KR101281072B1 - ＯｓＦＫＢＰ１６－３ 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

ＯｓＦＫＢＰ１６－３ 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsFKBP16-3 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, OsFKBP16-3 유전자를 이용하여 환경 스트레스에 대해 저항성이 강한 형질전환 식물체를 개발할 수 있게 하므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＯｓＦＫＢＰ１６－３ 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with increased resistance to various environmental stresses using OsFKBP16-3 gene and the plant thereof}
본 발명은 OsFKBP16-3 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsFKBP16-3 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 상기 OsFKBP16-3 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 OsFKBP16-3 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.
식물은 생활사에서 고염, 건조, 극한 온도, 오존 또는 홍수와 같은 다양한 환경 스트레스 의해 지속적으로 공격받는다. 환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소로서, 수분 스트레스, 저온 스트레스, 염해 스트레스, 산화 스트레스 등이 있다. 특히 수분 스트레스는 탈수, 고염도 및 저온과 같은 외부 환경에 의해 유발되며, 식물의 생장을 저해하는 환경 스트레스에 있어서 가장 가혹한 스트레스 중의 하나이다. 또 다른 환경 스트레스의 대표 인자인 건조 스트레스는 식물 세포 내 삼투압 불균형 및 이온 불균형을 발생시켜 식물의 생장 및 광합성을 저해한다. 상기 식물의 건조 스트레스 저항성 기작으로는 ABA(엡시스산) 의존성 신호전달 경로 또는 ABA 비의존성 신호 전달 경로가 있다(Finkelstein et. al., 2002 Plant Cell 14, S15-S45).
한편, 식물은 상기 스트레스에 대한 방어 기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자하는 경향이 있다. 상기 스트레스 조건을 극복하기 위해, 식물은 신속하고 효율적인 유전자 발현 프로그램을 통해 스트레스 적응 또는 내성과 연관된 수많은 유전자를 발현한다. 수많은 스트레스-유도성 유전자들이 다양한 식물 종에서 밝혀진 바 있고, 상기 유전자 산물의 기능이 보고된 바 있다(Lushchak, 2011 Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 153, 175-190).
본 발명에서는 OsFKBP16-3 유전자의 특성 및 스트레스 내성 기능을 최초로 분석하였다. 대부분의 광합성 식물 및 클라미도모나스에 존재하는 FKBP16-3 유전자는 산화-환원반응 모티프인 CxxxC 구조를 진화적으로 잘 보존하고 있어 산화적 스트레스 하에서의 광합성 기작에 작용할 것으로 예측되며, 본 발명에서 OsFKBP16-3 유전자 특성 분석 및 스트레스 내성 유전자로서의 활용성을 검증하였다. 벼 유래 환경 스트레스 반응 유전자 OsFKBP16-3의 발현은 주로 광합성이 활발한 잎 조직에 특이적으로 나타났으며 빛, 염, 건조 및 고온의 다양한 환경 스트레스, 과산화수소 및 메틸 비올로겐 처리시 유전자 발현이 증가하였다. GFP 형광 단백질을 이용한 세포 내 위치 추적 결과 OsFKBP16-3은 식물 세포에서 엽록체 내에 존재하는 단백질임을 확인하였고, 모델식물 애기장대 및 벼에 전신발현 프로모터에 의한 과발현을 유도하여 OsFKBP16-3 유전자 발현에 의한 고농도의 염 및 건조 스트레스에 대한 내성을 확인하였다.
한편, 한국등록특허 제0695072호에는 '비생물성 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 스트레스 유도성 OsAsr1 유전자 및 단백질'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0794291호에는 '작물의 내건성을 증진시키는 인산화 효소, 유전자 및 형질전환 작물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 OsFKBP16-3 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 염, 건조, 빛, 과산화수소, 고온 또는 메틸 비올로겐 등의 환경 스트레스 조건에서 벼 유래 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, OsFKBP16-3 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체가 염 또는 건조의 환경 스트레스 내성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물 세포에 형질전환시켜 OsFKBP16-3 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 벼 유래 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자는 염, 건조, 빛, 과산화수소, 고온 또는 메틸 비올로겐 등의 환경 스트레스 조건 하에 강하게 발현이 유도되고, OsFKBP16-3 유전자를 과발현시킨 형질전환 애기장대 또는 벼 식물체가 염 또는 건조 스트레스 내성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 OsFKBP16-3 유전자를 이용하여 환경 스트레스에 대해 저항성이 강한 형질전환 식물체를 개발할 수 있게 하므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 벼 OsFKBP16-3 아미노산 서열을 대상으로 BLASTP 프로그램을 이용한 FKBP16-3 유전자의 상동성 및 진화적 상관성을 조사한 결과이다. (A) ClustalW2 및 GeneDoc2.7 프로그램을 이용한 FKBP16-3의 아미노산 서열 비교 분석 결과를 나타낸다. *; PPIase(Peptidyl prolyl cis/trans isomerase) 활성에 필수적 주요 아미노산 잔기, I; 틸라코이드 루멘 신호 펩타이드(thylakoid lumen signal peptide), Ⅱ; 틸라코이드 루멘 표적 절단 모티프(thylakoid lumen target cutting motif), Ⅲ; CxxxC 모티프를 나타낸다. 농도 구배에 따른 아미노산 상동성은 검정색 박스; 90% 이상, 진회색 박스; 80% 이상, 연회색 박스; 50% 이상을 나타낸다. (B) MEGA5 프로그램을 이용한 OsFKBP16-3의 계통학적 근연관계 분석 결과를 나타낸다. OsFKBP16-3; Oryza sativa FKBP16-3(NP_001062387), TaFKBP16-3; Triticum aestivum FKBP16-3(TA84905_4565), SbFKBP16-3; Sorgum bicolor FKBP16-3(XP_002445769), PtFKBP16-3; Populus trichocarpa FKBP16-3(XP_002328028), AtFKBP16-3; Arabidopsis thaliana FKBP16-3(XP_002881909), CrFJBP16-3; Chlamydomonas reinhardtii FKBP16-3(XP_ 001692929)을 나타낸다.
