CN103626856B - 转录因子AtGT4及其编码基因与应用 - Google Patents
转录因子AtGT4及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103626856B CN103626856B CN201210305931.3A CN201210305931A CN103626856B CN 103626856 B CN103626856 B CN 103626856B CN 201210305931 A CN201210305931 A CN 201210305931A CN 103626856 B CN103626856 B CN 103626856B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant
- sequence
- atgt4
- gene
- encoding gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 101000847291 Arabidopsis thaliana Xyloglucan 6-xylosyltransferase 4 Proteins 0.000 title abstract description 55
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 title abstract description 13
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 title abstract description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 77
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 claims abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 26
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 14
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 abstract description 15
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 abstract description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000012797 qualification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 abstract description 4
- 241000044469 Oplismenus hirtellus Species 0.000 abstract description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 15
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 14
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 7
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 7
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 241000218218 Ficus <angiosperm> Species 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 3
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010001572 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000000806 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004298 light response Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229940064457 osmitrol Drugs 0.000 description 1
- 238000009400 out breeding Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种转录因子AtGT4及其编码基因与应用。本发明提供的所提供的蛋白,是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明,发现了一种基因,其具有耐盐性,对于培育耐逆植物品种,特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值,可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定,对提高农作物产量具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种转录因子AtGT4及其编码基因与应用。
背景技术
