KR20210087462A - Gm1 및 gm2 강글리오시드증의 치료를 위한 raav 벡터 - Google Patents

Gm1 및 gm2 강글리오시드증의 치료를 위한 raav 벡터 Download PDF

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Abstract

본 개시의 양태는 GM1 강글리오시드증, 테이 삭스병 및 샌드호프병과 같은 리소좀 축적병의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 조성물은 베타-갈락토시다제를 인코딩하는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 베타-헥소사미니다제 서브유닛(예를 들어, HEXA, HEXB 또는 이들의 조합)을 인코딩하는 바이러스 벡터를 포함한다.

Description

GM1 및 GM2 강글리오시드증의 치료를 위한 RAAV 벡터
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 "GM1 및 GM2 강글리오시드증의 치료를 위한 RAAV 벡터"의 명칭으로 2018년 10월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/741,848, "GM1 및 GM2 강글리오시드증의 치료를 위한 RAAV 벡터"의 명칭으로 2019년 3월 6일에 출원된 62/814,587, "GM1 및 GM2 강글리오시드증의 치료를 위한 RAAV 벡터"의 명칭으로 2019년 3월 8일에 출원된 62/815,996, "GM1 및 GM2 강글리오시드증의 치료를 위한 RAAV 벡터"의 명칭으로 2019년 3월 29일에 출원된 62/826,863", "GM1 및 GM2 강글리오시드증의 치료를 위한 RAAV 벡터"의 명칭으로 2019년 4월 29일에 출원된 62/840,359, 및 "GM1 및 GM2 강글리오시드증의 치료를 위한 RAAV 벡터"의 명칭으로 2019년 5월 16일에 출원된 62/848,858의 출원일의 이익을 주장하며, 각 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
EFS-WEB을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 언급
본 출원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록(명칭: "Sequence Listing"; 크기: 80,237 바이트; 및 Patent-In 3.5으로 작성됨)을 포함하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시는 일부 양태에서 리소좀 축적병의 치료에 유용한 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV), 조성물 및 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 리소좀 축적병은 GM1 또는 GM2 강글리오시드증(예를 들어, 테이 삭스병)이다.
연방 지원 연구
본 발명은 국립보건원에 의해 수여되는 수여 번호 HD060576 하에 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
배경
GM1 강글리오시드증은 인간 유전자 GLB1의 돌연변이에 의해 야기되는 상염색체 열성 신경병성 리소좀 축적병이다. 인간 GLB1 유전자는 중추 신경계(예를 들어, GM1 강글리오시드) 및 말초 조직(예를 들어, 올리고당, 당단백질 및 글리코사미노글리칸)의 수많은 분자로부터 말단 갈락토스 잔기를 제거하는 효소 β-D-갈락토시다제(βgal)를 인코딩한다. 리소좀 βgal 활성의 결핍은 GM1 강글리오시드 및 이의 아시알로-유도체 GA1이 그 합성 속도가 가장 높은 중추 신경계에 주로 축적되게 한다. GM1 강글리오시드증은 한결같이 치명적이며 효과적인 요법이 존재하지 않는다.
테이 삭스병(GM2 강글리오시드증) 및 샌드호프(Sandhoff)병은 각각 HEXA 및 HEXB 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 상염색체 열성 리소좀 축적병으로, β-N-아세틸-D-헥소사미니다제(Hex) 효소 활성의 결핍을 초래한다. Hex 효소는 HexA 및 HexB 단백질 서브유닛을 포함하는 이종이량체이다. Hex 활성의 결핍은 중추 신경계에서 GM2 강글리오시드의 점진적인 축적을 초래하고 이에 따른 신경변성을 초래한다. 테이 삭스병은 끊임 없이 진행되는 신경계의 쇠퇴와 궁극적인 죽음을 특징으로 한다. 테이 삭스병의 증상은 잦은 발작, 삼킴 곤란, 운동 조절 상실 및 잦은 호흡기 감염을 포함한다. 샌드호프병은 또한 CNS의 점진적인 쇠퇴를 특징으로 하며, 보행 이상, 삼킴 및 언어 장애, 말초 신경병증, 정신적 증상 및 궁극적인 사망을 초래한다. 현재 테이 삭스병 또는 샌드호프병에 대한 질병-변형 치료 옵션은 없으며, 항경련제 및 진경제를 포함하는 증상 치료만이 가능하다.
개요
본 개시의 양태는 유전자 전달을 위한 재조합 AAV 벡터에 관한 것이다. 일부 현재의 AAV 벡터는 대상체에서 부작용(예를 들어, 세포독성)을 야기하는 높은 수준의 유전자 발현을 전달한다. 본 개시는 조작된 조절 요소가 부작용의 유도 없이 치료량의 트랜스진을 제공하기 위해 트랜스진 발현 수준을 조절할 수 있다는 인식에 부분적으로 기초한다.
일부 양태에서, 본 개시는 키메라 인트론을 통해 리소좀 축적병-관련 단백질(예를 들어, HEXA, HEXB, GLB1 등)을 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 재조합 AAV(rAAV)를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 키메라 인트론을 통해 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 재조합 AAV(rAAV)를 제공하며, 여기서 프로모터 및 트랜스진은 키메라 인트론에 의해 분리되고, 핵산은 인핸서 요소를 함유하지 않으며, 트랜스진은 리소좀 축적병-관련 단백질(예를 들어, HEXA 및/또는 HEXB 및/또는 GLB1)을 인코딩한다. 일부 구체예에서, 프로모터는 닭 베타-액틴(CB) 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 인트론은 닭 베타 액틴 인트론 및/또는 토끼 베타 글로빈 인트론을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 하나 이상의 비번역 서열, 예를 들어, 토끼 베타-글로불린 엑손 1 및/또는 엑손 2로부터의 비번역 서열을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 인트론은 2개의 비번역 서열의 측면에 위치한다(예를 들어, 제1 비번역 서열은 프로모터와 키메라 인트론 사이에 위치하고 제2 비번역 영역은 키메라 인트론과 트랜스진의 제1 코돈 사이에 위치한다).
일부 구체예에서, βgal은 인간 βgal이다. 일부 구체예에서, 본 개시에 의해 기재된 rAAV는 베타-헥소사미니다제 서브유닛 알파(HexA)를 인코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 구체예에서, HEXA는 SEQ ID NO: 20에 제시된 서열로 표시된다. 일부 구체예에서, 트랜스진은 베타-헥소사미니다제 서브유닛 베타(HexB)를 인코딩한다. 일부 구체예에서, HEXB는 SEQ ID NO: 21에 제시된 서열로 표시된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 rAAV의 적어도 하나의 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10 캡시드 단백질이다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 rAAV의 적어도 하나의 ITR은 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR 또는 AAV6 ITR로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 ITR은 전장 ITR이다. 일부 구체예에서, rAAV는 2개의 ITR을 포함하고, 여기서 하이브리드 프로모터 및 트랜스진은 2개의 ITR 사이에 위치한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 rAAV는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10 중 하나를 갖는다.
일부 구체예에서, 본 개시는 본원에 기재된 rAAV의 성분을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 개시는 SEQ ID NO: 1 내지 6 또는 16 내지 19로부터 선택되는 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 SEQ ID NO: 20 또는 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.
일부 구체예에서, rAAV의 성분을 인코딩하는 핵산(예를 들어, SEQ ID NO:1 내지 6 또는 16 내지 19로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO:1 내지 6 또는 16 내지 19로부터 선택되는 서열의 일부를 포함하는 핵산)은 숙주 세포에 포함된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포이다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 AAV 캡시드 단백질(e.g., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10 캡시드 단백질)을 인코딩하는 분리된 핵산을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 (i) 키메라 인트론을 통해 베타-헥소사미니다제 서브유닛 알파(HexA)를 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 제1 rAAV; 및 (ii) 키메라 인트론을 통해 베타-헥소사미니다제 서브유닛 베타(HexB)를 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 제2 rAAV를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 rAAV 및 제2 rAAV는 조성물에 1:1의 비로 존재한다.
일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 AAV(rAAV) 또는 약학적 조성물을 리소좀 축적병(예를 들어, 테이 삭스병, GM2 강글리오시드증, 샌드호프병, 모르키오 증후군 B 등)을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 리소좀 축적병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 리소좀 축적병은 테이 삭스병 또는 샌드호프병이다. 일부 구체예에서, rAAV 또는 약학적 조성물은 두개내 주사, 뇌내 주사, 또는 대뇌 심실 시스템, 소뇌숨뇌수조 또는 척수강내 공간을 통한 CSF로의 주사에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 또는 약학적 조성물을 GM2 강글리오시드증을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 GM2 강글리오시드증을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 AAV(rAAV)를 수용하는 용기; 또는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 AAV(rAAV)를 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 키트는 약학적으로 허용되는 담체를 수용하는 용기를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, rAAV 또는 rAAV와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 동일한 용기에 수용된다. 일부 구체예에서, 용기는 주사기이다.
일부 양태에서, 본 개시는 SEQ ID NO: 23에 제시된 바와 같이 인간 GLB1을 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 SEQ ID NO: 23에 제시된 바와 같이 인간 GLB1을 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 인코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 rAAV 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시는 rAAV 또는 약학적 조성물을 GM1 강글리오시드증을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 GM1 강글리오시드증을 치료하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1A-1B는 rAAV 벡터 CBA-mβgal-WPRE의 설계를 보여준다. 도 1A는 rAAV 벡터 CBA-mβgal-WPRE의 개략도를 보여준다. AAV2로부터의 2개의 역 말단 반복부(ITR)는 각 단부에서 벡터의 측면에 있다. CBA 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터에 융합된 사이토메갈로바이러스 즉시 조기 인핸서(CMV), 이어서 키메라 닭 베타-액틴/토끼 베타 글로빈 인트론(CBA), 마우스 리소좀 산 β-갈락토시다제 cDNA(mβgal), 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE), 및 소 성장 호르몬(BGH) 및 SV40으로부터 유래된 직렬 방식(in tandem)의 2개의 폴리A 신호로 구성된다. 이 벡터는 이후 AAVrh8 캡시드에 패키징되었다. 도 1B는 CBA 프로모터의 제어하에 hGLB1을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV(rAAV) 벡터를 보여준다.
도 2A-2J는 βgal-/- 마우스에 두개내 주사된 AAVrh8-mβgal이 용량 의존적 효소 분포를 생성함을 보여준다. 대표적인 AAVrh8-주사된 동물 및 연령-매칭된 대조군의 뇌에서 βgal 발현을 주사 후 2주(4e10vg) 또는 3개월(2.6e10vg 및 2.6e9vg)에 X-gal을 사용한 20 μm 관상 뇌 섹션의 조직화학적 염색 및 Nuclear Fast Red를 사용한 대조 염색에 의해 분석하였다. 도 2A-2B는 4e10vg를 나타내고; 도 2E-2F는 2.6e10vg를 나타내고; 도 2I-2J는 2.6e9vg를 나타내고; 도 2C-2D는 나이브 βgal-/-를 나타내고; 도 2G-2H는 나이브 βgal+/- 마우스를 나타낸다. 이미지는 N ≥ 3마리 마우스/그룹을 나타낸다.
도 3A-3C는 AAV가 두개내 주사된 βgal-/- 마우스가 로타로드에서 상당한 운동 성능을 유지함을 보여준다. 가속 로타로드 시험(5분에 걸쳐 4-40 rpm)에서 운동 기능에 대해 동물을 평가하였다. 세 번의 시험에서 가장 높은 값이 기록되었다. (도 3A) 4e10vg; (도 3B) 2.6e10vg 및 (도 3C) 2.6e9vg의 AAVrh8 벡터의 총 용량으로 처리된 βgal-/- 동물은 모두 비-파라미터 언페어드 스튜던트 T 테스트 및 웰치-보정(Welsh-correction)을 사용하여 주사 6개월 후에 나이브 βgal-/- 대조군보다 유의하게 우수한 운동 성능을 유지하였다(각각 P = 0.006, 0.0009, 0.005). N = 각 시점에 3-15마리 동물/그룹, 및 N = 처리 6개월 후 6-10마리 동물/그룹.
도 4는 AAV가 두개내 주사된 βgal-/- 마우스가 수명에서 상당한 연장을 달성함을 보여준다. 두개내 AAVrh8 처리된 βgal-/- 마우스에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선. 4e10vg, 2.6e10vg 및 2.6e9vg의 AAVrh8 벡터의 총 용량으로 처리된 마우스는 모두 Log-rank(Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 나이브 βgal-/- 대조군에 비해 현저히 연장된 수명을 가졌다(각각 p = 0.0004, 0.002, < 0.0001). 중간 생존율은 나이브 βgal-/- 대조군(245.5일, N = 13)으로부터 4e10vg 코호트(293.5일, N = 12), 2.6e10vg 코호트(349.0일, N = 13) 및 2.6e9vg 코호트(389.0일, N = 13)까지 증가하였다.
도 5A-5F는 βgal-/- 마우스에서 AAV의 두개내 주사가 가장 높은 효소 발현 영역에서 비정상적인 필리핀(Filipin) 염색을 초래함을 보여준다. 도 5A는 1 μl의 AAVrh8-CBA-mβgal-WPRE(2.6e10vg 총 용량)가 양측에서 시상으로 주사된 대표적인 βgal-/-(KO + AAV)에서 주사 12주 후 βgal 효소 존재에 대해 Xgal로 염색되고 Nuclear Fast Red로 대조 염색된 마우스 뇌의 관상 섹션을 보여준다. 도 5B는 βgal-/- 미처리 마우스(KO 미처리)를 보여준다. 박스는 (도 5C)-(도 5F)에 묘사된 이미지의 위치를 나타낸다. 2.6e10vg의 AAVrh8-CBA-mβgal-WPRE로 처리된 βgal-/- 동물에서 인접한 뇌 섹션에 대한 필리핀 염색은 도 5C 및 도 5E에 도시되어 있다. 도 5D 및 도 5F는 βgal-/- 미처리 마우스(KO 미처리)를 보여준다. 10X 배율로 촬영한 필리핀 이미지. 이미지는 N ≥ 3마리 마우스/그룹을 나타낸다.
도 6A-6H는 긴 수명의 AAV 두개내 주사된 βgal-/- 마우스의 척수에서 리소좀 저장이 지속됨을 보여준다. GM1-강글리오시드 저장에 대해 20 μm로 절단된 척수 섹션을 필리핀으로 염색하였다. 긴 수명의 모든 동물은 척수에서 어느 정도의 제거를 보였지만, 제거가 발생하지 않은 영역도 함유하였다. 도 6A 및 도 6B는 621일에 4e10vg의 주사를 보여준다. 도 6C 및 도 6D는 547일에 2.6e10vg의 주사를 보여준다. 도 6E 및 도 6F는 495일에 2.6e9vg의 주사를 보여준다. 도 6G 및 도 6H는 전체에 걸쳐 저장과 함께 약 250일에 나이브 βgal-/-의 주사를 보여준다. 이미지는 N ≥ 2마리 마우스/그룹을 나타낸다.
도 7A-7K는 βgal-/- 마우스에서 AAV의 두개내 주사가 시상에서 주사 부위에 형태학적 변화를 초래함을 보여준다. 두개내 주사된 βgal-/- 마우스를 주사 후 2주(4e10vg) 또는 3개월(2.6e10vg 및 2.6e9vg)에 20 μm 관상 뇌 섹션의 H&E 염색에 의해 분석하였다. 시상 주사 부위의 형태학적 변화: 두꺼운 화살표는 혈관 커핑(vascular cuffing)을 나타내고, 얇은 화살표는 염증을 나타낸다. 왼쪽 패널은 10x, 오른쪽 패널은 40x 촬영한 사진이다(왼쪽 패널의 영역에서). 형태학적 변화 및 뉴런 손실은 최저 주사 용량에서 감소하는 것으로 보인다. 도 7A 및 도 7B는 처리 2주 후에 4e10vg의 주사를 보여준다. 도 7E 및 도 7F는 처리 3개월 후에 2.6e10vg의 주사를 보여준다. 도 7I 및 도 7J는 처리 3개월 후에 2.6e9vg의 주사를 보여준다. 도 7G 및 도 7H는 처리된 동물의 연령에서 미처리된 나이브 βgal+/-를 보여준다. 도 7C 및 도 7D는 처리된 동물의 연령에서 미처리된 나이브 βgal-/-를 보여준다. 도 7K는 AAVrh8-mβgal이 주사된 대뇌를 보여준다. 빨간색 화살표는 βgal 동물의 주사 부위 및 여기에 표시된 사진의 위치를 나타낸다. 스케일 바는 100um을 나타낸다. 이미지는 N ≥ 3마리 마우스/그룹을 나타낸다.
도 8A-8K는 βgal-/- 마우스에서 AAV의 두개내 주사가 심부 소뇌핵에서 주사 부위에 형태학적 변화를 초래함을 보여준다. 두개내 주사된 βgal-/- 마우스를 주사 후 2주(4e10vg) 또는 3개월(2.6e10vg 및 2.6e9vg)에 20 μm 관상 뇌 섹션의 H&E 염색에 의해 분석하였다. DCN의 주사된 영역에서 기록된 형태학적 변화. 두꺼운 화살표는 혈관 커핑을 나타낸다. 화살촉은 의심되는 신경세포 침윤을 나타낸다. 왼쪽 패널은 10x, 오른쪽 패널은 40x 촬영한 사진이다(왼쪽 패널에 표시된 영역에서). 형태학적 변화 및 뉴런 손실은 최저 주사 용량에서 감소하는 것으로 보인다. 도 8A 및 도 8B는 처리 2주 후에 4e10vg의 주사를 보여준다. 도 8E 및 도 8F는 처리 3개월 후에 2.6e10vg의 주사를 보여준다. 도 8I 및 도 8J는 처리 3개월 후에 2.6e9vg의 주사를 보여준다. 도 8G 및 도 8H는 처리된 동물의 연령에서 미처리된 나이브 βgal+/-를 보여준다. 도 8C 및 도 8D는 처리된 동물의 연령에서 나이브 βgal-/-의 주사를 보여준다. 도 8K는 AAVrh8-mβgal이 주사된 DCN을 보여준다. 화살표는 βgal 동물의 주사 부위 및 여기에 표시된 사진의 위치를 나타낸다. 스케일 바는 100um을 나타낸다. 이미지는 N ≥ 3마리 마우스/그룹을 나타낸다.
도 9A-9L은 βgal+/- 및 βgal-/- 마우스에서 AAV의 두개내 주사가 가장 강한 효소 발현 영역에서 비정상적인 필리핀 염색을 초래함을 보여준다. 1 μl의 AAVrh8-CBA-mβgal-WPRE가 1.7x1012vg/μl로 양측에서 시상으로 주사되고, 2 μl가 뇌내 심실로 주사되고, 0.3 μl가 심부 소뇌핵으로 주사된 대표적인 (도 9A) βgal+/-(CA + AAV) (도 9B) βgal-/-(KO + AAV), 및 (도 9C) βgal-/- 미처리 마우스(KO 미처리)에서 주사 10주 후 βgal 효소 존재에 대해 Xgal로 염색되고 Nuclear Fast Red로 대조 염색된 마우스 뇌의 시상 섹션. 박스는 도 9D-9I에 묘사된 이미지의 위치를 나타낸다. 필리핀 염색은 CA + AAV(도 9D, 도 9G 및 도 9J βgal+/-) 및 βgal-/- KO + AAV(도 9E, 도 9H 및 도 9K) 주사된 동물 둘 모두에서 가장 강한 효소 발현의 영역에서 양성이었다. 도 9F, 도 9I 및 도 9L은 βgal-/- 미처리 마우스(KO 미처리)가 필리핀 함량에 변화가 없었음을 보여준다. 10X 배율로 촬영한 뇌 섹션의 필리핀 염색. 이미지는 N ≥ 3마리 마우스/그룹을 나타낸다.
도 10A-10B는 벡터 설계의 변경이 βgal+/- 마우스에서 βgal 단백질 존재 및/또는 효소 활성의 감소를 초래함을 보여준다. 도 10A는 주사된 구조에서 2mm x 2mm 생검 펀치의 βgal 효소 활성을 보여준다. 주사 약 6주 후에 4-MU 검정에 의해 결정되는 양측에서 시상으로 1 μl의 AAVrh8-벡터(총 용량 3.4e9vg, 또는 2.0e10vg, CB6 High만) 또는 모의 처리된 PBS. 효소 활성은 Bradford에 의해 단백질 농도로 표준화되고, nmol/시간/단백질 mg으로 보고된다. 오차 막대는 평균 + SD, N = 3마리/그룹을 나타내며, *는 βgal+/- + AAV(CA + 벡터 명칭) 대 βgal+/- 미처리(CA 미처리)의 유의한 차이를 나타내거나 연결선으로 표시되는 바와 같다. 언페이드 다중 T 테스트(Holm-Sidak)을 사용하여 계산된 P 값, 여기서 * = p < 0.05, ** = p < 0.01 및 *** = p < 0.001. 도 10B는 67kd에서 나타나는 웨스턴 블롯에 의해 결정된 내인성 βgal 단백질 존재를 나타내며, 여기서 AAV 벡터로부터의 트랜스진 발현은 더 높은 중량 밴드로 나타난다. 로딩 제어는 42kd에서 나타나는 액틴이다. 표시된 웨스턴 블롯은 실행된 N = 3 블롯을 나타낸다.
도 11은 βgal+/- 마우스에서 주사된 구조 생검 펀치의 벡터 게놈 존재를 보여준다. 1 μl의 AAVrh8-벡터(총 용량 3.4e9vg, 또는 2.0e10vg, CBA High만)가 βgal+/- 마우스(CA + 벡터 명칭)의 양측에서 시상으로 주사된 구조에서 2mm x 2mm 생검 펀치의 이배체 게놈 당 벡터 게놈, 이는 트랜스진 상의 SV40 폴리 A에 대한 qPCR에 의해 결정된다. 주사 6주 후에 샘플을 채취하였다. 오차 막대는 평균 + SD, N = 3마리/그룹을 나타내고, *는 연결선에 의해 언페어드 다중 T 테스트(Holm-Sidak)를 사용하여 표시된 유의한 차이를 나타내고, 여기서 * = p < 0.05, ** = p < 0.01 및 *** = p < 0.001.
도 12A-12U는 단백질 존재의 감소 갖는 벡터가 βgal+/- 마우스에서 필리핀 양성 영역의 감소를 초래함을 보여준다. 1 μl의 AAVrh8-벡터(총 용량 3.4e9vg, 또는 CBA High만 2.0e10vg)가 양측에서 시상으로 주사된 대표적인 βgal+/-(CA + 벡터 명칭) 또는 βgal+/- 미주사(CA 미처리)에서 (도 12A, 도 12D, 도 12G, 도 12J, 도 12M 및 도 12P)에서 주사 6주 후 βgal 효소 존재에 대해 Xgal로 염색되고 Nuclear Fast Red로 대조 염색된 마우스 뇌의 관상 섹션. 도 12B, 도 12E, 도 12H, 도 12K, 도 12N 및 도 12Q는 (도 12A, 도 12D, 도 12G, 도 12J, 도 12M 및 도 12P)에서 동일한 동물의 병렬 섹션에서 필리핀 염색을 보여준다. 도 12C, 도 12F, 도 12I, 도 12L, 도 12O 및 도 12R은 (도 12A, 도 12D, 도 12G, 도 12J, 도 12M 및 도 12P)에서 동일한 동물의 병렬 섹션에서 ToPro3 핵 염색을 보여준다. 박스는 20x 배율로 촬영한 뇌 섹션에서 필리핀 및 ToPro3 염색의 대략적인 위치를 나타낸다. 스케일 바 = 250 μm. 이미지는 N ≥ 2마리 마우스/그룹을 나타낸다.
도 13은 βGal+/- 마우스에서 모든 차별적으로 발현된 유전자의 클러스터링 히트맵 및 벤다이어그램이 트랜스진 발현 의존적 변이를 나타냄을 보여준다. 모든 차별적으로 발현된 유전자의 히트맵 및 벤다이어그램은 1 μl의 AAVrh8-벡터(총 용량 3.4e9vg)가 양측에서 주사되거나 PBS로 모의 처리된 시상의 2mm x 2mm 생검 펀치로부터의 데이터를 사용하여 βgal+/- 마우스(CA + 벡터 명칭)에서 주사 약 6주 후에 생성되었다. Affymetrix 마우스 유전자 2.0ST, N = 3마리/그룹, P<0.05 및 >1.8배 변화로 결정되는 마이크로어레이 결과.
도 14는 처리된 βgal-/- 마우스의 CNS에서 βgal 효소 활성이 구조 전체에 걸쳐 효소의 다양한 분포를 초래함을 보여준다. 1μl의 AAVrh8-벡터가 양측에서 시상으로 그리고 0.3ul(총 용량 3.4e9vg, 또는 2.0e10vg, CBA High만)가 DCN에서 주사된 βgal-/- 또는 미처리(KO 미처리) 또는 βgal+/+ 미처리 마우스(WT 미처리)의 대뇌, 소뇌 + 뇌간 또는 척수의 βgal 효소 활성이 주사 약 6주 후에 4-MU 검정에 의해 결정된다. 효소 활성은 Bradford에 의해 단백질 농도로 표준화되고, nmol/시간/단백질 mg으로 보고된다. 값은 평균 + SD, N = 3마리/그룹을 나타내고, *는 βgal-/- + AAVrh8-CB6 벡터(총 용량 3.4e9vg, KO + CB6 Low) 대 βgal-/- + AAVrh8-CB6 벡터(총 용량 2.0e10vg, KO + CB6 High)의 유의한 차이를 나타낸다. 언페어드 T 테스트(Holm-Sidak)을 사용하여 계산된 P 값, 여기서 *** = p <0.001.
도 15A-15F는 βgal-/- 마우스에서 βgal 효소 존재에 대한 Xgal 염색이 발현 및 용량 의존적 방식으로 뇌 전체에 걸쳐 효소의 확산을 입증함을 보여준다. 1μl의 AAVrh8-벡터가 양측에서 시상으로 그리고 0.3ul(총 용량 3.4e9vg, 또는 CBA High만 2.0e10vg)가 DCN에서 주사된 대표적인 βgal-/-(도 15A-15C), 또는 미처리(KO 미처리; 도 15E) 또는 βgal+/- 미처리 마우스(CA 미처리; 도 15F)에서 주사 약 6주 후에 βgal 효소 활성에 대해 Xgal로 염색되고 Nuclear Fast Redat로 대조 염색된 마우스 뇌의 시상 섹션. N = 2-3마리/그룹. 스케일 바 = 10mm. 도 15D는 빈 벡터로 처리된 KO 마우스를 보여준다.
도 16은 치료적 AAVrh8 처리 후 βgal-/- 마우스의 뇌에서 GM1-강글리오시드 함량에 대한 필리핀 염색을 보여준다. 1μl의 AAVrh8-벡터가 양측에서 시상으로 그리고 0.3ul(총 용량 3.4e9vg, 또는 2.0e10vg, CBA High만)가 DCN에서 주사된 대표적인 βgal-/-, 또는 미처리(KO 미처리)에서 주사 6주 후에 GM1 함량에 대해 필리핀 및 핵 염색 ToPro3(KO 미처리, ToPro3, 맨 아래 줄)으로 염색된 마우스 뇌의 시상 섹션. N = 2-3마리/그룹. 5X로 촬영한 이미지, 스케일 = 100mm.
도 17A-17L은 AAVrh8 벡터로 치료적 처리 후 βgal-/- 마우스의 척수에서 GM1 함량에 대한 필리핀 염색을 보여준다. 1μl의 AAVrh8-벡터가 양측에서 시상으로 그리고 0.3ul(총 용량 3.4e9vg, 또는 2.0e10vg, CBA High만)가 DCN에서 주사된 대표적인 βgal-/-, 또는 미처리(KO 미처리)에서 주사 6주 후에 GM1 함량에 대해 필리핀 또는 핵 염색 ToPro3(KO 미처리, ToPro3, 맨 아래 줄)로 염색된 척수의 경추(도 17A, 도 17C, 도 17E, 도 17G, 도 17I 및 도 17K) 및 흉부(도 17B, 도 17D, 도 17F, 도 17H, 도 17J 및 도 17L) 섹션. N = 2-3마리/그룹. 5X로 촬영한 이미지, 스케일 = 100mm.
도 18은 βgal-/- 마우스의 CNS에서 AAVrh8을 사용한 치료적 처리가 더 높은 용량에서 더 낮은 발현 프로모터로 처리될 때 GM1 함량의 정상화를 발생시킴을 보여준다. 1μl의 AAVrh8-벡터가 양측에서 시상으로 그리고 0.3ul(총 용량 3.4e9vg, 또는 CBA High 그룹만 2.0e10vg)가 DCN에서 주사된 βgal-/-, 미처리(KO 미처리), 또는 βgal+/- 미처리(WT 미처리)에서 주사 6주 후에 마우스의 대뇌, 소뇌 + 뇌간 또는 척수에서 LC-MS/MS에 의해 정량화된 GM1 함량. GM1 함량은 ng GM1/μg 단백질로 표현된다. 값은 평균 + SD, N ≥ 3마리/그룹을 나타내고 *는 KO + AAVrh8 대 KO + PBS의 유의한 차이를 나타내거나, 연결선에 의해 다중 T 테스트(Holm-Sidak)을 사용하여 나타내며, 여기서 * = p < 0.05, ** = p < 0.01 및 *** = p < 0.001.
도 19는 AAVrh8 벡터의 구조를 도시한다.
도 20은 2140.8 pAAV-cb-mβgal의 벡터 맵을 보여준다.
도 21은 HexA 알파- 및 베타-서브유닛을 인코딩하는 모노시스트로닉 AAV 벡터의 구조를 보여준다.
도 22A-22F는 원숭이 시상에서의 신경병리를 보여준다. 도 22A에서, 단핵성 혈관주위 커프(화살표) 및 백색질의 괴사 영역(*)이 관찰된다. 도 22B는 화살표가 하나의 큰 괴사 영역, 혈관 증식 및 백색질 손실을 나타내는 Luxol Fast Blue-염색 섹션을 보여준다(인접한 진한 파란색에 비해 창백함을 주목한다). 도 22C는 공포가 있는 시상의 괴사 영역(화살표)을 보여준다. 도 22D는 시상(40x)의 혈관 커프의 예이다. 유사한 신경병리가 최저 용량(1/30)에서 관찰되었다(도 22E). 도 22F는 PBS 주사된 동물의 정상 시상을 보여준다; (1x 용량, 도 22A-22D; 1/30 용량, 도 22E; PBS 주사됨, 도 22F).
도 23A-23D는 CNS에서 헥소사미니다제 활성을 보여준다. cmHex-알파 및 cmHex-베타를 인코딩하는 AAVrh8 벡터의 상이한 용량의 1:1 제형이 주사된 NHP의 시상 및 흉부 척수에서 Hex 활성을 측정하였다. 2개의 인공 기질, 즉, MUG 및 MUGS가 생화학적 검정에 사용되었다. 첫 번째 기질은 모든 Hex 동종효소(HexA, HexB, HexS)에 의해 절단되는 한편, 후자는 HexA 및 HexS 동종효소에 의해서만 절단된다.
도 24는 시상에서 부종을 나타내는 부검 전 뇌 MRI이다. 부검 전 1/30th 용량에서 cmHex-알파 및 cmHex-베타를 인코딩하는 AAVrh8 벡터의 제형이 주사된 NHP의 시상에서의 부종(화살표). 트랜스진-empty AAVrh8 벡터를 주사한 NHP에서는 변화가 관찰되지 않았다.
도 25A-25G는 원숭이 시상에서의 단백질 발현을 보여준다. 1x 용량 동물의 시상에서 주사 부위에 대한 (도 25A) 근위 및 (도 25B) 원위 Hex-β 염색(녹색)이 표시된다. 1/30 용량 동물의 시상에서 주사 부위에 대한 (도 25C) 근위 및 (도 25D) 원위 Hex-α 염색(녹색)이 표시된다. 도 25C-25D에 표시된 1/30 용량 동물의 시상에서 주사 부위에 대한 (도 25E) 근위 및 (도 25F) 원위 H&E 염색. 도 25G는 도 25E의 박스 영역의 확대도이다. 화살표는 뉴런의 호산구성 물질을 나타낸다.
도 26A-26B는 예상되는 구배의 HexA 발현 수준을 갖는 새로운 AAV 벡터의 패널을 제시한다. 도 26A는 현재 버전(상단)으로부터 아데닐중합체형성 신호를 갖는 ITR-측면 cDNA의 고전적인 프로모터 요소가 없는 가장 기본 형태(하단 벡터)까지의 발현 요소의 체계적인 제거를 나타내는 반면, 도 26B는 ITR-유도 유전자 발현을 증가시키는 것으로 알려진 더 많은 요소를 점진적으로 통합하는 ITR-발현 기반 벡터를 나타낸다. 약어: CMV Enh - 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 인핸서; CB - 닭 베타-액틴 프로모터; HexA/B - 각 벡터 설계를 위해 사이노몰구스 원숭이 HexA 및 HexB cDNA를 운반하는 한 쌍의 벡터가 생성될 것이다; pA - 아데닐중합체형성 신호; ITR - AAV2 역 말단 반복부; P1 - 프로모터 1은 ITR-매개 유전자 발현을 약 10배만큼 증가시키는 것으로 생각됨; P2 - 프로모터는 ITR-매개 유전자 발현을 약 50배만큼 증가시키는 것으로 생각됨.
도 27은 pAAV-cb-ci-cmHexA-2158 벡터의 플라스미드 맵을 보여준다.
도 28은 pAAV-P2Int-cmHexA_2194(변형됨) 벡터의 플라스미드 맵을 보여준다.