도 2는 RT-PCR에 의한 OsFKBP16-3의 유전자 발현을 분석한 결과이다. (A) 벼 발달시기 및 조직 특이적 OsFKBP16-3 유전자 발현 분석 결과를 나타낸다. 1, 2 및 6-weeks는 벼 종자 발아 후 1주, 2주 및 6주된 유식물체를 나타내고, En은 배유(endosperm), Ro는 뿌리(root), Sh는 껍질(sheath), St는 줄기(stem), Le는 잎(leaf)을 나타낸다. (B) 환경 스트레스 반응에 대한 OsFKBP16-3 유전자 발현 분석 결과를 나타낸다. NaCl; 200mM NaCl, Drought; 건조(dessication), High light; 880μmole photons m2sec-1, Heat; 42℃, H2O2; 과산화수소(hydrogen peroxide) 10mM 및 MV; 메틸 비올로겐(methyl viologen) 10μM 처리를 나타낸다.
도 3은 GFP 형광단백질을 이용한 벼 이뮤노필린 OsFKBP16-3 단백질의 세포 내 위치를 추적한 결과 엽록체 내 표적됨을 나타낸다. (A) 35S 프로모터 조절에 의한 GFP 형광 단백질의 OsFKBP16-3 C-말단 융합 유전자 조작 모식도를 나타낸다. mGFP4가 삽입된 pCAMBIA1302 벡터에 OsFKBP16-3의 종결 코돈을 제외한 전장 ORF(open reading frame, 1-261 aa)를 GFP 유전자 앞에 위치시켰다. (B) 상단; 담배 잎을 이용하여 OsFKBP16-3-GFP를 일시적으로 과발현시킨 후 형광 단백질의 위치를 분석한 결과를 나타낸다. 잎 표피세포에서의 pCAMBIA1302는 mGFP4가 발현되는 대조구로서 세포질 및 핵에 위치한다. pCAMBIA1302::OsFKBP16-3는 OsFKBP16-3이 포함된 pCAMBIA1302 벡터로서 엽록체 내에 위치한다. GFP(green fluorescence protein)는 여기파장(excitation) 450-490nm, 방출파장(emission) 500-550nm이고, 엽록소(Chlorophyll)는 엽록체 자가형광(chloroplast autofluorescence)으로 여기파장(excitation) 530-585nm, 방출파장(emission) 650 nm이다. UV는 자외선(ultra violet)을 나타내고, Light은 빛 조건(bright condition)을 나타낸다. 하단; 세포벽 제거 후 원형질체에서의 형광 단백질 위치 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 35S 전신발현 프로모터에 의한 애기장대 및 벼에서의 OsFKBP16-3 유전자의 게놈 내 유전자 도입 및 발현 정도를 분석한 결과이다. (A) 35S 프로모터에 의한 OsFKBP16-3 유전자의 과발현 유도를 위한 유전자 조작 모식도를 나타낸다. pCAMBIA1300 벡터에 35S 프로모터 및 OsFKBP16-3의 전장 ORF(1-261 aa)를 삽입한 도면을 나타낸다. (B) 모델식물 애기장대에 pCAMBIA1300-35S-OsFKBP16-3 플라스미드를 형질전환시킨 후, 생산된 형질전환체로부터 T-DNA 유전자의 삽입 및 OsFKBP16-3 발현 분석 결과를 나타낸다. V1 및 V2는 독립적 pCAMBIA1300-35S 벡터 대조구 형질전환체 T3 세대를 나타내고, AT1, AT2 및 AT3는 OsFKBP16-3이 전신발현 되고 있는 독립적 애기장대 형질전환체 T3 세대를 나타낸다. T-DNA; transfer DNA, OsFKBP16-3; 애기장대 형질전환체에서 OsFKBP16-3 유전자 발현 정도, AtACT2; 애기장대 actin2 유전자 발현 정도를 나타낸다. (C) 벼 작물에 pCAMBIA1300-35S-OsFKBP16-3 플라스미드를 형질전환시킨 후 생산된 형질전환체로부터 T-DNA 유전자의 삽입 및 OsFKBP16-3의 발현 분석 결과를 나타낸다. WT는 야생형 식물체(wild type plant)를 나타내고, RT1, RT2, RT3, RT4, RT5 및 RT6은 OsFKBP16-3이 전신발현되고 있는 독립적 벼 형질전환체 T2 세대를 나타낸다. T-DNA; transfer DNA, OsFKBP16-3; 벼 형질전환체에서 과발현되고 있는 OsFKBP16-3 유전자 발현 정도, OsACT1; 벼 actin 1 유전자 발현 정도를 나타낸다.