环境中物理、化学因素的变化,例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响,严重时会造成农作物大规模减产,因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前,应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫,其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子,例如:EREBP/AP2中的DREB类,bZIP,MYB等等。Trihelix转录因子是植物特有的一类转录因子家族。Trihelix转录因子因其蛋白质结构中的DNA结合域有3个α-螺旋(helix-loop-helix-loop-helix)而得名。该蛋白家族的成员根据其DNA结合元件的特异性而划分为3个蛋白亚家族,即GT-1,GT-2和GT-3(Ayadietal.,2004,AnalysisofGT-3aidentifiesadistinctsubgroupoftrihelixDNA-bindingtranscriptionfactorsinArabidopsis,FEBSLetters562,147-154,2004)。就蛋白质结构中DNA结合域数目而言,GT-1类和GT-3类仅在其N端有一个trihelix域,而GT-2类蛋白则具有两个trihelix域,分别位于C端和N端。Trihelix转录因子调控光应答基因的表达,也参与叶与花器官的正常发育(Breweretal.,2004,PETALLOSS,atrihelixranscriptionfactorgene,regulatesperiantharchitectureintheArabidopsisflower,Development131,4035-4046)。
目前已发现大豆Trihelix转录因子在植物耐受非生物胁迫机制中发挥作用(XieZM,ZouHF,LeiG,WeiW,ZhouQY,NiuCF,LiaoY,TianAG,MaB,ZhangWK,ZhangJS*,ChenSY*(2009)SoybeanTrihelixtranscriptionfactorsGmGT-2AandGmGT-2Bimproveplanttolerancetoabioticstressesintransgenicarabidopsis.PLoSONE,.2009Sep;4:4(9)e6898),拟南芥中的此类家族与耐逆的相关性尚未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种转录因子AtGT4及其编码基因。
本发明所提供的蛋白,名称为AtGT4,来源于(ArabidopsisthalianacvColumbia-0,Col-0),是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
上述耐逆具体为耐盐。
其中,序列表中的序列2由372个氨基酸残基组成。
上述蛋白中,所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白AtGT4的基因AtGT4也属于本发明的保护范围。
编码上述蛋白AtGT4的基因如下(1)-(4)中任一一种的DNA分子:
(1)序列表中序列1所示的DNA分子;
(2)序列表中序列1自5’末端第1-1116位核苷酸所示的DNA分子;
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子;
(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
上述耐逆具体为耐盐。
上述基因中,所述严格条件可为如下:50℃,在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交,在50℃,2×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交,在50℃,1×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交,在50℃,0.5×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交,在50℃,0.1×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交,在65℃,0.1×SSC,0.1%SDS中漂洗;也可为:在6×SSC,0.5%SDS的溶液中,在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
其中,序列表中的序列1由1119个脱氧核苷酸组成,本序列为AtGT4基因的读码框,编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
上述重组载体在本发明的实施例中具体为将上述编码基因(序列表中序列1自5’末端第1-1116位核苷酸所示的DNA分子)***表达载体pCAMBIA1302的BamHI和HindIII识别位点间得到的重组载体。
扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
上述引物对在本发明的实施例中具体可为如下1)或2):
1)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对;
2)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对。
上述蛋白或其编码基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用是本发明保护的范围。
上述应用中,所述调节植物耐逆性具体为提高植物耐逆性或降低植物耐逆性;
所述耐逆性具体为耐盐性;
所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物,所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。
本发明的第二个目的是提供一种培育转基因植物方法。
本发明提供的方法是为将所述蛋白的编码基因导入目的植物,获得转基因植物,所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
在上述方法中,所述耐逆性为耐盐性;上述蛋白的编码基因通过上述的重组载体导入目的植物;
上述目的植物为双子叶植物或单子叶植物,所述双子叶植物进一步具体为拟南芥,在本发明的实施例中采用的是哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0);
上述耐盐性进一步具体通过提高存活率体现。
本发明的第三个目的是提供一种降低植物耐逆性的方法。
本发明提供的方法,是降低目的植物中上述蛋白编码基因的表达,得到耐逆性低于所述目的植物的植物;
所述耐逆性为耐盐性;所述耐盐性低于所述目的植物具体体现在莲座直径小于所述目的植物;
