、帕金森氏患者人类大脑裂解物和小鼠大脑裂解物。

参考图7，2F11抗体显示其至少具有结合高中分子量低聚体的双重鼠和人特异性。帕金森病患者的脑裂解物中150kD条带的比例略高于人脑裂解物，但低于小鼠脑裂解物。在人和小鼠样本的变性条件下，相同的抗体也识别出单体α-突触核蛋白条带。

参照图8A，检查了天然(非还原性)条件下2F11抗体的结合情况。用2F11抗体和4F1抗体印迹和探测天然凝胶(图8B)。结果显示，2F11可通过人脑裂解物(包括帕金森氏病脑裂解物和小鼠脑裂解物)结合大约60kD至250kD的高分子量低聚体，具体取决于样本。在天然条件下，也观察到2F11与纯化的活性致病性α-突触核蛋白单体或聚合体结合。在天然条件下，还观察到4F1抗体与高分子量低聚体结合。然而，4F1不能识别纯化的活性致病性α-突触核蛋白单体或聚合体。

结果显示，在天然***中，2F11与人和小鼠样本均可结合。此外，在天然条件下，2F11抗体(和4F1抗体)不与活性α-突触核蛋白单体结合。不愿受理论束缚，2F11可能与活性α-突触核蛋白聚合体有独特的结合模式，使其能够结合活性α-突触核蛋白低聚体的致病物种，或直接参与产生路易体病理学途径的活性低聚体。

结果显示，帕金森氏病脑裂解物中存在寡聚α-突触核蛋白。这也表明这些抗体不是小鼠特异性的，而是会将其种属反应性扩展至人类。

2F11结合活性人类α-突触核蛋白聚合体

通过点印迹法检查了2F11抗体结合活性人类α-突触核蛋白聚合体和无活性人类α-突触核蛋白聚合体的特异性。将活性和无活性突触核蛋白置于硝酸纤维素上，并使用2F11进行检测。我们还检测了抗体A11的能力，其对纤丝前Aβ低聚体(Kayed.R等人，2007，Molecular Neurodegeneration 2007，2：18 doi：10.1186/1750-1326-2-18)在活性和无活性α-突触核蛋白低聚体/纤丝物种中具有阳性特异性。结果如图8C所示，2F11抗体仅与活性α-突触核蛋白聚合体结合。Kayed等人(2007)表明A11抗体结合结合α-突触核蛋白低聚体仅与无活性的寡聚/纤丝物种。

为了进一步证明2F11抗体与寡聚α-突触核蛋白纤丝结合，使用了电子显微镜检查。2F11抗体与纳米金颗粒结合，并允许与活性α-突触核蛋白聚合体结合。如图8D所示，2F11抗体与活性人类α-突触核蛋白聚合体结合。

总体而言，这些结果表明，2F11抗体对活性α-突触核蛋白聚合体具有特异性，并且这两种聚合体(即活性和无活性α-突触核蛋白聚合体)是不同的。

实施例5：在体外，2F11阻断β-折叠结构的形成

α-突触核蛋白β-折叠结构形成

硫磺素体外分析用于测量存在各种抗体时α-突触核蛋白反应的进展。图9A示出典型α-突触核蛋白反应时间动力学。存在活性α-突触核蛋白聚合体和活性α-突触核蛋白单体(第一条)的情况下，活性α-突触核蛋白单体被“接种”，并随时间推移从α-螺旋结构变为β折叠结构，相应的硫磺素荧光增加(与图2A中观察到的结果相似；实施例2)。

β-折叠结构形成需要活性α-突触核蛋白单体和α-突触核蛋白聚合体同时存在，硫磺素荧光增加。随着时间推移，活性α-突触核蛋白聚合体导致硫磺素荧光轻微增加(从上至下第二条)，但β-折叠结构形成的量小于活性α-突触核蛋白聚合体与活性α-突触核蛋白单体的混合物(第一条)。类似的结果如图2所示，随着时间的推移，活性α-突触核蛋白单体可以缓慢地自身传种(从上至下第三条)。

该试验用于测定抗体2F11、4F1和3F8、所有相同的同种型抗体(IgG1kappa)和随机同种型对照抗体：小鼠单克隆至hsp70、StressMarq、cat编码#SMC-104在存在活性α-突触核蛋白聚合体和活性α-突触核蛋白单体的情况下对硫磺素荧光反应动力学的影响。结果见图9B(在反应开始时加入抗体)和图9C(抗体在反应开始前预孵育)。