도 5는 OsFKBP16-3 유전자가 발현되는 애기장대 형질전환체의 발달 시기별 고염 스트레스에 대한 내성이 증가되는 표현형을 나타낸다. (A) 좌; 애기장대 OsFKBP16-3 형질전환체가 0, 50, 100 및 150mM NaCl이 함유된 MS 배지에서 발아 후 7일째의 표현형을 나타낸다. OsFKBP16-3 발현 식물체가 벡터 대조구에 비해 NaCl 함유 배지에서 내성을 나타낸다. 우; 뿌리 길이 비교에 의한 스트레스 내성 정량화 분석 결과를 나타낸다. V1 및 V2는 독립적 pCAMBIA 벡터 대조구 형질전환체 T3 세대를 나타내고, AT1, AT2 및 AT3는 OsFKBP16-3 전신발현 독립적 애기장대 형질전환체 T3 세대를 나타낸다. *는 t-테스트에 의한 P value 0.01 이하의 값을 나타낸다. (B) 좌; 유식물체 시기의 OsFKBP16-3 애기장대 형질전환체의 고농도 염 내성 표현형을 나타낸다. 토양에서 배양한지 3주된 형질전환체를 대상으로 200mM NaCl을 4일간 처리한 후의 표현형이다. 우; 생체량(fresh weight) 측정에 의한 고농도 염 스트레스 표현형의 정량화 분석 결과를 나타낸다. 고농도 염 처리 후 형질전환체의 지상부 생체량을 측정하였다. *는 t-테스트에 의한 P value 0.001 이하의 값을 나타낸다.
도 6은 OsFKBP16-3 유전자가 발현되는 애기장대 형질전환체의 발달 시기별 만니톨 및 건조 스트레스에 대한 내성이 증가되는 표현형을 나타낸다. (A) 좌; 애기장대 OsFKBP16-3 형질전환체가 0, 200 및 400mM 만니톨이 함유된 MS 배지에서 발아 후 7일째의 표현형을 나타낸다. OsFKBP16-3 발현 식물체가 벡터 대조구에 비해 만니톨 함유 배지에서 내성이 증가하였다. 우; 뿌리 길이 비교에 의한 스트레스 내성 정량화 분석 결과를 나타낸다. V1 및 V2는 독립적 pCAMBIA 벡터 대조구 형질전환체 T3 세대를 나타내고, AT1, AT2 및 AT3는 OsFKBP16-3 전신발현 독립적 애기장대 형질전환체 T3 세대를 나타낸다. *는 t-테스트에 의한 P value 0.1 이하의 값을 나타낸다. (B) 좌; 유식물체 시기의 OsFKBP16-3 애기장대 형질전환체의 건조 스트레스 내성 표현형을 나타낸다. 토양에서 배양한지 3주된 형질전환체를 대상으로 건조 후 재수화에 의해 건조 스트레스를 극복한 식물체의 표현형이다. Water; 정상조건에서의 수분공급, Drought-rewater(건조-재수화); 3주된 형질전환체를 대상으로 8 일간 건조 스트레스 후 재수화 유도. 우; 생체량 측정에 의한 건조 스트레스 표현형의 정량화 분석 결과를 나타낸다. 건조-재수화 처리 후 형질전환체의 지상부 생체량을 측정하였다. *는 t-테스트에 의한 P value 0.05 이하의 값을 나타낸다.
도 7은 OsFKBP16-3 유전자가 과발현되는 벼 형질전환체의 고농도 염 스트레스에 대한 내성이 증가되는 표현형을 나타낸다. (A) 발아 후 3일된 벼 OsFKBP16-3 형질전환체가 0, 150 및 200mM NaCl이 함유된 MS 배지에서 배양된 후 10일째의 표현형을 나타낸다. OsFKBP16-3 발현 식물체가 대조구(wild type)에 비해 고농도 염 함유 배지에서 내성이 증가하였다. WT(wild type); 동진벼, RT1, RT2 및 RT3; OsFKBP16-3이 과발현되고 있는 독립적 벼 형질전환체 T2 세대를 나타낸다. (B) 뿌리 길이, 지상부 길이 및 생체량 측정에 의한 고농도 염 스트레스 내성 증가의 정량화 분석 결과를 나타낸다. *는 t-테스트에 의한 P value 0.05 이하의 값을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물 세포에 형질전환시켜 OsFKBP16-3 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress) 및 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 건조, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염, 건조, 강한 빛, 고온, 과산화수소 또는 메틸 비올로겐 스트레스일 수 있고, 바람직하게는 염 또는 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 OsFKBP16-3 단백질의 범위는 벼(Oryza sativa)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 의미한다.