도 29A-29B는 일시적으로 트랜스펙션된 293T 세포에서 헥소사미니다제 활성의 구배를 보여준다. 헥소사미니다제 활성은 모든 베타-헥소사미니다제 아이소형(HexA, B 및 S) 또는 아이소형 (HexA, HexS)만을 함유하는 알파-서브유닛에 의해 각각 절단된 인공 기질 4MUG(도 29A) 및 4MUGS(도 29B)를 사용하여 트랜스펙션 72시간 후에 세포 용해물에서 측정되었다.
도 30은 1개월 연구 기간 동안의 체중 변화를 보여준다. 오차 막대는 1 표준 편차를 나타낸다.
도 31A-31T는 최고 수준의 사이노몰구스 Hex 단백질을 발현하는 마우스 뇌가 호산구성 뉴런을 함유함을 보여준다. H&E 염색은 해마 및 시상에서 사이노몰구스 Hex 발현 수준과 상관 관계가 있는 호산구성 과립을 함유하는 뉴런의 존재를 나타낸다(40x). 그룹 1(도 31A, 31K), 그룹 2(도 31B, 31L), 그룹 3(도 31C, 31M), 그룹 4(도 31D, 31N), 그룹 5(도 31E, 31O), 그룹 6(도 31F, 31P), 그룹 7(도 31G, 31Q), 그룹 8(도 31H, 31R), 그룹 9(도 31I, 31S) 및 그룹 10(도 31J, 31T) 마우스.
도 32A-32T는 무흉선 누드 마우스 뇌에서 사이노몰구스 원숭이 Hexα 발현이 AAV 벡터 사이에서 변하는 것을 보여준다. 그룹 1(도 32A, 32K), 그룹 2(도 32B, 32L), 그룹 3(도 32C, 32M), 그룹 4(도 32D, 32N), 그룹 5(도 32E, 32O), 그룹 6(도 32F, 32P), 그룹 7(도 32G, 32Q), 그룹 8(도 32H, 32R), 그룹 9(도 32I, 32S) 및 그룹 10(도 32J, 32T) 마우스의 시상 및 해마에서 Hexα 염색(녹색); DAPI로 대조 염색된 핵(파란색). 화살표는 효소 양성 세포를 나타낸다.
도 33A-33T는 사이노몰구스 Hex 단백질의 감소된 발현이 미세아교세포 활성화의 감소를 초래함을 보여준다. Iba-1 염색은 해마 및 시상에서 감소된 사이노몰구스 Hex 단백질 발현을 갖는 그룹의 감소된 염증을 나타낸다(20x). 그룹 1(도 33A, 33K), 그룹 2(도 33B, 33L), 그룹 3(도 33C, 33M), 그룹 4(도 33D, 33N), 그룹 5(도 33E, 33O), 그룹 6(도 33F, 33P), 그룹 7(도 33G, 33Q), 그룹 8(도 33H, 33R), 그룹 9(도 33I, 33S) 및 그룹 10(도 33J, 33T).
도 34A-34T는 사이노몰구스 Hex 단백질의 감소된 발현이 반응성 별아교세포증의 감소를 초래함을 보여준다. GFAP 염색은 해마 및 시상에서 감소된 사이노몰구스 Hex 단백질 발현을 갖는 그룹의 감소된 염증을 나타낸다(20x). 그룹 1(도 34A, 34K), 그룹 2(도 34B, 34L), 그룹 3(도 34C, 34M), 그룹 4(도 34D, 34N), 그룹 5(도 34E, 34O), 그룹 6(도 34F, 34P), 그룹 7(도 34G, 34Q), 그룹 8(도 34H, 34R), 그룹 9(도 34I, 34S) 및 그룹 10(도 34J, 34T).
도 35는 비인간 영장류에서 추가 시험을 위해 선택된 새로운 AAV 벡터를 보여준다.
도 36은 사이노몰구스 Hexα 및 Hexβ를 인코딩하는 AAV 벡터를 두개내로 주사한 무흉선 누드 마우스에서 상대적인 총 Hex 활성을 보여준다. 나이브에 대해 표준화된 MUG 기질에 의해 측정된 HexB, HexA 및 HexS의 시험관내 효소 활성(C1: 후각 망울 및 대뇌의 처음 3 mm 관상 슬라이스, C2: 대뇌의 다음 2 mm 관상 슬라이스, C3: 주사 부위를 포함하는 대뇌의 다음 3 mm 관상 슬라이스, C4: 대뇌의 다음 2 mm 관상 슬라이스, CRBL: 소뇌, BS: 뇌간, SC: 척수)이 도시된다.
도 37은 사이노몰구스 Hexα 및 Hexβ를 인코딩하는 AAV 벡터를 두개내로 주사한 무흉선 누드 마우스에서 상대적인 HexA 및 HexS 활성을 보여준다. 나이브에 대해 표준화된 MUGS 기질에 의해 측정된 HexA 및 HexS의 시험관내 효소 활성(C1: 후각 망울 및 대뇌의 처음 3 mm 관상 슬라이스, C2: 대뇌의 다음 2 mm 관상 슬라이스, C3: 주사 부위를 포함하는 대뇌의 다음 3 mm 관상 슬라이스, C4: 대뇌의 다음 2 mm 관상 슬라이스, CRBL: 소뇌, BS: 뇌간, SC: 척수)이 도시된다.
도 38A-38B는 실질내 주사 후 표적화 및 분포의 MRI 분석을 보여준다. 도 38A에서, 수술 전 및 수술 후 뇌 MRI는 상이한 서열을 사용하여 도시된다. AAVrh8 벡터 제형은 T1-가중 MRI를 사용하여 주사된 용액의 분포를 분석하기 위해 2 mM 가돌리늄을 함유하였다; 이 동물에서 가돌리늄 분포의 부피(Gd-증강 부피)는 1.67 mL였다. 도 38B에서, 각각의 NHP에 대한 분포 부피(Vd) 및 평균 ± SD가 도시된다; 시상(Vi)의 총 주입 부피는 0.3 mL였다.
도 39는 90일 실험의 과정을 통틀어 AAVrh8-주사된 NHP의 뇌 MRI를 보여준다. 화살표는 3마리의 NHP의 시상에서의 고강도 신호 영역을 나타낸다.
도 40A-40C는 주사 90일 후에 일부 AAVrh8-주사된 NHP의 시상에서 검출 가능한 뇌 MRI의 고강도를 보여준다. 코호트 1의 1마리의 NHP(도 40A)는 90일의 이미징 시간에 좌측 시상에서 큰 고강도를 보였지만, 초기 이미징 시점에서는 이것이 검출되지 않았다. 도 40B는 코호트 2의 NHP를 도시하며, 여기서 양측 고강도 신호는 d30에 시작하여 검출되었고 90일까지 변함없이 유지되었다. 도 40C에서, 코호트 3의 NHP는 d30-d90의 좌측 시상에서 고강도 신호를 나타내었다.
도 41은 관상 뇌 섹션의 생검 샘플링을 보여준다. 우측(R) 또는 좌측(L) 시상의 등쪽(D) 및 배쪽(V) 샘플에서 정상보다 높은 헥소사미니다제가 측정되었다.
도 42는 호산구성 과립의 신경세포내 축적, 신경변성 및 신경세포포식을 포함하는 코호트 1 NHP의 뇌에서의 신경병리학적 소견을 보여준다.
도 43A-43B는 코호트 1에서 1마리의 AAVrh8-주사된 원숭이의 좌측 시상에서 혈관주위 커핑을 갖는 심각한 국소 해면화를 보여준다. 도 43A는 4x 배율로 촬영되었고; 도 43B는 10x 배율로 촬영되었다.
도 44A-44B는 코호트 3 원숭이의 신경병리학적 관찰을 보여준다. 이들 원숭이에서는 신경변성이 드물었지만(도 44A), 원숭이 295709에서는 주사 트랙과 관련된 것으로 보이는 혈관주위 지터 세포(gitter cells)의 증거가 있었다(도 44B).
도 45는 코호트 1 및 3의 원숭이의 우측 및 좌측 시상에서 호산구성 물질의 신경세포내 축적의 스코어링을 보여준다.
도 46은 코호트 1 및 3의 원숭이의 우측 및 좌측 시상에서 신경 변성 및 괴사의 스코어링을 보여준다.
도 47은 코호트 1 및 3의 원숭이의 우측 및 좌측 시상에서 염증 점수를 보여준다.
도 48A-48F는 AAVrh8-cmHex 벡터의 두개내 주사가 샌드호프 마우스의 뇌에서 Hex 발현을 증가시키고 GM2 강글리오시드 함량을 감소시킴을 보여준다. 6-8주령 샌드호프 마우스는 PBS(n=1; 보라색 막대; n=1), AAVrh8-CBA-cmHex-W(녹색 막대(A), n=3, 4.68x109 vg), AAVrh8-CBA-cmHex(주황색 막대(B), n=3, 4.68x109 vg) 또는 AAVrh8-CB-I-cmHex(파란색 막대(C), 4.68x109 vg - n=3; C(5x): 2.34x1010 vg - n=4) 벡터의 두개내 주사를 수용하였다. 주사 4주 후에 뇌를 수집하고 상부 도식에 나타낸 바와 같이 2-3 mm 관상 블록으로 분할하였다; 수직 화살표는 주사 부위를 나타낸다. 도 48A-48C에서, 총 Hex 효소 활성(HexA, B 및 S)을 인공 기질 MUG를 사용하여 측정한 다음 야생형 수준(T, 검은색 막대, n = 1)에 대한 배수로 표시하였다. 별표(*)는 검출할 수 있는 Hex 활성이 없는 동물을 나타낸다. 도 48D 및 48F는 GM2 강글리오시드 함량을 측정하기 위해 사용된 정성적 LC-MS/MS의 막대 그래프이다.
도 49A-C는 본 개시에 의해 기재된 프로모터의 구조적 렌더링을 보여준다. 도 49A는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 CB 프로모터의 구조적 렌더링을 보여준다. 도 49B는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 CB(6)-I 프로모터의 구조적 렌더링을 보여준다. 도 49C는 SEQ ID NO: 5로 표시되는 P2-I 프로모터의 구조적 렌더링을 보여준다.
도 50은 이중 프로모터 AAV9-Syn1-GFP-2xmiRSOD1/GFAP-2xmiRSOD1-mCherry 벡터의 개략도를 보여준다.
도 51은 성체 SOD1G93A 마우스에서 선조체내 주사 후 이중 프로모터 AAV9-Syn1-GFP-2xmiRSOD1/GFAP-2xmiRSOD1-mCherry의 형질도입 프로파일을 보여준다. AAV9 벡터는 뉴런 시냅신1 프로모터에 의해 유도되는 GFP 및 별아교세포 GFAP 프로모터에 의해 유도되는 mCherry를 함유하였다. GFP(녹색) 및 mCherry(빨간색) 발현 세포의 형태는 각각 뉴런 및 별아교세포와 일치한다.
도 52는 이중 프로모터 AAV9-Syn1-GFP-2xmiRSOD1/GFAP-2xmiRSOD1-mCherry 벡터의 주사 후 성체 SOD1G93A 마우스에서 인간 SOD1mRNA 수준이 감소됨을 보여준다. 인공 마이크로RNA(miR)는 인간 SOD1을 표적화한다. 척수에서 최대 25%의 인간 SOD1 mRNA 발현의 감소는 1 x 1012 총 벡터 게놈의 정맥내 주사 후 관찰되었다. 선조체에서 최대 55%의 인간 SOD1 mRNA 발현의 감소는 8 x 109 총 벡터 게놈의 직접 선조체내 주사 후 관찰되었다.
도 53A-53D는 두개내 AAVrh8-mHEXA/B 처리가 샌드호프 질병(SD) 마우스의 수명을 증가시키고 유지된 운동 성능을 초래함을 보여준다. (도 53A) 반전 스크린, (도 53B) 로타로드 및 (도 53C) 와이어 걸기 시험에서 TH/ICV 또는 TH/DCN 전달을 통해 4.68 x 109 vg의 AAVrh8-mHexA/B 벡터 제형으로 처리된 SD 마우스의 성능이 60, 120 및 180일령에 평가되었다. 도 53D는 4.68 x 109 vg의 AAVrh8-mHexA/B로 두개내 처리된 SD 마우스의 카플란-마이어 생존 플롯을 보여주며, 이는 양측 시상 주사(TH)와 함께, 양측 심부 소뇌핵(DCN) 주사 또는 단일 뇌내 심실(ICV) 주사가 동등한 생존 결과를 발생시킴을 나타낸다.
도 54A-54D는 SD 마우스에서 두개내 AAVrh8-mHexA/B 처리가 수명의 용량-의존적 연장을 제공하고 운동 성능을 연장시킴을 보여준다. 도 54A는 1개월 SD 마우스의 TH/ICV에 두개내 주사된 AAVrhh8-mHexA/B에 대한 용량 상승 실험의 카플란-마이어 생존 플롯을 보여준다. (도 54B) 반전 스크린, (도 54C) 로타로드 및 (도 54D) 와이어 걸기 시험에서 TH/ICV 전달을 통해 4.68 x 109 vg 및 1.17 x 1010 vg의 AAVrh8-mHexA/B 벡터 제형으로 두개내 처리된 SD 마우스의 성능이 60, 120 및 180일령에 평가되었다.
도 55A-55C는 AAVrh8-mHexA/B의 두개내 전달이 정상 마우스의 운동 성능에 최소한의 영향을 미친다는 것을 보여준다. (도 55A) 반전 스크린, (도 55B) 로타로드 및 (도 55C) 와이어 걸기 시험에서 TH/ICV 또는 TH/DCN 전달을 통한 4.68 x 109 vg AAVrh8-mHexA/B의 두개내 주사에 의해 처리된 이형접합(HexB+/-, HZ) 마우스의 성능이 60, 120 및 180일령에 평가되었다.
도 56A-56B는 AAVrh8-mHexA/B 처리의 두개내 전달이 GM2 강글리오시드 저장을 감소시키고 SD 마우스의 중추 신경계에서 광범위한 헥소사미니다제 발현을 발생시킴을 보여준다. SD 마우스를 1.17 x 1010 vg AAVrh8-mHexA/B의 TH/ICV 주사로 처리하고, 미처리된 SD 마우스의 인도적 종말점과 동일한 연령에서 신경화학을 평가하였다. 2개의 인공 기질: MUG(HexA, HexB 및 HexS 동종효소에 의해 절단됨) 및 MUGS 기질(HexA 및 HexB 동종효소에 의해 절단됨)을 사용하여 대뇌, 소뇌 및 척수를 (도 56A) GM2 강글리오시드 함량 및 (도 56B) 헥소사미니다제 활성에 대해 분석하였다.
도 57A-57E는 AAV의 TH+ICV 주사 후 SD 고양이의 생존 및 생체분포를 보여준다. 도 57A는 미처리된 SD 고양이의 생존이 4.4 +/- 0.6개월임을 보여준다. 도 57B는 AAV 처리 후 SD 고양이에서 임상 질환 발병이 지연되고 임상 징후가 약화되었음을 보여준다. 도 57C는 섹션의 위치를 보여주는 뇌의 총 이미지이다(좌측). 분석된 위치를 예시하는 인 시튜(in situ) 뇌 및 척수의 우반구의 관상 섹션. 도 57D는 정상, SD 및 대표적인 cat AAV 처리된 SD 고양이에서 Hex의 분포를 보여주는 조직화학적 나프톨 염색을 보여준다. 도 57E는 SD 고양이의 뇌 및 척수에서 HexA 효소 활성이다.
도 58A-58H는 AAV 매개 유전자 요법의 치료 효능의 바이오마커이다. 도 58A는 백색질의 탈수초화 증가 및 회색질의 GM2 저장 증가로 인한 회색질 및 백색질 강도의 증가를 나타내는 SD 고양이 뇌의 7T MRI를 보여준다. AAV 유전자 요법의 TH/ICV 전달 후, 회색질 및 백색질 강도가 완전히 정상화된다. 경증의 피질 위축은 시상 주사 부위의 고강도와 마찬가지로 분명하다. 도 58B는 미처리 SD 고양이의 MR 분광법이 SD 환자에서 이전에 보고된 독성 대사산물인 N-아세틸 헥소사민의 증가를 나타냄을 보여준다. AAV 유전자 요법의 TH/ICV 전달 후, 이것은 완전히 정상화된다. 도 58C는 대표적인 SD MR 스펙트럼이다. 도 58D는 SD+AAV TH/ICV SD 고양이에서 뇌척수액(CSF)의 HexA 활성이다. 도 58E 및 58F는 정상(열린 원), SD(검은색 닫힌 원) 및 SD+AAV TH/ICV 고양이(음영된 닫힌 원)의 CSF에서 락테이트 데하이드로게나제(도 58E) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(도 58F) 수준이다. 도 58G 및 58H는 SD+AAV TH/ICV 고양이 11-907(도 58G) 및 7-760(도 58H)의 혈청 항체 역가이다.
도 59A-F는 SD+AAV 소뇌숨뇌수조(CM) 고양이에서 임상적 치료 효과 및 생체분포를 보여준다. 도 59A는 4.4 +/- 0.6개월의 미처리 SD 고양이 생존을 보여주는 카플란-마이어 곡선이다. 소뇌숨뇌수조를 통해 AAV로 처리된 SD 고양이는 생존이 9.9 +/- 0.5개월로 증가한다. 도 59B는 미처리 SD 고양이에서 급격한 감소를 보여주는 임상 등급 점수이다. 감소는 표현형의 긴 고원을 갖는 SD+AAV 고양이에서 약화된다. 고양이는 근골격계 이상뿐만 아니라 시력 및 청력 상실로 인한 보행 상실 전에 안락사되었다. 임상 등급 점수는 다음 임상 징후를 기반으로 하였고, 정상 점수 10점 및 획득한 각 증상에 대해 1점 차감된다: 경미한 떨림, 명백한 떨림, 뒷다리 쇠약, 넓은 기저 자세, 운동 실조, 간헐적 낙하, 제한된 보행, 경련성 앞다리, 경련성 뒷다리 및 보행 불능. 도 59C는 뇌 섹션의 위치를 나타내는 선이 있는 고양이 뇌(좌측), 뇌의 우반구 및 척수를 일괄적으로 보여주고, 이는 생체분포 분석에 대한 위치를 예시한다. 도 59D는 SD+AAV 장기간 고양이의 뇌 및 척수의 HexA 활성(MUGS)이다. 1의 굵은 선은 정상 수준을 나타낸다. 도 59E 및 59F는 qPCR에 의해 측정된 다양한 뇌 영역에서의 HexA의 발현을 보여준다.
도 60은 SD+ AAV 소뇌숨뇌수조(CM) 고양이의 저장 제거를 보여준다. 정상(좌측) SD(중간) 및 SD+AAV CM 장기간 처리된 고양이의 대표적인 주기적 산-Schiff(PAS) 염색. 정상 고양이는 뇌와 소뇌의 회색질보다 백색질의 PAS 염색이 더 어둡고 척수에서는 그 반대이다. SD 고양이는 백색질보다 회색질에서 더 어두운 염색을 갖고 백색질에 염색 손실 영역이 있다(특히 척수에서 분명함). 소뇌숨뇌수조를 통한 주사로 처리된 SD+AAV 고양이는 소뇌, 뇌간 및 척수의 정상화와 함께 피질에서 증가된 저장 및 탈수초화를 나타내었다.
도 61은 AAV 유전자 요법 후 조직병리학의 정상화를 보여준다. SD 고양이는 소뇌잎새, DCN 및 뇌간에서 변성 뉴런을 나타낸다. AAV 유전자 요법 16주 후에, SD 고양이는 이러한 모든 영역에서 정상화된 형태를 갖고, 푸르킨예 세포 변성을 제외하고는 장기간 AAV 처리된 동물에서 유지된다. 흥미롭게도, 보트리오드(botriod) 호산구성 봉입체를 갖는 치아핵 내에 뉴런의 서브세트가 있었다(삽도, 스케일 바 5 μm). 스케일 바 10 μm.
도 62A-62H는 SD+AAV CM 고양이에서 질병 진행 및 개선에 대한 바이오마커를 보여준다. 도 62A는 정상 고양이와 비교하여 백색질의 탈수초화 및 회색질의 지질 저장과 일치하는 피질 위축 및 고강도 백색질 및 저강도 회색질을 나타내는 SD 고양이의 7T MRI이다. SD+AAV CM 고양이에서, 강도 변화는 지속되었지만 피질 위축은 개선되었다. SD 고양이 시상의 MR 분광법은 N-아세틸헥소사민의 증가를 나타내며, 이는 치료 16주 후에 AAV의 CM 전달에 의해 교정된다. 인도적 종말점의 1마리의 CM 고양이에서, NA Hex 수준이 더 증가하였다. 도 62B는 SD+AAV CM 고양이에서 신경아교증의 마커인 미오이노시톨(INS) 및 탈수초화의 마커인 글리세로포스포콜린 + 포스포콜린(GPC + PCh)이 또한 증가하였음을 보여준다. 도 62C는 대표적인 MR 스펙트럼을 보여준다. 도 62D는 시간 경과에 따른 SD+AAV CM 고양이에서의 CSF HexA를 보여준다. 정상 수준은 점선으로 표시된다. 도 62E-H는 정상(열린 원), SD 고양이(닫힌 원) 및 SD+AAV CM 고양이(밝은 닫힌 원)에서 CSF 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 활성의 세포독성 마커를 보여준다.
도 63A-63C는 AAVrh8-CB-CI-mHexA/B 벡터의 두개내 주사가 헥소사미니다제 활성의 수반되는 증가와 함께 CNS에서 GM2 강글리오시드 저장을 감소시켜 SD 마우스의 생존을 개선시킴을 보여준다. SD 마우스는 4.68 x 109 vg 또는 2.34 x 1010 vg의 총 용량으로 AAVrh8-CH-CI-mHexA/B 벡터, 또는 원래 벡터(4.68 x 109 vg), 또는 PBS의 두개내 주사를 수용하였다. 도 63A는 주사 8주 후에 CNS에서 LC-MS/MS에 의해 측정된 GM2 강글리오시드 함량을 보여준다. 도 63B는 주사 8주 후에 MUG 기질을 사용하여 헥소사미니다제 활성 8주 후 MUG 기질을 사용하여 측정된 대뇌 헥소사미니다제 활성을 보여준다. 점선은 미처리된 야생형 동물의 평균 활성을 나타낸다. 결과는 평균 +/- SD, Tukey의 다중 비교 테스트, * (P ≤ 0.05), ** (P ≤ 0.01), *** (P ≤ 0.0001), n=4 PBS, n=4 원래 CBA-mHexA/B, n=6 2.34 x 1010 vg CB-CI-mHexA/B 및 4.68 x 109 vg CB-CI-mHexA/B n.d.(검출되지 않음)로 표시된다. 도 63C는 2.34 x 1010 vg의 AAVrh8-CB-CI-mHexA/B가 주사된(5개월 연구 종말점) SD 마우스의 생존 및 증상 제시이다(n=8). 미처리된 샌드호프병 마우스의 중간 생존은 125.5일이었다(n=6).
도 64A-64B는 증가하는 용량의 CSF에 전달된 AAVrh8-CB-CI-mHexA/B 벡터가 척수 및 소뇌에서 GM2 강글리오시드 저장을 추가로 감소시킴을 보여준다. SD 마우스에 1.17 x 1010 vg의 AAVrh8-CB-CI-mHexA/B를 증가하는 CSF 용량으로(1.17 x 1010 vg, 2.34 x 1010 vg, 5.85 x 1010 vg 및 5.5 x 1011 vg) 시상에 주사하였다. 주사 4주 후, 척수(도 64A) 및 소뇌(도 64B)에서 LC-MS/MS에 의해 GM2 강글리오시드 함량을 측정하였다. 결과는 평균 +/- SD, Dunnet의 다중 비교 테스트, * (P ≤ 0.05), ** (P ≤ 0.01), *** (P ≤ 0.0001), n=3으로 표시된다.
도 65는 AAV-HexA 및 AAV-HexB 벡터 게놈의 구조를 예시한 것이다.
도 66은 pAAV-CB-ci-hHexA(v2) 벡터의 플라스미드 맵을 보여준다.
도 67은 pAAV-CB-ci-hHexB 벡터의 플라스미드를 보여준다.
도 68은 단일 진행된 테이-삭스 대상체에게 rAAVrh8-HexA/B 투여 전 및 후에 혈청 및 CSF에서 HexA 효소 활성을 보여준다.
도 69는 기준선 MRI(대략 2년 차이)와 비교하여 전두엽 및 두정엽의 백색질을 보여주는 치료 전 및 치료 후 MRI 스캔을 보여준다.
도 70은 1회 용량의 리툭시맙 투여 후 대상체의 CD19 및 CD20 계수, 및 IVIg 주입 후 IgG 계수를 보여준다.
도 71은 대뇌 척수액(CSF)에서 기준선으로부터 GM2 강글리오시드의 약 25% 감소를 보여준다.
도 72는 0일 및 처리 3개월 후에 HEXA, HEXB 및 TTR의 웨스턴 블롯 염색을 보여준다.
도 73은 임상 연구 치료 설계를 보여준다.
도 74A-74C는 소뇌숨뇌수조 및 요추 L2 수준에서 AAVrh8 벡터의 카테터 기반 투여의 예를 보여준다.
도 75A-75G는 양의 소뇌숨뇌수조에 대한 형광 투시 유도 혈관내 마이크로카테터에 의한 rAAV 투여 방법의 한 구체예를 보여준다. 도 75A는 혈관내 마이크로 카테터의 형광 투시 유도 전진술을 보여준다. 도 75B는 마이크로카테터 팁의 최종 배치를 보여준다. 도 75C는 사후 척수의 전체 사진을 보여준다. 도 75D는 면역조직화학에 의한 척수 섹션에서의 GFP 발현을 보여준다. 도 75E-75G는 면역조직화학에 의한 뇌 섹션에서의 GFP 발현을 보여준다.
상세한 설명
일부 예에서, 현재 rAAV 벡터를 갖는 트랜스진의 전달은 분해되지 않은 기질의 축적 또는 리소좀 구획의 조절장애를 야기하며, 이는 리소좀 생물발생, 기질 감소 또는 세포외배출을 상향조절하는 반응을 초래한다. 또한, rAAV 벡터-유도된 트랜스진 발현을 통한 생리학적 수준-위의 치료 단백질의 도입은 또한 이러한 장애에서 공통적인 언폴딩된 단백질 반응과 관련될 수 있는 유해한 보호 캐스케이드를 유발할 수 있다.
따라서, 일부 양태에서, 본 개시는 CNS 조직과 같은 조직에서 리소좀 효소의 발현을 위한 조성물(예를 들어, 분리된 핵산, rAAV, rAAV 벡터 등)을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 rAAV를 사용하여 GM1 강글리오시드증, 테이 삭스병 또는 샌드호프병과 같은 리소좀 축적병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시는 특정 조절 서열 및 요소, 예를 들어, 프로모터 영역이 rAAV에서 사용되도록 조작되어, 치료적으로 효과적이지만 이전에 사용된 rAAV와 관련된 벡터-매개 유전독성을 유발하지 않는 수준의 트랜스진 발현을 제공할 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다.
분리된 핵산
일부 양태에서, 본 개시는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 트랜스진을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 트랜스진은 리소좀 축적병과 관련된 단백질(예를 들어, 리소좀 저장 단백질, 예를 들어 HexA 및/또는 HexB 및 GLB1)을 인코딩한다.
일부 구체예에서, GLB1 트랜스진은 인간 GLB1 유전자(GeneID: 2720)이다. 인간 GLB1 유전자는 NM_000404.4, NM_001079811.2, NM_001135602.2 또는 NM_001317040.1의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 인간 GLB1 유전자는 β-갈락토시다제 단백질을 인코딩한다. 인간 β-갈락토시다제 단백질은 NP_000395.3, NP_001073279.1, NP_001129074.1 또는 NP_001303969.1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 GLB1은 SEQ ID NO: 23에서와 같은 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 HexA 트랜스진(GeneID: 3073)은 NM_000520.5 또는 NM_001318825.1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HexA 단백질은 NCBI 참조 서열 번호 NP_000511.2(SEQ ID NO: 20) 또는 NP_001305754.1에 제시된 서열로 표시된다. 일부 구체예에서, 인간 HexB 트랜스진(GeneID: 3074)은 NM_000521.4 또는 NM_001292004.1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HexB 단백질은 NCBI 참조 서열 번호 NP_000512.1(SEQ ID NO: 21) 또는 NP_001278933.1에 제시된 서열로 표시된다.
리소좀 축적병과 관련된 단백질을 인코딩하는 트랜스진은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본원에서 사용되는 "작동 가능한 링커"는 다운스트림 트랜스진에 연결되어 발현을 촉진하는 프로모터를 지칭한다. 일부 구체예에서, 프로모터는 항시적 프로모터, 예를 들어, 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서와 함께), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서와 함께)[예를 들어, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985) 참조], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터[Invitrogen]이다. 일부 구체예에서, 프로모터는 강화된 닭 β-액틴 프로모터이다. 일부 구체예에서, 프로모터는 U6 프로모터이다. 일부 구체예에서, 닭 베타-액틴 프로모터는 SEQ ID NO: 22에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하며, 외인적으로 공급된 화합물, 환경 요인, 예를 들어, 온도, 또는 특정 생리학적 상태의 존재, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제하는 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 상업적 공급처로부터 이용 가능하다. 많은 다른 시스템이 기재되어 있으며, 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인적으로 공급된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유암 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 탈피호르몬 곤충 프로모터(No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라사이클린-억제성 시스템(Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라사이클린-유도성 시스템(Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995), 또한 Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 참조), RU486-유도성 시스템(Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 유도성 프로모터의 또 다른 유형은 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의하거나, 복제하는 세포에서만 조절되는 유도성 프로모터이다.
또 다른 구체예에서, 트랜스진에 대한 자연 프로모터(예를 들어, GLB1, HEXA 또는 HEXB)가 사용될 것이다. 자연 프로모터는 트랜스진의 발현이 자연 발현을 모방해야 하는 것이 요망되는 경우에 바람직할 수 있다. 자연 프로모터는 트랜스진의 발현이 시간적 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에 사용될 수 있다. 추가의 구현예에서, 다른 자연 발현 조절 요소, 예를 들어, 인핸서 요소, 아데닐중합체형성 부위 또는 Kozak 컨센서스 서열이 또한 자연 발현을 모방하기 위해 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 프로모터는 뉴런 조직에서 트랜스진 발현을 유도한다. 일부 구체예에서, 본 개시는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 조직-특이적 프로모터를 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 트랜스진은 리소좀 축적병 단백질을 인코딩한다. 본원에서 사용되는 "조직-특이적 프로모터"는 다른 세포 유형에 비해 특정 세포 유형에서 유전자 발현을 우선적으로 조절(예를 들어, 유도 또는 상향조절)하는 프로모터를 지칭한다. 세포-유형-특이적 프로모터는 중추 신경계(CNS) 세포, 간 세포(예를 들어, 간세포), 심장 세포, 신장 세포, 안구 세포, 근육 세포 등과 같은 임의의 세포 유형에 대해 특이적일 수 있다. 예를 들어, 인간 시냅신 1 프로모터(Syn1 프로모터)는 우선적으로 뉴런에서 유전자 발현을 유도하고 GfaABC1D(GFAP로도 지칭됨) 프로모터는 별아교세포에서 우선적으로 발현을 유도한다. 그러나, 여러 세포-유형이 특정 유형의 조직 내에 상주할 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 중추 신경계 조직은 뉴런 세포 및 비-뉴런 세포(예를 들어, 아교세포, 별아교세포 등)를 포함한다.
일부 구체예에서, 분리된 핵산은 리소좀 축적병와 관련된 단백질(예를 들어, HEXA 및 HEXB)을 인코딩하는 적어도 2개의 트랜스진을 포함한다. 제1 트랜스진 및 제2 트랜스진은 적어도 하나의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 트랜스진은 HEXA를 인코딩하고 제2 트랜스진은 HEXB를 인코딩한다. HEXA 트랜스진 및 HEXB 트랜스진은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 이들은 제1 프로모터 및 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 제1 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 항시적 프로모터일 수 있다(예를 들어, CBA). 대안적으로, 제1 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 추가로, 제1 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 프로모터는 뉴런에 특이적이고, 선택적으로 시냅신 1 프로모터(Syn1 프로모터)이다. 일부 구체예에서, Syn1 프로모터는 SEQ ID NO: 13으로 표시된다. 일부 구체예에서, 제2 프로모터는 별아교세포에 특이적이고, 선택적으로 GFAP 프로모터이다. 일부 구체예에서, GFAP 프로모터는 SEQ ID NO: 14로 표시된다.