如图9B所示，将30μg抗体加入100μM的活性α-突触核蛋白单体，以及10nM的活性α-突触核蛋白聚合体。未添加抗体的情况下，存在活性α-突触核蛋白聚合体和活性α-突触核蛋白单体(第一条)、活性聚合体(从下至上第三条)或活性单体(从下至上第二条)时，β-折叠结构形成的时程动力学与图9A中观察到的相似。在反应混合物中加入SMC-104(从上至下第二条)4F1(从上至下第三条)或3F8(从上至下第四条)时，观察到总硫磺素荧光下降，但仍观察到β-折叠结构形成显著增加。存在2F11(从下至上第四条)时，硫磺素荧光大大减少，表明存在2F11抗体时，β-折叠结构形成减少。

添加2F11抗体具有高度破坏性，而且在前1000分钟(16小时)内减少了β-折叠结构的形成速率。然而，活性α-突触核蛋白聚合体+活性α-突触核蛋白单体(第一条)观察到的反应率与在4F1或3F8或对照抗体SMC-104时活性底物的反应率相似。

对于图9C所示的分析，将30μg抗体加入到10nM活性α-突触核蛋白聚合体中，持续60分钟，在加入100μM活性α-突触核蛋白单体开始反应前，冲洗混合物以除去任何未结合的抗体。未添加抗体的情况下，存在活性α-突触核蛋白聚合体和活性α-突触核蛋白单体(第一条)、活性聚合体(从下至上第四条)或活性单体(从下至上第二条)时，β-折叠结构形成的时程动力学与图9A中观察到的相似。

在开始反应前，将抗体与聚合体进行预孵育，导致2F11抗体以类似于单用活性α-突触核蛋白单体(从下至上第二条)或单用α-突触核蛋白聚合体(从下至上第四条)的方式，完全抑制聚合活性(从下至上第三条)。与活性α-突触核蛋白聚合体和活性α-突触核蛋白单体(第一条)相比，在存在2F11反应混合物的情况下，前1000分钟内的荧光增加速率也大大减少，并观察到再次接近活性α-突触核蛋白单体或α-突触核蛋白聚合体的动力学。

与同型对照(SMC-104)抗体预孵育相比，在开始反应前使用3F8和4F1预孵育活性α-突触核蛋白聚合体没有改变前1000分钟内的荧光增加速率，并且导致总荧光只有轻微的差异。

Tauβ-折叠结构形成

由于tau和α-突触核蛋白之间的已知相互作用，Li，X.等人2016，分子神经科学期刊60：298-304)，采用硫磺素试验检测了单克隆抗体2F11对tau诱导的β-折叠结构形成的影响。采用Li W、Lee VM(2006，Biochemistry.45(51)：15692-15701.doi：10.1021/bi061422+)中描述的方法制备Tau纤维。

将抗体(60μg 2F11或SMC-104)与10nM tau纤丝在4℃条件下震摇孵育1小时。将混合物在10000rpm下离心5min，然后用1mL PBS冲洗。该步骤额外重复4次。取出上清液，将tau纤丝(含结合抗体)重新混悬于10μL PBS中，然后加入25μM tau单体开始反应。加入硫磺素T储备液至终浓度25μM。在37℃条件下，于1小时至48小时振荡条件下孵育后，测定各孔(激发450nm，发射485nm)中的硫磺素T荧光。结果如图13所示。

当单独分析tau纤丝或单独分析tau单体时，观察到背景荧光信号。然而，tau单体和tau纤丝的混合物产生了强烈的荧光信号，表明β-折叠结构形成。当单克隆抗体2F11在开始反应之前与tau单体和tau纤丝预孵育时，观察到tau反应的进度被阻断。单克隆抗体SMC-104(小鼠hsp70单克隆)对tau反应几乎没有影响。

这些结果表明单克隆抗体2F11在体外阻断tau纤丝、β-折叠结构的形成。

实施例6：在体内，2F11抑制α-突触核蛋白纤丝诱导的路易体活性病理

如实施例5所示，鉴于2F11在显示能够在体外抑制α-突触核蛋白的聚合，检测到从Sprague-Dawley大鼠胚胎大脑获取的原代皮质细胞中2F11抗体抑制α-突触核蛋白聚合的能力。