또한, 본 발명은 OsFKBP16-3 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 OsFKBP16-3 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자 상동체는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 OsFKBP16-3 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
OsFKBP16-3 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 OsFKBP16-3 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염, 건조, 강한 빛, 고온, 과산화수소 또는 메틸 비올로겐 스트레스일 수 있고, 바람직하게는 염 또는 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물이 포함된다. 상기 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 상기 쌍자엽 식물체는 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana)일 수 있고, 단자엽 식물체는 벼(Oryza sativa)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsFKBP16-3 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성을 증진시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. FKBP16 -3 유전자의 아미노산 상동성 분석 및 OsFKBP16 -3 유전자의 계통발생학적 근연관계 분석
벼 OsFKBP16-3 유전자는 261개 아미노산으로 구성된 PPIase(peptidyl prolyl isomerase) 도메인을 갖는 이뮤노필린(immunophilin) 그룹의 유전자로 기존 연구에서 분류되었다(Ahn et al., 2010. BMC Plant Biology 10, 253-275). OsFKBP16-3 유전자의 상동성 분석을 위해 OsFKBP16-3의 성숙 형태(mature form)의 아미노산 서열(121-261 aa)을 BlastP 프로그램을 이용하여 상동성을 갖는 OsFKBP16-3을 조사한 결과, OsFKBP16-3이 대부분의 고등식물 및 진핵 광합성 생물 클라미도모나스에 존재하며 시아노박테리아에는 존재하지 않는 것을 확인하였다. 즉, OsFKBP16-3은 진핵 광합성 생물에 특이적으로 존재하는 유전자임을 확인하였다. 상동성 분석 결과 N-말단의 엽록체 표적 아미노산 서열을 제외하고는 진화적으로 매우 잘 보존되어 있으며, 틸라코이드 루멘 표적 아미노산 서열(도 1A I 및 Ⅱ)을 모든 생물체가 포함하고 있어 엽록체 루멘 기관 특이적 단백질임을 예측할 수 있었다. 또한, 산화환원 반응의 중요 모티프인 CxxxC 구조(도 1A Ⅲ)가 모든 생물체에 존재하고 있어, OsFKBP16-3의 광합성 기작에서 산화환원 조절자로서의 역할을 할 것으로 예측되었다(도 1A). PPIase 활성 및 FK506 약물 결합(drug binding)에 영향을 주는 주요 아미노산 잔기 14개에 대해 7개가 보존되고 있어 PPIase 활성 유무는 생화학적 실험을 통한 검증이 필요할 것으로 판단된다. MEGA5 프로그램을 이용한 OsFKBP16-3의 계통발생학적 근연관계를 분석한 결과, 단자엽 식물 유전자인 TaFKBP16-3(Triticum aestivum FKBP16-3, TA84905_4565) 및 SbFKBP16-3(Sorgum bicolor FKBP16-3, XP_002445769)가 가장 가까운 것으로 나타났으며(84-89%), 쌍자엽 식물인 PtFKBP16-3(Populus trichocarpa FKBP16-3, XP_002328028) 및 애기장대의 AtFKBP16-3(Arabidopsis thaliana FKBP16-3, XP_002881909)이 78% 내지 79%, 클라미도모나스의 CrFJBP16-3(Chlamydomonas reinhardtii FKBP16-3, XP_ 001692929)가 69%의 계통학적 근연관계를 나타내었다(도 1B). 상기 결과로서 FKBP16-3은 고등식물 및 클라미도모나스에 존재하는 중요 유전자로 엽록체의 틸라코이드 루멘 표적 신호 펩타이드(signal peptide)를 함유하며 산화환원 반응의 CxxxC 모티프를 전 생물체에서 잘 보존하고 있어 광합성 기작의 산화환원 조절자로서의 역할이 유추되었다.
실시예 2. OsFKBP16 -3 조직별 및 발달 시기별 유전자 발현 분석
OsFKBP16-3의 조직별 및 발달 시기별 유전자 발현 분석을 위해 벼 종자를 발아한 후 1주, 2주 및 6주된 식물체로부터 배유, 뿌리, 신초, 줄기 및 잎 조직을 분리하였다. 분리된 식물체의 조직으로부터 총 RNA를 추출한 후, 추출된 총 RNA의 2㎍을 MMLV 역전사 효소(Invitrogen 사)를 이용하여 cDNA를 합성하고, RT-PCR 분석에 사용하였다. OsFKBP16-3 특이적 프라이머는 정방향(5'-CCT CGA AAA TGT GCC CAT GG-3'; 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(5'-CAT AAC TGG GCT GCT TGG AGC C-3'; 서열번호 4)를 사용하였다. 발현량 보정을 위한 OsActin1 프라이머로는 정방향(5'-CAT GCT ATC CCT CGT CTC GAC CT-3'; 서열번호 5) 및 역방향 프라이머(5'-CGC ACT TCA TGA TGG AGT TGT AT-3'; 서열번호 6)의 염기서열을 각각 사용하였다.