조직-특이적 프로모터의 추가 예는 간-특이적 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터, 인슐린 프로모터, 글루카곤 프로모터, 소마토스타틴 프로모터, 췌장 폴리펩티드(PPY) 프로모터, 시냅신-1( Syn1) 프로모터, 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 포유동물 데스민(DES) 프로모터, α-미오신 중쇄(a-MHC) 프로모터 또는 심장 트로포닌 T(cTnT) 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 예시적인 프로모터는 다른 것들 중에서 당업자에게 명백할 베타-액틴 프로모터, B형 간염 코어 프로모터, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); 알파-태아단백질(AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), 뼈 오스테오칼신 프로모터(Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); 뼈 시알로단백질 프로모터(Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), CD2 프로모터(Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); 면역글로불린 중쇄 프로모터; T 세포 수용체 α-사슬 프로모터, 신경세포, 예를 들어, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터(Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), 신경미세섬유 경쇄 유전자 프로모터(Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런-특이적 vgf 유전자 프로모터(Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995))를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 키메라 인트론을 통해 프로모터에 작동 가능하게 연결된 트랜스진(예를 들어, 리소좀 저장 단백질, 예를 들어, GLB1, HexA, HexB, 및/또는 HexA 및 HexB)을 포함하는 분리된 핵산에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 키메라 인트론은 닭 베타-액틴 유전자로부터의 핵산 서열, 예를 들어, 닭 베타-액틴 유전자의 인트론 1로부터의 비-코딩 인트론 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 닭 베타-액틴 유전자의 인트론 서열은 약 50개 내지 약 150개 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 50개 내지 150개 뉴클레오티드의 임의의 길이 포함)의 범위이다. 일부 구체예에서, 닭 베타-액틴 유전자의 인트론 서열은 약 100개 내지 120개(예를 들어, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 또는 120개) 뉴클레오티드 길이의 범위이다. 일부 구체예에서, 키메라 인트론은 하나 이상의 비번역 서열(예를 들어, 프로모터 서열과 키메라 인트론 서열 사이에 위치한 비번역 서열 및/또는 키메라 인트론과 트랜스진 서열의 제1 코돈 사이에 위치한 비번역 서열)에 인접한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 비번역 서열 각각은 토끼 베타-글로불린 유전자로부터의 비-코딩 서열이다(예를 들어, 토끼 베타-글로불린 엑손 1, 엑손 2로부터의 비번역 서열 등)으로부터의 비-코딩 서열이다.
재조합 AAV
본 개시의 분리된 핵산은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시에 의해 기재된 바와 같은 분리된 핵산은 제1 아데노-관련 바이러스(AAV) 역 말단 반복부(ITR) 또는 이의 변이체를 포함하는 영역(예를 들어, 제1 영역) 및 리소좀 축적병과 관련된 트랜스진(예를 들어, GLB1, HEXA 및/또는 HEXB)을 인코딩하는 제2 영역을 포함한다. 분리된 핵산(예를 들어, 재조합 AAV 벡터)은 캡시드 단백질로 패키징되고 대상체에게 투여되고/되거나 선택된 표적 세포에 전달될 수 있다. 트랜스진은 또한 본 개시의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 단백질 및/또는 발현 조절 서열(예를 들어, 폴리-A 테일)을 인코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
본 개시는 단일, 시스-작용 야생형 ITR을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구체예에서, ITR은 5' ITR이다. 일부 구체예에서, ITR은 3' ITR이다. 일반적으로, ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 바람직하게는, ITR(들)을 인코딩하는 실질적으로 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 약간의 변형이 어느 정도 허용된다. ITR 서열을 변형하는 능력은 당 분야의 기술 내에 있다. (예를 들어, Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); and K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)과 같은 텍스트 참조). 예를 들어, ITR은 그 말단 분해 부위(TR)에서 돌연변이될 수 있으며, 이는 TR이 돌연변이된 벡터 말단에서의 복제를 억제하여 자가-상보성 AAV의 형성을 초래한다. 본 개시에 사용된 그러한 분자의 또 다른 예는 트랜스진을 함유하는 "시스-작용" 플라스미드이며, 여기서 선택된 트랜스진 서열 및 관련 조절 요소는 5' AAV ITR 서열 및 3' 헤어핀-형성 RNA 서열의 측면에 위치한다. AAV ITR 서열은 현재 확인된 포유동물 AAV 유형을 포함하는 임의의 공지된 AAV로부터 수득될 수 있다. 일부 구체예에서, ITR 서열은 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10 및/또는 AAVrh10 ITR 서열이다.
본 개시의 분리된 핵산 및/또는 rAAV는 표적 조직(예를 들어, CNS)에 대한 분리된 핵산 및/또는 rAAV의 표적화를 향상시키기 위해 변형 및/또는 선택될 수 있다. 변형 및/또는 선택의 비제한적인 방법은 AAV 캡시드 혈청형(예를 들어, AAV8, AAV9), 조직-특이적 프로모터(예를 들어, Syn1, GFAP) 및/또는 표적화 펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시의 분리된 핵산 및 rAAV는 CNS 조직에 대한 표적화가 향상된 AAV 캡시드 혈청형을 포함한다(예를 들어, AAV8, AAV9). 일부 구체예에서, 본 개시의 분리된 핵산 및 rAAV는 조직-특이적 프로모터(예를 들어, Syn1, GFAP)를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시의 분리된 핵산 및 rAAV는 CNS 조직 및 조직-특이적 프로모터에 대한 표적화가 향상된 AAV 캡시드 혈청형을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 분리된 AAV를 제공한다. AAV와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 인위적으로 수득되거나 생산된 AAV를 지칭한다. 분리된 AAV는 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 그러한 AAV는 본원에서 "재조합 AAV"로 지칭된다. 재조합 AAV(rAAV)는 바람직하게는 조직-특이적 표적화 능력을 가지며, 따라서 rAAV의 트랜스진은 하나 이상의 미리 결정된 조직(들)에 특이적으로 전달될 것이다. AAV 캡시드는 이러한 조직-특이적 표적화 능력을 결정하는데 중요한 요소이다. 따라서, 표적화되는 조직에 적합한 캡시드를 갖는 rAAV가 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10 캡시드 단백질, 또는 이에 실질적인 상동성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, rAAV는 AAVrh8 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 슈도타입 rAAV이다. 슈도타입핑은 외래 바이러스 외피 단백질과 함께 바이러스 또는 바이러스 벡터를 생산하는 과정이다. 결과는 슈도타입 바이러스 입자이다. 이 방법으로, 외래 바이러스 외피 단백질을 사용하여 숙주 친화성 또는 바이러스 입자의 증가/감소된 안정성을 변경할 수 있다. 일부 양태에서, 슈도타입 rAAV는 2개 이상의 상이한 AAV로부터의 핵산을 포함하고, 여기서 하나의 AAV로부터의 핵산은 캡시드 단백질을 인코딩하고 적어도 하나의 다른 AAV의 핵산은 다른 바이러스 단백질 및/또는 바이러스 게놈을 인코딩한다. 일부 구체예에서, 슈도타입 rAAV는 하나의 AAV 혈청형의 역 말단 반복부(ITR) 및 상이한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 AAV를 지칭한다. 예를 들어, Y의 단백질로 캡슐화된 혈청형 X의 ITR을 함유하는 슈도타입 AAV 벡터는 AAVX/Y로 지정될 것이다(예를 들어, AAV2/1은 AAV2의 ITR 및 AAV1의 캡시드를 가짐). 일부 구체예에서, 슈도타입 rAAV는 하나의 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질의 조직-특이적 표적화 능력을 또 다른 AAV 혈청형으로부터의 바이러스 DNA와 조합하여, 표적 조직으로의 트랜스진의 표적화된 전달을 허용하는데 유용할 수 있다.
요망되는 캡시드 단백질을 갖는 재조합 AAV를 얻는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2003/0138772 참조, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 전형적으로 방법은 AAV 캡시드 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 서열; 기능성 rep 유전자; AAV 역 말단 반복부(ITR) 및 트랜스진으로 구성된 재조합 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드 단백질로 재조합 AAV 벡터의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 캡시드 단백질은 AAV의 cap 유전자에 의해 인코딩되는 구조적 단백질이다. 일부 구체예에서, AAV는 3개의 캡시드 단백질인 비리온 단백질 1 내지 3(VP1, VP2 및 VP3으로 명명됨)을 포함하며, 이들 모두는 대안적 스플라이싱을 통해 단일 cap 유전자로부터 전사된다. 일부 구체예에서, VP1, VP2 및 VP3의 분자량은 각각 약 87 kDa, 약 72 kDa 및 약 62 kDa이다. 일부 구체예에서, 번역시, 캡시드 단백질은 바이러스 게놈 주위에 구형 60-mer 단백질 껍질을 형성한다. 일부 구체예에서, 캡시드 단백질은 바이러스 게놈을 보호하고/거나, 게놈을 전달하고/거나 숙주 세포와 상호작용한다. 일부 양태에서, 캡시드 단백질은 조직 특이적 방식으로 바이러스 게놈을 숙주에 전달한다.
일부 구체예에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAVrh8 AAV9, AAV10 및 AAVrh10으로 구성된 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형을 갖는다. 일부 구체예에서, AAV 캡시드 단백질은 AAVrh8 또는 AAVrh10 혈청형을 갖는다. 일부 구체예에서, AAV 캡시드 단백질은 AAVrh8 혈청형을 갖는다.
일부 구체예에서, AAV 캡시드에 rAAV 벡터를 패키징하기 위해 숙주 세포에서 배양될 성분은 트랜스로(in trans) 숙주 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 임의의 하나 이상의 필요한 성분(예를 들어, 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및/또는 헬퍼 기능)은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 하나 이상의 필요한 성분을 함유하도록 조작된 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 그러한 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어하에 필요한 성분(들)을 함유할 것이다. 그러나, 필요한 성분(들)은 항시적 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 적합한 유도성 및 항시적 프로모터의 예는 본원에서 트랜스진과 함께 사용하기에 적합한 조절 요소의 논의에서 제공된다. 또 다른 대안에서, 선택된 안정한 숙주 세포는 항시적 프로모터의 제어하에 선택된 성분(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어하에 선택된 다른 성분(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 293 세포(항시적 프로모터의 제어하에 E1 헬퍼 기능을 함유함)로부터 유래되지만, 유도성 프로모터의 제어하에 rep 및/또는 cap 단백질을 함유하는 안정한 숙주 세포가 생성될 수 있다. 또 다른 안정한 숙주 세포가 당업자에 의해 생성될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 SEQ ID NO: 1-6으로 구성된 군으로부터 선택되는 코딩 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본 개시는 상기 기재된 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 숙주 세포를 포함하는 조성물은 동결보존제를 추가로 포함한다.
본 개시의 rAAV를 생산하는데 유용한 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및 헬퍼 기능은 임의의 적절한 유전적 요소(벡터)를 사용하여 패키징 숙주 세포로 전달될 수 있다. 선택된 유전적 요소는 본원에 기재된 것을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 개시의 임의의 구체예를 구축하기 위해 사용되는 방법은 핵산 조작의 숙련가에게 공지되어 있으며, 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y] 참조. 유사하게, rAAV 비리온을 생성하는 방법은 잘 알려져 있으며, 적합한 방법의 선택이 본 개시를 제한하지 않는다. 예를 들어, 문헌[K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993) and U.S. Pat. No. 5,478,745] 참조.
일부 구체예에서, 재조합 AAV는 삼중 트랜스펙션 방법을 사용하여 생산될 수 있다(미국 특허 번호 6,001,650에 상세히 기재됨). 전형적으로, 재조합 AAV는 AAV 입자로 패키징될 재조합 AAV 벡터(트랜스진 포함), AAV 헬퍼 기능 벡터 및 보조 기능 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션시킴으로써 생산된다. AAV 헬퍼 기능 벡터는 생산적 AAV 복제 및 캡시드화를 위해 트랜스로 기능하는 "AAV 헬퍼 기능" 서열(즉, rep 및 cap)을 인코딩한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 검출 가능한 야생형 AAV 비리온(즉, 기능성 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 발생시키지 않고 효과적인 AAV 벡터 생산을 지지한다. 본 개시와 함께 사용하기에 적합한 벡터의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 6,001,650에 기술된 pHLP19 및 미국 특허 번호 6,156,303에 기술된 pRep6cap6 벡터를 포함하며, 둘 모두의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 보조 기능 벡터는 AAV가 복제를 위해 의존하는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능(즉, "보조 기능")에 대한 뉴클레오티드 서열을 인코딩한다. 보조 기능은 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 생성물의 합성 및 AAV 캡시드 어셈블리와 관련된 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는 AAV 복제에 필요한 기능을 포함한다. 바이러스-기반 부속 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(단순 헤르페스 바이러스 타입-1이 아님) 및 백시니아 바이러스로부터 유래될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다. 용어 "트랜스펙션"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하는데 사용되며, 세포는 외인성 DNA가 세포막을 통해 도입되었을 때 "트랜스펙션"되었다. 다수의 트랜스펙션 기술이 일반적으로 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197] 참조. 그러한 기술은 뉴클레오티드 통합 벡터 및 다른 핵산 분자와 같은 하나 이상의 외인성 핵산을 적합한 숙주 세포로 도입하는데 사용될 수 있다.
"숙주 세포"는 관심 물질을 보유하거나 보유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 종종 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 작제물, AAV 미니유전자 플라스미드, 보조 기능 벡터, 또는 재조합 AAV의 생산과 관련된 다른 전달 DNA의 수용자로서 사용될 수 있다. 상기 용어는 트랜스펙션된 원래 세포의 프로제니를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열로 트랜스펙션된 세포를 지칭할 수 있다. 단일 부모 세포의 프로제니는 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 부모와 형태 또는 유전체 또는 전체 DNA 보체에서 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "세포주"는 시험관 내에서 연속적 또는 연장된 성장 및 분열이 가능한 세포 집단을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 전구 세포로부터 유래된 클론 집단이다. 그러한 클론 집단의 저장 또는 전달 동안 핵형에서 자발적 또는 유도된 변화가 발생할 수 있다는 것이 당 분야에 추가로 공지되어 있다. 따라서, 지칭된 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확히 동일하지 않을 수 있으며, 지칭된 세포주는 그러한 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 세포"는 생물학적-활성 폴리펩티드의 전사 또는 RNA와 같은 생물학적 활성 핵산의 생산을 유도하는 DNA 세그먼트와 같은 외인성 DNA 세그먼트가 도입된 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등과 같은 임의의 유전적 요소를 포함하며, 이는 적절한 제어 요소와 연관될 때 복제가 가능하며 세포간에 유전자 서열을 전달할 수 있다. 따라서, 상기 용어는 바이러스 벡터뿐만 아니라 클로닝 및 발현 비히클을 포함한다. 일부 구체예에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 세그먼트가 프로모터의 전사 조절하에 위치하는 벡터인 것으로 고려된다. "프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기구에 의해 인식되거나 합성 기구에 의해 도입되는 DNA 서열을 지칭한다. 어구 "작동 가능하게 위치", "제어하에" 또는 "전사 제어하에"는 프로모터가 RNA 중합효소 개시 및 유전자의 발현을 제어하기 위해 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 배향에 있음을 의미한다. 용어 "발현 벡터 또는 작제물"은 핵산 인코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전적 작제물을 의미한다. 일부 구체예에서, 발현은, 예를 들어, 전사된 유전자로부터 생물학적-활성 폴리펩티드 생성물 또는 억제성 RNA(예를 들어, shRNA, miRNA, miRNA 억제제)를 생성하기 위한 핵산의 전사를 포함한다.
본 개시의 rAAV를 생산하기 위해 요망되는 AAV 캡시드에 재조합 벡터를 패키징하기 위한 전술한 방법은 제한적인 것을 의미하지 않으며, 다른 적합한 방법이 당업자에게 명백할 것이다.
재조합 AAV 벡터
본 개시의 분리된 핵산은 재조합 AAV(rAAV) 벡터일 수 있다. 본 개시의 "재조합 AAV(rAAV) 벡터"는 전형적으로 적어도 트랜스진 및 이의 조절 서열, 및 5' 및 3' AAV 역 말단 반복부(ITR)로 구성된다. 이것은 캡시드 단백질로 패키징되고 선택된 표적 세포로 전달되는 재조합 AAV 벡터이다. 일부 구체예에서, 트랜스진은 벡터 서열에 이종인 핵산 서열이며, 이는 관심 폴리펩티드, 단백질, 기능성 RNA 분자(예를 들어, miRNA, miRNA 억제제) 또는 다른 유전자 생성물을 인코딩한다. 핵산 코딩 서열은 표적 조직의 세포에서 트랜스진 전사, 번역 및/또는 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결된다.
본 개시의 양태는 rAAV의 조절 서열을 변형시키는 것이 치료적으로 효과적이지만 이전에 사용된 rAAV와 관련된 벡터-매개 독성을 유발하지 않는 수준의 트랜스진 발현을 제공한다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 개시는 변형된 유전적 조절 요소를 포함하는 재조합 AAV(rAAV)에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 변형된 유전적 조절 요소는 하이브리드 프로모터이다.
본원에서 사용되는 용어 "하이브리드 프로모터"는 RNA 전사체(예를 들어, 트랜스진에 의해 인코딩되는 것을 포함하는 전사체)의 전사를 유도할 수 있는 조절 작제물을 지칭하며, 여기서 작제물은 인위적으로 배열된 2개 이상의 조절 요소를 포함한다. 전형적으로, 하이브리드 프로모터는 최소 프로모터인 적어도 하나의 요소 및 인핸서 서열을 갖는 적어도 하나의 요소 또는 하나 이상의 전사 조절 요소를 포함하는 인트론, 엑손 또는 UTR 서열을 포함한다. 하이브리드 프로모터가 엑손, 인트론 또는 UTR 서열을 포함하는 구체예에서, 그러한 서열(들)은 RNA 전사체의 업스트림 부분(예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같음)을 인코딩하는 한편, 또한 전사체의 전사를 조절하는(예를 들어, 향상시키는) 조절 요소를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 하이브리드 프로모터의 2개 이상의 요소는 서로에 대해 이종성 공급원으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 하이브리드 프로모터의 2개 이상의 요소는 트랜스진에 대해 이종성 공급원으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 하이브리드 프로모터의 2개 이상의 요소는 상이한 유전적 유전자좌로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 하이브리드 프로모터의 2개 이상의 요소는 동일한 유전적 유전자좌에서 유래하지만 유전적 유전자좌에서 발견되지 않는 방식으로 배열된다. 일부 구체예에서, 하이브리드 프로모터는 상이한 공급원의 프로모터 또는 인핸서 요소를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열에 융합된 하나의 프로모터로부터의 제1 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하이브리드 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터로부터의 제1 서열 및 CMV 인핸서의 제2 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하이브리드 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터로부터의 제1 서열 및 닭-베타 액틴 유전자의 인트론으로부터의 제2 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하이브리드 프로모터는 CMV 인핸서 서열에 융합된 닭 베타-액틴 프로모터로부터의 제1 서열 및 닭-베타 액틴 유전자의 인트론으로부터의 서열을 포함한다.
일부 양태에서, rAAV는 인핸서 요소를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "인핸서 요소"는 활성제 단백질에 의해 결합될 때 유전자 또는 유전자들의 전사를 활성화하거나 증가시키는 핵산 서열을 지칭한다. 인핸서 서열은 이들이 조절하는 유전자에 비해 업스트림(즉, 5') 또는 다운스트림(즉, 3')일 수 있다. 인핸서 서열의 예는 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 서열 및 유인원 공포 바이러스 40(SV40) 인핸서 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, rAAV는 CMV 인핸서 요소 또는 이의 일부를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "이의 일부"는 이것이 유래된 전체 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 요망되는 기능적 특성을 보유하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 단편을 지칭한다. 예를 들어, "CMV 인핸서 서열 또는 이의 일부"는 트랜스진의 전사를 증가시킬 수 있는 야생형 CMV 인핸서로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
일부 양태에서, rAAV는 전사 후 반응 요소를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "전사 후 반응 요소"는 전사될 때 유전자의 발현을 향상시키는 3차 구조를 채택하는 핵산 서열을 지칭한다. 전사 후 조절 요소의 예는 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE), 마우스 RNA 수송 요소(RTE), 유인원 레트로 바이러스 타입 1(SRV-1)의 구성적 수송 요소(CTE), 메이슨-화이자 원숭이 바이러스(MPMV)로부터의 CTE 및 인간 열 충격 단백질 70의 5' 비번역 영역(Hsp70 5' UTR)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, rAAV 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 하이브리드 또는 키메라 인트론을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "키메라 인트론"은 2개 이상의 상이한 공급원으로부터의 서열을 갖는 인트론을 지칭한다. 일부 구체예에서, 키메라 인트론은 제1 공급원(예를 들어, 유기체 또는 종)으로부터의 스플라이스 공여자 부위 및 제2 공급원(예를 들어, 유기체 또는 종)으로부터의 스플라이스 수용자 부위를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 인트론은 하나 이상의 전사 조절 요소 및/또는 인핸서 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 인트론은 하이브리드 프로모터의 엑손과 트랜스진 사이에 위치한다. 일부 구체예에서, 본 개시는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 rAAV를 제공하고, 여기서 트랜스진은 리소좀 저장 단백질을 코딩하고, rAAV는 키메라 인트론을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시는 인공 전사 요소를 포함하는 rAAV 벡터에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "인공 전사 요소"는, 일부 구체예에서, RNA 중합효소에 의한 DNA의 제어된 전사가 RNA 전사체를 생성할 수 있게 하는 합성 서열을 지칭한다. 본 개시의 전사 활성 요소는 일반적으로 500 bp 미만, 바람직하게는 200 bp 미만, 더욱 바람직하게는 100 미만, 가장 바람직하게는 50 bp 미만이다. 일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 전사 활성 요소로부터의 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 전사 활성 요소는 일반적으로 당 분야에 인지되어 있고, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 서열, TATA 박스, G/C 박스, CCAAT 박스, 특이성 단백질 1(Sp1) 결합 부위, Inr 영역, CRE(cAMP 조절 요소), 활성화 전사 인자 1(ATF1) 결합 부위, ATF1-CRE 결합 부위, APBβ 박스, APBα 박스, CArG 박스, CCAC 박스 및 미국 특허 번호 6,346,415에 개시된 것들을 포함한다. 전술한 전사 활성 요소의 조합이 또한 고려된다.
일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 프로모터 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 인핸서 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 ATF1-CRE 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 SP1 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 C 박스를 포함한다. 일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 TATA 박스를 포함한다. 일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 ATF1-CRE 결합 부위, SP1 결합 부위 및 TATA 박스를 포함한다. 일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 SEQ ID NO: 2로 표시된다.
발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예를 들어, 스플라이싱 및 아데닐중합체형성(폴리A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 요망될 때, 인코딩된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 자연, 항시적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 포함하는 매우 많은 수의 발현 조절 서열이 당 분야에 공지되어 있으며, 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 핵산 서열(예를 들어, 코딩 서열) 및 조절 서열은 핵산 서열의 발현 또는 전사가 조절 서열의 영향 또는 제어하에 놓이는 방식으로 공유적으로 연결될 때 "작동 가능하게" 연결된다고 일컬어진다. 핵산 서열이 기능성 단백질로 번역되는 것이 요망된다면, 5' 조절 서열에서 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 초래하고 두 DNA 서열 간의 연결 특성이 (1) 프레임-이동 돌연변이의 도입을 초래하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, (3) 상응하는 RNA 전사체가 단백질로 번역되는 능력을 방해하지 않는 경우 2개의 DNA 서열은 작동 가능하게 연결된다고 일컬어진다. 따라서, 프로모터 영역이 DNA 서열의 전사에 영향을 미쳐 생성된 전사체가 요망되는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있는 경우, 프로모터 영역은 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 유사하게, 2개 이상의 코딩 영역이 공통 프로모터로부터의 이들의 전사가 인 프레임으로(in frame)으로 번역된 2개 이상의 단백질의 발현을 초래하는 방식으로 연결될 때 이들은 작동 가능하게 연결된 것이다. 일부 구체예에서, 작동 가능하게 연결된 코딩 서열은 융합 단백질을 생성한다. 일부 구체예에서, 작동 가능하게 연결된 코딩 서열은 기능성 RNA(예를 들어, shRNA, miRNA, miRNA 억제제)를 생성한다.
단백질을 인코딩하는 핵산의 경우, 아데닐중합체형성 서열은 일반적으로 트랜스진 서열 뒤에 그리고 3' AAV ITR 서열 앞에 삽입된다. 본 개시에 유용한 rAAV 작제물은 또한 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열과 트랜스진 사이에 위치하는 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 가능한 인트론 서열은 SV-40에서 유래되며, SV-40 T 인트론 서열로 지칭된다.
사용될 수 있는 또 다른 벡터 요소는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 하나 초과의 폴리펩티드를 생산하는데 사용된다. IRES 서열은 하나 초과의 폴리펩티드 사슬을 함유하는 단백질을 생산하는데 사용될 것이다. 이들 및 다른 공통 벡터 요소의 선택은 통상적이며 많은 그러한 서열이 이용 가능하다[예를 들어, 문헌[Sambrook et al, and references cited therein at, for example, pages 3.18 3.26 and 16.17 16.27 and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989] 참조]. 일부 구체예에서, 구제역 바이러스 2A 서열은 다기능단백질에 포함되며; 이것은 다기능단백질의 절단을 매개하는 것으로 밝혀진 작은 펩티드(약 18개 아미노산 길이)이다(Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; and Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 치료 벡터(AAV 및 레트로바이러스)를 포함하는 인공 시스템에서 이전에 입증되었다(Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; and Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.; and Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817).
숙주 세포에서 유전자 발현에 필요한 조절 서열의 정확한 특성은 종, 조직 또는 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로, 필요에 따라, 전사 및 번역의 개시에 각각 관여하는 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예를 들어, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열, 인핸서 요소 등을 포함해야 한다. 특히, 그러한 5' 비-전사 조절 서열은 작동 가능하게 결합된 유전자의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절 서열은 또한 요망에 따라 인핸서 서열 또는 업스트림 활성제 서열을 포함할 수 있다. 본 개시의 벡터는 선택적으로 5' 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다.
항시적 프로모터의 예는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)[예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터[Invitrogen]를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하며, 외인적으로 공급된 화합물, 환경 요인, 예를 들어, 온도, 또는 특정 생리학적 상태의 존재, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제하는 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 상업적 공급처로부터 이용 가능하다. 많은 다른 시스템이 기재되어 있으며, 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인적으로 공급된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유암 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 탈피호르몬 곤충 프로모터(No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라사이클린-억제성 시스템(Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라사이클린-유도성 시스템(Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), 또한 Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 참조), RU486-유도성 시스템(Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 유도성 프로모터의 또 다른 유형은 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의하거나, 복제하는 세포에서만 조절되는 유도성 프로모터이다.
벡터의 AAV 서열은 전형적으로 시스-작용 5' 및 3' 역 말단 반복 서열을 포함한다(예를 들어, 문헌[B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)] 참조). ITR 서열은 약 145 bp 길이이다. 바람직하게는, ITR을 인코딩하는 실질적으로 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 약간의 변형이 어느 정도 허용된다. 이러한 ITR 서열을 변형하는 능력은 당 분야의 기술 내에 있다. (예를 들어, Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); and K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)과 같은 텍스트 참조). 본 개시에 사용된 그러한 분자의 예는 트랜스진을 함유하는 "시스-작용" 플라스미드이며, 여기서 선택된 트랜스진 서열 및 관련 조절 요소는 5' 및 3' AAV ITR 서열의 측면에 위치한다. AAV ITR 서열은 현재 확인된 포유동물 AAV 유형을 포함하는 임의의 공지된 AAV로부터 수득될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 슈도타입 rAAV이다. 예를 들어, Y의 단백질로 캡슐화된 혈청형 X의 ITR을 함유하는 슈도타입 AAV 벡터는 AAVX/Y로 지정될 것이다(예를 들어, AAV2/1은 AAV2의 ITR 및 AAV1의 캡시드를 가짐). 일부 구체예에서, 슈도타입 rAAV는 하나의 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질의 조직-특이적 표적화 능력을 또 다른 AAV 혈청형으로부터의 바이러스 DNA와 조합하여, 표적 조직으로의 트랜스진의 표적화된 전달을 허용하는데 유용할 수 있다.
재조합 AAV 벡터에 대해 상기 확인된 주요 요소에 추가하여, 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 트랜스펙션되거나 본 개시에 의해 생산된 바이러스로 감염된 세포에서 이의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 필요한 통상적인 제어 요소를 포함한다. 본원에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 조절 서열 및 관심 유전자를 조절하기 위해 트랜스로 또는 좀 떨어져서 작용하는 발현 조절 서열 둘 모두를 포함한다.
재조합 AAV 벡터: 트랜스진 코딩 서열
rAAV 벡터의 트랜스진 서열의 조성은 생성된 벡터가 사용될 용도에 좌우될 것이다. 예를 들어, 한 유형의 트랜스진 서열은 발현시 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 트랜스진은 치료 단백질 또는 치료 기능성 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 트랜스진은, 예를 들어, 트랜스진 생성물의 기능을 연구하기 위해, 예를 들어, 트랜스진을 보유하는 체세포 트랜스제닉 동물 모델을 생성하기 위해, 연구 목적으로 사용되도록 의도된 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 트랜스진은 질병의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 적절한 트랜스진 코딩 서열은 당업자에게 명백할 것이다.
일부 양태에서, 본 개시는 리소좀 축적병의 치료에 유용한 rAAV 벡터에 관한 것이다. 리소좀 축적병(리소좀 축적 질환으로도 지칭됨)는 리소좀 기능의 결함으로 인한 유전적 대사 장애의 그룹이다. 일반적으로, 리소좀 축적병은 리소좀 대사에 관여하는 단일 단백질(예를 들어, 효소)의 손상된 기능을 특징으로 한다. 예를 들어, 테이 삭스병은 헥소사미니다제 A(HEXA) 유전자의 유전적 돌연변이에 의해 유발되며, 이는 HEXA 효소가 GM2 강글리오시드를 가수분해하지 못하게 한다. 리소좀 축적병 및 이와 관련된 단백질의 다른 예는 아스파르틸글리코사민뇨증(아스파르틸글루코사미니다제), 영아 바텐병(팔미토일 단백질 티오에스테라제), 후기 영아 바텐병(트리펩티딜 펩티다제), 파브리병(α-갈락토시다제), 푸코시드축적증(α-푸코시다제), 갈락토시알리도시스(보호 단백질/카텝신 A), 고쉐병(β-글루코시다제), 갈락토시알리도시스(보호 단백질/카텝신 A), 공세포백색질장애(갈락토실세라미다제), GM1 강글리오시드증(β-갈락토시다제), α-만노시드증(α-만노시다제), 이염색백색질장애(아릴설파타제 A), 점액다당류증 I(α-L-이듀로니다제), 점액다당류증 II(이듀로네이트 설파타제), 점액다당류증 IIIA(헤파린 설파타제), 점액다당류증 IIIA(헤파린 설파타제), 점액다당류증 IIIB(α-N-아세틸글루코사미니다제), 점액다당류증 IIIC(아세틸-CoA 알파 글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제), 점액다당류증 IIID(N-아세틸글루코사민-6-설페이트 설파타제), 점액다당류증 IVA(N-아세틸갈락토사민 6-설파타제), 점액다당류증 IVB(β-갈락토시다제), 점액다당류증 IX(히알루로니다제), 점액다당류증 VI(아릴설파타제 B), 점액다당류증 VII(β-글루쿠로니다제), 점액지질증 타입 I(α-뉴라미니다제), 점액지질증 타입 II(GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제), 점액지질증 타입 III(N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제), 니만-픽병(산 스핑고마이엘리나제), 폼페병(α-글루코시다제), 샌드호프병(β-헥소사미니다제 A 및 B), 쉰들러병(α-N-아세틸갈락토사미니다제), 테이 삭스병(β-헥소사미니다제 A/B) 및 월만병(산 리파제)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 본 개시는 리소좀 축적병-관련 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 rAAV를 제공한다. 일부 구체예에서, 리소좀 축적병-관련 단백질은 HEXA, HEXB 및 GLB1으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 리소좀 축적병-관련 단백질은 HEXA이고 SEQ ID NO: 20에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 리소좀 축적병-관련 단백질은 HEXB이고 SEQ ID NO: 21에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 리소좀 축적병-관련 단백질은 GLB1이고 SEQ ID NO: 23에 제시된 서열을 포함한다.
본원에 기재된 rAAV를 사용하여 트랜스진을 대상체에게 전달함으로써 리소좀 축적병을 치료하는 방법이 또한 본원에서 고려된다. 일부 구체예에서, 본 개시는 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 리소좀 축적병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, rAAV는 하이브리드 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, rAAV는 키메라 인트론을 포함한다. 일부 구체예에서, rAAV는 인공 전사 요소를 포함한다. 일부 구체예에서, 인공 전사 요소는 ATF1-CRE 결합 부위, SP1 결합 부위 및 TATA 박스를 포함한다. 일부 구체예에서, 프로모터, 키메라 인트론 또는 인공 전사 요소는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 트랜스진은 리소좀 축적병 관련 트랜스진이다. 일부 구체예에서, 트랜스진은 HEXA, HEXB 및 GLB1으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 리소좀 축적병은 GM2 강글리오시드증(샌드호프병 및 및 테이 삭스병)이고, rAAV는 HEXA 및 HEXB를 인코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 구체예에서, 리소좀 축적병은 GM1 강글리오시드증이고, 트랜스진은 GLB1을 인코딩한다.
일부 양태에서, 본 개시는 제1 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 제1 세포-유형-특이적 프로모터 및 제2 트랜스진에 연결된 제2 세포-유형-특이적 프로모터를 갖는 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 rAAV를 제공하며, 여기서 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 동일한 세포-유형에 대해 특이적이지 않다. 임의의 특정 이론에 구속되길 원치 않으며, 그러한 rAAV 벡터는 일부 구체예에서 주어진 조직(예를 들어, CNS 조직) 내의 다중 세포 유형에 영향을 미치는 질병의 치료에 유용하다.