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物,所述双子叶植物一步具体为拟南芥,在本发明的实施例中采用的是哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)。
上述方法中的耐逆性低于所述目的植物的植物为T-DNA***突变体gt4,购自ABRC,ABRC编号:salk_095404。
上述的转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物,也包括其子代。对于转基因植物,可以在该物种中繁殖该基因,也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种,特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物,会使所述蛋白质目的植物中合成,进而是目的植物的耐逆性性状得到改良。
上述基因可先进行如下修饰,再导入宿主中,以达到更好的表达效果:
1)根据实际需要进行修饰和优化,以使基因高效表达;例如,可根据受体植物所偏爱的密码子,在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性;优化过程中,最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量,以最好地实现植物中导入基因的高水平表达,其中GC含量可为35%,优选为多于45%,更优选为多于50%,最优选多于约60%;
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列,以使翻译有效起始;例如,利用在植物中已知的有效的序列进行修饰;
3)与各种植物表达的启动子连接,以利于其在植物中的表达;所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子;启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化,而且也取决于靶物种;例如组织或器官的特异性表达启动子,根据需要受体在发育的什么时期而定;尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的,反之亦然,但是理想地,选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达,单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达;
4)与适合的转录终止子连接,也可以提高本发明基因的表达效率;例如来源于CaMV的tml,来源于rbcS的E9;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。
5)引入增强子序列,如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
在实际操作中,也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如,将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合,再导入植物细胞中,就可定位了。
携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。
本发明的实验证明,本发明在拟南芥中发现一个新基因AtGT4,该基因的表达受高盐、300mM甘露醇模拟干旱和低温诱导,因此AtGT4可能与植物对非生物逆境应答的调控相关。将AtGT4导入拟南芥Col0中,获得了过量表达AtGT4基因的纯系株系,将该转基因株系与野生型拟南芥和AtGT4的突变体gt4相比,其耐盐性有显著提高,而突变体gt4的耐盐性则较对照显著下降。说明AtGT4基因的过量表达显著提高了植物的耐盐性。从而说明该基因AtGT4参与植物对高盐胁迫应答的调控,为培育耐盐植物品种,特别是培育耐盐作物、林草等新品种具有重要价值,可用于农牧业和生态环境治理所需的耐盐植物品种的培育和鉴定,对提高含盐土壤中的作物产量具有重要意义。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为AtGT4基因在不同处理时的表达模式
图2为植物表达载体pCAMBIA1302-AtGT4的示意图
图3为AtGT4过表达转基因植株的分子鉴定
图4为AtGT4突变体gt4的分子和耐盐性鉴定
图5为AtCT4过表达株系、突变体与对照的耐盐性比较
图6为AtGT4过表达株系、突变体和对照经盐胁迫后的存活率统计
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的%,如无特殊说明,均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
所有植物材料均生长于22°C每天的光照为16h/8h(光照/黑暗)。
pCAMBIA1302载体记载在LimHS,KoTS,LambertKN,KimHG,KorbanSS,HartmanGL,DomierLL.Soybeanmosaicvirushelpercomponent-proteaseenhancessomaticembryoproductionandstabilizestransgeneexpressioninsoybean.PlantPhysiolBiochem.2005Oct-Nov;43(10-11):1014-21,公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
农杆菌GV3101菌株记载在Clough-SJ,Bent-AF.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.Plant-Journal.1998,16:6,735-743中,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0):种子购自ArabidopsisBiologicalResourceCenter(ABRC),以下简称野生型拟南芥。
所有植物材料均生长于22-25°C每天的光照为16h/8h(光照/黑暗)。