그 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이, OsFKBP16-3 유전자는 광합성 조직인 잎에서 주로 발현되었으며, 비 광합성 조직인 배유 및 뿌리에서는 매우 약하게 발현되었고, 엽록체가 존재하는 줄기 조직에서도 매우 약한 발현을 나타내었다. 발달 시기별 분석 결과, 발아 후 2주된 잎 조직에서 발현이 가장 증가하였으며, 6주 이후에는 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 2A).
실시예 3. 다양한 환경 스트레스 반응에 대한 OsFKBP16 -3 유전자의 발현 특성 분석
OsFKBP16-3 유전자가 다양한 환경 스트레스 자극에 반응하여 발현하는 정도를 분석하기 위해, 식물체에 고농도의 염, 건조, 강한 빛, 고온, 과산화수소(H2O2) 및 메틸 비올로겐(methyl viologen) 관련 화합물 처리를 한 후, OsFKBP16-3 유전자의 발현 변화를 RT-PCR을 수행하여 분석하였다. 각 스트레스 처리는 종자 발아 후 2주된 벼 유식물체를 대상으로 염의 경우 200mM NaCl 용액 처리 후 0, 1, 3, 6, 12, 24 및 48 시간대별, 건조 스트레스의 경우 수분 제거 후 0, 1, 3, 6, 12 및 24 시간대별, 강한 빛 스트레스의 경우 880μmole photons m2sec-1의 빛 처리 후 0, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2 및 5 시간대별, 고온 스트레스의 경우 42℃ 고온 처리 후 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 3 및 4 시간대별, 10mM 과산화수소(hydrogen peroxide) 및 10μM 메틸 비올로겐 처리 후 0, 1, 3, 6, 12, 24 및 48 시간대별 총 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA의 2㎍을 MMLV 역전사 효소(Invitrogen 사)를 이용하여 cDNA를 합성하고, RT-PCR 분석에 사용하였다.
그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, OsFKBP16-3 유전자 발현은 염 스트레스 처리 후 1시간부터 12시간까지 점차적으로 2배 정도 증가하였으며, 24시간대에서는 4배 이상의 강한 증가를 나타내었고, 이후 48시간에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 건조 스트레스를 처리한 경우에는 처리 후 1시간부터 OsFKBP16-3 유전자 발현이 2배 이상 증가하였고, 3시간부터 12시간까지 4배 이상의 계속적인 발현 증가를 나타내었으나, 처리 후 24시간에는 발현이 감소하는 양상을 나타내었다. 상기 결과로부터 OsFKBP16-3의 유전자 발현은 수분 스트레스에 의해 유전자 발현이 강하게 증가하는 것을 확인하였다. 강한 빛 스트레스의 경우에도 처리 후 10분 내에 OsFKBP16-3 유전자의 발현이 빠르게 증가하여 5시간까지 지속적으로 증가하였으며, 고온 스트레스 처리시에도 단시간 내에 유전자 발현이 증가한 것을 확인하였다. 산화 스트레스를 빠르게 유도하는 과산화수소 및 메틸 비올로겐 처리시에도 OsFKBP16-3의 유전자 발현이 증가된 것을 확인하였다(도 2B). 상기 결과로서 다양한 환경 스트레스에 전반적으로 반응하는 OsFKBP16-3 유전자 발현의 특성을 확인하였다.
실시예 4. OsFKBP16 -3 단백질의 세포 내 엽록체 소기관 위치 확인
OsFKBP16-3 유전자의 종결 코돈을 제외한 전장 ORF(open reading frame) 아미노산(1-261 aa)의 염기서열을 mGFP4가 발현되는 pCAMBIA1302 벡터로 도입하여 OsFKBP16-3-GFP 융합 단백질이 합성되도록 유전자 조작을 수행하였다(도 3A). 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 담배 잎에서 OsFKBP16-3의 일시적 과발현을 유도하고, 48시간 후에 형광현미경(Zeizz, 독일)을 이용하여 잎의 표피 세포를 대상으로 형광 단백질의 위치를 추적하였다. 그 결과, mGFP4 단백질이 발현되는 pCAMBIA1302의 경우 세포질 및 핵에 형광 단백질이 분포하는 반면, OsFKBP16-3-GFP가 발현되는 조건에서는 엽록체의 자가형광(autofluorescence) 및 형광 단백질이 정확하게 일치하여 분포함으로써 OsFKBP16-3 단백질이 엽록체 내에 표적되는 것을 확인하였다(도 3B 상단).