따라서, 일부 양태에서, 본 개시는 CNS-관련 질병의 치료에 유용한 rAAV 벡터에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "CNS-관련 질병"은 중추 신경계의 질병 또는 질환을 지칭한다. CNS-관련 장애는 척수(예를 들어, 골수병증), 뇌(예를 들어, 뇌병증) 또는 뇌와 척수를 둘러싼 조직에 영향을 미칠 수 있다. CNS-관련 장애는 유전되거나 체세포 돌연변이를 통해 획득된 유전적 기원일 수 있다. CNS-관련 장애는, 예를 들어, 주의력 결핍 과잉행동 장애, 자폐 스펙트럼 장애, 기분 장애, 정신분열증, 우울증, 레트 증후군 등과 같은 심리적 질환 또는 장애일 수 있다. CNS-관련 장애는 자가면역 장애일 수 있다. CNS-관련 장애는 또한 CNS의 암, 예를 들어, 뇌암일 수 있다. 암인 CNS-관련 장애는 CNS의 원발성 암, 예를 들어, 별아교세포종, 아교모세포종 등일 수 있거나, CNS 조직으로 전이된 암, 예를 들어, 뇌로 전이된 폐암일 수 있다. CNS-관련 장애의 추가의 비제한적인 예는 헌팅톤병, 파킨슨병, 리소좀 축적병, 허혈, 신경병성 통증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다발성 경화증(MS), 캐너번병(CD), 전두측두엽 변성(FTLD), 척수소뇌성 실조증, 척수 및 구근 위축증, 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증 및 프라드라히(Freiderich) 운동실조를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시에 의해 기재된 rAAV 벡터는 CNS 질병-관련 유전자를 인코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 구체예에서, CNS 질병-관련 유전자를 인코딩하는 트랜스진은 단백질 또는 간섭 RNA를 인코딩한다. 간섭 RNA의 예는 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및 인공 miRNA(amiRNA)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. CNS 질병과 관련된 유전자의 예는 알츠하이머병과 연관된 DRD2, GRIA1, GRIA2, GRIN1, SLC1A1, SYP, SYT1, CHRNA7, 3Rtau/4rTUS, APP, BAX, BCL-2, GRIK1, GFAP, IL-1, AGER; 파킨슨병과 연관된 UCH-L1, SKP1, EGLN1, Nurr-1, BDNF, TrkB, gstm1, S106β; 헌팅톤병과 연관된 헌팅틴(huntingtin)(Htt), IT15, PRNP, JPH3, TBP, ATXN1, ATXN2, ATXN3, 아트로핀(Atrophin) 1, FTL, TITF-1, Xbp1s, CRAG; 프라드라히 운동실조와 연관된 FXN; 캐너번병과 연관된 ASPA; 근육퇴행위축과 연관된 DMD; 척수근 위축증과 연관된 SMN1, UBE1, DYNC1H1; 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 연관된 ALS2, ANG, ATXN2, C9orf72, DCTN1, FIG4, FUS, NEFH, OPTN, PFN1, PRPH, SETX, SIGMAR1, SMN1, SOD1, SPG11, TARDBP, UBQLN2, VAPB, VCP; 알파-만노시드증과 연관된 MAN2B1, MAN2B2, MAN2C1; 아스파르틸글리코사민뇨증과 연관된 AGA; 바텐병과 연관된 CLN1, CLN2, CLN3, CLN5, CLN6, MFSD8, CLN8, CTSD; 베타-만노시드증과 연관된 MANBA; 시스틴증과 연관된 CTNS; 다논병과 연관된 LAMP2; 파브리병과 연관된 GLA; 파버병과 연관된 ASAH1; 푸코시드축적증과 연관된 FUCA1; 갈락토시알리도시스와 연관된 CTSA; 고쉐병과 연관된 GBA; 크라베병과 연관된 GALC; 이염색백색질장애와 연관된 ARSA; 및 점액다당류증 장애(예를 들어, 헐러 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 A-D, 모르키오, 히알루로니다제 결핍, 마로토-라미, Sly 증후군, 시알산증, I-세포병, 점액지질증 타입 I-IV, 다중 설파타제 결핍, 니만-픽병 타입 A-C, 폼페병, 피크노디소토시스, 샌드호프병, 쉰들러병, 테이 삭스, 월만병)와 연관된 IDUA, IDS, SGSH, NAGLU, HGSNAT, GNS, GALNS, ARSB, GUSB, HYAL1, SMPD1, NPC1, NPC2, GAA, NAGA, SLCA17A5 및 LAL (LIPA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
유용한 트랜스진 생성물은 또한 miRNA를 포함한다. miRNA 및 다른 작은 간섭 핵산은 표적 RNA 전사체 절단/분해 또는 표적 메신저 RNA(mRNA)의 번역 억제를 통해 유전자 발현을 조절한다. miRNA는 전형적으로 최종 19-25개의 비-번역된 RNA 생성물로서 본래 발현된다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR)과의 서열-특이적 상호작용을 통해 이들의 활성을 나타낸다. 이러한 내인적으로 발현된 miRNA는 헤어핀 전구체를 형성하고, 이는 후속적으로 miRNA 듀플렉스로, 그리고 추가로 "성숙한" 단일 가닥 miRNA 분자로 처리된다. 이러한 성숙한 miRNA는 성숙한 miRNA에 대한 상보성에 기초하여 표적 mRNA의, 예를 들어, 3' UTR 영역에서 표적 부위를 확인하는 다중단백질 복합체, miRISC를 유도한다. 일부 구체예에서, 억제성 RNA는 miRNA이다. 일부 구체예에서, 본 개시에 의해 기재된 rAAV는 인간 SOD1(예를 들어, SOD1G93A)을 표적화하는 억제성 RNA를 인코딩하는 트랜스진을 포함하고 SEQ ID NO: 15를 포함한다.
재조합 AAV 투여 방법
rAAV는 당 분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라 조성물로 대상체에게 전달될 수 있다. 바람직하게는 생리학적으로 적합한 담체(즉, 조성물에서)에 현탁된 rAAV는 대상체, 즉, 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기니피그, 햄스터, 닭, 칠면조 또는 비인간 영장류(예를 들어, 마카크)와 같은 숙주 동물에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 동물은 인간을 포함하지 않는다.
포유동물 대상체에게 rAAV의 전달은, 예를 들어, 근육내 주사에 의해, 또는 포유동물 대상체의 혈류로의 투여에 의해서일 수 있다. 혈류로의 투여는 정맥, 동맥 또는 임의의 다른 혈관 도관으로의 주사에 의해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, rAAV는 수술 분야에 잘 알려진 기술인 분리된 사지 관류에 의해 혈류로 투여되며, 상기 방법은 본질적으로 당업자가 rAAV 비리온의 투여 전에 전신 순환으로부터 사지를 분리할 수 있게 한다. 미국 특허 번호 6,177,403에 기재된 분리된 사지 관류 기술의 변형이 또한 비리온을 분리된 사지의 혈관계로 투여하여 근육 세포 또는 조직으로의 형질도입을 잠재적으로 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 특정 예에서, 비리온을 대상체의 CNS로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. "CNS"는 척추동물의 뇌 및 척수의 모든 세포 및 조직을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 신경 세포, 아교 세포, 별아교세포, 뇌척수액(CSF), 간질 공간, 뼈, 연골 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 재조합 AAV는, 예를 들어, 정위 주사에 의한 것과 같은 당 분야에 공지된 신경외과 기술을 사용하여, 바늘, 카테터 또는 관련 장치로, 예를 들어, 심실 영역뿐만 아니라 선조체(예를 들어, 선조체의 꼬리핵 또는 조가비핵), 척수 및 신경근 접합부 또는 소뇌 소엽으로의 주사에 의해 CNS 또는 뇌로 직접 전달될 수 있다(예를 들어, Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; and Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000 참조).
일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 요추 척수강내 주사(LIT)에 의해 CNS에 투여된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 주사(예를 들어, 시상 주사)에 의해 뇌의 시상에 직접 투여된다. 일부 구체예에서, rAAV의 2회의 시상 주사가 양측에서 수행된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 주사에 의해 심부 소뇌핵(DCN)에 직접 투여된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 주사에 의해 시상 및 DCN 둘 모두에 양측에서 투여된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 뇌실내(ICV) 주사에 의해 직접 투여된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 주사에 의해 시상 및 ICV 둘 모두에 양측으로 투여된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 주사에 의해 DCN 및 ICV에 직접 투여된다.
일부 구체예에서, 본 개시에 기재된 바와 같은 rAAV는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 구체예에서, rAAV는 뇌내 주사에 의해 투여된다. 일부 구체예에서, rAAV는 척수강내 주사에 의해 투여된다. 일부 구체예에서, rAAV는 두개내 주사에 의해 전달된다. 일부 구체예에서, rAAV는 소뇌숨뇌수조 주사에 의해 전달된다. 일부 구체예에서, rAAV는 대뇌 외측 심실 주사에 의해 전달된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 형광 투시-유도 요추 척수강내 카테터를 통해 척추관에 투여된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 소뇌숨뇌수조 및 척수강내 공간(예를 들어, 척추관) 둘 모두에 투여된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 rAAV는 소뇌숨뇌수조, 척수강내 공간(예를 들어, 척추관) 및 시상(예를 들어, 시상내 주사에 의해)에 투여된다.
본 개시의 양태는 적어도 하나의 변형된 유전적 조절 서열 또는 요소를 포함하는 재조합 AAV를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 개시의 조성물은 rAAV를 단독으로 또는 하나 이상의 다른 바이러스(예를 들어, 하나 이상의 상이한 트랜스진을 갖는 제2 rAAV)와 조합하여 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 각각 하나 이상의 상이한 트랜스진을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 rAAV를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 HexA 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시는 HexB 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시는 HexA 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 rAAV 및 HexB 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 rAAV를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)에 관한 것이다.
약학적 조성물에서 HexA를 인코딩하는 rAAV:HexB를 인코딩하는 rAAV의 비는, 예를 들어, 약 1:10 내지 약 10:1로 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, HexA를 인코딩하는 rAAV:HexB를 인코딩하는 rAAV의 비는 1:1 비이다. 일부 구체예에서, HexA를 인코딩하는 rAAV:HexB를 인코딩하는 rAAV의 비는 1:2 비이다. 일부 구체예에서, HexA를 인코딩하는 rAAV:HexB를 인코딩하는 rAAV의 비는 1:5 비이다. 일부 구체예에서, HexA를 인코딩하는 rAAV:HexB를 인코딩하는 rAAV의 비는 1:10 비이다. 일부 구체예에서, HexA를 인코딩하는 rAAV:HexB를 인코딩하는 rAAV의 비는 2:1 비이다. 일부 구체예에서, HexA를 인코딩하는 rAAV:HexB를 인코딩하는 rAAV의 비는 5:1 비이다. 일부 구체예에서, HexA를 인코딩하는 rAAV:HexB를 인코딩하는 rAAV의 비는 10:1 비이다.
일부 구체예에서, HexB를 인코딩하는 rAAV:HexA를 인코딩하는 rAAV의 비는 1:2 비이다. 일부 구체예에서, HexB를 인코딩하는 rAAV:HexA를 인코딩하는 rAAV의 비는 1:5 비이다. 일부 구체예에서, HexB를 인코딩하는 rAAV:HexA를 인코딩하는 rAAV의 비는 1:10 비이다. 일부 구체예에서, HexB를 인코딩하는 rAAV:HexA를 인코딩하는 rAAV의 비는 2:1 비이다. 일부 구체예에서, HexB를 인코딩하는 rAAV:HexA를 인코딩하는 rAAV의 비는 5:1 비이다. 일부 구체예에서, HexB를 인코딩하는 rAAV:HexA를 인코딩하는 rAAV의 비는 10:1 비이다.
적합한 담체는 rAAV가 지시되는 적응증의 관점에서 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 담체는 다양한 완충 용액(예를 들어, 포스페이트 완충 염수)과 함께 제형화될 수 있는 염수를 포함한다. 다른 예시적인 담체는 멸균 염수, 락토스, 수크로스, 칼슘 포스페이트, 젤라틴, 덱스트란, 아가, 펙틴, 땅콩 오일, 참기름 및 물을 포함한다. 담체의 선택은 본 개시의 제한이 아니다.
선택적으로, 본 개시의 조성물은 rAAV 및 담체(들)에 추가하여, 보존제 또는 화학적 안정화제와 같은 다른 통상적인 약학적 성분을 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 포타슘 소르베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
rAAV는 요망되는 조직의 세포를 트랜스펙션시키고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약학적으로 허용되는 투여 경로는 선택된 장기로의 직접 전달(예를 들어, CNS로의 주사), 경구, 흡입(비내 및 기관내 전달 포함), 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내 및 다른 비경구 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 요망되는 경우 투여 경로를 조합할 수 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하는데 필요한 rAAV 비리온의 용량, 예를 들어, 게놈 복사체/체중 킬로그램(GC/kg)의 용량 단위는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 인자에 기초하여 달라질 것이다: rAAV 비리온 투여 경로, 치료 효과를 달성하는데 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료할 특정 질병 또는 장애, 및 유전자 또는 RNA 생성물의 안정성. 당업자는 전술한 인자뿐만 아니라 당 분야에 잘 알려진 다른 인자에 기초하여 특정 질병 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위해 rAAV 비리온 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
rAAV의 유효량은 동물을 감염시키고 요망되는 조직을 표적화하기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, rAAV의 유효량은 안정한 체세포 트랜스제닉 동물 모델을 생산하기에 충분한 양이다. 유효량은 주로 종, 연령, 체중, 대상체의 건강 및 표적화될 조직과 같은 인자에 의존할 것이며, 따라서 동물 및 조직에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, rAAV의 유효량은 일반적으로 약 106 내지 1016 게놈 복사체(예를 들어, 1 x 106 내지 1 x 1016 포함)를 함유하는 용액 약 1 ml 내지 약 100 ml의 범위이다. 일부 경우에, 약 1011 내지 1012 rAAV 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 약 1011 내지 1013 rAAV 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 약 1011 내지 1014 rAAV 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 약 1011 내지 1015 rAAV 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 약 1012 내지 1014 rAAV 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 약 1013 내지 1014 rAAV 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 체중 킬로그램(kg) 당 약 1 x 1012, 약 1.1 x 1012, 약 1.2 x 1012, 약 1.3 x 1012, 약 1.4 x 1012, 약 1.5 x 1012, 약 1.6 x 1012, 약 1.7 x 1012, 약 1.8 x 1012, 약 1.9 x 1012, 약 1 x 1013, 약 1.1 x 1013, 약 1.2 x 1013, 약 1.3 x 1013, 약 1.4 x 1013, 약 1.5 x 1013, 약 1.6 x 1013, 약 1.7 x 1013, 약 1.8 x 1013, 약 1.9 x 1013 또는 약 2.0 x 1014 벡터 게놈(vg) 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 약 4 x 1012 내지 2 x 1013 rAAV 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 4.68 x 107의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 4.68 x 108 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 4.68 x 109 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 1.17 x 1010 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 2.34 x 1010 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 3.20 x 1011 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 약 4.2 x 1012 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 1.2 x 1013 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 1.3 x 1013 게놈 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 1.5 x 1013 벡터 게놈(vg) 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 약 1 x 1014 벡터 게놈(vg) 복사체의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 정맥내 투여에 의한 약 1.5 x 1013 vg/kg의 투여량이 적절하다. 일부 구체예에서, 약 1x 1014 vg/뇌 중량 kg의 투여량이 적절하다. 특정 구체예에서, 1012-1013 rAAV 게놈 복사체는 리소좀 축적병과 관련된 조직, 예를 들어, 뇌 조직 또는 CNS 조직을 표적화하는데 효과적이다. 특정 구체예에서, 1013-1014 rAAV 게놈 복사체는 리소좀 축적병과 관련된 조직, 예를 들어, 뇌 조직 또는 CNS 조직을 표적화하는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 대상체에게 정맥내로 투여되는 rAAV의 용량은 체중 킬로그램(kg) 당 약 1011 내지 1014 rAAV 벡터 게놈(vg) 복사체이다. 일부 구체예에서, 정맥내로 전달되는 용량은 1 x 1011 내지 1 x 1014 vg/kg, 1 x 1012 내지 1 x 1014 vg/kg 또는 1 x 1013 내지 1 x 1014 vg/kg이다. 일부 구체예에서, 정맥내로 전달되는 용량은 약 1.2 x 1013 내지 1.8 x 1013 vg/kg이다. 일부 구체예에서, 정맥내로 전달되는 용량은 약 1.5 x 1013 vg/kg이다. 일부 구체예에서, 투여량의 투여는 뇌척수액(CSF)으로의 전달을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 투여량은 (i) 소뇌숨뇌수조 및/또는 척수강내 공간(예를 들어, 척추관)을 통한 주사에 의해 CSF로, 및/또는 (ii) 시상내 주사에 의해 시상으로 전달된다. 일부 구체예에서, 총 용량의 약 75%가 소뇌숨뇌수조에 전달된다. 일부 구체예에서, 총 용량의 약 25%가 척수강내 공간으로 전달된다. 일부 구체예에서, CSF로의 총 용량의 약 75%가 소뇌숨뇌수조로 전달된다. 일부 구체예에서, CSF로의 총 용량의 약 25%가 척수강내 공간으로 전달된다. 일부 경우에, 안정한 트랜스제닉 동물은 다중 용량의 rAAV에 의해 생산된다.
일부 구체예에서, 시상으로 전달되는 용량은 약 1 x 1011 내지 1 x 1014 vg, 1 x 1012 내지 1 x 1014 vg 또는 1 x 1012 내지 5 x 1013 vg이다. 일부 구체예에서, 시상으로 전달되는 용량은 약 2.8 x 1012 내지 1.1 x 1013 vg이다. 일부 구체예에서, 시상으로 전달되는 용량은 약 7.2 x 1012 내지 1.4 x 1013 vg이다.
일부 구체예에서, 시상으로 전달되는 부피는 약 0.5 mL 내지 약 1.5 mL, 약 .75 mL 내지 약 1.25 mL 또는 약 .8 mL 내지 약 1.2 mL이다.
일부 구체예에서, 소뇌숨뇌수조 및/또는 척수강내 공간(예를 들어, 척추관)으로 전달되는 용량은 1 x 1012 내지 1 x 1015 vg, 1 x 1013 내지 1 x 1015 vg 또는 1 x 1013 내지 1 x 1014 vg이다. 일부 구체예에서, 소뇌숨뇌수조 및/또는 척수강내 공간(예를 들어, 척추관)으로 전달되는 용량은 약 2.0 x 1013 내지 9.0 x 1013 vg이다. 일부 구체예에서, 척수강내 공간(예를 들어, 척추관)으로 전달되는 용량은 약 2.0 x 1013 내지 8.13 x 1013 vg이다.
일부 구체예에서, 척수강내 공간(예를 들어, 척추관)으로 전달되는 부피는 약 1 mL 내지 약 10 mL 또는 약 2 mL 내지 약 8 mL이다. 일부 구체예에서, 척수강내 공간(예를 들어, 척추관)으로 전달되는 부피는 약 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL 또는 8 mL이다.
일부 구체예에서, 대상체로의 전달(예를 들어, 대상체의 CSF, 척수강내 공간 및/또는 소뇌숨뇌수조)은 혈관내 마이크로카테터에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 1 x 1014 vg의 투여량이 혈관내 마이크로카테터를 통해 전달된다. 일부 구체예에서, 용량은 혈관내 마이크로카테터를 삽입하고, 수동적 흐름에 의해 대상체로부터 14 mL의 CSF를 제거하고, 이어서 대상체의 소뇌숨뇌수조 수준에서 대상체에게 9 mL의 rAAV를 약 1 mL/분으로 투여함으로써 전달된다. 일부 구체예에서, 대상체로의 전달은 요추 주입(예를 들어, 요추 영역의 척수강내 공간으로의 투여)에 의해, 예를 들어, 혈관내 마이크로카테터에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 전달은 대상체의 L2 영역으로의 요추 주입이다. 일부 구체예에서, 3 ml 부피의 rAAV 벡터가 대상체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 본 개시는 리소좀 축적병 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 rAAV 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 리소좀 축적병, 예를 들어, 테이 삭스병 또는 샌드호프병을 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체)에게 투여하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 대상체는, 예를 들어, MUG 또는 MUGS와 같은 인공 기질을 사용하여 측정시, 본원에 개시된 바와 같은 rAAV 또는 이를 포함하는 조성물의 투여 전에 대상체의 CSF에서 ≤ 1.0%, ≤ 0.5% 또는 ≤ 0.1%의 정상 β-헥사미니다제 A 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, 대상체는 영아 테이-삭스병을 갖는다. 일부 구체예에서, 대상체는 5-36개월령이다. 일부 구체예에서, 대상체는 12-36개월령이다. 일부 구체예에서, 대상체는 18-30개월령이다.
일부 양태에서, 본 개시는 AAV를 대상체에게 투여하기 위한 하나의 잠재적인 부작용이 염증을 포함하는 AAV에 대한 대상체에서의 면역 반응이라는 인식에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 rAAV의 투여 전에 면역억제된다.
본원에서 사용되는 "면역억제된" 또는 "면역억제"는 대상체에서 면역 반응의 활성화 또는 효능의 감소를 지칭한다. 리툭시맙, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 시롤리무스, 면역글로불린 주사, 프레드니손, 솔루-메드롤, 란소프라졸, 트리메토프림/설파메톡사졸, 메토트렉세이트 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상과 같은 다수)의 제제를 사용하여 대상체에서 면역억제가 유도될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역억제 요법은 시롤리무스, 프레드니솔론, 란소프라졸, 트리메토프림/설파메톡사졸 또는 이들의 임의의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시에 의해 기재된 방법은 대상체가 rAAV(예를 들어, 본 개시에 기재된 바와 같은 rAAV 또는 약학적 조성물)를 투여받기 전에 대상체에서 면역억제를 유도하는 단계(예를 들어, 하나 이상의 면역억제제 투여)를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 대상체에게 rAAV를 투여하기 약 30일 내지 약 0일 전에(예를 들어, rAAV의 투여까지 30일 사이의 임의의 시간) 면역억제된다(예를 들어, 대상체에서 면역억제가 유도된다). 일부 구체예에서, 대상체는 적어도 7일 동안 면역 억제(예를 들어, 리툭시맙, 시롤리무스 및/또는 프레드니손)로 전처리된다.
일부 구체예에서, 본 개시에 기재된 방법은 본 개시의 rAAV 또는 rAAV를 포함하는 약학적 조성물을 투여받은 대상체에게 제제의 공동-투여 또는 사전 투여를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 미글루스타트(Miglustat), 케프라(Keppra), 프레바시드(Prevacid), 클로나제팜(Clonazepam) 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 대상체의 면역억제는 rAAV 또는 약학적 조성물의 투여 동안 및/또는 후에 유지된다. 일부 구체예에서, 대상체는 rAAV 또는 약학적 조성물의 투여 후 1일 내지 1년 동안 면역억제된다(예를 들어, 하나 이상의 면역억제제가 투여된다).
일부 구체예에서, rAAV 조성물은 특히 높은 rAAV 농도가 존재하는 경우(예를 들어, 약 1013 GC/ml 이상), 조성물에서 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 제형화된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 계면활성제의 첨가, pH 조정, 염 농도 조정 등을 포함한다(예를 들어, Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다).
약학적으로 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형은 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 마찬가지로 당업자에게 잘 알려져 있다.
전형적으로, 이들 제형은 적어도 약 0.1% 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 물론 변할 수 있고 편리하게는 총 제형의 중량 또는 부피의 약 1 또는 2% 내지 약 70% 또는 80% 이상일 수 있다. 당연히, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 얻어지는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 저장 수명 및 다른 약리학적 고려 사항과 같은 인자가 그러한 약학적 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이며, 그에 따라 다양한 투여량 및 치료 요법이 요망될 수 있다.
특정 상황에서, 피하, 췌장내, 비내, 비경구, 정맥내, 근육내, 척수강내 또는 경구, 복강내, 또는 흡입에 의해 본원에 개시된 적합하게 제형화된 약학적 조성물에서 rAAV-기반 치료 작제물을 전달하는 것이 바람직할 것이다. 일부 구체예에서, 미국 특허 번호 5,543,158; 5,641,515 및 5,399,363(각각은 그 전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함됨)에 기재된 투여 방식을 사용하여 rAAV를 전달할 수 있다. 일부 구체예에서, 바람직한 투여 방식은 문맥 주사이다.
주사용으로 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건에서, 이러한 제조물은 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다. 많은 경우에, 형태는 멸균되고 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정적이어야 하고, 미생물, 예를 들어, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에서 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.
주사용 수용액의 투여를 위해, 예를 들어, 용액은 필요한 경우 적합하게 완충될 수 있으며, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 될 수 있다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고 1000 ml의 피하주입 유체에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주입할 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580 참조). 투여량의 약간의 변화는 숙주의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여 책임자는 모든 경우에 개별 숙주에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 본원에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 rAAV를 혼입한 후, 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 화합물 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 이의 이전의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 냉동-건조 기술이다.
본원에 개시된 rAAV 조성물은 또한 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(단백질의 자유 아미노기로 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한, 예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 하이드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다. 제형화시, 용액은 투여 제형과 양립 가능한 방식으로 그리고 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 주사용 용액, 약물-방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다.
본원에서 사용되는 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 그러한 매질 및 제제의 사용은 당 분야에 잘 공지되어 있다. 보충적 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약학적으로 허용되는"이라는 어구는 숙주에 투여될 때 알레르기성 또는 유사한 부작용을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다.
리포좀, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로스피어, 지질 입자, 소포 등과 같은 전달 비히클이 적합한 숙주 세포로의 본 개시의 조성물의 도입에 사용될 수 있다. 특히, 전달된 rAAV 벡터는 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노스피어 또는 나노입자 등에 캡슐화된 전달을 위해 제형화될 수 있다.
그러한 제형은 본원에 개시된 핵산 또는 rAAV 작제물의 약학적으로 허용되는 제형의 도입에 바람직할 수 있다. 리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 최근에, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖는 리포좀이 개발되었다(미국 특허 번호 5,741,516). 추가로, 잠재적인 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀 유사 제조물의 다양한 방법이 기술되었다(미국 특허 번호 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 및 5,795,587).
리포좀은 일반적으로 다른 절차에 의한 트랜스펙션에 내성이 있는 다수의 세포 유형과 함께 성공적으로 사용되었다. 또한, 리포좀은 바이러스-기반 전달 시스템에 전형적인 DNA 길이 제약이 없다. 리포좀은 다양한 배양된 세포주 및 동물에 유전자, 약물, 방사선 치료제, 바이러스, 전사 인자 및 알로스테릭 이펙터를 도입하기 위해 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀-매개 약물 전달의 효과를 조사하는 몇 가지 성공적인 임상 시험이 완료되었다.
리포좀은 수성 매질에 분산되어 자발적으로 다층 동심 이중층 소포(다층 소포(MLV)라고도 함)를 형성하는 인지질로부터 형성된다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파처리는 코어에 수용액을 함유하는 직경이 200 내지 500 Å인 작은 단층 소포(SUV)의 형성을 발생시킨다.
대안적으로, rAAV의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정적이고 재현 가능한 방식으로 물질을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 그러한 초미립자(약 0.1 μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 고려된다.
상기 기재된 전달 방법에 추가하여, 다음 기술이 또한 숙주에 rAAV 조성물을 전달하는 대안적인 방법으로서 고려된다. 초음파영동(예를 들어, 초음파)이 사용되었고 이는 순환계 내로 및 순환계를 통한 약물 투과의 속도 및 효능을 향상시키기 위한 장치로서 미국 특허 번호 5,656,016에 기재되어 있다. 고려되는 다른 약물 전달 대안은 골내 주사(미국 특허 번호 5,779,708), 마이크로칩 장치(미국 특허 번호 5,797,898), 안과 제형(Bourlais et al., 1998), 경피 매트릭스(미국 특허 번호 5,770,219 및 5,783,208) 및 피드백-제어 전달(미국 특허 번호 5,697,899)이다.
일부 구체예에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 또는 약학적 조성물을 투여받은 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제의 투여에 관한 것이다. 예를 들어, 효소 대체 요법(ERT)에서 감소된 효소 활성을 완화하기 위한 야생형 분리된 단백질의 투여는 고쉐병, 헌터 증후군, 파브리병, 폼페병, 마로토-라미 증후군, 모르키오 A 증후군 및 LAL 결핍을 포함하는 리소좀 축적병을 효과적으로 치료하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 일부 구체예에서, 대상체는 본 개시에 의해 기재된 바와 같은 rAAV 또는 약학적 조성물에 추가하여 하나 이상의 효소 대체 요법(ERT)을 투여받는다. ERT는 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Li (2018) Pediatr Ann. 47(5):e191-e197]에 기술되어 있다.
본원에 기재된 조성물은, 일부 구체예에서, 분리된 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 분리된 야생형 HexA 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 분리된 야생형 HexB 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 분리된 야생형 HexA 및 HexB 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 rAAV 및 분리된 야생형 HexA 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 rAAV 및 분리된 야생형 HexB 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 rAAV 및 분리된 야생형 HexA 및 HexB 단백질을 포함한다.
키트 및 관련 조성물
본원에 기재된 제제는, 일부 구체예에서, 치료, 진단 또는 연구 적용에서 이들의 사용을 용이하게 하기 위해 약학적 또는 진단적 또는 연구 키트로 어셈블링될 수 있다. 키트는 본 개시의 성분 및 사용 설명서를 수용하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 구체적으로, 그러한 키트는 의도된 적용 및 이들 제제의 적절한 사용을 설명하는 설명서와 함께 본원에 기재된 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 키트의 제제는 특정 적용 및 제제의 투여 방법에 적합한 약학적 제형 및 투여량일 수 있다. 연구 목적을 위한 키트는 다양한 실험을 실행하기 위해 적절한 농도 또는 양의 성분을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시는 rAAV를 생산하기 위한 키트에 관한 것으로, 키트는 SEQ ID NO: 1-6 또는 16-19 중 어느 하나의 서열을 갖는 분리된 핵산을 수용하는 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 rAAV를 생산하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 재조합 AAV 벡터를 수용하는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함하고, 여기서 재조합 AAV 벡터는 트랜스진을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시는 상기 기재된 바와 같은 재조합 AAV를 수용하는 용기를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 키트는 약학적으로 허용되는 담체를 수용하는 용기를 추가로 포함한다. 예를 들어, 키트는 rAAV를 수용하는 하나의 용기 및 대상체에게 rAAV를 주사하기에 적합한 완충제를 수용하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 용기는 주사기이다.
키트는 연구자들에 의해 본원에 기재된 방법의 사용을 용이하게 하도록 설계될 수 있고 많은 형태를 취할 수 있다. 키트의 각각의 조성물은, 적용 가능한 경우, 액체 형태(예를 들어, 용액) 또는 고체 형태(예를 들어, 건조 분말)로 제공될 수 있다. 특정 경우에, 조성물의 일부는, 예를 들어, 키트와 함께 제공되거나 제공되지 않을 수 있는 적합한 용매 또는 다른 종(예를 들어, 물 또는 세포 배양 배지)의 첨가에 의해 구성 가능하거나 달리 처리될 수 있다. 본원에서 사용되는 "설명서"는 설명 및/또는 프로모션의 구성요소를 정의할 수 있고, 전형적으로 본 개시의 패키징에 대한 또는 이와 관련된 서면 설명서를 포함한다. 설명서는 또한 사용자가 설명서가 키트와 연관되어야 한다는 것을 명확하게 인식할 수 있도록 하는 임의의 방식으로 제공된 모든 구두 또는 전자 설명서, 예를 들어, 시청각(예를 들어, 비디오테이프, DVD 등), 인터넷 및/또는 또는 웹-기반 통신 등을 포함할 수 있다. 서면 설명서는 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태일 수 있으며, 이는 또한 동물 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영할 수 있다.
키트는 하나 이상의 용기에 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 키트는 키트의 하나 이상의 성분을 혼합하고/하거나 샘플을 분리 및 혼합하고 대상체에게 적용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기재된 제제를 수용하는 용기를 포함할 수 있다. 제제는 액체, 겔 또는 고체(분말)의 형태일 수 있다. 제제는 멸균 상태로 제조되고, 주사기에 패키징되어, 냉장 운송될 수 있다. 대안적으로, 이것은 저장을 위해 바이알 또는 다른 용기에 수용될 수 있다. 제2 용기는 멸균 상태로 제조된 다른 제제를 가질 수 있다. 대안적으로 키트는 주사기, 바이알, 튜브 또는 다른 용기에 미리 혼합되고 운송되는 활성제를 포함할 수 있다. 키트는 특히 특정 체세포 동물 모델을 생산하기 위한 키트의 경우, 주사기, 국소 적용 장치 또는 iv 바늘 튜브 및 백과 같은 제제를 동물에게 투여하는데 필요한 하나 이상의 또는 모든 구성요소를 가질 수 있다.
일부 경우에, 상기 방법은 매우 낮은 풍부도의 프로바이러스 AAV 게놈을 잠재적으로 보유하는 조직으로부터 분리된 총 세포 DNA로 세포를 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포에서 AAV rep 및 cap 유전자 전사를 유발 및/또는 증진시키기 위해 헬퍼 바이러스 기능(예를 들어, 아데노바이러스)을 보충하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 트랜스펙션된 세포로부터의 RNA는 cDNA의 RT-PCR 증폭 및 신규 AAV의 검출을 위한 주형을 제공한다. 세포가 잠재적으로 프로바이러스 AAV 게놈을 보유하는 조직으로부터 분리된 총 세포 DNA로 트랜스펙션되는 경우, AAV 유전자 전사를 촉진하는 인자로 세포를 보충하는 것이 종종 바람직하다. 예를 들어, 세포는 또한 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염될 수 있다. 특정 구체예에서, 헬퍼 기능은 아데노바이러스에 의해 제공된다. 아데노바이러스는 야생형 아데노바이러스일 수 있고, 인간 또는 비인간 기원, 바람직하게는 비인간 영장류(NHP) 기원일 수 있다. 유사하게, 비인간 동물(예를 들어, 침팬지, 마우스)을 감염시키는 것으로 알려진 아데노바이러스가 또한 본 개시의 방법에 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 6,083,716 참조). 야생형 아데노바이러스에 추가하여, 필요한 헬퍼 기능을 운반하는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드, 에피솜 등)가 이용될 수 있다. 그러한 재조합 바이러스는 당 분야에 공지되어 있으며 공개된 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 Ad/AAV 바이러스를 기술하는 미국 특허 번호 5,871,982 및 미국 특허 번호 6,251,677 참조. 다양한 아데노바이러스 균주가 미국 미생물보존센터(American Type Culture Collection, Manassas, Va.)로부터 이용 가능하거나, 다양한 상업 및 기관 공급처로부터 요청에 의해 이용 가능하다. 추가로, 많은 그러한 균주의 서열은, 예를 들어, PubMed 및 GenBank를 포함하는 다양한 데이터베이스로부터 이용 가능하다.