实施例1、大豆AtGT4及其编码基因的筛选及其cDNA的克隆
1、拟南芥AtGT4及其编码基因的获得
前期的研究表明大豆Trihelix类转录因子家族中某些成员参与植物对非生物胁迫的应答反应,并与植物耐逆性相关,例如GmGT2A和GmGT2B等(XieZM,ZouHF,LeiG,WeiW,ZhouQY,NiuCF,LiaoY,TianAG,MaB,ZhangWK,ZhangJS,ChenSY,SoybeanTrihelixtranscriptionfactorsGmGT-2AandGmGT-2Bimproveplanttolerancetoabioticstressesintransgenicarabidopsis.PLoSONE,2009Sep;4:4(9)e6898)。通过Blast搜索拟南芥基因组数据库,聚类了拟南芥Trihelix类基因,共有26个,应用Rt-PCR方法鉴定了26个基因在非生物胁迫,包括高盐、低温和干旱下的表达特征,其中9个基因的表达受至少一种非生物胁迫的诱导。选取9个诱导表达基因中的AtGT4作进一步研究。AtGT4具有序列表中序列1的核苷酸序列,由1119bp组成,编码具有序列表中序列2的氨基酸残基的蛋白,该蛋白命名为AtGT4,序列表中序列2由372个氨基酸残基组成。
根据AtGT4基因序列设计引物:
AtGT4F:5‘-CGGGATCCATGTTTGTTTCCGATAAC-3’,(序列3)
AtGT4R:5‘-GGGGTACCCCTCTCATTCCTCTGTATAAG-3’(序列4)
应用RT-PCR方法,从拟南芥总RNA中扩增AtGT4基因,具体方法如下:
取野生型拟南芥叶片,置于液氮中研碎,悬于4mol/L硫氢酸胍中,并用酸性苯酚、氯仿抽提,向上清中加入无水乙醇进行沉淀,最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录,以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20μlPCR反应体系为:1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(20μM)、2μl10×PCR缓冲液、0.4μldNTP(10mM)和1UTaqDNA聚合酶,用超纯水补足20μl,液面覆盖液体石蜡油。反应在PE9600型PCR仪上进行,其程序为94℃变性5min;再94℃1min,56℃1min,72℃1min,共30-32个循环;然后72℃延伸10min;4℃保存。所获得的PCR产物约1100bp。经回收后序列分析表明,该PCR产物的大小为1119bp,具有序列表中序列1自5’末端第1-1116位核苷酸,即为AtGT4基因。
将上述PCR产物克隆于pMD18-T质粒的多克隆位点,得到重组载体pMDAtGT4,并且测序验证构建成功。
2、AtGT4基因在非生物胁迫下的表达特征
对野生型拟南芥进行300mM甘露醇模拟的干旱、200mMNaCl和0℃低温处理,用于分析拟南芥AtGT4在非生物胁迫下的表达特征。将拟南芥种子种在盆中,生长2星期后,对幼苗分别进行下述胁迫处理:
干旱处理:将拟南芥幼苗的根系置于300mM甘露醇水溶液中,分别在光照条件下干旱培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。
盐处理:将拟南芥幼苗的根系置于200mMNaCl水溶液中,分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。
低温处理:将拟南芥幼苗置于0℃培养箱中,分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。
总RNA的提取上述1。应用RT-PCR分析AtGT4基因在上述处理时的转录特征,所用引物同上述。结果如图1所示,1A中从左到右依次为盐处理、干旱处理、低温处理下AtGT4基因的的RT-PCR扩增;1B为盐处理后AtGT4基因的相对表达量;1C为干旱处理后AtCT4基因的相对表达量;可以看出,随着不同的处理时间,AtCT4基因的表达有变化,表明AtGT4参与植物对非生物胁迫的应答反应,可能与植物的耐逆性相关。
实施例2、AtCT4的应用
一、转AtGT4拟南芥株系(过量表达AtGT4拟南芥株系)的获得
1、重组表达载体pCAMBIA1302-AtCT4的构建
从野生型拟南芥中提取总RNA,反转录得到cDNA为模板(也可以序列1为模板),用Primer-F+和Primer-R-作为引物进行PCR扩增,获得约1.1Kb的PCR产物,经测序鉴定该PCR产物具有序列表中序列1自5’末端第1-1116位核苷酸。
Primer-F+:5’-CGGGATCCATGTTTGTTTCCGATAAC-3’(序列3,下划线为BamHⅠ位点)
Primer-R-:5’-CCCAAGCTTTCTCATTCCTCTGTATAAG-3’(序列5,下划线为HindIII位点)
将上述PCR产物经BamHⅠ和HindIII双酶切,得到的该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pCAMBIA1302得到的载体骨架连接,得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中,得到转化子。提取转化子的质粒,送去测序,该质粒为将序列表中序列1自5’末端第1-1116位核苷酸***pCAMBIA1302的BamHⅠ和HindIII酶切位点之间得到的载体,将该载体命名为pCAMBIA1302–AtGT4,且序列表中序列1自5’末端第1-1116位核苷酸位于CaMV35S启动子之后。重组表达载体pCAMBIA1302–AtCT4结构示意图如图2所示。
2、转AtCT4拟南芥株系的获得及鉴定
将重组载体pCAMBIA1302–AtGT4用电击转化法导入农杆菌GV3101中,得到重组菌,提取重组菌的质粒,测序,结果为该质粒为pCAMBIA1302–AtGT4,含有该质粒的重组菌命名为GV3101/pCAMBIA1302-AtGT4。