또한, OsFKBP16-3 유전자의 보다 상세한 세포 소기관 내의 위치 추적을 위해 세포벽 제거 효소(1% cellulase, 0.25% macerozyme, 400mM mannitol, 8mM CaCl2, 5mM MES, 0.1% BSA, pH 5.6)를 처리하고, 원형질체를 나출한 후 형광 단백질의 위치를 관찰하였다. 그 결과, 세포 내의 OsFKBP16-3 형광 단백질 위치 추적 결과와 동일하게, pCAMBIA1302 대조구에서는 세포질 및 핵에 형광 단백질이 분포한 반면, OsFKBP16-3-GFP 조건에서는 정확하게 엽록체 내에 분포하고 있는 것을 재확인하였다(도 3B 하단). 아미노산 서열 분석시 틸라코이드 루멘 표적 신호 펩타이드 및 절단 모티프(cutting motif)를 확인한 바와 같이(도 1A의 I 및 II), OsFKBP16-3 단백질이 식물세포 내 엽록체 소기관에 존재함을 GFP 형광 단백질을 이용하여 실험적으로 증명함으로써 OsFKBP16-3이 광합성 기작에 관련하여 작용할 수 있음을 예측할 수 있었다.
실시예 5. 모델식물 애기장대 및 벼에서 35S 프로모터에 의한 OsFKBP16 -3 유전자의 전신발현 유도
OsFKBP16-3 유전자의 과발현을 유도하기 위해 pCAMBIA1300 벡터에 35S 프로모터를 삽입하고, OsFKBP16-3 전장 ORF 유전자를 도입하여 유전자 조작을 수행하였다(도 4A). pCAMBIA1300 벡터에 35S-OsFKBP16-3 유전자가 도입된 플라스미드를 아그로박테리움 GV3101에 형질전환하였다. 그 후, 모델식물인 애기장대 및 벼에 형질전환시키고, 하이그로마이신(hygromycine) 항생제를 이용하여 형질전환체를 선별하였다(도 4A).
애기장대 형질전환체는 T3 세대진전에 의한 유전적 배경(genetic background)이 동일한 독립적 호모 라인 3개를 확보하였다(AT1, AT2 및 AT3). 대조구로는 pCMABIA1300에 35S 프로모터만 삽입된 플라스미드를 사용하였다(V1 및 V2). OsFKBP16-3 유전자의 애기장대 게놈 삽입을 확인하기 위해 각 형질전환체로부터 게놈 DNA를 추출하고, OsFKBP16-3에 특이적 프라이머(5'-CCT CGA AAA TGT GCC CAT GG-3'; 서열번호 3) 및 T-DNA Nos-terminator 프라이머(5'-ATA ATC ATC GCA AGA CCG GCA AC-3'; 서열번호 7)를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 애기장대 형질전환체 게놈 DNA의 PCR 분석 결과, 애기장대의 3개의 독립적 라인 모두 OsFKBP16-3 유전자가 게놈 내로 삽입되어 안정적으로 세대진전되고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 4B).
또한, 애기장대 형질전환체의 OsFKBP16-3 유전자 발현 확인을 위해 각 형질전환체로부터 총 RNA를 추출한 후, 역전사 효소로 cDNA를 합성하였다. 그 후, OsFKBP16-3 특이적 정방향 프라이머(5'-CCT CGA AAA TGT GCC CAT GG-3'; 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(5'-CAT AAC TGG GCT GCT TGG AGC C-3'; 서열번호 4)로 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 분석시 cDNA의 양적 정량을 위해 애기장대 actin2 유전자의 정방향 프라이머(5'-GGA AGG　ATC TGT ACG GTA AC-3'; 서열번호 8) 및 역방향 프라이머(5'-CAT AAC TGG GCT GCT TGG AGC C-3'; 서열번호 9)를 사용하였다. RT-PCR 결과, OsFKBP16-3 유전자가 애기장대에서 모두 강하게 발현되고 있음을 확인하였다(도 4B).
벼 형질전환체는 T2 세대를 대상으로 도입 유전자의 분자 수준을 분석하여 독립적 호모 라인 5개를 분리하였다(RT1, RT2, RT3, RT4, RT5 및 RT6). 벼의 경우 동진 일반벼를 대조구(WT)로 사용하였다. OsFKBP16-3 유전자의 벼 게놈 삽입을 확인하기 위해, 각 형질전환체로부터 게놈 DNA를 추출하고, T-DNA Nos-terminator 프라이머(5'-ATA ATC ATC GCA AGA CCG GCA AC-3'; 서열번호 7) 및 OsFKBP16-3 특이적 프라이머(5'-CCT CGA AAA TGT GCC CAT GG-3'; 서열번호 3)를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 벼 형질전환체 게놈 DNA의 PCR 분석 결과, 벼의 6개의 독립적 라인 모두 OsFKBP16-3 유전자가 게놈 내로 삽입되어 안정적으로 세대진전되고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 4C).