세포는 또한 AAV에 헬퍼 기능을 제공하는 벡터(예를 들어, 헬퍼 벡터)로 트랜스펙션될 수 있다. 헬퍼 기능을 제공하는 벡터는, 예를 들어, E1a, E1b, E2a, E4ORF6을 포함하는 아데노바이러스 기능을 제공할 수 있다. 이러한 기능을 제공하는 아데노바이러스 유전자의 서열은 당 분야에 공지된 현재 확인된 인간 유형 중 임의의 유형을 추가로 포함하는 임의의 공지된 아데노바이러스 혈청형, 예를 들어, 혈청형 2, 3, 4, 7, 12 및 40으로부터 획득될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 방법은 AAV 복제, AAV 유전자 전사 및/또는 AAV 패키징에 필요한 하나 이상의 유전자를 발현하는 벡터로 세포를 트랜스펙션시키는 것을 포함한다.
일부 경우에, 유전자에 의해 인코딩된 신규 캡시드 단백질과 관련된 기능적 특징을 결정하기 위해, 당 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 재조합 AAV 벡터를 작제하고 패키징하기 위해 신규한 분리된 캡시드 유전자가 사용될 수 있다. 예를 들어, 신규한 분리된 캡시드 유전자는 리포터 유전자(예를 들어, B-갈락토시다제, GFP, 루시페라제 등)를 포함하는 재조합 AAV(rAAV) 벡터를 작제하고 패키징하는데 사용될 수 있다. 이후 rAAV 벡터는 동물(예를 들어, 마우스)에 전달될 수 있고, 신규한 분리된 캡시드 유전자의 조직 표적화 특성은 동물의 다양한 조직(예를 들어, 심장, 간, 신장)에서 리포터 유전자의 발현을 조사함으로써 결정될 수 있다. 신규한 분리된 캡시드 유전자를 특성화하기 위한 다른 방법이 본원에 개시되며 또 다른 방법이 당 분야에 잘 알려져 있다.
키트는 블리스터 파우치, 수축 포장된 파우치, 진공 밀봉 가능한 파우치, 밀봉 가능한 열성형 트레이, 또는 유사한 파우치 또는 트레이 형태와 같은 다양한 형태를 가질 수 있으며, 부속물은 파우치, 하나 이상의 튜브, 용기, 박스 또는 백 내에 느슨하게 패킹된다. 키트는 부속물이 추가된 후 멸균될 수 있으며, 이에 따라 용기 내의 개별 부속물이 달리 개봉될 수 있다. 키트는 방사선 멸균, 열 멸균, 또는 당 분야에 공지된 다른 멸균 방법과 같은 임의의 적절한 멸균 기술을 사용하여 멸균될 수 있다. 키트는 또한 특정 적용에 따라 다른 성분, 예를 들어, 용기, 세포 배지, 염, 완충제, 시약, 주사기, 바늘, 소독제를 바르거나 제거하기 위한 거즈와 같은 직물, 일회용 장갑, 투여 전 제제용 지지물 등을 포함할 수 있다.
키트에 포함된 설명서는 세포에서 잠복성 AAV를 검출하기 위한 방법을 포함할 수 있다. 또한, 본 개시의 키트는 설명서, 음성 및/또는 양성 대조군, 샘플을 위한 용기, 희석제 및 완충제, 샘플 제조 튜브 및 서열 비교를 위한 참조 AAV 서열의 인쇄된 또는 전자 표를 포함할 수 있다.
리소좀 축적병을 치료하는 방법
본 개시의 양태는 리소좀 축적병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 리소좀 축적병(LSD)은 리소좀에서 분해되지 않은 기질의 축적을 초래하는 상주 효소의 기능부전과 관련된 >50 장애의 부류이다. 시간 경과에 따라, 이러한 축적은 리소좀 기능부전으로 이어질 수 있으며, 이는 종종 세포 사멸을 초래하는 사건의 캐스케이드를 발생시킨다. 중추 신경계(CNS)가 관여하는 LSD는 질병 해결을 달성하기 위해 기능성 효소를 표적 세포에 전달하기 위해 혈액 뇌 장벽을 가로지르거나 우회하는 의도된 치료를 필요로 한다. 한 가지 치료적 전달 접근법은 AAV-매개 표적 유전자 전달이다.
본 개시의 일부 구체예에서, 리소좀 축적병은 일반적으로 치명적인 상염색체 열성 장애인 GM1 강글리오시드증이다. GM1 강글리오시드증(OMIM #230500)은 β-갈락토시다제 효소를 인코딩하는 GLB1 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 타입 I-III GM1 강글리오시드증은 잔류 β-gal 활성의 양 및 질병의 발병에 기초하여 기술되며, 타입 I은 영아기에 나타나고, 타입 II는 후기-영아기 또는 청소년기에 나타나고, 타입 III은 성인기에 나타난다. 일부 구체예에서, 본 개시는 타입 II GM1을 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체에게 투여하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 타입 II GM1 및 후기-영아기 발병 환자는 일반적으로 1세에서 3세 사이에 증상이 나타나며, 기대 수명은 5 내지 10년이다. 이들 대상체는 첫해에 발달 이정표를 충족하지만, 말하기 및 운동성과 같은 이전에 습득한 기술을 잃기 시작한다. 타입 II GM1 및 청소년기 발병 환자는 3세에서 10세 사이에 증상이 나타나며, 유사하게 말하기 및 운동성과 같은 이전에 습득한 기술의 퇴보를 보인다.
일부 구체예에서, GLB1은 인간(GeneID: 2720)이고 NM_000404.3, NM_001079811.2, NM_001135602.2 또는 NM_00137040.1에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, GLB1은 인간이고 NP_000395.2, NP_001073279.1, NP_00129074.1 또는 NP_001303969.1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, GLB1은 마우스 GLB1(Gene ID: 12091)이고 NM_009752.2에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, GLB1은 인간이고 NP_033882.1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, GLB1은 P10L, R59C, R59H, R121S, G123R, M132T, G134V, P136S, R148S, D151V, D151Y, 및/또는 리소좀에서 감소된 β-gal 활성과 관련된 GLB1의 임의의 다른 돌연변이와 같은 돌연변이를 포함한다(예를 들어, 열거된 바와 같이, 제공된 Uniprot-KB, P16278, 이의 내용은 그 전문이 본원에 포함됨).
일부 양태에서, 본 개시는 GM1 강글리오시드증을 치료하는 방법을 제공한다. GM1 강글리오시드증은 타입 I, 타입 II 또는 타입 III GM1 강글리오시드증일 수 있다. GM1 강글리오시드증은 결핍된 β-갈락토시다제(β-gal) 단백질 활성에 의해 야기되기 때문에, GM1 강글리오시드증을 치료하는 방법은 증가된 β-gal 활성을 제공한다. β-gal 활성을 증가시키는 방법의 비제한적인 예는 세포 또는 대상체에서 야생형 GLB1을 발현시키거나, 세포 또는 대상체에서 돌연변이체 GLB1 유전자의 발현을 감소시키거나, 세포 또는 대상체에게 야생형 GLB1 단백질을 제공하는 것을 포함한다(예를 들어, 효소 대체 요법). 일부 구체예에서, GM1은 GLB1(예를 들어, 야생형 GLB1)을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 분리된 핵산 또는 rAAV를 투여함으로써 치료될 수 있다. 일부 구체예에서, 트랜스진은 SEQ ID NO: 23에 제시된 야생형 GLB1 서열을 포함한다.
GM1 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 GLB1 활성은 본 개시의 방법을 수행함으로써 증가될 수 있다. GM1 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 GLB1 활성은 50%-500%만큼 증가될 수 있다. GM1 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 GLB1 활성은 적어도 50%만큼 증가될 수 있다. GM1 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 GLB1 활성은 적어도 500%만큼 증가될 수 있다. GM1 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 GLB1 활성은 100%-400%만큼 증가될 수 있다. GM1 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 GLB1 활성은 200%-500%만큼 증가될 수 있다. GM1 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 GLB1 활성은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% 또는 500%만큼 증가될 수 있다.
대상체에서 GM1 강글리오시드증을 치료하는 방법은 인간 GLB1을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 본 발명의 분리된 핵산, rAAV 또는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대상체는 인간, 마우스, 래트, 돼지, 개, 고양이 또는 비인간 영장류일 수 있다. 투여는 세포 또는 대상체를 본 개시의 분리된 핵산, rAAV 또는 조성물과 접촉시키는 것을 의미한다. 투여의 비제한적인 예는 정맥내 주사, 동맥내 주사, 두개내 주사, 척수강내 주사, 뇌내 주사, 주입 또는 흡입을 포함한다.
일부 구체예에서, 리소좀 축적병은 유전자 HEXA, HEXB 및 GM2A 중 적어도 하나의 돌연변이에 의해 야기되는 상염색체 열성인 테이 삭스병(GM2 강글리오시드증으로도 알려짐)이다. 테이 삭스병(TSD)(OMIM #272800)은 생후 2년 또는 3년에 발달 지체, 치매, 실명 및 사망과 같은 증상을 나타내는 유아, 청소년 또는 성인에서 나타나는 보편적으로 치명적인 장애이다. 3개의 효소 헥소사미니다제 A(HexA), 헥소사미니다제 B(HexB) 및 GM2 강글리오시드 활성제(GM2A) 모두의 야생형 수준은 GM2 강글리오시드의 분해에 필요하며, 이들 3개의 효소 중 어느 하나의 활성 감소는 리소좀에서 GM2 강글리오시드의 저장 증가와 관련이 있다. TSD 환자는 지질-함유 신경절 세포로 인해 망막의 중심와 주위에 회백색 영역을 발생시켜, 장애의 특징인 중앙 "앵두 반점"을 남긴다. 현재 TSD 환자를 위한 치료법은 없다.
본 개시의 일부 구체예에서, 리소좀 축적병은 HEXB 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 상염색체 열성 질환인 샌드호프병(GM2 강글리오시드증으로도 알려짐)이다. 샌드호프병(SD)(OMIM #268800)은 보편적으로 치명적인 장애이다. SD 환자는 전형적으로 생후 첫 6개월 동안 쇠약으로 발전한 다음, 과장된 놀람 반응, 조기 실명, 진행성 운동 및 정신 저하, 인형 같은 얼굴, 앵두 반점 및 대두증이 뒤따른다. 사망은 전형적으로 3세에 발생한다.
일부 구체예에서, HexA는 인간(GeneID: 3073)이고 NM_000520.5 또는 NM_001318825.1에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 HexA는 NP_000511.2 또는 NP_001305754.1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HexA는 마우스(GeneID: 15211)이고 NM_010421.5에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 마우스 HexA는 NP_034551.2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HexB는 인간(GeneID: 3074)이고 NM_000521.3 또는 NM_001292004.1에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 HexB는 NP_000512.1 또는 NP_001278933.1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, HexB는 마우스(GeneID: 15212)이고 NM_010422.2에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 마우스 HexB는 NP_034552.1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, GM2A는 인간(GeneID: 2760)이고 NM_000405.4 또는 NM_001167607.1에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 G2MA는 NP_000396.2 또는 NP_001161079.1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, GM2A는 마우스(GeneID: 14667)이고 NM_010299.3에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 마우스 GM2A는 NP_034429.1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시는 인간 GLB1, HexA 또는 HexB를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 분리된 핵산 및 재조합 AAV를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 개시는 마우스 GLB1, HexA 또는 HexB를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 분리된 핵산 및 재조합 AAV를 제공한다. 일부 구체예에서, GLB1, HexA 및/또는 HexB는 프로모터, 선택적으로 특정 조직에서 트랜스진의 발현을 유도하는 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 특정 조직은 CNS에 있다. 일부 구체예에서, 본 개시는 상기 기재된 분리된 핵산 또는 재조합 AAV를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 조성물이 투여되는 대상체는 GM1 강글리오시드증, 테이 삭스병 또는 샌드호프병을 포함하나 이에 제한되지 않는 리소좀 축적병을 갖거나 가질 것으로 의심된다.
일부 구체예에서, 대상체는 인간 HexA 및/또는 인간 HexB를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 본 개시의 rAAV 또는 약학적 조성물을 투여받으며, 여기서 대상체는 rAAV 또는 약학적 조성물의 투여 3개월 후에 정상 효소 활성의 적어도 0.5%, 적어도 1.0% 또는 적어도 1.4%인 CSF에서의 β-헥사미니다제 A 효소 활성의 증가를 갖는다. 일부 구체예에서, 효소 활성은 MUG 또는 MUGS와 같은 인공 기질을 사용하여 측정된다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간 HexA 및/또는 인간 HexB를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 본 개시의 rAAV 또는 약학적 조성물을 투여받으며, 여기서 대상체의 CSF에서 β-헥사미니다제 A 효소 활성은 투여 전 대상체의 기준선 효소 활성에 비해 3개월에 적어도 2배 또는 적어도 3배 증가된다. 일부 구체예에서, 대상체는 테이 삭스병(예를 들어, 영아기 테이 삭스병)으로 고통받는다.
일부 구체예에서, GM2 강글리오시드는 본 개시의 rAAV 또는 약학적 조성물의 투여 후 약 3개월까지 또는 약 3개월에 대상체의 뇌척수액(CSF)에서 기준선으로부터 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24% 또는 적어도 25%만큼 감소된다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 개시는 리소좀 축적병을 치료하는데 유용한 분리된 핵산, rAAV, 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 분리된 핵산, rAAV, 조성물 및 방법은 GM1 강글리오시드증의 치료를 위한 것이다. 일부 구체예에서, 분리된 핵산, rAAV, 조성물 및 방법은 테이 삭스병을 치료하는데 유용하다. 일부 구체예에서, 분리된 핵산, rAAV, 조성물 및 방법은 샌드호프병을 치료하는데 유용하다.
일부 양태에서, 본 개시는 GM2 강글리오시드증을 치료하는 방법을 제공한다. GM2 강글리오시드증은 테이 삭스병 또는 샌드호프병일 수 있다. GM2 강글리오시드증은 결핍된 HEXA 및/또는 결핍된 HEXB 효소 활성에 의해 야기되기 때문에, GM2 강글리오시드증을 치료하는 방법은 증가된 HEXA 및/또는 HEXB 활성을 제공한다. 활성을 증가시키는 방법의 비제한적인 예는 세포 또는 대상체에서 야생형 HEXA 또는 HEXB를 발현시키거나, 세포 또는 대상체에서 돌연변이체 HEXA 및/또는 HEXB 유전자의 발현을 감소시키거나, 세포 또는 대상체에게 야생형 HEXA 및/또는 HEXB 단백질을 제공하는 것을 포함한다(예를 들어, 효소 대체 요법). 일부 구체예에서, GM2는 HEXA 또는 HEXB를 인코딩하는 적어도 하나의 트랜스진(예를 들어, 야생형 HEXA 및/또는 HEXB)을 포함하는 분리된 핵산 또는 rAAV를 투여함으로써 치료될 수 있다. 일부 구체예에서, 트랜스진은 SEQ ID NO: 20에 제시된 야생형 HEXA 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 트랜스진은 SEQ ID NO: 21에 제시된 야생형 HEXB 서열을 포함한다.
GM2 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 HEXA 및/또는 HEXB 활성은 본 개시의 방법을 수행함으로써 증가될 수 있다. GM2 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 HEXA 및/또는 HEXB 활성은 50%-500%만큼 증가될 수 있다. GM2 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 HEXA 및/또는 HEXB 활성은 적어도 50%만큼 증가될 수 있다. GM2 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 HEXA 및/또는 HEXB 활성은 적어도 500%만큼 증가될 수 있다. GM2 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 HEXA 및/또는 HEXB 활성은 100%-400%만큼 증가될 수 있다. GM2 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 HEXA 및/또는 HEXB 활성은 200%-500%만큼 증가될 수 있다. GM2 강글리오시드증을 갖는 세포 또는 대상체에서 HEXA 및/또는 HEXB 활성은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% 또는 500%만큼 증가될 수 있다.
대상체에서 GM2 강글리오시드증을 치료하는 방법은 인간 HEXA 및/또는 HEXB를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 본 발명의 분리된 핵산, rAAV 또는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대상체는 인간, 마우스, 래트, 돼지, 개, 고양이 또는 비인간 영장류일 수 있다. 투여는 세포 또는 대상체를 본 개시의 분리된 핵산, rAAV 또는 조성물과 접촉시키는 것을 의미한다. 투여의 비제한적인 예는 정맥내 주사, 동맥내 주사, 두개내 주사, 척수강내 주사, 뇌내 주사, 주입 또는 흡입을 포함한다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
벡터 설계, 작제 및 바이러스 생성.
AAV 벡터(SEQ ID NO: 3)를 작제하였고, 이는 닭 베타-액틴 프로모터에 융합된 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 인핸서(CMV)로 구성된 프로모터에 이어 키메라 닭 베타-액틴/토끼 베타 글로빈 인트론(CBA), 마우스 리소좀 산 β-갈락토시다제 cDNA(mβgal), 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE), 및 소 성장 호르몬(BGH) 및 SV40으로부터 유래된 직렬 방식(in tandem)의 2개의 폴리A 신호에 의해 구동되는 발현 카세트를 갖는다. 이러한 벡터는 AAV-CBA-mβgal-WPRE로 언급된다. AAV-CBA-mβgalE269Q-WPRE는 다음 프라이머를 사용한 PCR 돌연변이유발에 의해 생성하였다: For 1: AAA CGT CTC ACT AGT CCG CGG AAT TC (SEQ ID NO: 7), Rev1: AAA CGT CTC ACT GAG AAT TGA TCA AA (SEQ ID NO: 8), For2: AAA GGT CTC CGG CCG CTA GCG TCA G (SEQ ID NO: 9), Rev2: AAA GGT CTC ATC AGT TCT ATA CTG GC (SEQ ID NO: 10). 생성된 PCR 생성물을 SpeI 및 Not I 제한 효소로 분해하고, 야생형 βgal cDNA 대신 클로닝하였다. 다른 모든 AAV 벡터는 AAV-CBA-mβgal-WPRE 벡터(SEQ ID NO: 3)로부터 상이한 요소를 제거하여 생성시켰다. 모든 AAVrh8 벡터 스톡은 표준 방법에 의해 생성시켰다.
동물 절차
GM1-강글리오시드증 마우스(βgal-/-), β-갈락토시다제 유전자, GLB1의 엑손 6에 네오마이신 카세트를 삽입하여 생성된 녹아웃 버전. βgal-/-, βgal+/- 및 βgal+/+ 마우스는 수컷 βgal-/- 및 암컷 βgal+/- 마우스 또는 βgal+/- 수컷 및 암컷의 교배에 의해 생성시켰다.
두개 내 주사
6 내지 8주령의 βgal-/- 또는 βgal+/- 마우스에 0.9% 식염수 중 케타민(125 mg/kg) 및 자일라진(12.5 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취시키고, 설치류 정위 프레임에 두었다. 절개 부위 주변의 털을 잘라 내고, 피부를 포비딘-요오드 패드 및 70% EtOH로 문질렀다. 두개골을 정중선을 따라 작은 세로 절개(< 1 cm)에 의해 노출시켰다. 멸균 면 팁 어플리케이터(sterile cotton tipped applicator)로 수술 부위로부터 골막을 제거하였다. 적절한 정위 좌표에서 고속 드릴을 사용하여 작은 버 홀(burr hole)(< 1 mm)을 만들었다. AAV 벡터 또는 PBS를 33G 바늘이 장착된 10 μl 기밀 유리 주사기를 구동하기 위해 울트라마이크로 펌프(Ultramicro Pump)를 사용하여 0.2 μl/분의 속도로 βgal-/- 또는 βgal+/- 마우스에 양측으로 1 μl를 시상으로(정위 좌표: 브레그마로부터 AP -2.0 mm, ML ± 1.5 mm; 뇌 표면으로부터 DV -3.5 mm) 그리고 βgal-/- 마우스에서 0.3 또는 1 μl를 심부 소뇌 핵(브레그마로부터의 AP -6.0 mm, ML ±1.5 mm; 뇌 표면으로부터 DV -3.5 mm)으로 주입하였다. 주입은 표적 구조에 바늘을 배치한 지 1분 후에 시작하였고, 주입 종료 2.5분 후에 천천히 회수하였다. 두피를 멸균 상처 클립(9 mm)으로 닫았다.
?P동 검정
로타로드(Rotarod) 시험은 5분에 걸쳐 4 내지 40 rpm으로 가속하는 로타로드 장치에서 수행하였고, 떨어지기까지 걸리는 시간(latency to fall)을 기록하였다. 시험은 세션 시작시 2 내지 20 rpm으로 가속하는 1분의 1회의 연습 시험에 이어 사이에 15-20분으로 휴지하면서 3회의 시험으로 수행하였다. 시험 세션에서 각각의 마우스에 대한 떨어지기까지 걸리는 시간을 기록하였고, 3개의 시험 중 로타로드에서 가장 긴 시간을 보고하였다.
조직 처리
βgal+/- 마우스에서의 생화학 연구를 위해, 뇌를 분리하고, 뇌 매트릭스를 사용하여 2 mm 관상 블록으로 슬라이스하고, 즉시 드라이아이스 상에서 동결시켰다. 시상을 함유하는 블록을 형태 및 등쪽 뇌 표면 상의 바늘 진입 지점의 존재에 의해 확인하였다. 2 mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 시상을 샘플링하고, 조직 플러그를 분석을 위해 적절한 완충액에 넣었다. 조직학적 연구를 위해, 뇌 및 척수를 분리하고, Neg 50 동결 배지에 넣고, 드라이아이스/2-메틸부탄 배쓰에서 동결시켰다. βgal-/- 마우스에서의 생화학적 연구를 위해, 대뇌, 소뇌 + 뇌간 및 척수를 분리하고, 즉시 드라이아이스에서 동결시켰다.
조직학적 분석
20 μm 뇌(시상 및 관상) 및 척수(횡) 섹션을 냉동미세절단기에서 절단하고, -80℃에서 저장하였다.
뇌 섹션을 X-gal로 염색하여 이전에 기재된 바와 같이 변형과 함께 βgal의 분포를 평가하였다. 간단히 말해서, 슬라이드를 PBS 중 0.5% 글루타르알데하이드에 고정시키고, 얼음 냉각된 시트레이트 포스페이트 완충액(CPB)(50mM C6H8O, 50mM Na2HPO4, 10mM NaCl, pH=4.2)에서 3회 세척하고, X-gal 염색 용액[HCON(CH3)2 중 20mM K4Fe(CN)6, 20mM K3Fe(CN)6, 2mM MgCl2, 0.01% C24H39NaO4, 0.02% (C2H4O)nC14H22O(IGEPAL CA-630, SigmaAldrich), 97% CPB @ pH=4.2, 2mg/ml 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시다제(X-gal)]에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 슬라이드를 CPB 및 이후 물에서 헹구고, Vector Nuclear Fast Red로 대조염색하고, 일련의 에탄올 50%-100%를 통해 탈수시키고, CitriSolv로 청소하고, Permount로 마운팅하였다.
뇌 및 척수 섹션을 필리핀(Filipin)으로 염색하여 이전에 기재된 바와 같이 변형과 함께 리소좀 저장을 평가하였다. 간단히 말해서, 슬라이드를 인산염 완충 식염수(PBS) 중 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고, PBS로 세척하고, 물 중 1.5% 글리신과 함께 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, 1-2시간 동안 100 μg/ml의 필리핀 및 1 μg/ml의 ToPro3 요오다이드(Life Technologies, Grand Island, NY)와 함께 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, 형광 마운팅 매질인 PermaFluor로 마운팅하였다.
뇌 섹션을 메이어 헤마톡실린 및 에오신(Mayer's Hematoxylin and Eosin)으로 염색하여 조직의 형태학적 변화를 평가하였다. 간단히 말해서, 슬라이드를 실온에서 건조시키고, 인산염 완충 식염수(PBS) 중 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고, 물로 세척하고, 메이어 헤마톡실린과 함께 인큐베이션하고, 흐르는 수돗물에서 세척하고, 에오신으로 대조염색하고, 탈이온수로 헹구고, 일련의 에탄올 50%-100%를 통해 탈수시키고, CitriSolv로 청소하고, Permount로 마운팅하였다.
의료용 슬라이드 홀더가 있는 Nikon Super CoolScan 5000 ED에서 백색광을 사용하여 전체 뇌 슬라이스 이미지를 포착하였다. 현미경 이미지를 Leica DFC425 C 및 DFC365 FX 디지털 카메라가 장착된 Leica DM550 B 현미경으로 포착하였다. 필리핀을 405 nm에서 그리고 ToPro3 요오다이드를 636 nm에서 이미지화하였다. H&E를 명시야를 사용하여 이미지화하였다.
모든 조직학적 분석을 N ≥ 2-3 동물에 대한 비-맹검 정성 분석으로 수행하였으며, 대표적 그림은 도면에 제시되어 있다.
βgal 효소 검정 및 면역블로팅
생검 펀치를 용해 완충액(0.2M CH3COONa, 0.1M NaCl, pH 4.3 중 0.1% Triton X-100)에서 균질화하고, βgal 효소 활성에 대해 검정하였다. 간단히 말해서, βgal 기질 = 1mM 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시드(4-MUG)과의 반응을 96-웰 플레이트 형식으로 수행하고, 방출된 4-메틸움벨리페릴(4-MU)의 양을 BioTek Synergy HT 플레이트 판독기를 사용하여 360 nm에서의 여기 및 460nm에서의 방출에 의한 형광 검출과 함께 표준 곡선에 대해 측정하였다. 효소 활성은 브래드포드(Bradford) 검정에 의해 결정된 바와 같이 단백질 함량으로 표준화하였고, (전환된 기질의)nmol/시간/mg 단백질로 보고하였다. 면역블로팅 주사 부위의 경우, 생검 펀치를 Complete Mini 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 T-PER 완충액에서 균질화하고, 10분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후, 5분 동안 10,000 x g에서 원심분리하였다. 상층액을 수집하고, 단백질 농도를 브래드포드 검정을 사용하여 결정하였다. Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 젤을 사용하여 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 전체 단백질(20 μg)을 분리하고, 단백질을 NitroPure 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 5% 무지방 우유와 함께 Tris-완충 식염수-Tween-20(TBST)에서 블롯을 차단한 후, α-토끼 GLB1(β-갈락토시다제 항체)(1:250) 및 α-마우스 β-액틴(1:1000)에 대한 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. HRP-컨쥬게이션된 항-토끼 및 항-마우스 이차 항체를 사용하였고(1:4000), 신호 검출을 Pierce ECL 웨스턴 블로팅 기질 및 Amersham Hyperfilm ECL에 노출된 블롯으로 수행하였다.
유전체 카피
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit를 사용하여 주사 부위 생검 펀치로부터의 유전체 DNA를 분리하고, 농도를 Nanodrop 분광광도계를 사용하여 결정하였다. 100 ng의 유전체 DNA에서 AAV 벡터 유전체 카피의 수를 벡터 유전체에서 BGH 폴리A에 특이적인 다음 프라이머 및 Taqman 프로브를 사용하여 qPCR에 의해 결정하였다: (TaqMan 프로브, 6FAM- AGC ATT TTT TTC ACT GCA TTC TAG TTG TGG TTT GTC -TAMRA SEQ ID NO: 11). DNA μg 당 ≥ 100 vg 유전체 카피를 갖는 샘플은 벡터 유전체에 대해 양성인 것으로 간주되었다.
마이크로어레이
Trizol을 사용하여 생검 펀치로부터 전체 RNA를 분리하고, RNeasy Plus Mini Kit를 사용하여 추가로 정제하고, Agilent Bioanalyzer에서 이의 품질을 분석하였다. Bioanalyzer RNA 온전성 번호(RIN) 값은 8.7-9.5였으며, 이는 고품질 RNA를 나타낸다. 샘플 제조 및 마이크로어레이 하이브리드화를 Affymetrix Mouse Gene 2.0ST Array를 사용하여 수행하였다. 그룹 당 3개의 독립적인 샘플을 분석하였다. 결과로서 발생된 데이터를 처리하고, P 값 <0.05 및 PBS 대조군에 대한 1.5배 변화를 차별적으로 발현된 유전자로 간주하였다.
GM1 강글리오시드 함량의 정량화
CNS의 GM1 함량을 액체 크로마토그래피 직렬 질량 분광법(LC-MS/MS)에 의해 정량화하였다. 간단히 말해서, 25 ul의 0.01-0.04mg/μl 조직을 pH=4.3의 0.1M NaCl, 0.2M CH3COONa에서 균질화하고, 내부 표준 3μg의 d3-GM1을 첨가하고, 변형된 Folch 추출을 통해 강글리오시드를 분리하였다. 이후, 샘플을 C18 컬럼을 통해 실행시키고, 건조시키고, 실행 완충액에서 재구성한 후, LC-MS/MS, Waters Quattro Premier XE를 통해 처리하였다. 샘플을 290의 질량/전하 비율(m/z)로 분리하고, 지방산 조성이 상이한 각각의 GM1 종을 정량화하였다. GM1 함량을 d3-GM1에 대한 모든 종의 합계의 비율을 계산하여 결정하고, 표준 곡선으로부터 정제된 GM1/d3-GM1의 비율에 대해 플로팅하였다. 브래드포드 검정에 의해 결정된 초기 용해질 내의 단백질 함량에 대해 샘플을 표준화하고, ng GM1/μg 단백질로 보고하였다.
예시적 작제물
인간 GLB1 유전자를 인코딩하는 재조합 AAV 벡터(rAAV9hGLB1)를 생성시켰다(SEQ ID NO: 23). 이는 복제 결핍 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 벡터이다. 단일 가닥 DNA 유전체는 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자 부위를 함유하는 토끼 β-글로빈 인트론과 함께 닭 β-액틴 프로모터에 융합된 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 인핸서에 의해 구동되는 인간 β-갈락토시다제(βgal) cDNA로 구성된 발현 카세트가 측면에 있는 AAV2로부터의 역 말단 반복으로 구성된다. 작제물은 또한 원숭이 바이러스 40으로부터의 아데닐중합체형성 신호를 함유한다. 유전체는 인간 유래 AAV(Gao 2004)인 AAV 혈청형 9의 캡시드 내에 패키징된다(도 1B). 정맥 내 전달을 위해 완충된 수성 현탁액으로 제형화된다.
C57BL/6 마우스에 PBS(대조군), 또는 CAG 프로모터의 작동 제어 하에 있는 AAV9-hGLB1을 주사하였다(도 1B). 처리되는 마우스에 2.25 x 1011 vg AAV9-hGLB1을 투여하였다. 각각의 코호트(n=5)는 처리 후 7일, 30일 및 30개월 후에 안락사시켰다. Β-갈락토시다제 효소 활성을 β-갈락토시다제에 의한 절단시 형광을 나타내는 형광성 기질 β-4-메틸움벨리페론(4-MU)을 사용하여 샘플로부터 측정하였다. β-갈락토시다제 활성의 증가는 PBS-주사 대조군 마우스에 비해 AAV9-hGLB1 처리 그룹에서 관찰되었다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 2
뇌에서의 βgal의 AAV 용량 의존적 분포
AAVrh8-CBA-mβgal-WPRE 벡터(도 1 및 20)를 4e10vg, 2.6e10vg 및 2.6e9vg의 전체 용량으로 시상 및 심부 소뇌 핵에 양측 주사함으로써 6-8주령 GM1 강글리오시드증 마우스(βgal-/-)의 뇌에 주입하였다. 가장 높은 용량 코호트의 동물은 시상 및 DCN에서 1 μl의 양측 주사를 투여받은 반면, 다른 2개의 코호트의 동물은 시상에서 1 μl 및 DCN에서 0.3 μl를 투여받았다. 주사 후 3개월에 뇌에서 βgal 분포 패턴은 주사 부위에서 βgal 활성의 가장 높은 강도와 함께 용량 의존적인 것으로 보였다(도 2). 가장 높은 용량(4e10vg)은 대뇌(도 2A) 및 소뇌(도 2B)의 많은 섹션에 걸쳐 효소 활성을 제공하였다. 중간 용량, 2.6e10vg는 대뇌(도 2E)에서 유사한 수준의 활성을 가졌고, 소뇌(도 2F)는 약간 더 적은 활성을 제공하지만 여전히 구조 전체에 걸쳐 효소의 확산을 제공하는 것으로 보였다. 저용량, 2.6e9vg는 대뇌 및 소뇌 둘 모두에서 덜 확산하였다(도 2I 및 2J 각각).
AAV 처리된 동물은 용량 의존적 방식으로 운동 기능을 유지한다.
AAVrh8-처리된 마우스의 운동 기능은 로타로드 시험을 사용하여 시간이 지남에 따라 평가하였다(도 3). AAVrh8-처리된 βgal-/-의 모든 코호트는 처리 후 6개월 시점에 처리되지 않은 βgal-/- 대조군보다 유의하게 더 잘 수행하였다(고용량 4e10vg p = 0.006, 중간 용량 2.6e10vg p = 0.0009, 및 저용량 2.6e9vg p = 0.005). N = 처리 6개월 후 6-10마리의 동물/그룹.
실시예 3
AAV 처리는 수명을 연장시킨다.