挑取GV3101/pCAMBIA1302–AtGT4的单菌落在5mlLB培养基中,于28℃培养8小时,再转接到200mlLB中继续培养3小时,收菌后重悬于LB培养基中得到转化液。将野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)Col-0的花浸泡于转化液中10秒,取出后放入MS培养基中避光培养8小时,获得T0代转化种子,将其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培养基上,获得54株过表达的T0代转AtGT4拟南芥。
提取上述54个单株T0代转AtGT4拟南芥植株叶的RNA,并反转录获得cDNA,进行RealTimePCR鉴定,探针为:
AtGT4-Real+:5’-CGGGATCCATGTTTGTTTCCGATAAC
AtGT4-Real-:5’-GGGGTACCCCTCTCATTCCTCTGTATAAG
以野生型拟南芥(col-0)为对照。
结果如图3所示,可以看出,在54个转基因株系中,有53个株系的GmGT4的相对表达量明显大于野生型对照,为阳性T0代转AtGT4拟南芥;筛选2个T0代转AtGT4拟南芥株系命名为GT4-3和GT4-47作进一步研究。
将T1单株收获种子,此为T2代种子,各单株种子分别播种,用卡那霉素继续筛选以观察T2代的分离情况,如此重复筛选,直至T3代获得遗传稳定的转基因株系,共获得稳定遗传的转AtGT4基因株系。其中包括用以进行进一步实验的T3代转AtGT4拟南芥GT4-3和T3代转AtGT4拟南芥GT4-47。
采用同样的方法将空载体pCAMBIA1302转入野生型拟南芥中,得到T0代转空载体拟南芥,采用上述引物进行鉴定,未得到目标片段,说明该T0代转空载体拟南芥构建正确;播种筛选如此重复直至得到T3代转空载体拟南芥。
二、AtGT4突变体gt4的分子及耐盐性鉴定
T-DNA***突变体gt4购自ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter,ABRC编号:salk_095404,已经证明仅AtGT4基因失活,其他基因与野生型一致)。
将野生型拟南芥和gt4突变体种子在培养皿生长2周后移栽(生长于22°C每天的光照为16h/8h(光照/黑暗))至盆中待开花后,取全株提取RNA做RT-PCR鉴定。引物同Primer-F+(序列3)和Primer-R-(序列5)。
结果如图4A所示,突变体gt4中未能检测出AtGT4基因的转录,进一步验证该突变体为AtGT4基因的突变。
将萌发后5天的野生型对照和突变体gt4,分别置于含0、100、125和150mMNaCl的MS培养基中培养,各处理15株,生长18天后统计莲座直径。
表型观察结果如图4B所示,可以看出,随着NaCl的浓度增加,突变体gt4的生长明显差于野生型。
统计莲座直径结果如图4C所示,在正常条件下生长(未含NaCl的MS培养基)的野生型对照和突变体莲座直径分别约为1.63cm和1.7cm;在含有125mMNaCl的MS培养基中野生型对照和突变体莲座直径分别约为:1.0cm和0.78cm;在150mMNaCl的MS培养基中野生型对照和突变体莲座直径分别约为0.95cm和0.63cm;结果表明,盐胁迫下,突变体莲座直径明显小于对照。
三、转AtGT4拟南芥株系的耐盐鉴定
实验样本为作为对照的野生型拟南芥Col0、T3代纯系转AtGT4拟南芥GT4-3、T3代纯系转AtGT4拟南芥GT4-47、T3代转空载体拟南芥和AtGT4突变体gt4。每个株系15粒种子。
将各个株系植株的种子同时播种在MS平板上,萌发后10天后将幼苗分别移栽到含有0、125mM和150mMNaCl的蛭石中生长35天,比较表型。
表型观察结果如图5所示,A为正常条件生长的各个株系(0mMNaCl),B为125mM和150mMNaCl的蛭石生长的各个株系;可以看出,正常条件下各株系的生长无显著差异。在NaCl处理后,各株系的幼苗生长均受到严重抑制,突变体萎蔫严重,对照次之,而AtGT4过表达株系基本仍然存活。
存活率统计结果如图6所示,正常条件下(0mMNaCl),各株系存活率均约为100%,在125mMNaCl处理时,GT4-3、GT4-47、gt4和Col0的存活率分别约为56%、59%、8%、48%,当蛭石中NaCl浓度为150mM时,GT4-3、GT4-47、gt4和Col0的存活率分别约为50%、38%、0%和27%。结果表明,过表达株系(T3代纯系转AtGT4拟南芥)在高盐胁迫下的存活率显著或极显著高于对照,而突变体gt4的存活率极显著低于对照。
T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
上述结果表明AtGT4基因的表达与植物的耐盐性相关,其过表达明显提高了转基因植株的耐盐性。
Claims (3)
1.蛋白、蛋白的编码基因或含有所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物耐逆性中的应用;
所述耐逆性为耐盐性;
所述蛋白是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
所述编码基因是序列表中序列1所示的DNA分子;
所述植物为双子叶植物;
所述双子叶植物为拟南芥。
2.一种培育转基因植物的方法,为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物,获得转基因植物,所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物;
所述耐逆性为耐盐性;所述目的植物为双子叶植物,所述双子叶植物拟南芥。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:
权利要求1所述蛋白的编码基因通过所述的重组载体导入目的植物;
所述耐盐性通过提高存活率体现。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210305931.3A CN103626856B (zh) | 2012-08-24 | 2012-08-24 | 转录因子AtGT4及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210305931.3A CN103626856B (zh) | 2012-08-24 | 2012-08-24 | 转录因子AtGT4及其编码基因与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103626856A CN103626856A (zh) | 2014-03-12 |