如图9D所示，对照样本经DAPI处理并检测了pSer129α-突触核蛋白抗体(左上图)，仅显示DAPI染色的细胞核。首先将活性α-突触核蛋白纤丝加入原代大脑细胞，随后进行DAPI染色并使用pSer129α-突触核蛋白抗体进行检测，结果显示，经DAPI染色的细胞核和经pSer129抗体染色的细胞(右上图)，表明pSer129与α-突触核蛋白抗体结合，以及α-突触核蛋白在大脑细胞中诱导了病理学。当将活性α-突触核蛋白纤丝和2F11加入到原代脑损伤细胞中，暴露于DAPI并与pSer129α-突触核蛋白抗体结合，观察到DAPI染色的核酸背景上有少量的pSer129染色(下图)。因此，α-突触核蛋白聚合体的加入诱导了原代皮质细胞的路易体病理学(右上图)，然而，当加入2F11抗体与α-突触核蛋白聚合体时，路易体病理学被抑制(下图)。

这些结果表明，2F11抑制活性α-突触核蛋白纤丝诱导的原代大脑细胞的路易体病理学。

2F11抗体经纹状体注射减少原代大鼠皮质细胞中路易体的生成

还在体内检查了2F11抗体中和大鼠皮质细胞中生成路易体病理学的能力。注射后30天(dpi)对大鼠实施安乐死。4月龄雄性Long Evans大鼠随机分为4组。患者接受无菌PBS(对照，4μLPBS)、超声处理的预形成α-突触核蛋白纤丝(PFF；共4.2μg)或PFF plus抗体(如适用)(2μg)1个部位的经纹状体注射。检测了2种抗体(2μg抗体)中和路易体病理学形成的能力：已知2F11中和体外病理学和3D10，另一种α-突触核蛋白抗体不能中和病理学的产生。

经纹状体注射前，将保存在-80℃下的PFF解冻，并使用具有60个脉冲、10％功率(总共持续30s，0.5s开启，0.5s关闭)的超声膜100型(Fisher Scientific)在室温下进行超声处理。将麻醉大鼠(吸入异氟烷)置于立体定向仪中。使用手术刀刀片，通过正中切口暴露颅骨，并使颅骨表面干燥以鉴定前囟。钻一个直径为1mm直通硬脑膜的孔。适当情况下，使用5μL Hamilton注射器，将无菌PBS、PFF或含抗体的PFF注射至右侧纹状体的某个部位，总体积为4μL(距离颅骨AP+1.6mm、ML+2.4mm、DV-4.2mm)，速率为每分钟0.4μL。每次注射后，注射器置于原处2分钟，然后缓慢拔出。手术后对动物每周监测一次，并在注射后30天(dpi)处死。

动物经心脏灌注200mL肝素化0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)，随后在0.1MPBS中稀释200mL 4％多聚甲醛(PFA)。灌注后，解剖大脑，并将其浸泡在相同的固定液(4％PFA的0.1MPBS溶液)中，在4℃下过夜固定。使用振荡器(Leica VT1000S)将大脑切片放入冷PBS中，制成50微米切片。每6片中的1片保存在同一个孔中。使用每只动物的一个孔进行免疫荧光染色。将切片分成12孔板的小孔，并在室温下于含3mL2％牛血清白蛋白(BSA)和0.2％Triton-100X的0.1M PBS中孵育1小时。样本经封闭和透化处理后，将切片在2％BSA-PBS中冲洗10分钟，共冲洗3次。在2％BSA-PBS中制备1∶500稀释的StressMarq SPC-742(丝氨酸129磷酸化特异性α-突触核蛋白抗体)，并添加至每个孔中。将切片在4℃条件下摇动过夜，总体积为3mL/孔。样本在2％BSA-PBS中冲洗10分钟，共冲洗3次。制备并向每孔中加入2％BSA-PBS中与Alexa Fluor488偶联的羊抗兔第二抗体1∶400的稀释物。将切片在室温下震摇2小时，总体积为每孔3mL。样本在2％BSA-PBS中洗涤两次，每次10分钟，然后用DAPI复染10分钟，在PBS中洗涤10分钟。固定切片，使其干燥约40分钟，在盖玻片上加入fluoront-G(ThermoFisher Scientific，目录号00-4958-02)。使用Olympus BX51共聚焦显微镜和Fluoview FV1000软件采集图像。用405nm激光激发DAPI，用461nm激光激发Alexa-488。所有采集参数(如激光功率、HV、增益、z-步骤)在样本之间保持恒定。