AAVrh8-처리된 βgal-/- 마우스의 수명은 나이브 βgal-/- 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(도 4). 나이브 βgal-/- 대조군에 대한 중앙값 생존은 245.5일(N=18), 4e10vg 코호트의 경우 293.5일(N=12, p=0.0004), 2.6e10vg 코호트의 경우 349일(N=13, p=0.002) 및 2.6e9vg 코호트의 경우 389일(N=12, p < 0.0001)이었다.
GM1-강글리오시드 저장은 수명이 긴 AAV 처리 동물의 주사 부위 및 척수에서 지속된다.
주사 후 3개월에 동물의 CNS에서 필리핀 염색에 의한 리소좀 저장의 조직학적 분석은 동일한 시점에 Xgal 염색에서 관찰되는 바와 같이 효소 존재에 상응하는 뇌 및 소뇌에서 거의 완전한 교정을 나타내었다(도 2). 놀랍게도, 필리핀-양성 세포는 주사 부위에서 또는 주사 트랙을 따라서만 발견되었다(도 5C, 5E).
AAVrh8-주사된 βgal-/- 마우스의 시상에서 필리핀-양성 세포의 존재는 이것이 또한 높은 βgal 효소 활성의 반-정량적 지표인 뇌에서 가장 강렬한 X-gal 조직화학 염색(도 5A, 박스)을 나타내는 뇌 영역이기 때문에 놀랍다. 수명이 긴 AAV 처리된 마우스(495-612일)의 척수에서, 리소좀 저장에 대한 영향은 매우 적은 수의 필리핀-양성 세포가 남아 있는 영역에서 처리되지 않은 βgal-/- 대조군에 비해 명백한 변화가 없는 영역까지 다양하였다(각각 도 6A, 6D, 6F, 및 6B, 6C, 6E).
실시예 4
주사 부위의 신경병리학
동물을 초기 손실 후 또는 주사 후 3개월에 헤마톡실린 & 에오신(H&E)으로 조직학적으로 평가하였다. 이들 동물은 용량과 상관 관계가 있는 주사 부위에서 형태학적 변화를 갖는 것으로 밝혀졌다. 주사 2주 후 βgal-/- + AAV 4e10vg는 시상에서 혈관 커핑(cuffing) 및 염증의 출현(각각 도 7A, 7B, 두꺼운 화살표 및 얇은 화살표)과 같은 많은 양의 변화, 및 DCN에서 혈관 커핑 및 겉보기 신경 탐식(engulfment)(각각 도 8A, 두꺼운 화살표 및 8B, 화살표 머리)을 나타내었다. 처리 3개월 후 βgal-/- + AAV 2e10vg에서, 시상 변화가 또한 혈관 커핑 및 염증과 함께 관찰되었다(각각 도 7E, 7F, 두꺼운 화살표 및 얇은 화살표). 그러나, DCN에서 βgal-/- + AAV 2e10vg 용량은 더 적은 혈관 커핑만 가졌다(도 8E, 두꺼운 화살표). 가장 낮은 용량의 대표적 동물에서, 주사 후 3개월에 βgal-/- + AAV 2e9vg는 시상에서 단지 매우 최소의 염증이 관찰되었고(도 7J, 얇은 화살표), 이러한 효과는 DCN에서 부재하였다(도 8I, 8J). 처리되지 않은 βgal-/- 대조군(도 7C, 7D 및 도 8C, 8D) 또는 처리되지 않은 βgal+/- 대조군(도 7G, 7H 및 도 8G, 8H)에서는 혈관 커핑 또는 염증이 관찰되지 않았다.
높은 수준의 βgal은 주사된 뇌 구조에서 예기치 않은 반응을 유도한다.
주사 부위에서 필리핀-양성 세포의 역설적 존재(도 5C, 5E)는 βgal-/- 마우스에서 AAV 유전자 전달에 대한 예기치 않은 반응의 결과일 수 있다. 이러한 현상을 이해하기 위해, 정상의 영향을 받지 않은 βgal+/- 한배새끼에게 AAVrh8 벡터를 두개 내 주사하였다. βgal-/- 마우스(도 5C, 5E)의 결과와 유사하게, 많은 수의 필리핀-양성 세포가 AAVrh8-주사된 βgal+/- 마우스(도 9D, 9G, 9J)에서 가장 높은 βgal 염색 강도(도 9A, 9B)를 갖는 뇌 영역에 존재하였다. 이러한 결과는 표적화된 뇌 구조에서 필리핀-양성 세포의 존재가 AAV 유전자 전달의 양태에 대한 예기치 않은 역반응임을 나타낸다.
실시예 5
필리핀-검출된 반응에 대한 효소 활성, 단백질 수준, 및 AAVrh8 캡시드의 기여를 평가하기 위한 AAVrh8 벡터 시리즈의 검증
일련의 AAVrh8 벡터는 주사 부위에서 예기치 않은 반응의 특성을 연구하기 위해 설계되었다(표 1). 설계된 추가 벡터는 도 19에 제시되어 있다. 이러한 일련의 AAVrh8은 원래 벡터인 AAVrh8-CBA-mβgal-WPRE(여기서부터는 'CBA-WPRE'로 언급될 것임)에서 트랜스진 발현 수준에 영향을 미치는 요소의 순차적 제거로 구성되었다. 벡터 2 'CBA'에서, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)가 제거되었다. 벡터 3 'CBA-EI-WPRE'는 벡터 1과 정확히 동일한 백본을 갖지만, 추정 활성 부위에 E269Q 돌연변이를 갖는 βgal 단백질을 인코딩한다. 이러한 벡터는 관찰된 반응이 효소적 활성 또는 단백질 생성에 의해 야기된 것인지 평가하기 위해 설계되었다. 벡터 4 'CB6'은 mβgal cDNA를 함유하지만, 다른 벡터에 존재하는 WPRE 또는 키메라 인트론을 갖지 않았다. 이러한 벡터는 'CB6 Low'(다른 모든 벡터와 동일한 용량) 및 'CB6 High'(2.0e10vg)의 2개의 용량으로 시험하였다. 벡터 5 '트랜스진 비어 있음(transgene empty)' 또는 'T. Empty'는 벡터 1의 모든 성분을 함유하지만, mβgal cDNA가 결여되었다.
더 높은 용량(2.0e10vg의 전체 용량에 대해 1 μl/부위)으로 또한 주사된 CB6 벡터를 제외하고 새로 작제된 AAVrh8 벡터를 정상 βgal+/- 마우스의 시상에 양측으로 주사(3.4e9vg의 전체 용량에 대해 1 μl/부위)하였다. 대조군은 인산염 완충 식염수(PBS)가 주사된 βgal+/- 마우스 및 나이브 βgal+/- 마우스였다. 시상에서 효소 활성 및 단백질 생성을 주사 후 6주에 4-메틸움벨리페릴(4-MU) 생화학 검정 및 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다(도 10).
표 1: 저장 바이오마커 필리핀 지속성을 평가하기 위해 설계된 벡터의 변경 목록
Figure pct00001
CBA-WPRE 벡터는 나이브 βgal+/- 마우스의 시상에서의 것보다 686배 높은 가장 높은 효소 활성(도 10A), 및 단백질에서 상응하는 증가(도 10B, 레인 1)를 발생시켰다. CBA 벡터는 CBA-WPRE 벡터(도 10A, p=0.001)로 획득된 것보다 유의하게 낮은 βgal+/- 수준에 비해 224배의 βgal 활성 및 단백질 생성물에서의 명백한 상응하는 감소(도 10B, 레인 2)를 발생시켰다. CBA-EI-WPRE 벡터가 주사된 마우스의 시상에서, βgal 활성은 나이브 대조군 마우스에서의 것과 유사했지만(도 10A), 단백질은 CBA-WPRE 주사된 시상에서의 것과 유사한 수준으로 발현되었다(도 10B, 레인 3 대 레인 1). 따라서, E269Q 돌연변이는 효소 활성을 폐지하지만, 단백질 발현 수준에는 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 다른 벡터(CB6-Low)와 동일한 용량의 CB6 벡터의 주사는 βgal+/- 수준에 비해 54배 높은 βgal 활성(도 4A), 및 다른 벡터를 이용한 것에 비해 상응하는 더 낮은 양의 단백질 존재(도 10B, 레인 4)를 발생시켰다. 더 높은 용량(CB6-High)에서의 이러한 벡터의 주사는 βgal+/- 수준보다 420배 더 높은 βgal 활성을 발생시켰으며, 이는 CB6-Low 코호트에서보다 유의하게 더 높다(도 10A, 10b, p = 0.03). CB6-High 코호트에서 βgal 활성 수준은 CBA-WPRE 코호트에서 측정된 것과 유사하였고, 단백질 수준에서 유사하게 보였다(도 10A, 10b, 레인 1 대 레인 5). 트랜스진 비어 있음 벡터(T. Empty) 또는 PBS가 주사된 동물의 시상은 나이브 βgal+/- 수준과 비교하여 βgal 활성 또는 단백질 수준의 변화를 나타내지 않았다(도 10A, 10b). AAV 주사된 시상에서의 벡터 유전체 카피의 수는 T.empty 코호트를 제외하고는 3.4e9 vg의 전체 용량으로 주사된 대부분의 코호트에서 유사한 것으로 나타났다(도 11). 예상된 바와 같이, 2.0e10 vg가 주입된 CB6-High 코호트는 유의하게 증가된 수의 벡터 유전체 카피를 나타내었다(도 11).
필리핀이 검출된 반응은 단백질 수준과 관련이 있다.
AAVrh8 주사 및 대조군 βgal+/- 마우스의 뇌를 Xgal 염색에 의해 βgal 효소 활성에 대해(도 12A, 12D, 12G, 12J, 12M, 12P, 12S) 및 시상에서 필리핀-양성 세포의 존재 또는 부재(도 12B, 12E, 12H, 12K, 12N, 12Q, 12T)에 대해 분석하였다. 가장 강렬한 βgal 염색(도 11A, 11D)을 갖는 시상 영역은 또한 후자 코호트에서 명백히 낮은 수(도 11B, 11E)이지만 CBA-WPRE 및 CBA 주사된 동물에서 필리핀-양성 세포를 함유하였다(도 11A, 11D). CBA-EI-WPRE 코호트의 시상은 많은 수의 필리핀-양성 세포를 가졌지만, 활성 βgal 효소는 없었다(각각 도 11K, 11J). 유사한 필리핀 염색은 T-empty 및 CB6-low 코호트의 시상에서 명백했지만(도 11K, 11Q), 이는 CBA-WPRE 및 CBA-EI-WPRE 코호트에서 관찰된 패턴과 구별되는 작은 점으로 나타났다. 필리핀 염색은 또한 CB6-High 코호트의 시상에서 관찰되었고, 패턴은 CBA-WPRE 및 CB6-Low 코호트에서 관찰된 것의 혼합으로 나타났다(도 11H). 이들 결과는 주사 부위의 비정상적인 필리핀 축적이 효소 활성이 아니라 단백질 발현 수준과 관련이 있음을 나타낸다.
주사된 시상의 전사체적 변화는 필리핀이 검출된 비정상 반응과 관련이 있다.
유전자 전달에 의해 유도된 생리학적 변화에 대한 조직 반응을 추가로 특성규명하기 위해 시상에서 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 전체 시상 RNA를 CBA-mβgal-WPRE, CB6-Low, T.Empty 및 PBS-주사된 코호트로부터 분리하였다. 분석된 모든 샘플에 대한 전사체적 변화(배수 변화 > 1.8배, p<0.05)는 열 지도에 표시된다(도 13A). CB6-low 및 T.Empty 샘플은 PBS와 함께 클러스터링되며, CBA-WPRE 샘플과 상이하다. 발현 수준에서 >2배 변화(p<0.05)를 갖는 유전자의 수는 몇몇 중복 유전자를 갖는 CB6 및 T.Empty에 비해 CBA-WPRE 샘플에서 상당히 더 크다(도 13B). CBA-WPRE 샘플에서 상향 조절된 다수의 유전자는 활성화된 미세아교세포 및 반응성 별아교세포의 특징이다(표 2). 이들 유전자 중 어느 것도 CB6 또는 T.Empty 샘플에서 유의한 변화를 나타내지 않았다.
표 2: CBA-WPRE 벡터의 마이크로어레이 분석에서 상향 조절된 유전자 선택. 배수 변경은 PBS에 대한 CBA-WPRE 벡터이다.
Figure pct00002
실시예 6
GM1-강글리오시드증 마우스에서 상이한 AAVrh8 벡터의 치료적 영향
상기 βgal+/- 마우스에서 수행된 연구로부터, 트랜스진으로부터의 감소된 단백질 발현이 주사된 구조에서 병리학적 전사 수준 변화를 감소시킬 수 있다는 상관관계가 결정되었다. 이후, AAV 벡터 설계의 변화가 GM1-강글리오시드증 마우스(βgal-/-)에서 치료 결과의 차이로 번역되었는지의 여부를 조사하였다. 6 내지 8주령의 βgal-/- 마우스에 시상(1 μl/측면) 및 심부 소뇌 핵(0.3 μl/측면)에 AAV 벡터를 양측 주사하였고, 결과는 주사 후 약 6주에 측정하였다. 연구 코호트는 4.4e9vg의 전체 용량으로 투여된 CBA-WPRE, CB6(CB6-Low) 및 트랜스진 비어 있음 벡터가 주사된 βgal-/- 마우스였다. 또한, CB6는 2.6e10vg(CB6-High)의 전체 용량을 주사하였다. 나이브의 미처리 βgal-/-및 βgal+/+ 동물을 대조군으로 사용하였다. CNS의 4-MU 검정에 의한 βgal 활성의 평가(도 14)는 대뇌에서 CBA-WPRE가 야생형 수준보다 45배 높고(도 14), 여기서 CB6 Low는 9배 더 높고(도 14), CB6 High는 30배 더 높은(도 14) 것을 나타내었다. 예상된 바와 같이 βgal-/- 마우스의 T.Empty 및 미처리 코호트는 분석된 임의의 CNS 영역에서 검출 가능한 βgal 활성을 갖지 않았다(도 14). 소뇌 + 뇌간에서, 경향은 동일하였으며, 야생형 수준보다 CBA-WPRE는 47배(도 14), CB6-Low는 6배(도 14), CB6-High는 27배 더 높았다(도 14). 흥미롭게도, 척수에서 CBA-WPRE는 야생형 수준의 단지 50%였고(도 14), CB6-High는 30%였고(도 14), CB6-Low는 검출 가능한 활성을 갖지 않았다(도 14). 분석된 모든 CNS 조직에서, CB6-High는 더 낮은 용량 CB6-Low로 주사된 동일한 벡터보다 βgal 활성에서 유의하게 더 높았다(p < 0.001).
조직학적 염색 X-gal에 의해 입증된 바와 같은 뇌에서의 βgal 분포 패턴(도 15)은 4-Mu 검정에 의해 결정된 대뇌 또는 소뇌 + 뇌간에서의 활성 수준과 상관 관계가 있었다(도 14). CBA-WPRE 벡터는 시상 및 DCN에서 진한 청색 염색 및 뇌 전체에 걸친 검출 가능한 효소 활성의 광범위한 분포를 발생시켰다(도 15A). 대조적으로, CB6-Low 코호트(도 15B)에서, 시상 및 DCN에서 강렬한 염색이 있었지만, 대뇌, 소뇌 또는 뇌간 전체에 걸쳐 더 낮은 검출 가능한 수준이 있었다. CB6-High 동물에서, 뇌에서의 βgal 분포 패턴은 CB6-Low 동물에서보다 더 넓게 나타났다(도 15C). 예상된 바와 같이, T.Empty(도 15D) 및 나이브 βgal-/- 마우스 코호트(도 15E)에서 증가된 βgal 활성의 증거는 없었다.
필리핀 염색을 사용하여 뇌 및 척수에서 리소좀 저장의 조직학적 분석(도 16)은 상기 기재된 βgal 활성(도 14) 및 분포 패턴(도 15)과 상관 관계가 있었다. CBA-WPRE 주사된 동물에서, 주사 부위 및 배쪽 해마 및 시상 전체에 걸친 필리핀 양성 세포를 사용한 추적(도 16; 1행, 4열)을 제외하고는 뇌 전체에 걸쳐 저장의 거의 완전한 청소가 있었다(도 16). CB6-Low 코호트에서의 저장 청소는 필리핀-양성 세포가 여전히 전방 피질, 선조체 및 뇌간에 존재하기 때문에(도 16; 2열, 2, 5, 7행 각각) 덜 효율적으로 보였다(도 16; 2열). 더 높은 용량(CB6-High)에서, CB6 벡터의 효율은 뇌 전체에 걸쳐 리소좀 저장의 분해능과 함께 매우 높았다(도 16; 3열). 이전과 마찬가지로, 필리핀-양성 세포는 배쪽 해마 및 등쪽 시상에서 존재했지만, CBA-WPRE에서보다 적었다(도 16; 3열, 1행, 4행). T.Empty 코호트(도 16, 4열)는 βgal-/- 미처리 대조군과 비교하여 리소좀 저장에 변화가 없음을 나타내었다(도 16; 5열).
AAV 처리 동물의 척수는 또한 필리핀 염색에 의해 저장 함량에 대해 평가하였다. CBA-WPRE 동물의 척수는 경부 영역에 남아 있는 저장이 거의 없었으나, 흉부 영역은 최소의 감소만을 나타내었다(각각 도 17A-17B, 화살표). CB6-Low 동물의 척수는 미처리 대조군과 비교하여 저장에서 거의 구별할 수 없는 감소를 가졌다(도 17C-17D). CB6-High 동물의 척수는 경부 및 흉부 영역에서 리소좀 저장이 거의 없었다(도 17E-17F, 화살표). 예상된 바와 같이, T.Empty 동물의 척수는 미처리 βgal-/- 대조군과 비교하여 리소좀 저장에 변화를 나타내지 않았다. (각각 도 17G-17H; 17I-17J).
CNS에서 GM1 강글리오시드 수준을 LC-MS/MS에 의해 정량화하였다(도 18). CBA-WPRE 및 CB6-Low 코호트에서, 대뇌(각각 p = 0.0009 및 p = 0.002) 및 소뇌 + 뇌간(각각 p < 0.0001 및 p = 0.0001)에서 미처리 βgal-/- 대조군과 비교하여 GM1 강글리오시드 함량에서 유의한 감소가 있었다. 어느 코호트에서도 척수의 GM1 강글리오시드 함량에는 유의한 변화가 없었다. CB6-High 코호트에서, GM1 강글리오시드 수준은 조사된 모든 CNS 영역에서 대뇌, 소뇌 + 뇌간 및 척수에서 정상화되었다(도 18, 각각 p = 0.64, p = 0.06 및 p = 0.79). 예상된 바와 같이, 나이브 βgal-/- 대조군과 비교하여 T.Empty 코호트에서 CNS의 어느 곳에서나 GM1 강글리오시드 함량에 변화가 없었다(도 18).
실시예 7
GM2-강글리오시드증의 동물 모델에서 CNS로의 AAV-매개 유전자 전달
테이 삭스병 환자에서 임상 시험을 수행하기 전에, 비-인간 영장류에서 최종 안전성 연구를 수행하였다. 이러한 연구는 AAVrh8 벡터 제형의 시상 및 하나의 대뇌 측 뇌실로의 양측 주사로 구성된 주사 절차의 안전성을 입증하기 위해 상이한 종점을 갖는 단일 용량(GM2 마우스 및 고양이에서의 이전 연구에 기초함; 3.2E12 vg의 전체 벡터 용량)이 되도록 설계하였다.
AAVrh8 제형(N=3)으로 주사된 첫 번째 NHP는 주사 후 28일 이내에 중등증 내지 중증의 신경학적 증상을 발생시켰다. NHP를 안락사시키고, CNS의 조직학적 평가는 주사 트랙인 것으로 보이는 것을 따라 시상에서 괴사 및 수초 손실의 넓은 영역을 나타내었다(도 22A-22D). 대조적으로, 식염수로 주사된 NHP는 증상을 나타내지 않았고, 부검시(주사 후 >90일) 신경병리의 증거가 없었다(도 22F). 뇌의 조직병리학적 평가에 추가하여, 헥소스아미니다제 활성은 정상 활성보다 6 내지 48배 높은 것으로 측정되었다(도 24).
NHP의 2개의 추가 코호트(코호트 당 N=2)에 본래 용량의 1/10 및 1/30인 2E11 및 1.1E11 vg 각각의 전체 용량으로 AAVrh8 벡터 제형을 주사하였다. cmHexA 서브유닛을 발현하는 더 낮은 용량의 AAVrh8 벡터 제형이 주사된 4마리의 NHP 중 3마리에서 신경학적 증상이 발생하였으나, 개시는 용량이 감소함에 따라 점진적으로 지연되었다. 증상의 발병 지연(또는 한 마리의 NHP에서 명백한 증상의 부재)에도 불구하고, 뇌의 신경병리학적 평가는 보다 낮은 용량 코호트에서 4마리 모두의 NHP에서 광범위한 괴사 영역, 뉴런 손실 및 혈관 커핑을 나타내었다(도 22E). 뇌에서의 헥소스아미니다제 활성은 또한 식염수 주사된 동물에서의 것과 비교하여 이들 NHP에서 증가되었다(도 23). 증가된 Hex 발현은 또한 척수에서 발견되었으며, 이는 1x 용량 동물에서 더욱 현저하였다(도 23, 하단 열).
AAVrh8 캡시드 및/또는 제조 방법과 관련된 잠재적인 독성에 대한 대조군으로서, NHP의 또 다른 코호트(N=2)에 3.2E12 vg의 트랜스진이 없는 AAVrh8 벡터를 투여하였으며, 둘 모두의 동물은 연구 전체에 걸쳐(주사 후 >90일) 정상 행동을 나타내었다. 연구에서 모든 동물에 대한 행동 관찰은 표 3에 요약되어 있다.
부검 전, 저 용량 코호트에서 일부 NHP에 대해 뇌 MRI를 수행하였고, 아마도 부종으로 인해 양측 신호 변화가 시상에서 발견되었지만(상단 열, 도 24), 트랜스진이 없는 AAVrh8 벡터가 주사된 NHP에서 변화가 관찰되지 않았다(하단 열, 도 24).
주사 트랙을 따른 시상에서의 뉴런 손실에 더하여, 세포 내 호산구성 과립이 로딩된 뉴런의 큰 필드가 매우 근접하여 관찰되었으며(도 25E, 25G), 이는 뇌의 다른 영역에서 명백하지 않았다(도 25F). 헥소스아미니다제 알파- 또는 베타-서브유닛에 특이적인 항체를 사용한 면역형광 염색은 이들 과립이 이들 2개의 단백질을 함유할 가능성이 있음을 나타내었다(도 25A, 25C). HexA 서브유닛-양성 과립이 로딩된 이들 세포는 시상에서만 관찰되었으며(도 25B, 25D), 이는 H&E 염색된 섹션에서의 발견과 관련이 있다. 이들 관찰은 단백질 리소좀 저장이 여러 조직에서 명백한 GUSB 트랜스제닉 마우스 모델에서의 발견을 연상시킨다(Vogler et al., 2003).
정상적인 소아 NHP에서 이러한 안전성 연구로부터 두 가지 주요 관찰이 있다: 첫째로, 많은 수의 HexA-양성 뉴런을 함유하는 시상 영역이 주사 트랙을 따른 대규모 신경 손실 및 염증(도 22)에도 불구하고 유의한 염증 침윤물의 증거 없이 온전한 것으로 보이고(도 25E 및 25G), 둘째로, 가장 높은 용량에서 트랜스진 비어 있음 AAVrh8 벡터와 관련된 독성의 증거가 없다. 결과적으로, AAVrh8-HexA-매개 유전자 전달 후 NHP 뇌의 신경독성은 AAVrh8-형질도입된 시상 뉴런에서 HexA의 대규모 과발현에 의해 유발되며, 이는 공지되지 않은 역치를 넘어서 세포 사멸을 촉발시키고 이차 신경-염증 반응(혈관 커핑 등)을 유도하는 것으로 생각된다.
표 3: 연구 동물에서 관찰된 신경학적 증상의 요약
Figure pct00003
실시예 8
새로운 AAV 벡터 플라스미드(도 26)를 293T 세포의 일시적인 형질감염시 헥소스아미니다제(Hex) 효소 발현 수준에 대해 시험하였다. 2개의 예가 도 27 및 28에 제시된다.
원래의 AAV 벡터 플라스미드 쌍(pAAV-CBA-CI-Wdelta6ATG)은 가장 높은 수준의 Hex 활성을 발생시켰으며, 프로모터(pAAV-NoP) 또는 트랜스진(트랜스진 비어 있음)이 없는 AAV 벡터 플라스미드는 나이브의 형질감염되지 않은 293T 세포에 대한 Hex 활성에서의 임의의 검출 가능한 증가를 발생시키지 않았다(도 29). 다른 AAV 벡터 플라스미드 쌍은 Hex 활성의 구배를 발생시켰다. 2개의 AAV 벡터 대조군(프로모터 및 트랜스진 없음)과 함께 누드 마우스에서 추가 시험을 위해 6개의 실험적 AAV 벡터 쌍을 선택하였다. 생체 내 시험을 위해 전체 15개의 벡터 스톡이 생성되었다(표 4).
AAV 벡터를 1.32x1010 벡터 유전체(vg)의 전체 용량으로 10-12주령의 수컷 무흉선 누드 마우스(Charles River Labs)의 시상 및 좌뇌 측 뇌실에 양측 주사하였다. 대조군 그룹은 프로모터가 없는 AAV 벡터 제형(AAV-NoP), 트랜스진이 없는 AAV 벡터(트랜스진 비어 있음), 인산염 완충 식염수(PBS)가 주사된 마우스, 및 최종적으로 주사되지 않은 마우스(모든 실험 및 대조군 그룹에 대해 N=8)를 포함하였다(표 4). Hex 발현의 생화학적 분석 및 조직학적 연구를 위해 주사 1개월 후에 마우스를 사멸시켰다. 모든 그룹은 실험 과정에 걸쳐 평균 체중에서 동일한 증가를 나타내었고(도 30), 유의한 체중 손실 및 신경학적 증상의 발병으로 인해 동물이 안락사된 더 높은 AAV 벡터 용량을 이용한 예비 실험과 달리 상기 기간 동안 심한 행동 변화의 증거가 없었다. 현재 실험에서 사용된 용량(1.32x1010 vg)을 모든 시험 물품 및 대조군에 대한 전체 벡터 용량을 표준화하기 위해 벡터 쌍 중 하나의 가장 낮은 역가에 의해 결정하였다.
인공 기질 MUG(도 36) 및 MUGS(도 37)를 사용하여 4개의 관상 뇌 블록, 소뇌, 뇌간 및 척수에서 Hex 활성을 측정하였다. 주사 부위를 포함하는 관상 뇌 블록에서의 Hex 활성은 결과를 요약하기 위해 표 4에 제시된다. 원래의 AAV 벡터 쌍(그룹 1)은 정상보다 400-1,700배 높은 Hex 활성을 생성시켰다. 세포 배양의 결과와 유사하게, 다른 AAV 벡터 쌍은 뇌에서 원래 AAV 벡터 제형(그룹 1)보다 3배(그룹 2), 20-30배(그룹 4) 및 50-100배(그룹 6)보다 낮은 Hex 활성을 생성시켰으며, 이는 뇌에서 AAV-매개 Hex 발현에서 1-2 log 활성의 예상 범위를 제공한다. 다른 AAV 벡터 쌍(그룹 3 및 5)은 무흉선 누드 마우스 뇌에 존재하는 정상 수준 이상의 Hex 활성을 생성시키지 않았다. 대조군 그룹(그룹 7, 8 및 9)은 Hex 활성에서 유의한 변화를 나타내지 않았다.
뇌의 신경병리학적 검사는 그룹 1 동물에서 호산구성 과립을 포함하는 다수의 시상 뉴런을 나타내었다(도 31K). 이러한 발견은 그룹 1에서 사용된 이들 AAV 벡터를 주사한 원숭이에서의 관찰과 동일하지만, 이들 비정상적인 뉴런의 수는 원숭이보다 마우스에서 상당히 낮게 나타난다. 이러한 관찰은 그룹 2 동물에서도 이루어졌지만, 비정상 뉴런의 수는 그룹 1에서보다 상당히 낮았다(도 31L). 그룹 2 동물의 해마에서 동일한 뉴런이 관찰되었다(도 31B). 임의의 다른 그룹의 동물에서는 상기 뉴런의 증거가 없었다. HexA의 알파-서브유닛에 대한 항체를 이용한 면역형광 염색은 그룹 1(도 31A, 31K), 2(도 31B, 31L), 4(도 31D, 31N) 및 6(도 31F, 31P)의 동물의 해마 및 시상에서 효소를 발현하는 다수의 세포를 나타내었다. 대조군 그룹에서 Hex-알파 서브유닛 발현의 증거는 없었는데, 이는 아마도 인간 및 시노몰구스 마카쿠(cynomolgus macaque) 효소를 검출하지만 마우스 단백질은 검출하지 않은 상기 연구에서 사용된 항체의 종 특이성 때문일 것이다.
대조군(도 33I, 33J, 33S, 33T)에 비해 원래의 AAV 벡터 제형(그룹 1)(도 33A, 33K)이 주사된 동물의 해마 및 시상에서 Iba-1 염색(미세아교세포 활성화)의 극적인 증가가 관찰되었다. 미세아교세포 활성화에 대한 이러한 증거는 HexA-양성 세포가 면역형광 염색에 의해 검출된 부위에 국한되었으며(도 32A, 32K), 뇌의 다른 곳에서는 미세아교세포에는 명백한 변화가 없었다. 해마 및 시상에서는 Iba-1 염색의 증가는 그룹 2 및 3에서 상당히 경미하고(도 33B-33C, 33L-33M), 본질적으로 그룹 4-7의 대조군과 구별될 수 없었다(도 33D-33G; 33N-33Q).
뇌는 또한 GFAP 면역염색을 사용하여 반응성 성상교세포증의 증거에 대해 분석하였다(도 34). 해마에서, 반응성 성상교세포증의 증거는 원래의 AAV 벡터 제형(그룹 1)이 주사된 동물에서만 발견되었다(도 34A). 다른 모든 것은 대조군과 구별할 수 없었다. 시상에서, 그룹 1-3에서 어느 정도의 성상교세포증이 있는 것으로 보였고(도 34K-34M), 경미하거나 그룹 4-7의 대조군과 구별할 수없는 수준이 있는 것으로 보였다(도 34N-Q). 어떤 그룹에서도 뇌의 다른 영역에서 성상교세포증의 증거는 없었다.
2개의 새로운 AAV 벡터(도 35), AAV-CB6-I-cmHex(SEQ ID NO: 4로 표시되는 프로모터) 및 AAVP2-I-cmHex(SEQ ID NO: 5로 표시되는 프로모터, SEQ ID NO: 6로 표시되는 작제물)는 실험 개시 전에 정의된 모든 현재 시험 가능한 기준(심한 행동 변화의 부재, 대조군 그룹과 유사한 로타로드 수행, 주사 후 0 내지 30일 사이의 일정하거나 증가하는 체중, 신경병리의 부재, 및 시상 블록 및 입쪽 주사되지 않은 블록에서 정상 이상의 효소 발현)을 충족하였다. 이들 새로운 AAV 벡터 제형(그룹 4 및 6)은 대조군과 비교하여 신경병리학적 변화(호산구성 뉴런의 부재, 미세아교세포증 또는 성상교세포증)의 증거가 거의 없거나 전혀 없이 뇌에서 증가된 Hex 발현을 발생시켰다.
wpre 요소가 원래의 AAV 벡터로부터 제거되었지만, 발현 요소(프로모터 및 인공 인트론)가 동일하게 유지되는 새로운 AAV-CBA-I-cmHex 벡터(도 35)를 또한 시험하였다. 이러한 AAV 벡터(그룹 2)는 원래의 AAV 벡터에 비해 약 3배 더 낮은 Hex 활성 수준 및 원래의 AAV 벡터에 비해 감소된 미세아교세포증을 나타내었다. 발현 요소가 샌드호프(Sandhoff) 마우스 및 고양이의 장기 실험에 사용된 AAV 벡터에서와 동일하다는 점을 고려할 때, AAV 벡터가 또한 장기 발현을 매개할 수 있다고 생각된다. Hex 발현 수준의 감소 및 미세아교세포의 더 가벼운 활성화를 감안하는 경우, 이러한 새로운 AAV 벡터는 실시예 9의 용량(3E11 vg) 및 실험 기간에서의 NHP의 행동에 유의하게 영향을 미치지 않을 것이다.
표 4. 주사 블록의 실험 그룹 및 Hex 활성(MUG 및 MUGS)
Figure pct00004
주의: 상대 효소 활성은 무흉선 누드 마우스의 뇌에서 정상보다 높은 Hex 활성의 배수 증가를 나타낸다.
실시예 9
3개의 AAB 벡터 설계(도 19 및 35)는 원래의 AAV 벡터 제형과 비교하여 뇌에서 베타-헥소스아미니다제 발현을 증가시키고 염증 반응(성상교세포증 및 미세아교세포 활성화)를 감소시키기 위해 무흉선 누드 마우스에서 선택되었다. AAVrh8 캡시드에 대한 중화 항체의 부재 또는 매우 낮은 역가에 대해 스크리닝된 NHP(표 5)에 AAVrh8 벡터를 주사하였다.