CN103626856B true CN103626856B (zh) | 2016-04-13 |
Family
ID=50208334
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210305931.3A Expired - Fee Related CN103626856B (zh) | 2012-08-24 | 2012-08-24 | 转录因子AtGT4及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103626856B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110317795B (zh) * | 2019-07-11 | 2020-10-02 | 中国农业大学 | Pub25基因在调控植物耐低温性能中的应用 |
CN115894642B (zh) * | 2021-08-19 | 2024-04-02 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 果型控制基因SlGT-2及其同源基因与应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1919866A (zh) * | 2006-08-09 | 2007-02-28 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用 |
-
2012
- 2012-08-24 CN CN201210305931.3A patent/CN103626856B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1919866A (zh) * | 2006-08-09 | 2007-02-28 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Arabidopsis thaliana DNA-binding protein GT-1-related protein cds,NM_113503.3;Salanoubat M et al;《NCBI GenBank》;20110528;全文 * |
The trihelix family of transcription factors-light,stress and development;Ruth N Kaplan-Levy et al;《Trends in Plant Science》;20120331;第17卷(第3期);163-171页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103626856A (zh) | 2014-03-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110643618B (zh) | 小桐子MYB类转录因子JcMYB16基因及其在提高植物抗旱性中的应用 | |
CN105254726B (zh) | 与植物抗逆相关的erf类转录因子及其编码基因和应用 | |
CN104995304B (zh) | 转基因植物 | |
CN112779234B (zh) | 毛竹PeAPX5基因及应用 | |
CN103695438A (zh) | 拟南芥MYB家族转录因子AtMYB17基因、编码序列及其应用 | |
Chen et al. | Enhance sucrose accumulation in strawberry fruits by eliminating the translational repression of FabZIPs1. 1 | |
CN112126655A (zh) | 一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用 | |
CN111500579A (zh) | 棉花miR164a和NAC100L及其在调控植物黄萎病抗性中的应用 | |
CN112342236B (zh) | 水稻组蛋白甲基转移酶在增强作物干旱抗性及改善单株产量中的应用 | |
CN111171127B (zh) | 紫云英lhy基因及其应用 | |
CN110964740B (zh) | 一种高黄酮醇烟草的制备方法及其应用 | |
CN103626856B (zh) | 转录因子AtGT4及其编码基因与应用 | |
CN102449154B (zh) | 植物中用于胁迫耐性的方法和组合物 | |
CN114560919B (zh) | 一种与植物耐旱相关的转录因子VcMYB108及其编码基因与应用 | |
CN114703199B (zh) | 一种植物抗旱性相关的基因TaCML46及应用 | |
CN107973844B (zh) | 小麦抽穗期相关蛋白Ta-Hd4A及其应用 | |
CN114805508B (zh) | 水稻抽穗期基因dhd3功能以及应用 | |
CN103588867B (zh) | 大豆转录因子GmMYB174a及其编码基因与应用 | |
CN102653556A (zh) | 植物耐逆性相关转录因子GmWRKY78及其编码基因与应用 | |
CN103570813A (zh) | 与植物抗逆性相关蛋白Gh01399及其编码基因与应用 | |
KR101281072B1 (ko) | OsFKBP16-3 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 | |
CN103374060B (zh) | 棉花Trihelix转录因子GhGT23及其编码基因与应用 | |
CN103468740A (zh) | 水稻OsDRAP1基因在增强植物抗旱性中应用 | |
CN103102402A (zh) | 大豆转录活性蛋白GmPHD5及其编码基因与应用 | |
CN103360482B (zh) | 转录活性蛋白AtPHD6及其编码基因与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160413 Termination date: 20190824 |