从接受PBS中α-突触核蛋白纤丝处理的大鼠中获得的皮质组织切片显示出局部荧光，表明α-突触核蛋白抗体(pSer129)与α-突触核蛋白纤丝和α-突触核蛋白聚合体形成结合。然而，在PBS(对照)处理的大鼠中，没有观察到荧光，表明没有形成α-突触核蛋白聚合体。在用α-突触核蛋白纤丝和抗体3D10处理的大鼠皮质细胞中也观察到局部荧光，表明抗体(pSer129)与α-突触核蛋白纤丝和α-突触核蛋白聚合体形成结合。接受α-突触核蛋白纤丝和抗体3D10的皮质细胞中的局部结合量与仅施用α-突触核蛋白纤丝的大鼠皮质组织切片中观察到的量相似。虽然在用α-突触核蛋白纤丝和抗体2F11处理的大鼠脑皮质细胞中观察到局部荧光，但与单用α-突触核蛋白纤丝或α-突触核蛋白纤丝和抗体3D10处理的皮质细胞中观察到的结合位点的数量和大小相比，局部结合位点的数量和大小均减少。

上述结果表明，使用2F11抗体处理脑组织可减少体内大鼠皮质细胞中路易体的生成。

2F11减弱α-突触核蛋白细胞毒性作用

已知α-突触核蛋白具有细胞毒性作用，因此检测了2F11抗体降低SHSY-5Y细胞中细胞毒性的能力。

在96孔板中以20,000个细胞/孔接种人类SHSY-5Y细胞，在存在10μM RA的条件下分化5天。用1x PBS冲洗细胞，检测α-突触核蛋白抗体(2F11)中和α-突触核蛋白低聚体毒性作用的能力。将活性α-突触核蛋白低聚体、无活性α-突触核蛋白低聚体和活性α-突触核蛋白单体(25μg/ml或50μg/ml)与5μg/ml单克隆2F11在无血清DMEM中于RT振荡器中预孵育2小时。去除培养基，相关微孔中加入100μl含活性α-突触核蛋白聚合体+2F11抗体的培养基，37℃孵育过夜。处理后，立即用10％中性缓冲***固定细胞，并使用β-III微管蛋白抗体(β-III微管蛋白用作神经元细胞标志物)进行免疫染色。细胞死亡表示为总细胞百分比或β-III阳性细胞百分比。结果见图9E。

向人SHSY-5Y细胞中加入活性α-突触核蛋白低聚体，随后加入活性α-突触核蛋白低聚体与对照(未处理)细胞、暴露于无活性的活性α-突触核蛋白低聚体的细胞或暴露于活性α-突触核蛋白单体的细胞相比，导致更高水平的细胞死亡。该结果表明，活性α-突触核蛋白低聚体可能被活性α-突触核蛋白低聚体募集，与无活性α-突触核蛋白低聚体相比，反应导致细胞死亡增加。

向人类SHSY-5Y细胞中加入活性α-突触核蛋白低聚体，随后加入活性α-突触核蛋白聚合体+2F11抗体，可以使细胞死亡降低(约2.5倍)至在暴露于无活性α-突触核蛋白低聚体或活性α-突触核蛋白单体的细胞中所观察到的水平。这些结果表明，2F11在体内可阻断或中和α-突触核蛋白低聚体的毒性作用。

实施例7：表位作图

通过与长度约为30个氨基酸的α-突触核蛋白肽结合，评估了2F11和其他几种抗体的表位结合，包括4F1、3F8(以及按照实施例3中描述制备的其他抗体)，每种α-突触核蛋白肽与邻近氨基酸序列中约10个氨基酸残基重叠(如上所述：“用于表位定位的肽合成”)。

使用ELISA、点印迹法(DB)或蛋白印迹法(WB)进行分析前，将一系列重叠肽结合至BSA。

如实施例3所述，选择大约20种抗体作为结合活性α-突触核蛋白单体，但是，它们在天然或变性条件下表现出不同的结合。因此，选择包括变性和天然结合条件的三种方法用于图谱分析。这些方法涉及：蛋白印迹法(在变性条件下)、点印迹法(在非变性条件下)(使用与蛋白印迹法类似的输出***，但不使用离子洗涤剂(如十二烷基硫酸钠)、还原剂和沸点温度使样本变性)和ELISA(在非变性条件下)。实施例3中最初选择的15种抗体的结合分析结果如图10所示。