또한, 벼 형질전환체의 OsFKBP16-3 유전자 과발현 확인을 위해 각 형질전환체로부터 총 RNA를 추출한 후, 역전사 효소로 cDNA를 합성하였다. 그 후, OsFKBP16-3 특이적 정방향 프라이머(5'-CCT CGA AAA TGT GCC CAT GG-3'; 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(5'-CAT AAC TGG GCT GCT TGG AGC C-3'; 서열번호 4)로 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 분석시 cDNA의 양적 정량을 위해 벼 actin1 유전자의 정방향 프라이머(5'-CAT GCT ATC CCT CGT CTC GAC CT-3'; 서열번호 5) 및 역방향 프라이머(5'-CGC ACT TCA TGA TGG AGT TGT AT-3'; 서열번호 6)를 사용하였다. RT-PCR 결과, 벼의 6개의 독립적 라인 모두 OsFKBP16-3 유전자가 대조구에 비해 강하게 발현되는 것을 확인하였다(도 4C).
상기 결과로서 OsFKBP16-3 유전자가 도입 및 발현되는 쌍자엽 식물체의 애기장대 형질전환체 및 단자엽 식물체의 벼 형질전환체가 생산되어 인터클래스(interclass)간의 OsFKBP16-3의 기능 분석이 가능하게 되었다.
실시예 6. 애기장대 형질전환체에서 OsFKBP16 -3 발현 증가에 의한 염 스트레스 내성 표현형
애기장대 발아시 OsFKBP16-3 유전자 발현 변화에 따른 염 스트레스 내성 표현형을 관찰하기 위해 정상 조건 및 염 농도별 처리 조건의 MS 배지에서 애기장대 형질전환체를 배양하였다. 배양 후 7 일째 정상 조건의 MS 배지에서는 벡터 대조구 및 애기장대 OsFKBP16-3 발현체의 성장에 변화가 없는 반면, 염 50, 100 및 150mM 농도의 배지에서는 벡터 대조구(V1 및 V2)에 비해 OsFKBP16-3 발현체에서 강한 내성을 나타내었다. 독립적 3개 라인(AT1, AT2 및 AT3) 모두 50mM 및 100mM 농도에서 대조구에 비해 성장이 우수한 것으로 나타났고, 뿌리 길이(root length) 정량화 분석의 경우에도 50mM 및 100mM 농도에서 OsFKBP16-3 발현체의 뿌리 길이 성장이 증가한 것을 확인하였다(도 5A).
발달 시기별 표현형 변화를 관찰하기 위해 토양에서 배양한 3주된 유식물체를 대상으로 200mM NaCl의 고농도의 염을 4일간 처리한 후 애기장대 식물체의 표현형을 관찰하였다. 정상 조건에서는 벡터 대조구 및 OsFKBP16-3 발현체 사이의 성장의 차이가 없었지만, 고농도의 염 처리구에서 대조구가 정상 조건에서와는 달리 성장이 크게 저해되는 표현형을 나타내었다. OsFKBP16-3 발현체의 경우 정상 조건에 비해 고농도의 염 스트레스 처리시 성장이 다소 저해되었으나, 대조구에 비해 강한 스트레스 내성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 지상부의 생체량(fresh weight) 분석 결과, 정상 조건에서는 대조구 및 OsFKBP16-3 발현체의 생체량이 매우 유사하였다. 반면, 고농도의 염 처리 시에는 대조구의 경우 정상 조건에 비해 생체량이 절반 정도 감소하였으나, OsFKBP16-3 발현체는 정상 조건에 비해 30% 이상 생체량이 증가한 것으로 나타났다(도 5B).
상기 결과로부터 단자엽 식물 유래의 OsFKBP16-3 유전자의 발현이 쌍자엽 식물인 애기장대 내에서 고농도 염의 환경 스트레스 내성 증가에 중요한 역할을 수행하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 애기장대 형질전환체에서 OsFKBP16 -3 발현 증가에 의한 건조 스트레스 내성 표현형
애기장대 발아시 OsFKBP16-3 유전자 발현 변화에 따른 수분 스트레스 내성 표현형을 관찰하기 위해 정상 조건 및 만니톨을 농도별로 처리한 조건의 MS 배지에서 형질전환체를 배양하였다. 도 6A에 나타낸 바와 같이, 배양 후 7일째 정상 조건의 MS 배지에서는 벡터 대조구 및 OsFKBP16-3 발현체의 성장에 변화가 없는 반면, 400mM의 고농도의 만니톨이 처리된 배지에서는 벡터 대조구에 비해 OsFKBP16-3 발현체에서 강한 내성을 나타내었다. 독립적 3개 라인 모두 400mM 만니톨 농도에서 대조구에 비해 성장이 우수한 것으로 나타났고, 200mM 농도에서도 약한 내성을 관찰할 수 있었다. 뿌리 길이 정량화 분석의 경우 200mM 및 400mM 만니톨 농도에서 OsFKBP16-3 발현체의 길이 성장이 증가한 것을 확인하였다.
