CN110964740B - 一种高黄酮醇烟草的制备方法及其应用 - Google Patents

一种高黄酮醇烟草的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，特别是指一种高黄酮醇烟草的制备方法及其应用。步骤为：构建烟草基因NtMYB12的植物表达载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得NtMYB12‑Oe转基因纯合系即为高黄酮醇烟草。本发明利用烟草云烟87和NtMYB12过表达转基因植株分析了低磷胁迫条件下植株黄酮醇含量和参与黄酮醇合成的基因表达水平，经分析可知NtMYB12基因属于MYB转录因子PFG类型成员，能通过对黄酮醇代谢途径基因的转录调控实现其对该途径的正向调节，进而显著增加黄酮醇的含量，提高植物耐低磷胁迫能力。

Description

一种高黄酮醇烟草的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，特别是指一种高黄酮醇烟草的制备方法及其应用。
背景技术
黄酮是植物中分布广泛的次级代谢产物，通常具有C6-C3-C6碳骨架。植物中最常见的黄酮类化合物是花青素和黄酮醇。黄酮生物合成基因由MYB家族的转录因子（TF）转录调节。目前在拟南芥和木本植物如葡萄，苹果和梨中发现了几种类黄酮相关的MYB TF。研究表明，MYB家族中的三个亚群分别是花色素苷，黄烷醇和黄酮醇途径的典型活化剂。PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT (PAP) 型的 MYBs是花青素合成的正调节剂；TRANSPARENT TESTA 2 (TT2) 型的MYBs是黄烷醇途径的正调节剂；PRODUCTION OFFLAVONOL GLYCOSIDES (PFG) 型的MYB TFs，在拟南芥中被鉴定为黄酮醇途径的正调节剂。这些PFG型TF激活编码CHS，CHI和FLS的基因的表达。
植物中的黄酮醇具有多种生物功能，其中抗氧化能力是黄酮醇和大多数其他类黄酮化合物的共同特征，可以帮助植物抵抗环境的各种刺激。磷是重要的植物营养元素，但是其在土壤中的有效性却很低，因此土壤溶液中植物根系可吸收的有效磷浓度通常只有2-10µM, 远远满足不了植物的生长需要。虽然施用磷肥可以提高当季利用率，但是由于磷矿资源是不可再生的，同时过量磷肥的施用也造成了土壤板结和环境污染。因此，提高植物对磷的吸收与利用是现代农业发展的重要研究方向。近年来，关于MYB转录因子参与植物黄酮代谢的研究逐渐被报道，但关于植物中调控黄酮合成和营养代谢的关键基因及调控机制仍不清楚。
烟草是一种重要的叶用经济作物，高黄酮醇烟草能提高烟草的耐低磷胁迫能力，从而减少磷肥的使用，节省生产成本，保护环境；同时由于黄酮醇在人体内同样具有清除自由基、增强人体抗氧化能力，延缓人体衰老的保健功效，因此可以通过提取烟叶中黄酮醇用于生物制药，为烟叶的多用途发展提供新的思路和方法。综上所述，目前对烟叶中调控黄酮醇合成与营养代谢关键基因的克隆、功能分析和应用研究尤为迫切。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种高黄酮醇烟草的制备方法及其应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种高黄酮醇烟草的制备方法，步骤为：构建烟草基因NtMYB12的植物表达载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得NtMYB12-Oe（NtMYB12过表达）转基因纯合系即为高黄酮醇烟草。
所述NtMYB12序列如SEQ ID No.1所示。
所述植物表达载体上带有35S强启动子。
所述野生型烟草为云烟87。
所述的方法制备的高黄酮醇烟草作为培育耐低磷胁迫烟草植株的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用烟草云烟87和NtMYB12-Oe转基因植株分析了低磷胁迫条件下植株黄酮醇含量和参与黄酮醇合成的基因表达水平，经分析可知NtMYB12基因属于MYB转录因子PFG类型成员，能通过对黄酮醇代谢途径基因的转录调控实现其对该途径的正向调节，进而显著增加黄酮醇的含量，提高植物耐低磷胁迫能力。
转基因过表达方法获得的NtMYB12-Oe转基因纯合系烟草对低磷胁迫耐受性明显提高。本发明通过以上分析，表明NtMYB12过表达烟草植株可以上调NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtFLS的表达水平，导致烟叶中黄酮醇的含量相比野生型烟草（WT）显著增加12倍，提高植物对低磷胁迫耐受性，使烟草植株能够在低磷甚至无磷的条件下，维持正常的生长发育。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是NtMYB12的序列排列和***进化分析。