如图10所示，2F11克隆显示独特的表位图，是唯一仅与氨基酸61-90和氨基酸101-130特异性结合的克隆(使用ELISA测定)。其余抗体结合不同的区域组合。例如，克隆3F8也表现出与C-末端部分的强结合(氨基酸101-130和121-140；使用变性和非变性方法)。克隆3F8也与氨基酸41-70结合。

这些结果进一步表明了2F11抗体的独特性质。2F11独特的结合能力使其能够结合并中和α-突触核蛋白聚合和纤丝化反应的核心组分。

实施例8：ELISA测量强效寡聚α-突触核蛋白

使用2F11制备基于三明治的ELISA检测。对照治疗可使用4F1和3F8抗体。可以使用重组α-突触核蛋白种子，或活性α-突触核蛋白聚合体作为标准。ELISA分析可用于选择性测量强效寡聚α-突触核蛋白。含量测定未发现无活性的单体或无活性的聚合α-突触核蛋白。

实施例9：小鼠免疫

转基因(tg)小鼠(PD模型；见网址：jax.org/strain/004479；Masliah等人，2011)和非tg小鼠使用2F11、3F8和4F1抗体分别免疫接种，每周1次腹膜内注射，共6个月，Masliah等人，2011。

行为反应

按照Masliah等人(2011)的描述，每周腹腔内注射6个月后，使用水迷宫试验、杆状测试和旋转测试评价α-突触核蛋白转基因(tg)小鼠和非tg小鼠的行为反应。结果将确定免疫的tg小鼠是否有更好的记忆恢复，是否能以与非tg小鼠相似的方式完成其任务，并确定抗体治疗是否逆转学习障碍。

血浆水平

测定6个月期间小鼠血浆和脑脊液中2F11、3F8、4F1抗体的滴度。脑部滴度增加将表明抗体能够穿过血脑屏障。

免疫组织化学

6个月后处死动物，对其海马结构和新皮质样本进行免疫组织化学分析(如Masliah等人所述，2011)。结果显示，免疫的tg小鼠的海马结构和新皮质中的α-突触核蛋白水平发生变化。

所有参考文献在此被引用合并

本申请描述了一个或多个实施例。在上文中已示例性地说明了本发明的一个或多个示例性实施例。但是，本领域技术人员应理解，在不脱离如所附权利要求所限定的本发明的范围的前提下，能够做出各种变化和修改。

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Claims

1.一种沉积在ATCC PTA-124174下的单克隆抗体2F11。

2.一种包含权利要求1中定义的单克隆抗体2F11的组合物，其在药学上可接受的载体、佐剂、溶媒或赋形剂中。

3.一种包含权利要求1中定义的单克隆抗体2F11的疫苗，其在药学上可接受的载体、佐剂、溶媒或赋形剂中。

4.一种在有需要的受试者中减少活性α-突触核蛋白或tau纤丝形成的方法，包括向所述受试者施用一定量的权利要求2所述的组合物。

5.一种在有需要的患者中减少活性α-突触核蛋白或tau纤丝形成的方法，包括向所述受试者施用一定量的权利要求3所述的疫苗。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述组合物经口服、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用于所述受试者。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述疫苗经口服、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用于所述受试者。

8.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述施用的步骤前，测定所述受试者中的活性α-突触核蛋白或tau纤丝的水平，并且在所述施用的步骤后的一段时间之后，测定活性α-突触核蛋白或tau纤丝的第二水平。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，在所述施用的步骤前，测定所述受试者中的活性α-突触核蛋白或tau纤丝的水平，并且在所述施用的步骤后的一段时间之后，测定活性α-突触核蛋白或tau纤丝的第二水平。

10.一种测定样品中是否存在活性寡聚α-突触核蛋白的方法，包括：

i)所述样本的一部分与对照抗体预混合，然后加入重组的活性α-突触核蛋白单体，以产生对照治疗，

ii)将所述样本的第二部分与权利要求1中定义的单克隆抗体2F11预混合，然后加入重组的活性α-突触核蛋白单体，以产生活性治疗，

iii)使用硫磺素试验测定所述对照治疗和所述活性治疗两者中的β-折叠结构形成的量，其中，与所述对照治疗相比，所述活性治疗中的硫磺素荧光下降表明所述样品中存在活性寡聚α-突触核蛋白。