발달 시기별 표현형 변화를 관찰하기 위해 토양에서 배양한 3주된 유식물체를 대상으로 건조 스트레스를 8일간 처리한 후, 재수화하여 표현형을 조사하였다. 그 결과, 정상 조건에서는 벡터 대조구 및 OsFKBP16-3 발현체 사이의 성장의 차이가 없었지만, 건조-재수화 처리구에서는 대조구가 정상 조건에서와는 달리 성장이 거의 정지되는 표현형을 나타내었고, OsFKBP16-3 발현체의 경우 정상 조건에 비해 건조 스트레스에 강한 내성을 나타내는 것을 확인하였다. 지상부의 생체량 분석 결과, 정상 조건에서는 대조구 및 OsFKBP16-3 발현체의 생체량이 매우 유사하였다. 반면, 건조 스트레스 시에는 대조구의 경우 정상 조건에 비해 생체량이 70% 이상 감소하였으나, OsFKBP16-3 발현체는 대조구에 비해 50% 이상 생체량이 증가한 것으로 나타났다(도 6B).
상기 결과로부터 단자엽 식물 유래의 OsFKBP16-3 유전자의 발현이 쌍자엽 식물인 애기장대 내에서 건조 환경 스트레스 내성 증가에 중요한 역할을 수행하는 것을 확인하였다.
실시예 8. 벼 형질전환체에서 OsFKBP16 -3 과발현에 의한 염 스트레스 내성 표현형
벼 식물체를 대상으로 OsFKBP16-3 유전자 과발현에 의한 염 스트레스 내성 표현형을 관찰하기 위해 정상 조건 및 염 농도별 처리 조건의 MS 배지에서 형질전환체를 배양하였다. 대조구인 동진 벼(WT)는 MS 기본 배지에서 종자를 3일간 발아시켰다. 벼의 OsFKBP16-3 과발현체(RT1, RT2 및 RT3)는 40㎎/L 하이그로마이신 항생제가 함유된 배지에서 3일간 배양한 후 선별하여 정상 조건의 MS 배지와 150mM 및 200mM NaCl이 함유된 배지로 치상하여 10일간 배양한 후 표현형을 관찰하였다.
그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, 정상 조건의 MS 배지에서는 벡터 대조구 및 OsFKBP16-3 과발현체 사이의 성장에 변화가 없는 반면, 염 150 및 200mM 농도의 배지에서는 벡터 대조구에 비해 OsFKBP16-3 발현체가 약한 내성을 나타내었다. 독립적 3개 라인 모두 염 150mM 및 200mM 농도에서 대조구에 비해 성장이 증가하는 것으로 나타났고, 뿌리 길이 정량화 분석에서는 대조구와 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
또한, 지상부 길이 성장의 경우에는 150mM NaCl 처리구에서 대조구에 비해 성장이 약간 증가한 것으로 나타났다. 생체량 분석에서도 OsFKBP16-3 과발현체가 대조구에 비해 생체량이 증가된 것을 확인하였다(도 7B).
상기 결과로서 OsFKBP16-3 유전자가 과발현된 벼 형질전환체에서도 고농도의 염 스트레스 내성이 확인되어 OsFKBP16-3 유전자가 환경 스트레스에 작용하는 유전자임을 인터클래스(interclass)간 입증하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 애기장대 또는 벼 식물세포에 형질전환시켜 OsFKBP16-3 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 애기장대 또는 벼 식물의 염 또는 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 애기장대 또는 벼 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 애기장대 또는 벼 식물세포로부터 애기장대 또는 벼 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 염 또는 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 애기장대 또는 벼 식물체의 제조 방법.
  4. 삭제
  5. 제3항의 방법에 의해 제조된 염 또는 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 애기장대 또는 벼 식물체.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제5항에 따른 애기장대 또는 벼 식물체의 종자.
  9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는, 애기장대 또는 벼 식물체의 염 또는 건조 스트레스 내성 증진용 조성물.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101550797B1 (ko) 2013-11-12 2015-09-07 한국해양과학기술원 식물의 비생물학적 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도
CN116426496A (zh) * 2023-02-23 2023-07-14 宁夏大学 一种紫花苜蓿ipt基因在调控植物耐旱性中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101154323B1 (ko) 2011-10-21 2012-06-13 전남대학교산학협력단 벼에서 유래한 ＯｓＧＲＰ6 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 저온 또는 동결 내성을 갖는 식물체의 제조 방법
KR101175102B1 (ko) 2010-05-03 2012-08-21 경희대학교 산학협력단 벼 유래의 ＯｓＡＢＦ2 유전자 및 이의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101175102B1 (ko) 2010-05-03 2012-08-21 경희대학교 산학협력단 벼 유래의 ＯｓＡＢＦ2 유전자 및 이의 용도
KR101154323B1 (ko) 2011-10-21 2012-06-13 전남대학교산학협력단 벼에서 유래한 ＯｓＧＲＰ6 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 저온 또는 동결 내성을 갖는 식물체의 제조 방법

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101550797B1 (ko) 2013-11-12 2015-09-07 한국해양과학기술원 식물의 비생물학적 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도
CN116426496A (zh) * 2023-02-23 2023-07-14 宁夏大学 一种紫花苜蓿ipt基因在调控植物耐旱性中的应用
CN116426496B (zh) * 2023-02-23 2023-12-26 宁夏大学 一种紫花苜蓿ipt基因在调控植物耐旱性中的应用

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