3.2x1011 vg의 전체 용량을 시상(50% 용량, 2x150 μl) 및 좌측 대뇌 측 뇌실(300 μl 중 50% 용량)에 양측으로 주입하였다. 벡터 제형은 또한 주사 직후 뇌 MRI에 의한 표적화 정확도 및 분포를 결정하기 위해 2 mM 가돌리늄을 함유하였다(도 38A). 모든 NHP는 합병증 없이 수술 절차를 잘 견뎌내었다. 시상에서 가돌리늄 분포(Vd)의 평균 부피는 1.47 ± 0.48 mL(도 38B)였고, 이는 시상(Vi)에 주사된 부피가 0.3 mL였기 때문에 4.9의 Vd/Vi 비율에 해당한다.
6개 모두의 AAVrh8 주사된 NHP의 행동은 90일 연구 전체에 걸쳐 정상으로 유지되었다. 계획된 바와 같이, 뇌 MRI를 매월 수행하였다(도 39). 주사 부위에서의 신호 변화는 30일 이후로 코호트 2 및 3으로부터의 2마리의 원숭이에서 기록되었지만, 시간에 따른 명백한 변화는 없었다(도 40B, 40C). 코호트 1의 한마리의 원숭이에서, 주사 후 30일 및 60일에 뇌 MRI에서 신호 변화가 없었지만, 90일에 좌측 시상에서 큰 신호 변화가 검출되었다(도 40A). 90일에 이러한 비정상적인 신호에도 불구하고 이러한 원숭이의 전반적 행동은 연구 전체에 걸쳐 변하지 않고 유지되었다.
뇌를 4 mm 관상 블록으로 절단하고, 헥소스아미니다제(Hex) 활성을 맵핑하고 신경병리를 평가하는 데 사용하였다. 생검 펀치(3 mm 직경)를 사용하여 뇌를 샘플링하여 효소 분포의 맵을 생성시켰다(도 41). 정상보다 높은 전체 Hex 활성(HexA, HexB 및 HexS)은 모든 코호트의 시상 펀치에서만 검출되었다(표 6). 무흉선 누드 마우스에서의 연구와 일치하게, 시상 펀치에서의 전체 Hex 활성은 코호트 1에서 가장 높았고(정상보다 최대 87배 높음), 코호트 2 및 3에서 유사하였다(정상보다 최대 9배 높음). 대부분의 다른 샘플링된 뇌 영역에서의 전체 Hex 활성은 주사되지 않은 대조군 원숭이에서의 것과 유사하였다.
뇌의 신경병리학적 평가는 코호트 1의 원숭이에서 신경 내 호산구성 물질의 풍부한 축적을 나타내었다(도 42, 흑색 화살표). 코호트 1 동물에서 중등증 내지 중증의 신경 변성이 관찰되었다. 코호트 1에서 한마리의 원숭이(ID 295851)의 좌측 시상에서, 중증 국소 해면화 및 혈관주위 커핑이 있었다(도 43A, 43B). 이러한 병변은 주사 후 90일에 코호트 1의 한마리의 원숭이의 좌측 시상에서 명백해진 비정상적인 MRI 신호에 상응하였다(도 40A).
코호트 2에서, 호산구성 물질의 축적, 드문 신경 변성 및 위성증이 없었다. 한마리의 원숭이에서 주사 부위/트랙 외상과 가장 관련이 있을 수 있는 신경 변성을 갖는 백색질의 국소 염증이 관찰되었다(ID 295847).
코호트 3에서, 뉴런 내 호산구성 물질의 축적, 드문 뉴런 변성 및 위성증이 없었다(도 44A). 한 마리의 원숭이(ID 295709)에서, 캐뉼라화와 관련된 것일 수 있는 혈관주위 번쩍이는 세포의 초점이 있었다(도 44B). 코호트 1 및 3에서 원숭이의 전체 좌측 및 우측 시상에 걸쳐 150 μm 떨어진 일련의 섹션을 조직학적 발견, 즉, 호산구성 물질의 신경세포 내 축적(도 45), 신경세포 변성 및 괴사(도 46)뿐만 아니라 염증(도 47)의 정량화를 위해 제조하였다. 이들 발견은 상당한 신경세포 변성, 괴사, 해면증 및 상응하는 염증이 있었던 코호트 1의 한 마리의 동물에서 좌측 주사 부위를 제외하고 제형 1 및 3이 뇌에 유사한 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 이들 발견은 90일 뇌 MRI와 매우 잘 일치한다(도 40A).
두개 내 전달 후 샌드호프병(SD)의 CNS에서 GM2 함량을 감소시키기 위한 새로운 벡터 AAVrh8-CBA-cmHex(도 19) 및 AAVrh8-CB-I-cmHex(도 19)의 효과를 결정하기 위해 소규모 파일럿 연구를 수행하였다. SD 마우스 및 고양이에서의 모든 이전 연구가 이러한 벡터로 수행되었으므로 원래의 AAVrh8-CBA-cmHex-WΔ6ATG 벡터를 효능 기준으로 사용하였다. AAV 벡터를 4.68x109 vg의 전체 용량/마우스로 시상 및 좌측 대뇌 측 뇌실에 양측으로 4-6주령의 SD 마우스에 주입하였다. 이는 원래의 AAVrh8-CBA-Hex-W 백터가 주사된 SD 마우스의 치료 효능 연구에서 시험된 1x 용량이었다. AAVrh8-CB-I-cmHex(표 6의 코호트 2)가 주사된 NHP의 시상에서 전체 Hex 활성은 AAVrh8-CBA-cmHex(표 6의 코호트 1)가 주사된 NHP에서보다 약 20배 낮았기 때문에, 5배 더 높은 용량(5x 용량: 2.34x1010 vg)의 AAVrh8-CB-I-cmHex 벡터가 주사된 SD 마우스의 추가 코호트가 또한 포함되었다. 마우스를 주사 후 1개월에 희생시키고, 뇌를 4개의 관상 블록 약 2 mm로 분할하여 Hex 활성뿐만 아니라 GM2 강글리오시드 함량을 측정하였다(도 48). 헥소스아미니다제는 AAVrh8-CBA-cmHex-WΔ6ATG(녹색 막대, 도 48) 및 AAVrh8-CBA-cmHex 벡터(오렌지색 막대, 도 48)가 주사된 1/3 SD 마우스에서 검출 가능하지 않았다. AAVrh8-CB-I-cmHex 벡터(도 12의 청색 막대)가 주사된 마우스에서, Hex 활성은 1x 및 5x 코호트에서 각각 3/3 및 2/4 동물에서 검출되지 않았다. 무흉선 누드(nu/nu) 마우스에서의 비교 연구에서, SD 마우스에서 본원에서 시험된 AAVrh8 벡터는 일부 경우에 정상보다 2 내지 3 크기 정도(orders of magnitude) 높은 상당한 Hex 과발현을 발생시켰다. 이는 SD 마우스의 서브셋에서 Hex 발현의 결여가 체액 반응을 통한 효소 분포를 제한하거나 적응 반응에 의해 매개된 형질도입된 세포 손실을 발생시키는 시노몰구스 마카쿠 Hex 알파(A)- 또는 베타(B)-서브유닛에 대한 면역 반응과 관련이 있을 수 있다는 가능성을 나타낸다. 그룹 당 마우스의 수는 적지만, Hex 활성 수준과 GM2 강글리오시드의 감소 사이에 직접적인 상관 관계가 있는 것으로 보인다. 블록 3에서, AAVrh8-CBA-cmHex-WΔ6ATG 벡터가 주사된 SD 마우스에서 GM2 강글리오시드 함량의 최대 96% 감소, AAVrh8-CBA-cmHex에 대해 최대 92%, 1x 및 5x 용량의 AAVrh8-CB-I-cmHex 벡터가 각각 주사된 마우스에서 42% 및 85% 감소가 관찰되었다.
표 5: 새로운 AAV 벡터가 주사된 NHP 코호트
Figure pct00005
표 6: AAVrh8-주사된 NHP의 시상에서 전체 헥소스아미니다제(HexA+HexB+HexS) 활성의 증가
Figure pct00006
실시예 10
뉴런 및 별아교세포 둘 모두 각각에서 관심 트랜스진의 동시 이중 발현을 위한 인간 시냅신-1("Syn1"로도 언급됨) 및 GfaABC1D("GFAP"로도 언급됨) 프로모터를 갖는 AAV 벡터를 생성시켰다. Syn1-GFP-2xmiRSOD1/GFAP-2xmiRSOD1-mCherry로 언급되는 벡터는 신경세포 Synapsin1 프로모터에 의해 구동되는 GFP, 및 별아교세포 GFAP 프로모터에 의해 구동되는 mCherry를 함유하며; 2개의 항-인간 SOD1 인코딩 miRNA가 각각의 GFP 및 mCherry의 마지막 코돈과 아데닐중합체형성 신호 사이에 위치한다(도 50). 벡터는 AAV9 캡시드 단백질을 사용하여 패키징되었다(도 50). 일부 구현예에서, 벡터 Syn1-GFP-2xmiRSOD1/GFAP-2xmiRSOD1-mCherry는 SEQ ID NO: 12로 표시된다.
이중 프로모터 벡터의 형질도입 프로파일을 조사하였다. AAV9-Syn1-GFP-2xmiRSOD1/GFAP-2xmiRSOD1-mCherry를 SOD1G93A 성체 마우스에 선조체내 주사하고, 형광 현미경검사를 수행하였다. 데이터는 GFP(녹색) 및 mCherry(적색) 발현 세포의 형태가 각각 뉴런 및 별아교세포와 일치함을 나타낸다(도 51).
SOD1 mRNA 발현을 측정하였다. 데이터는 이중 프로모터 AAV9-Syn1-GFP-2xmiRSOD1/GFAP-2xmiRSOD1-mCherry 벡터의 주사 후 성체 SOD1G93A 마우스에서 인간 SOD1 mRNA 수준이 감소됨을 나타낸다(도 52). 척수에서 최대 25%의 인간 SOD1 mRNA 발현의 감소는 1 x 1012의 전체 벡터 유전체의 정맥 내 주사 후에 관찰되었다. 선조체에서 최대 55%의 인간 SOD1 mRNA 발현의 감소는 8 x 109의 전체 벡터 유전체의 직접적인 선조체 내 주사 후에 관찰되었다.
데이터는 이러한 이중 프로모터 작제물이 비-CNS 조직에 대한 감소된 독성과 함께 편재성 프로모터(예를 들어, CBA, U6)를 사용하는 현재 접근법보다 CNS에서 특정 세포 유형(예를 들어, 뉴런 및 별아교세포)의 더 광범위한 형질도입을 발생시키는 것을 나타낸다.
실시예 11
헥소스아미니다제 A 및 B 서브유닛(각각 SEQ ID NO: 20 및 21)을 인코딩하는 rAAVrh8의 1:1 제형을 양측 시상(TH) 및 심부 소뇌 핵(DCN) 주사의 조합(TH/DCN), 또는 단일 뇌실내 주사와 조합된 양측 시상 주사(TH/ICV)의 2개의 접근법을 통해 4주령 SD 마우스에 두개 내 주사하였다. AAVrh8 처리된 SD 마우스(4.68 x 109 vg) 및 대조군(처리되지 않은 SD 및 야생형 한배새끼)의 행동 수행을 60일령(주사 후 1개월)에 시작하여 시간에 따라 평가하였다(도 53). TH/ICV AAVrh9 처리된 SD 마우스의 반전 스크린 수행은 120일령(P ≤ 0.05)에서 처리되지 않은 SD 마우스보다 유의하게 나았으며, TH/ICV 및 TH/DCN AAVrh8 처리된 마우스 둘 모두는 180일에 야생형 대조군의 것과 유사하게 수행하였다(도 53A). 로타로드 시험에서, AAVrh8 처리된 SD 마우스의 둘 모두의 코호트는 120일령에 처리되지 않은 SD 대조군(P ≤ 0.01)보다 더 잘 수행하였으며, 이들의 수행은 적어도 180일령에 대해 야생형 대조군과 유사하였다(도 53B). 처리되지 않은 SD 마우스와 비교하여 와이어 행 시험에서 유의한 개선이 측정되지 않았다(도 53C). 4.68 x 109 vg의 용량으로 TH/DCN 또는 TH/ICV로 처리된 처리되지 않은 SD 마우스는 각각 424일 및 423일의 중앙값 생존을 가졌다, 도 53D. 따라서, 둘 모두의 두개 내 전달 접근법은 처리되지 않은 SD 마우스와 비교하여 유사한 수명 연장을 발생시켰고(P ≤ 0.001 TH/DCN, P ≤ 0.0001 TH/ICV), 서로 유의하게 상이하지 않았다(P > 0.05).
AAVrh8의 용량을 증가시키는 것이 SD 마우스에서 생존을 추가로 연장시키는 지 결정하기 위해, 용량-증가 연구를 수행하였다. AAVrh-mHexA/B의 두개 내 TH/ICV 주입 2일 전에, SD 마우스에 AAV8-TRG-mHexB(3 x 1011 vg)를 정맥 내 주입하였다. AAV8-TBG-mHexB 단독의 전신 주사는 SD 마우스의 생존을 향상시키지 않았다(처리되지 않은 SD 마우스에 대한 중앙값 생존은 127일인 반면, AAV8-TBG-mHexB로 처리된 SD 마우스의 경우 128.5일이었다; 도 53D 및 54A). 두개 내 요법과 조합된 전신 매개 내약성은 4.68 x 108 vg에서 두개 내 전달 단독에 비해 중앙값 생존을 유의하게 향상시키지 않았다(병용 요법의 중앙값 생존 448.5일, TH/ICV 단독 423일; 도 53D 및 54A). 동일한 정맥 내 전달된 내약성 프로토콜(AAVrh8-mHexA/B 벡터의 TH/ICV 전달 전 AAV8-TBG mHexB)과 조합된 두개 내 전달되는 AAV의 용량 증가(4.68 x 107 vg, 4.68 x 108 vg, 4.68 x 109 vg, 1.17 x 1010 vg)는 2개의 가장 높은 용량에서 생존의 연장을 발생시켰다(4.68 x 109 vg 및 1.17 x 1010 vg, P ≤ 0.0001; 전신만 처리된 SD 마우스의 중앙값 생존은 128.5일이었음; 4.68 x 107: 110.5일, 4.68 x 108 vg: 135일, 4.68 x 109 vg: 448.5일, 1.17 x 1010 vg: 591일; 도 54A). 최대 666일의 생존에도 불구하고, 가장 높은 용량(1.17 x 1010 vg 용량)이 처리된 동물은 안락사 시 뒷다리 쇠약 및 운동실조를 결국에 나타냈으며, 일부는 체중 및/또는 등을 대고 누운 경우 스스로를 바로 잡는 능력을 상실하였다.
반전 스크린 수행(도 54B), 로타로드 수행(도 54C) 또는 와이어 행 시험(도 54D)에 의해 측정되는 경우 120일에서 처리되지 않은 SD 마우스에 비해 4.68 x 109 vg 또는 1.17 x 1010 vg(두개 내 TH/ICV 용량)에서 용량 증가 병용 요법 마우스에서 행동 수행의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, AAVrh8 처리된 SD 마우스는 운동 수행을 유지하였고, 180일령에 TH/ICV 처리된 SD 마우스는 둘 모두의 용량에서 반전 스크린 수행에서 야생형 마우스와 유사하게 수행하였다(도 54B). 또한, 180일령에, 둘 모두의 용량의 TH/ICV 처리된 SD 마우스는 로타로드 수행에서 야생형 마우스와 유사하게 수행하였다(도 54C). 처리되지 않은 SD 마우스의 중앙값 생존 나이(120일) 즈음에 두개 내 처리되지 않은 SD 마우스와 비교하여 와이어 행 시험에서 유의한 개선이 측정되지 않았다(도 54D). 그러나, 마우스는 처리되지 않은 SD 마우스가 생존하지 않은 180일에 여전히 시험을 수행할 수 있었다.
근본적인 신경퇴행성 과정의 부재하에 두개 내 AAVrh8 벡터 주입의 잠재적인 영향을 평가하기 위해, 연령 일치 이형접합체(HZ) 한배새끼(HexB+/-) 마우스에 TH/ICV 또는 TH/DCN을 통해 4.68 x 109 vg의 AAVrh8 벡터 제형의 두개 내 주사를 투여하였다. AAVrh8 처리된 HZ 마우스 및 처리되지 않은 대조군(야생형 및 HZ)을 시간이 지남에 따라 상이한 행동 시험으로 평가하였다(도 55). 대조군과 비교하여 AAVrh8 주사된 HZ 마우스의 행동에서 명백한 총체적 변화 또는 생존에 대한 어떠한 영향도 없었다. 반전 스크린 시험에서 코호트 사이의 차이는 분명하지 않았다(도 55A). TH/DCN 주사된 HZ 마우스는 로타로드 시험에서 180일에 처리되지 않은 HZ 및 WT 대조군보다 약간 더 나쁘게 수행하였다(도 55B). 60일령 및 120일령 둘 모두에서 코호트 사이에 와이어 행 수행에 유의한 차이가 없었다(도 55C). 그러나, 180일에, TH/DCN 주사된 HZ 마우스는 처리되지 않은 HZ 동물(P ≤ 0.05) 및 처리되지 않은 WT 동물(P ≤ 0.01)보다 나쁘게 수행하였다. 180일령에 처리되지 않은 HZ 또는 WT 동물과 비교하여 TH/ICV 주사된 동물의 수행에는 유의한 차이가 없었다.
CNS에서 GM2 강글리오시드 함량 및 헥소스아미니다제 발현을 TH/ICV AAVrh8 처리된(1.17 x 1010 vg) SD 마우스, 처리되지 않은 SD 마우스 및 처리되지 않은 WT 대조군에서 측정하였다(도 56). LC-MS/MS에 의해 측정된 GM2 강글리오시드는 AAVrh8 처리된 동물의 대뇌에서 검출되지 않았고, GM2 강글리오시드의 유의한 감소가 소뇌(91.1%), 뇌간(99.6%) 및 척수(99.8%)에서 관찰되었다(P ≤ 0.0001, 도 56A). 전체 헥소스아미니다제 활성은 AAVrh8 처리된 SD 마우스의 중추 신경계로 회복되었다. 효소 활성 수준은 대뇌에서 야생형의 수준보다 높았고, 소뇌, 뇌간 및 척수에서 비슷하였다. 동물을 처리되지 않은 SD 마우스와 유사한 미리 결정된 종점으로 가져갔고, 야생형 대조군과 구별할 수 없었다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 12
모든 SD 고양이 실험은 AAVrh8-CBA-mHexA/B-WPRE를 사용하였으며, 이는 인간 적용에 사용되는 벡터 작제물(AAVrh8-CB-CI-hHexA/B)과 약간 상이하였다. 치료 효능 연구를 자연 발생 SD 고양이 모델에서 수행하였으며, 여기서 질병은 평균 생존이 4.3 ± 0.2개월령으로 신속히 진행되었다. 이들 연구에서, 야생형 고양이 헥소스아미니다제 알파 및 베타 서브유닛을 개별적으로 인코딩하는 2개의 AAVrh8 벡터의 1:1 제형을 사용하였다.
장기 치료 효능 데이터가 본원에 보고된다. SD 고양이를 전체 4.6E11 vg의 용량으로 일방적 ICV 주사(ICV; n=5)와 조합된 양측 시상 주사에 의해 처리하였다(1:1 비율의 둘 모두의 벡터, 표 7). 유전자 요법은 SD 고양이의 생존을 유의하게 증가시켰으며(p<0.0001; 도 57A), 가장 오래된 고양이는 29.9개월까지 생존하였다. 처리되지 않은 SD 고양이는 심각한 소뇌 질병을 경험하며, 이는 쇠약해지는 명백한 전신 휴식 및 의도적 진전을 동반하며 약 4개월령에 보행 상실 및 후속 안락사를 동반한다. AAV 유전자 요법 후, 신경학적 징후가 현저하게 개선되었다(도 57B). 진전은 모든 처리된 고양이에서 완전히 개선되었고, 대부분의 고양이는 연구 과정 전체에 걸쳐 보행하는 능력을 유지하였고, SD 고양이의 전통적인 신경 질환 표현형의 일부가 아닌 근골격 또는 위장 질병으로 인해 안락사시켰다(표 7).
표 7: SD 고양이 모델에 대한 코호트, 용량 및 투여 경로 정보의 요약
Figure pct00007
둘 모두의 AAV 벡터의 ICV 주사와 조합된 시상(Th+ICV)은 피질, 소뇌 및 척수 전체에 걸쳐 광범위한 헥소스아미니다제 분포를 발생시켰으며(도 57B 및 57C), 더 낮은 분포를 갖는 뇌의 유일한 영역은 측두엽이었다(도 57D, 도 57D 및 도 57E의 측면 양상). HexA 수준은 뇌, 소뇌 및 척수 전체에 걸쳐 정상에 가깝거나 이보다 높았고, 시상 주사 부위에서 정상의 거의 50배에 이르렀다(도 57E). 주사 부위에서 Hex의 초-생리학적 수준에도 불구하고, AAV 처리된 고양이에서는 조직병리학적 이상이 인지되지 않았다.
SD 고양이의 인도적 종점에서 MRI(T2W)는 회색질의 어두워짐(GM2의 저장) 및 뇌 전체에 걸친 백색질의 라이트닝(탈수초화)을 나타낸다(도 58A). AAV 유전자 요법 후, Hex의 감소된 분포를 갖는 것으로 보이는 측두엽을 제외하고 뇌 전체에 걸쳐 회색질 및 백색질 강도의 정상화가 있었다(도 58D). 회색질 및 백색질 강도의 정상화에도 불구하고, 가쪽뇌실 및 뇌를 둘러싼 대뇌고랑에서 증가된 CSF에 의해 예시된 바와 같이 AAV 처리된 SD 고양이에서 피질 위축이 지속되었다. MR 분광법을 사용하여, 독성 대사물질인 N-아세틸헥소스아민(NA-Hex)의 유의한 증가가 처리되지 않은 SD 고양이의 시상에서 검출되었으며, 이는 SD를 갖는 마우스 및 인간에서 이전에 보고되었다. NA-Hex는 AAV 유전자 요법 후 콜 캣(call cat)에서 정상 수준으로 완전히 감소되었다(도 58B). HexA 수준은 정상 또는 정상 수준 이상으로 AAV 처리된 고양이에서 증가되었고, HexA 증가는 고양이의 일생 전체에 걸쳐 지속되었다(도 58D). 세포독성의 마커인 아스파테이트 아미노트랜스페라제 및 락테이트 데하이드로게나제는 SD 고양이의 CSF에서 증가되었고, AAV 유전자 요법 후, 이들 효소의 수준은 정상으로 회복되었다(도 58D 및 58E). 캡시드에 대한 혈청 항체 역가는 처리 후 1-2개월에 존재하였지만 시간이 지남에 따라 점점 작아졌다(도 58G 및 58H). 1세 이전에 인도적 종점에 도달한 유일한 고양이(11-907)는 처리 후 대략 2개월에 1:6의 최대 혈청 항체 역가를 가졌고, 단지 1:16의 종점 역가를 가졌다(도 58G). 대조적으로, 26개월령까지 살았던 고양이(7-760)는 수술 후 3.6개월에 1:16의 최대 역가를 가졌다(도 58H). 벡터 스톡의 수량 제한으로 인해 모든 시점이 분석될 수 없었으나; 처리 후 대략 20개월에 혈청 역가는 1:1로 감소하였다(도 58H).
AAV의 CNS 지시 전달에도 불구하고, 말초 기관의 HexA 효소 활성은 SD+AAV TH/ICV 고양이에서 증가되었다. 좌골 신경은 정상보다 203% 증가를 달성한 반면, 정상 간 및 근육은 정상의 53 및 20%로 증가하였다(표 8).
표 8: 말초 조직에서의 헥소스아미니다제 활성
Figure pct00008
HexA=MUGS 활성; HexT = 전체 Hex 활성; MUG; β-gal-β-갈락토시다제 효소 활성; Mann-만노시다제 효소 활성.
이러한 연구에서, 닭 베타 액틴(CBA) 프로모터 및 우드척 조절 후 요소(WPRE)가 측면에 있는 고양이 HEXA 또는 HEXB를 인코딩하는 2개의 모노시스트론 벡터의 AAVrh8 전달을 시험하였다. 고양이를 대수조 주사(6.4E11 vg, 주사 시점에 약 0.5 kg)로 처리하고, 동물의 서브셋을 처리 후 16주에 안락사시켜 생체분포를 평가하였고(n=3); 두 번째 코호트는 인도적 종점(n=2)에 따랐다. 처리되지 않은 SD 고양이는 심각한 소뇌 질병을 경험하며, 4.4 +/- 0.6 개월령에 점차적으로 쇠약해지는 명백한 전신 휴식 및 의도적 진전, 보행 상실 및 후속 안락사를 경험하였다(도 59A). 처리되지 않은 SD 고양이의 인도적 종점과 유사한 시점인 처리 후 16주에 대수조 주사(SD+AAV CM)를 통해 AAV 유전자 요법으로 처리된 SD 고양이는 넓은 기반의 위치 및 약간의 뒷다리 약점을 포함하는 경미한 신경학적 징후를 갖는다(도 59B). 인도적 종점을 따른 2마리의 고양이는 9.9+/-0.5개월까지 생존하였고, 서 있고 보행하는 능력을 유지했지만, 시각 또는 청각 자극에 반응하지 않았다.
SD+AAV CM 고양이에서 Hex의 생물분포는 척수 및 소뇌 전체에 걸쳐 널리 퍼졌지만, 전방 뇌 영역에서 감소되었다(도 59C, 59D, 59E). SD+AAV CM 단기(데이터는 제시되지 않음) 및 장기 처리 SD 고양이에서, 헥소스아미니다제 A(HexA) 활성은 소뇌 및 척수에서 정상 수준에 도달하거나 초과했지만, 입쪽 시상, 선조체 및 전두 피질(각각 뇌 블록 D-A)을 함유하는 블록에서 처리되지 않은 것과 유사하였다. 벡터 생물분포는 유사한 경향을 보였으며, 뇌 블록 D(분석된 가장 전방의 블록)는 가장 낮은 vg 카피 수를 함유하나(도 59F); qPCR은 척수와 뇌 사이의 Hex 발현 차이의 크기를 반영하지 않았다.
SD 고양이에서의 저장은 당지질(예를 들어, GM2)에 대해 염색되는 주기적 산-쉬프(PAS; 그레이스케일) 염색으로 표시된다. 더 어두운 염색을 갖는 영역, 예를 들어, PAS 양성은 증가된 강글리오시드 저장을 나타낸다. SD 고양이에서, 회색질에서 증가된 PAS 염색 및 감소된 염색 백색질이 있었으며, 이는 세포체에서의 강글리오시드 저장 및 탈수초화와 일치한다. SD+AAV CM 고양이(장기)에서, 저장 청소는 Hex 생물분포를 역으로 반영하고, 척수 및 소뇌에서 효과적인 저장 청소를 갖지만 피질은 그렇지 않다. PAS 양성 물질은 대뇌 피질 및 심부 뇌 구조에서 지속되었다. PAS 양성 물질의 손실로 대표되는 탈수초화는 또한 처리된 고양이의 대뇌 피질의 백색질에서 명확하게 나타난다.
SD 고양이 소뇌에서, 광범위한 신경퇴행이 있었는데, 이는 H&E 염색에서 분명했다(도 61). 푸르킨예 세포, 심부 소뇌 뉴런 및 뇌간 뉴런은 심각한 변성, 세포 손실 및 다량의 거품이 있는 공포 세포 내 저장의 징후를 나타내었다. 유전자 요법 후 16주에, AAV-CM 처리된 SD 고양이는 푸르킨예 세포, 심부 소뇌 핵 및 뇌간 세포 형태의 정상화를 가졌다(도 61). 인도적 종점을 따른 동물에서, 형태의 정상화가 DCN 및 뇌간에서 주목되었지만, 푸르킨예 세포의 퇴화 및 손실은 지속되었다. 흥미롭게도, 장기간의 AAV 처리된 고양이는 소뇌의 꼭지핵의 후내 측면에서 보트리오드(botriod) 호산구성 포함을 나타내었다(삽입)(도 61). 이들 포함은 이전에 AAV의 실질 주사 후 Hex에 대해 면역양성으로 나타났다.
초고장 MRI(7 Tesla) T2 가중 MRI는 AAV 처리된 동물에서 MRI 구조의 정상화를 나타내며, 이는 Hex의 분포를 반영한다(도 62A). 처리되지 않은 SD 고양이에서, 백색질의 증가된 수분(탈수초화) 및 회색질의 증가된 지질(GM2 저장)로 인한 회색질 및 백색질 강도의 반전이 존재한다. 대주조 주사 16주 후, 뇌량(도 62A; 흑색 화살표), 방사관(도 62A; 백색 화살표) 및 소뇌 백색질(도 62A; 흑색 화살촉)의 백색질 강도의 어두워짐과 함께 MIR 강도의 부분적 정상화가 있었다. SD+AAV CM 고양이의 인도적 종점에서, 대뇌 피질에서 회색질 및 백색질의 병리학적 강도 반전이 지속되었지만, 피질 위축이 약화되었고, 소뇌 백색질 강도가 부분적으로 회복되었다(흑색 화살촉). SD 고양이의 시상(도 62C), 두정 피질(도 62D) 및 소뇌(도 62D)의 MR 분광법은 독성 대사물질 N-아세틸 헥소스아민(NA-Hex, 도 62B)의 증가를 가졌다. 16주에서 SD+AAV CM 고양이에서, NA-Hex는 시상(도 62C) 및 소뇌(도 62E)에서 감소되지만, 인도적 종점에서 평가된 한 마리의 SD+AAV CM 장기 고양이의 두정 피질(도 62D)에서 계속 증가하였다(도 62E). 다른 대사물질 변화는 AAV 처리 후 소뇌에서 수초화(콜린 + 포스포콜린) 및 대사 활성(크레아틴 + 포스포크레아틴 Cr + PCr)의 부분적인 교정을 지원한다(도 62E).
HexA의 CSF 수준은 모든 SD+AAV 고양이에서 정상보다 높았으며(도 62F), 한 마리의 고양이(11-1042)는 5개월에서 인도적 종점까지 CSF HexA 활성의 급격한 감소를 경험하였다. 세포독성, 아스파테이트 아미노트랜스페라제(AST; 도 62G) 및 락테이트 데하이드로게나제(LDH; 도 62H)의 CSF 마커는 하나의 장기 SD+AAV CM 고양이(11-1042)에서 거의 정상 수준으로 감소하였고, 다른 하나(11-1148)에서는 적당히 증가하였다.
실시예 13
마우스
CNS GM2 강글리오시드 함량의 효과의 단기 생화학적 분석을 위해, SD 마우스에 4.68 x 109 vg 및 2.34 x 1010 vg의 2개의 용량으로 마우스 HexA/B(mHexA/B) 서브유닛을 인코딩하는 AAVrh8-CB-CI-mHexA/B 벡터 제형을 주입하였고, 4.68 x 109 vg 주사된 원래의 AAVrh8 벡터(AAVrh8-CBA-mHexA/B-WPREmut6ΔATG)와 비교하였다. GM2 강글리오시드 함량은 PBS 주사된 SD 마우스에 비해 AAVrh8-CB-CI-mHexA/B 벡터의 어느 한 용량이 주사된 SD 마우스의 대뇌에서 유의하게 더 낮았고, AAVrh8-CB-CI-mHexA/B 벡터의 가장 높은 용량(2.34x1010 vg)에 대해 관찰된 92% 감소는 원래 AAVrh8 벡터가 주사된 SD 마우스에서 기록된 것(97%)과 유사하였다. 소뇌 및 뇌간에서 GM2 강글리오시드 함량의 유의한 감소가 또한 PBS-주사된 SD 마우스와 비교하여 AAVrh8-CB-CI-mHexA/B 벡터가 주사된 SD 마우스에서 관찰되었지만, 원래의 AAVrh8 벡터보다 적은 정도로 관찰되었다. AAVrh8-CB-CI-mHexA/B 벡터가 주사된 SD 마우스의 CNS에서 GM2 감소 정도는 용량 의존적이다(도 63A). AAVrh8-CB-CI-mHexA/B 벡터로 처리된 SD 마우스의 뇌에서 헥소스아미니다제 활성은 용량 의존적이었고 원래의 AAVrh8 벡터보다 7-43배만큼 더 낮았지만, 그럼에도 불구하고 정상보다 2-12배 높았다(도 63B). 또 다른 세트의 SD 마우스(n=8)에 2.34 x 1010 vg의 AAVrh8-CB-CI-mHexA/B를 주사하여 결과 측정에 따라 5개월령까지의 생존(처리되지 않은 SD 마우스의 중앙값 생존보다 1개월 후)을 사용하여 치료 효능을 시험하였다. 대부분의 AAV 처리된 SD 마우스(8마리 중 6마리)는 5개월령까지 생존하였다. 그러나, 2/6 동물만이 5개월에 무증상으로 나타났다(도 63C). 나머지 4마리의 마우스는 다양한 정도의 뒷다리 손상 또는 쇠약을 나타냈다. 뒷다리 손상은 원래의 CBA 벡터와 비교하여 새로운 AAVrh8 벡터 제형에 의한 척수 GM2 강글리오시드 함량의 보다 온건한 감소에 의해 설명될 수 있다(도 63A, 35% 대 70%).
척수 및 소뇌에서 GM2 강글리오시드 저장에 대한 효과를 개선하기 위해, 시상 용량(1.17 x 1010 vg)을 일정하게 유지하면서 측방 뇌실을 통해 CSF에 전달되는 용량을 증가시켰다. SD 마우스에 증가하는 CSF 용량의 AAVrh8-CB-CI-mHexA/B - 1.17 x 1010 vg, 2.34 x 1010 vg, 5.85 x 1010 vg, 5.00 x 1011 vg(코호트 당 n=3)를 주사하였다. 주사 후 1개월에 척수(도 64A) 및 소뇌(도 64B)에서 GM2 강글리오시드 함량의 감소는 4.68 x 109 vg로 주사된 원래 AAVrh8 벡터와 유사한 효과를 나타내는 가장 높은 용량(5.2x1011 vg 전체)으로 용량 의존적이었다.