11.一种测定样品中是否存在活性寡聚α-突触核蛋白或tau纤丝的方法，包括将所述样品暴露于权利要求1中定义的单克隆抗体2F11，并测定所述单克隆抗体2F11是否与所述样品中的蛋白结合，其中，结合表明存在所述活性寡聚α-突触核蛋白或tau纤丝。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，在所述暴露的步骤前使用非变性电泳法分离所述样品，并经由Western分析使用所述单克隆抗体2F11探测所分离的蛋白，其中结合一个或多个高分子量蛋白表明所述样品中存在所述活性寡聚α-突触核蛋白或tau纤丝。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，使用所述单克隆抗体2F11探测所述样品的斑点印迹，并且所述单克隆抗体2F11与所述样品的结合表明存在所述活性寡聚α-突触核蛋白或所述tau纤丝。

14.一种在诊断为以下的受试者中诱导免疫反应的方法：突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森病、路易体痴呆、多***萎缩、阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病或家族性阿尔茨海默病，所述方法包括向受试者施用权利要求1中定义的单克隆抗体2F11，或包含所述单克隆抗体2F11的药物组合物。

15.一种治疗以下的方法：突触核蛋白病、以路易体为特征的病理状况、帕金森病、路易体痴呆、多***萎缩、散发性阿尔茨海默病或家族性阿尔茨海默病，所述方法包括向受试者施用权利要求1中定义的单克隆抗体2F11或包含所述单克隆抗体2F11的药物组合物。

16.一种用于测定样品中的活性寡聚α-突触核蛋白或tau纤丝的存在、浓度、或存在和浓度两者的方法，包括将样品施用于已使用权利要求1所述的单克隆抗体2F11制备的表面上，并测定与所述单克隆抗体结合的活性α-突触核蛋白聚合体或tau聚合体的出现次数、数量、或出现次数和数量两者，由此测定所述样品中的活性α-突触核蛋白聚合体或tau聚合体的存在、浓度、或存在和浓度两者。

17.一种单克隆抗体，包含由序列号：14-19定义的氨基酸序列，其是编码单克隆抗体CDR的氨基酸序列。

18.根据权利要求17所述的单克隆抗体，其中，所述氨基酸序列由包含一个或多个核苷酸序列的核酸序列所编码，所述核苷酸序列由序列号：20-25定义。

19.根据权利要求17所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体结合α–突触核蛋白活性聚合体、tau纤丝或其组合。

20.一种用于迁移血脑屏障的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含附接到权利要求1所述的单克隆抗体上的一个或多个载体分子。

21.根据权利要求20所述的多特异性抗体，其中，所述多特异性抗体为双特异性抗体，并且所述双特异性抗体为单价-双特异性抗体或二价-双特异性抗体。

22.根据权利要求21所述的多特异性抗体，其中，所述双特异性抗体的所述一个或多个载体分子源自转移因子受体(TfR)-结合抗体或源自***1受体(IGF1R)-结合抗体。

23.一种用于测定样品中是否存在tau聚合体的方法，包括：

i)将所述样本的一部分与对照抗体预混合，然后加入tau单体，以产生对照治疗，

ii)将所述样本的第二部分与单克隆抗体2F11预混合，然后加入所述tau单体，以产生活性治疗，和

iii)在所述对照治疗和所述活性治疗中测定β-折叠结构形成的量，其中，与所述对照治疗相比，所述活性治疗中β-折叠结构形成的量减少表明所述样品中存在tau聚合体。

24.一种在已诊断患有以下的受试者中诱导免疫反应的方法：tau病、以神经元纤维缠结为特征的病理状况、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关tau病、仅神经元纤维缠结性痴呆、球状胶质tau病，所述方法包括向受试者施用权利要求1中定义的单克隆抗体2F11，或包含所述单克隆抗体2F11的药物组合物。

25.一种治疗以下的方法：tau病、以神经元纤维缠结为特征的病理状况、阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、额颞叶痴呆、嗜银颗粒病、原发性年龄相关性tau病、仅神经元纤维缠结性痴呆、或球状胶质tau病，所述方法包括向受试者施用权利要求1中定义的单克隆抗体2F11，或包含所述单克隆抗体2F11的药物组合物。