실시예 14
테이 삭스병에 걸린 단일 대상체에 대해 동정적 사용(compassionate use) 연구를 설계하였다. rAAVrh8-HexA/B는 상기 제시된 전임상 데이터 및 테이 삭스병을 갖는 환자가 이용할 수 있는 치료의 부족에 기초하여 투여하였다.
처리 전 3주에, 진행된 영아 테이 삭스병(약 30개월 연령)을 갖는 대상체에게 여러 임상 안전성 시험을 제공하고, 처리 전 대략 7일 동안 면역억제 요법을 투여하였다. 대상체는 2개의 돌연변이체 HexA 대립유전자를 갖는다: 1) HexA, 4-BP 삽입(c.1274-1278) 가장 흔한 아쉬케나지 돌연변이; 및 2) HexA, c.82 C->T (p.Gln28). 또한, 대상체는 이전에 하기와 같은 질병 진행을 나타내었다:
8 mo - 과장된 놀람 반사
12 mo - MRI에서 비정상적인 수초화를 갖는 대두증, 비정상적인 MRS 바이오마커
14 mo - 최초 무열성 발작 → 진단
17 mo - G-튜브 삽입
20 mo - 재발성 발작으로 인한 응급 방문
대상체의 발작은 필요에 따라 기준선 약물 및 직장 미다졸람으로 합리적 통제하에 있었다. 대상체에 케톤생성 식이, 미글루스타트(Miglustat), 케프라(Keppra), 프레바시드(Prevacid) 및 클로나제팜(Clonazepam)을 G-튜브 공급하였다.
rAAVrh8-HexA/B rAAV 생물학적 생성물을 포함하는 조성물을 대상체의 CSF 압력에 의해 지시된 속도로 대상체에 주입하였다. 투여된 rAAVrh8-HexA/B 제형의 표적 용량은 1.0 x 1014 벡터 유전체(vg) 또는 1.0 x 1014 vg/kg 뇌 중량이었다.
환자에게 투여된 전체 용량은 19-30개월의 여성 영아에서 1040 ± 130 g의 뇌 중량을 기준으로 계산되었다. 전체 용량은 대략 75%가 대수조에 전달되고 대략 25%가 투시-유도 요추 척수강 내 카테터를 통해 척추관에 투여되었다(도 74A). 14 mL의 CSF를 수동 흐름에 의해 제거하였고, 이어서 대수조 수준에서 약 1 mL/분으로 9 ml의 AAVrh8 벡터를 투여하였다(도 74B). 3ml의 AAVrh8 벡터를 L2 수준으로 주입하였다(도 74C). 대상체의 진행성 질병으로 인해, rAAVrh8-HexA/B의 공동 전달된 시상 내 주사는 대상체에 투여되지 않았다.
연구에 사용된 생물학적 생성물은 AAVrh8-CB-ci-HEXA 및 AAVrh8-CB-ci-HEXB(rAAVrh8-HexA/B)로 명명된 2개의 비-복제 단일 가닥 아데노-관련 바이러스 벡터였으며, 이는 별도로 생성되었다. 벡터의 분자 특징은 표 9 및 10에 기재되어 있다. AAVrh8 벡터는 닭 베타-액틴 프로모터 하에 인간 HEXA 및 HEXB를 인코딩한다. 사용된 AAV 벡터 플라스미드는 도 65-67에 도시되어 있다. 벡터는 Mg2+ 및 Ca2+ 없이 인산염 완충 식염수로 제형화되었다.
rAAVrh8-HexA/B는 일반적으로 3개월의 임상 업데이트 시점에 보고된 투여와 관련된 심각한 유해 사례 없이 잘 용인되었다. 3개월에, 처리 후 임상적으로 관련된 실험실 이상이 관찰되지 않았고, 처리 후 유의한 면역 반응이 관찰되지 않았다. 대상체의 임상 상태는 신경학적 검사에서 관찰된 악화 없이 기준선에서 3개월까지 안정적이었다. 또한, 기준선에서 뇌의 처리 전 MRI와 비교하는 경우 3개월에 뇌의 자기 공명 영상화(MRI)에서 기준선으로부터의 악화의 증거가 분명하지 않았다. 이들 데이터는 도 69에 제시된다.
3개월에서의 데이터 수집은 또한 대상체의 CD19 및 CD20 수 둘 모두가 1회 용량의 리툭시맙에 의해 완전히 억제되었고(<1%의 말초 T 세포), IgG가 IVIg 주입에 의해 안전한 범위로 유지되었음을 나타내었다. 이들 데이터는 도 70에 제시된다.
대상체는 3개월 후에 AAVrh8 캡시드에 대한 거의 기준선 수준의 중화 항체를 가졌고, 3개월 후에 트랜스진 생성물에 대한 중화 항체가 관찰되지 않았다. 추가로, 트랜스진 생성물에 대한 T-세포 반응 또는 캡시드에 대한 세포독성 T 세포 반응은 3개월 후에 관찰되지 않았다. T조절 반응의 자극은 캡시드에 대한 장기적인 면역 내성의 성공적인 유도를 입증하며, 이는 향후 면역 반응을 방지한다.
효소 AST(기준선의 2배 미만) 및 ALT(정상 상한의 2배 미만)의 매우 약간의 증가가 처음 21일에 걸쳐 관찰되었으며, 자발적으로 해결되었다. hs-CRP 또는 전체 보체 활성에 기초한 전신 염증의 징후는 관찰되지 않았다. 간 초음파 및 소아 GI 상담은 특정 병리를 나타내지 않았다.
β-헥소스아미니다제 A 활성을 4MUGS 검정을 사용하여 결정하였다. 기준선에서, CSF에서의 대상체의 β-헥소스아미니다제 A 활성은 정상의 0.46%였다. 3개월에서, CSF에서 대상체의 β-헥소스아미니다제 A 활성의 정상 효소 활성의 1.44%로의 명백한 증가가 있었으며, 이는 기준선으로부터 3배 이상의 증가를 나타낸다. 3개월까지의 rAAVrh8-HexA/B 투여 전 및 후의 혈청 및 CSF에서 HexA 효소 활성이 도 68에 제시된다.
도 71에 제시된 바와 같이 대뇌 척수액(CSF)에서 기준선으로부터 GM2 강글리오시드의 대략 25%의 감소가 있었다. 이는 CSF에서 β-헥소스아미니다제 A 효소 활성의 기준선으로부터의 3배 증가가 테이-삭스병 환자에서 축적되고 질병 진행을 유발하는 것으로 생각되는 GM2 강글리오시드의 감소와 관련이 있음을 나타낸다. 또한, 웨스턴 블롯에 의해 측정된 β-헥소스아미니다제 A 단백질 발현은 기준선으로부터 3개월까지 증가하였다. 이들 데이터는 도 72에 제시된다.
표 9: 플라스미드 pAAV-CB-ci-hHexA(v2)의 분자 특징
Figure pct00009
표 10: 플라스미드 pAAV-CB-ci-hHexB의 분자 특징
Figure pct00010
실시예 15
진행된 영아 테이 삭스병을 갖는 두 번째 대상체(약 3개월 연령)에 rAAVrh8-HexA/B를 투여하였다. 처리 전 3주에서, 대상체는 여러 임상 안전성 시험을 받았고, 처리 전 대략 7일 동안 면역억제 요법을 투여 받았다. 대상체는 2개의 돌연변이체 HexA 대립유전자를 갖는다: 1) HexA, 엑손 11-13의 1.75kb 결실; 및 2) HexA, p.Val381* 엑손 10에서 트렁케이션 돌연변이.
rAAVrh8-HexA/B의 투여 전, 대상체는 정상 검사, 정상 성장 및 발달, 및 발작 또는 과장된 놀람 반응의 증거 없음으로 임상적으로 양호하였다. 대상체는 야생형 활성과 비교하여 약 1% 헥소스아미니다제 활성을 가졌다.
실시예 16
(rAAVrh8-HEXA/B)에 대한 임상 연구를 설계하였다. 상기 연구는 영아 발병 테이-삭스(TSD) 또는 샌드호프병(SD)에서 HEXA 및 HEXB를 인코딩하는 AAVrh8 벡터의 별도의 양측 실질내 시상 및 척수강 내 투여의 2단계, 용량 증가 및 안전성 및 효능 연구로 설계되었다. 임상 연구는 하기에 기재된 바와 같이 요약된다. GM2 강글리오시드증의 신속한 진행 및 치명적인 특성 및 승인된 요법의 부족으로 인해, 연구는 위약 또는 활성 대조군을 사용하지 않을 것이다. 처리는 맹검되지 않을 것이다.
본 연구의 대상체는 유전자 돌연변이 분석 및 증상 발병에 기초하여 영아 발병 TSD 또는 SD를 갖는 유전자 전달 시점에서 18개월 연령 미만(조산(임신 37주 미만) 영아에 대해 조정됨)의 남성 및 여성 영아일 것이다. TSD 및 SD 대상체는 α 서브유닛을 인코딩하는 HEXA 유전자의 돌연변이 또는 β 서브유닛을 인코딩하는 HEXB 유전자의 돌연변이를 각각 가져야 한다. 대상체는 5초 동안 지지 없이 앉는 능력을 나타내고, 적절한 수술 후보자로 간주되고(시험 및 MRI 소견에 기초하여 연구 신경외과의에 의해 확인됨), 혈청 Hex A 활성이 정상의 5% 미만이며, G269S 또는 W574C 돌연변이를 갖지 않을 것이다. 대상체는 또한 실험실 검정 역치에 기초하여 AAVrh8 중화 항체에 대해 혈청음성일 것이다. 다른 포함/제외 기준이 또한 적용될 수 있다.
연구는 양측 시상(BiTh) 및 척수강 내(IT) 투여에 의한 바이러스, 벡터 rAAVrh8-HEXA/B의 개방 라벨, 비-무작위화, 단일 투여일 것이다. 대상체는 다음과 같이 두 단계로 연구에 등록될 것이다(도 73):
단계 1: 최적 용량을 결정하기 위한 목적으로 4명의 대상체를 용량 증가 방식으로 순차적으로 처리할 것이다. 용량 선택은 안전성, 바이오마커 및 추가 데이터로부터 결정될 것이다; 단계 2: 최대 약 10명의 대상체가 안전성 및 효능을 결정하기 위한 목적으로 단계 1에서 확인된 최적 용량으로 처리될 것이다.
모든 대상체는 처리의 지속적인 안전성 및 효능을 결정하기 위해 최대 4년 동안 계획된 장기 추적(LTFU)에 참여할 것이다.
연구 처리는 다음과 같이 연장된 마취 시간의 위험을 최소화하기 위해 2일의 과정에 걸쳐 제공될 것이다: 방문 1a/0일에, 대상체는 뇌의 각각의 측면 상의 시상으로 rAAVrh8-HEXA/B의 양측 실질 내 주사를 투여받을 것이고; 방문 1b/1일에, 대상체는 rAAVrh8-HEXA/B의 IT 주입을 투여받을 것이다. 모든 주입은 rAAVrh8-HEXA 및 rh8AAV-HEXB의 1:1 혼합물로 구성될 것이다.
염증 반응의 위험을 예방하고 AAVrh8 캡시드에 대한 면역 반응으로부터 AAV-형질도입된 세포를 보호하기 위해, 대상체는 AAVrh8-HexA/B 처리의 투여 전에 면역억제될 것이다. 면역억제 요법은 미리 정의된 바와 같이 장기간 유지될 것이다.
연구의 -16일에 시작하여 하기가 개시될 것이다:
● 375 mg/m2 BSA의 리툭시맙
● 10 mg/kg의 Solu-Medrol
● 1 mg/m2 BSA의 시롤리무스
● 2 mg/kg/일의 프레드니솔론
● 1-1.5 mg/kg/일의 란소프라졸
● 10 mg/kg/용량으로 주 당 3회(M, W, F) 제공되는 트리메토프림/설파메톡사졸
-7일:
● 시롤리무스, 프레드니솔론 및 란소프라졸 투여의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
● 5% 이상의 지속적인 CD20 수에 필요한 리툭시맙 주입
-2일:
● 시롤리무스, 프레드니솔론 및 란소프라졸 투여의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
0일/BiTh 주입 일
● 시롤리무스, 프레드니솔론 및 란소프라졸 투여의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
1일 IT 주입 일
● 시롤리무스, 프레드니솔론 및 란소프라졸 투여의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
2-7일:
● 시롤리무스, 프레드니솔론 및 란소프라졸 투여의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
● 정맥 내 면역글로불린(IVIG) 투여 - 면역글로불린 수준은 700 mL/dL 미만이어야 한다. 용량은 700-1000 mg/dL의 혈청 최저 수준을 유지하도록 조정될 것이다. 벡터 주입 후 발생할 것이다.
14일:
● 시롤리무스, 프레드니솔론 및 란소프라졸 투여의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
21일:
● 시롤리무스, 프레드니솔론 및 란소프라졸 투여의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
4주/1개월:
● 시롤리무스, 프레드니솔론 및 란소프라졸 투여의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
● IVIG의 투여
4주/2개월:
● 시롤리무스, 프레드니솔론 및 란소프라졸 투여의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
● IVIG의 투여
12주/3개월:
● 시롤리무스의 지속
● 트리메토프림/설파메톡사졸의 지속
● IVIG의 투여
24주/6개월
● 상담 병원 약사의 지도하에서 시롤리무스 이유
시상 내(ITh) 용량
단계 1에 대해 시상(Th)으로 전달될 제안된 임상 용량 및 주입 부피는, 예를 들어, 표 11에 제시된 바와 같이 2.8e12 내지 1.1e13 vg/ml이다.
표 11.
Figure pct00011
벡터로 채워진 시상의 양 또는 분포 부피(Vd)는 전달 지점 공급원으로부터 얼마나 멀리 벡터가 퍼져 있는가에 대해 보정 계수에 의해 곱해진 표적 뇌 영역(시상)의 부피인 주입 부피(Vi)를 기초로 하여 계산될 수 있다. 다른 AAV IPa 주입 연구로부터, Vd:Vi의 비율은 3.0으로 가정되었다(Yin, Richardson et al. 2010)(Yin et al, 2010). 인간 시상에 대한 부피는 표 12에 제시된 바와 같이 1.08mL의 Vi 및 4.35ml3의 Vd(측면 당 전체 시상 부피의 77%)로 계산되었다.
표 12.
Figure pct00012
1.08ml의 Th 주입 부피는 임상 시험의 단계 1에서 대상체 1 내지 3에 대해 제안된 주입 부피 이상이다. 저용량, 중간 용량 및 고용량의 시상 내 투여를 위한 조정된 제안된 임상 용량은 7.2e12 내지 1.4e13 vg이다.
척수강 내(IT) 용량
척수강 내 투여를 위한 제안된 인간 용량은 2.03e13 내지 8.13e13 vg 범위 및 최대 8 mL 주입 부피의 용량이다(하기 표 참조). 후자의 값은 모든 처리된 대상체에 걸쳐 8.0e13 vg의 세트 IT 용량으로 임상 연구에 사용되도록 제안된다.
표 13.
Figure pct00013
대상체는 절차 전체에 걸쳐 삽관과 함께 전신 마취하에 놓일 것이다. 벡터로 프라이밍되고 전달 주사기 및 펌프에 부착된 우측 주입 캐뉼라 및 부착된 라인은 이후 0.1 μL/분의 주입을 실행하는 동안 우측 시상의 표적 영역에 정위 배치되어 캐뉼라 첨단의 임의의 폐색을 방지한다. 유연한 카테터 관류는 고정 복합사 및 접착 드레싱으로 두피에 고정된다. 이후, 좌측에 두 번째 카테터를 배치하기 위해 동일한 단계를 반복한다. 절차 전체에 걸쳐 지속적인 ICP 모니터링이 수행될 것이다.
주입 속도는 0.5 μL/분에서 시작하여, 5분마다 증가하였다(1.0 μl/분 → 2.0 μl/분 → 5 μl/분). 연구 약물은 HexA 및 HexB 벡터의 1:1 혼합물로서 연구 약물을 함유하는 미세주입 펌프 및 주사기를 통해 각각의 카테터로 주입된다.
IT 투여:
IT 약물 주입은 CSF 압력에 의해 지시된 속도로 주입될 것이다. 높은 경부 수준/대수조로 전체 6.0 ml 및 흉요 수준에서 2.0 ml가 전달될 것이다. 투시 지도하에 지주막하 공간에 Tuohy 척추 바늘을 삽입할 것이다. 지주막 하 공간으로의 진입은 자발적인 CSF 흐름으로 확인될 것이다. 전체 6-7 mL의 CSF가 중력에 의해 배출된 후, 유연한 Excelsior® SL-10® 마이크로카테터(Stryker Neurovascular, Stryker)가 직접적인 투시 지도하에 대수조에 가깝게 또는 내부로 나사산이 삽입될 것이다. 연구 약물(HexA 및 Hex B의 1:1 혼합물)을 함유하는 주사기가 카테터에 부착되고, 높은 경부/대수조 수준으로 6.0 ml가 투여된 후 마이크로카테터를 더 낮은 흉요 수준으로 후퇴시키고, 여기서 2.0 ml의 두 번째 볼루스가 투여될 것이다. 주사 완료시 마이크로카테터(약 0.3 mL의 무효 부피)는 0.5 mL 식염수로 플러싱된 후 제거될 것이다. 척추 해부학 및 기타 고려사항에 기초한 외과의의 재량에 따라, 용량은 높은 경부/대수조 및 흉요 수준으로 2개의 개별 IT 주입에 의해 투여될 수 있다.
1차 종점(들):
● 단계 1: 등급이 매겨진 NCI CTCAE v5.0에 따른 치료 응급 부작용(TEAE)의 발생률, 중증도, 심각도 및 치료 관련성
단계 2:
● 대리 생물학적 마커: 기준선에서 방문 7(3개월)까지 혈청/CSF HexA 활성 변화
● 임상 기능: 방문 9/12개월에서 Bayley Scales of Infant and Toddler Development, Third Edition(BSID-III)의 항목 22에서 평가된 바와 같이 5초 동안 지지 없이 앉을 수 있는 능력을 달성한 대상체의 비율
LTFU: 유해 사례
2차 종점(들) :
단계 1:
● 체중을 포함한 활력 징후의 변화
● 신체 및 신경학적 검사의 변화
● 자가-차별, 포괄적 대사 패널 및 hs-CRP를 사용한 완전한 혈구수를 포함한 임상 실험실 시험의 변화
● CD20 수
● ECG, EEG,
● AAVrh8 캡시드 및 HEXA 및 HEXB 단백질에 대한 세포 반응 및 중화 항체 역가뿐만 아니라 HEXA 및 HEXB 단백질에 대한 항체 수준
단계 2:
● 질병의 생물학적 마커:
- 기준선으로부터 방문 9(12개월)까지의 CSF HexA 활성 수준 변화
- 기준선으로부터 방문 4, 5, 6, 7, 8 및 9까지의 혈청 HexA 활성 수준 변화
- 기준선(LC-MS/MS에 의함)에서 방문 9(12개월)까지의 CSF GM2 강글리오시드 수준 변화
- 기준선으로부터 방문 7(3개월) 및 9(12개월)까지의 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 및 아스파테이트 아미노트랜스페라제(AST)의 CSF 수준 변화
● 임상 기능:
1. 5, 7 및 8에 BSID-III의 항목 22에서 평가된 바와 같이 5초 동안 지지 없이 앉는 능력을 달성하는 대상체의 비율
2. 기준선으로부터 방문 5, 7, 8 및 9까지 CHOP-INTEND 전체 스코어 변화
3. 방문 5, 7, 8 및 9에서 CHOP INTEND 운동 기능 척도에서 40 이상, 50 이상 및 64의 스코어를 달성하는 대상체의 비율
4. 기준선으로부터 방문 5, 7, 8 및 9까지의 BSID-III 복합 스코어 변화
5. 방문 7, 8 및 9에서 해머스미스 유아 신경학 검사(Hammersmith Infant Neurological Examination)-2 (HINE-2)에서 평가된 바와 같이 임의의 새로운 운동 이정표를 달성한 대상체의 비율
새로운 운동 이정표는 지지 없이 앉아 있고, 손-및-무릎을 대고 기고, 도움을 받아 서 있고, 도움을 받아 보행하고, 혼자 서 있고 혼자 보행하는 것으로 정의된다.
6. BSID-III - 대동작 운동(Gross Motor) 서브셋 #43을 사용하여 독립적으로 조정 및 균형을 나타내는 적어도 5단계를 수행하는 대상체의 비율
탐색적 종점(들) - 단계 2 :
● 기준선으로부터 방문 7, 8 및 9까지의 뇌간 청각 유발 반응(BAER) 및 시각 유발 반응(VER)의 기준선으로부터의 변화
● 기준선으로부터 방문 7 및 9까지의 수초화 및 뇌수 변화의 MRI 뇌 부피 및 확산 텐서 영상화(DTI) 지수
● 기준선으로부터 방문 7 및 9까지의 대사산물 축적 변화의 MRS 지수
● 기준선으로부터 방문 4, 5, 6, 7, 8 및 9까지의 시선 추적 평가 변화
하기는 스크리닝에서 치료 종료까지 평가될 것이다:
● 유해 사례는 NCI CTCAE v5.0에 따라 평가되고 등급이 매겨질 것이다.
● 신체 검사
● 활력 징후
● 표준 임상 실험실 시험: 혈액학, 임상 화학, 응고 및 소변검사
● 특별 관심 유해 사례(AESI):
- 수술 관련 합병증
- 장치 관련 합병증
- 급성 과민 반응
- 간 기능 검사 증가 (AST/ALT, GGT)
- 혈소판 수에 대한 특별 관심을 갖는 혈액학적 파라미터 장애
- 자가면역-유사 반응 및 악성종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는 지연 유해 사례
실시예 17
본 발명의 개시와 관련된 추가 세부사항은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2019년 4월 29일에 출원된 미국 가출원 62/840,359호의 부록 A에 제공된다.
마이크로카테터를 통한 대수조로의 AAV 투여 방법을 시험하였다. scAAV9-CB-GFP를 혈관 내 마이크로카테터를 통해 1x1014 vg로 양(30 kg, n=3)에 주사하였다. 마이크로카테터는 마이크로카테터 첨단이 최종적으로 배치될 때까지(도 75B, 우측 패널, 화살표) 양의 흉부 및 경부 영역을 통해 투시검사에 의해 안내되었다(도 75A). 조영제 주사 후, 15 ml의 scAAV-CB-GFP를 1 ml/분으로 주입하고, 소뇌 주위의 분포 패턴을 이미지화하였다. 이후, 양을 희생시키고, 사후 척수의 큰 이미지를 관찰하였다(도 75C). 면역조직화학 염색은 GFP가 운동 뉴런, 척수의 감각 뉴런(도 75D), 및 뇌의 푸르킨예 세포, 소뇌 다리, 심부 소뇌 핵, 뇌간, 후두 피질, 두정 피질, 시상, 해마, 측두 피질, 운동 피질, 내부 피막, 및 전두 피질에서 발현된 것을 나타낸다(도 75E-G). 이들 결과는 마이크로카테터를 통한 대수조로의 AAV 투여가 관심 트랜스진(예를 들어, GLB1, HEXA, HEXB 등)을 효율적으로 전달하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 개시는 이의 적용에서 본 설명에 기재되거나 도면에 예시된 구성의 세부사항 및 구성요소의 배열에 제한되지 않는다. 본 발명의 개시는 다른 구현예가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 어법 및 용어는 설명을 위한 것이며 제한적인 것으로 간주되어선 안 된다. 본원에서 "포함하는(including)", "포함하는(comprising)", 또는 "갖는", "함유하는", "수반하는" 및 이들의 변형의 사용은 이후에 나열된 항목 및 이의 등가물뿐만 아니라 추가 항목을 포함하는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 개시의 적어도 하나의 구현예의 여러 양태가 기재되었지만, 다양한 변경, 변형 및 개선이 당업자에게 용이하게 발생할 것임이 인지되어야 한다. 상기 변경, 변형 및 개선은 본 발명의 개시의 일부가 되도록 의도되고, 본 발명의 개시의 사상 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 설명 및 도면은 단지 예이다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS <120> RAAV VECTORS FOR THE TREATMENT OF GM1 AND GM2 GANGLIOSIDOSIS <130> U0120.70109WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/848,858 <151> 2019-05-16 <150> US 62/840,359 <151> 2019-04-29 <150> US 62/826,863 <151> 2019-03-29 <150> US 62/815,996 <151> 2019-03-08 <150> US 62/814,587 <151> 2019-03-06 <150> US 62/741,848 <151> 2018-10-05 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 60 ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 120 ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 180 gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 240 aaagcgaagc gcgcggcggg 260 <210> 2 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 tcgactctga cggttcacta aacgagctct gcttatatag 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Claims (60)

  1. 키메라 인트론을 통해 HEXA 및 HEXB로부터 선택되는 리소좀 축적병-관련 단백질을 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 재조합 AAV(rAAV).
  2. 제1항에 있어서, 핵산이 인핸서 요소를 포함하지 않는 재조합 AAV.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터가 닭 베타-액틴(CB) 프로모터를 포함하는 rAAV.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 인트론이 닭 베타 액틴 인트론 서열 및/또는 토끼 베타 글로빈 인트론 서열을 포함하는 rAAV.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 인트론이 비번역 서열의 측면에 있고, 선택적으로 상기 비번역 서열이 토끼 베타-글로불린 비번역 서열인 rAAV.
  6. 제5항에 있어서, 토끼 베타-글로불린 비번역 서열이 엑손 1 또는 엑손 2로부터의 비번역 서열인 rAAV.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 키메라 인트론과 아데닐중합체형성 신호 사이에 위치하고, 선택적으로 상기 트랜스진이 비번역 서열과 아데닐중합체형성 신호 사이에 위치하는 rAAV.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, HexA가 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 rAAV.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, HexB가 SEQ ID NO: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 rAAV.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10 및 AAVrh10으로부터 선택되는 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 AAVrh8 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 하나 이상의 ITR을 포함하고, 여기서 각각의 ITR이 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR 및 AAV6 ITR로 구성된 군으로부터 선택되는 rAAV.
  13. SEQ ID NO: 1 내지 6 또는 16-19에 제시된 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  14. SEQ ID NO: 20 또는 21에 제시된 서열을 갖는 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  15. 제13항 또는 제14항의 분리된 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 숙주 세포.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 숙주 세포.
  18. 제15항에 있어서, 세포가 원핵 세포인 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 숙주 세포.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산을 추가로 포함하는 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 캡시드 단백질이 AAVrh8 캡시드 단백질 또는 AAVrh10 캡시드 단백질인 숙주 세포.
  22. (i) 키메라 인트론을 통해 베타-헥소사미니다제 서브유닛 알파(HexA)를 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 제1 rAAV로서, 선택적으로 상기 HexA가 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제1 rAAV; 및
    (ii) 키메라 인트론을 통해 베타-헥소사미니다제 서브유닛 베타(HexB)를 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 제2 rAAV로서, 선택적으로 상기 HexB가 SEQ ID NO: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제2 rAAV를 포함하는 약학적 조성물로서,
    선택적으로 상기 약학적 조성물이 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 제1 rAAV 및/또는 제2 rAAV가 AAVrh8 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 제1 핵산 및/또는 제2 핵산이 트랜스진의 측면에 있는 AAV ITR을 포함하고, 선택적으로 상기 AAV ITR이 AAV2 ITR인 약학적 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 및/또는 제2 핵산이인핸서 요소를 포함하지 않는 약학적 조성물.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 프로모터 및/또는 (ii)의 프로모터가 닭 베타-액틴(CB) 프로모터를 포함하는 약학적 조성물.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 및/또는 (ii)의 키메라 인트론이 닭 베타 액틴 인트론 서열 및/또는 토끼 베타 글로빈 인트론 서열을 포함하는 약학적 조성물.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 및/또는 (ii)의 키메라 인트론이 비번역 서열의 측면에 있고, 선택적으로 상기 비번역 서열이 토끼 베타-글로불린 비번역 서열인 약학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 토끼 베타-글로불린 비번역 서열이 엑손 1 또는 엑손 2로부터의 비번역 서열인 약학적 조성물.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 트랜스진 및/또는 (ii)의 트랜스진이 키메라 인트론과 아데닐중합체형성 신호 사이에 위치하며, 선택적으로 트랜스진이 비번역 서열과 아데닐중합체형성 신호 사이에 위치하는 약학적 조성물.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 rAAV 및 제2 rAAV가 1:1의 비로 조성물에 존재하는 약학적 조성물.
  32. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 AAV(rAAV) 또는 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 리소좀 축적병을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 리소좀 축적병을 치료하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 리소좀 축적병이 테이 삭스병 또는 샌드호프병인 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, rAAV 또는 약학적 조성물이 두개내 주사, 뇌내 주사, 또는 대뇌 심실 시스템, 소뇌숨뇌수조 또는 척수강내 공간을 통한 CSF로의 주사에 의해 투여되는 방법.
  35. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 AAV(rAAV)를 수용하는 용기를 포함하는 키트.
  36. (i) 키메라 인트론을 통해 베타-헥소사미니다제 서브유닛 알파(HexA)를 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 제1 rAAV를 포함하는 제1 용기로서, 선택적으로 상기 HexA가 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제1 용기; 및
    (ii) 키메라 인트론을 통해 베타-헥소사미니다제 서브유닛 베타(HexB)를 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 제2 rAAV를 포함하는 제2 용기로서, 선택적으로 상기 HexB가 SEQ ID NO: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제2 용기; 및 선택적으로
    (iii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제3 용기를 포함하는 키트.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 제1 용기, 제2 용기 및/또는 제3 용기가 주사기인 키트.
  38. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 소뇌숨뇌수조 및/또는 척수강내 공간을 통한 CSF로의 주사를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 투여가 시상내 주사를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제32항 내지 제34항 또는 제38항 또는 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 소뇌숨뇌수조 및 척수강내 공간을 통한 CSF로의 주사, 및 시상내 주사에 의한 것인 방법.
  41. 제32항 내지 제34항 또는 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 투시-유도 요추 척수강내 카테터를 통해 척수강내 공간에 투여되는 방법.
  42. 제32항 내지 제34항 또는 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여된 총 rAAV가 약 1x1011 내지 1 x 1015 벡터 게놈(vg) 복사체인 방법.
  43. 제32항 내지 제34항 또는 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 rAAV 또는 약학적 조성물의 투여 전에 대상체의 CSF에서 0.5% 미만의 정상 β-헥소사미니다제 A 활성을 갖는 방법.
  44. 제32항 내지 제34항 또는 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 rAAV 또는 약학적 조성물의 투여 약 3개월 후에 정상 효소 활성의 적어도 0.5%, 적어도 1.0% 또는 적어도 1.4%인 CSF에서의 β-헥소사미니다제 A 효소 활성의 증가를 갖는 방법.
  45. 제32항 내지 제34항 또는 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 투여 전 대상체의 기준선과 비교하여 CSF에서 β-헥소사미니다제 A 효소 활성의 적어도 2배 증가 또는 적어도 3배 증가를 갖는 방법.
  46. SEQ ID NO: 23에서와 같은 인간 GLB1 서열을 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 함유하는 캡시드를 포함하는 재조합 AAV(rAAV).
  47. SEQ ID NO: 23에서와 같은 인간 GLB1 서열을 인코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 분리된 핵산.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 프로모터가 닭 베타-액틴(CB) 프로모터를 포함하는 rAAV 또는 분리된 핵산.
  49. 제46항 또는 제48항에 있어서, rAAV가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10 및 AAVrh10으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV.
  50. 제49항에 있어서, rAAV가 AAV9의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV.
  51. 제46항 또는 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 하나 이상의 ITR을 포함하고, 여기서 각각의 ITR이 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR 및 AAV6 ITR로 구성된 군으로부터 선택되는 rAAV.
  52. 제51항에 있어서, rAAV가 하나 이상의 AAV2 ITR을 포함하는 rAAV.
  53. 제46항 또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 rAAV 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  54. 제46항 또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 재조합 AAV(rAAV) 또는 제53항의 약학적 조성물을 GM1 강글리오시드증을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 GM1 강글리오시드증을 치료하는 방법.
  55. 제49항에 있어서, 투여가 정맥내 투여인 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 용량이 대상체 체중의 킬로그램(kg) 당 약 1011 내지 1014 rAAV 벡터 게놈(vg) 복사체인 방법.
  57. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 rAAV 또는 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 GM2 강글리오시드증을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 GM2 강글리오시드증을 치료하는 방법.
  58. 제32항 내지 제34항, 제38항 내지 제45항 또는 제57항 중 어느 한 항에 있어서, GM2 강글리오시드가 rAAV 또는 약학적 조성물의 투여 약 3개월 후에 대상체의 대뇌 척수액(CSF)에서 기준선으로부터 적어도 15%, 적어도 20% 또는 적어도 25%만큼 감소되는 방법.
  59. 제32항 내지 제34항, 제38항 내지 제45항 또는 제57항 또는 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 시상에 투여되는 용량이 약 1 x 1011 내지 1 x 1015 vg인 방법.
  60. 제32항 내지 제34항, 제38항 내지 제45항 또는 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 소뇌숨뇌수조 및/또는 척수강내 공간에 투여되는 용량이 약 1 x 1011 내지 1 x 1015 vg인 방법.
KR1020217013419A 2018-10-05 2019-10-04 Gm1 및 gm2 강글리오시드증의 치료를 위한 raav 벡터 KR20210087462A (ko)

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