图2是NtMYB12在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。
图3是本发明实施例提供的磷胁迫下NtMYB12在烟草不同部位中的表达模式和对NtMYB12表达的影响。
图4是本发明实施例提供的磷胁迫下野生型烟草（WT）和NtMYB12-Oe转基因烟草的表型特征和NtMYB12表达水平。
图5是本发明实施例提供的磷胁迫下野生型烟草（WT）和NtMYB12-Oe转基因烟草抗氧化酶的影响。
图6是本发明实施例提供的磷胁迫下野生型烟草（WT），NtMYB12-Oe转基因烟草中总磷含量，Pi含量和烟草Pht1基因家族的两个成员的表达的影响。
图7是本发明实施例提供的磷胁迫下对WT，NtMYB12-Oe植物中黄酮类化合物含量和编码黄酮类生物合成酶的主要基因的表达水平的研究。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
针对现有技术未对NtMYB12进行克隆和表达，不清楚NtMYB12基因的具体调控作用的问题；本发明从烟草云烟87中克隆到NtMYB12基因，构建NtMYB12基因的过表达载体并进行遗传转化，获得NtMYB12过表达转基因植株，利用烟草云烟87和NtMYB12过表达转基因植株分析了低磷胁迫条件下植株黄酮醇含量和参与黄酮醇合成的基因表达水平，经分析可知NtMYB12基因属于MYB转录因子PFG类型成员，能通过对黄酮醇代谢途径基因的转录调控实现其对该途径的正向调节，提高植物耐低磷胁迫能力。
烟草MYB转录因子NtMYB12的序列为SEQ ID NO.1。
烟草MYB转录因子NtMYB12的克隆方法具体包括：
第一步：烟草叶总RNA的提取；以云烟87幼叶为材料，按照天根生化科技（北京）有限公司的植物总RNA提取试剂盒提供的方法提取总RNA；
第二步：烟草叶总cDNA和基因组总DNA的获得；以云烟87幼叶总RNA样品1ug为模版，采用Oligo dT-Adaptor Primer进行反转录，反转录后产物即为总cDNA；烟草基因组总DNA的提取采用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Plant Genomic DNA Kit参照说明书进行提取；
在本发明的优选实施例中，反转录条件为：42℃ 40min，50℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。
第三步：烟草NtMYB12基因克隆引物设计；通过烟草MYB基因家族的***进化分析获得NtMYB12基因的编码区序列和基因组DNA序列，利用DNAMAN V6.0软件对多肽序列进行比对，选择NtMYB12基因特异的位点进行引物设计，设计出NtMYB12基因全长cDNA和基因组DNA序列扩增及真核表达载体构建的引物NtMYB12-F序列如SEQIDNo.2所示；NtMYB12-R序列如SEQIDNo.3所示；
在本发明的优选实施例中，真核表达载体为NtMYB12- pCAMBIA1305。
第四步：烟草NtMYB12基因的PCR扩增。以烟草幼叶cDNA第一链和基因组总DNA各1μL为模版，采用标准的50 uLPCR反应体系，以Phusion超保真DNA聚合酶扩增NtMYB12基因全长CDNA和基因组DNA序列；
在本发明的优选实施例中，PCR扩增cDNA的参数如下：94℃预变性4min，35个循环，72℃保温10min。基因组DNA扩增时，其延伸的时间增加至3min；
循环的过程为94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min。
本发明实施例提供的过表达载体构建方法具体包括：
过表达载体构建及检验。为构建过表达载体NTMYB12-pCAMBIA1305，使用引物扩增NTMYB12的整个编码序列(CDS)。用SacI/KpnI消化PCR产物，在CaMV35S启动子的控制下克隆到SacI/KpnI消化的pCAMBIA1305质粒中。挑选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，并送阳性克隆子测序，验证序列正确，载体构建成功；
设计NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtFLS的实时荧光定量PCR检测引物见表1，检测转基因植株中NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtFLS四种基因的表达量变化如图7所示。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
烟草(Nicotianatabacum cv, 云烟87)叶片RNA提取及cDNA合成
用TRIZOL Plus提取烟草云烟87叶片RNA，取1μg总RNA反转录为cDNA模板。
的分离及序列分析
从烟草云烟87中克隆出NtMYB12(GenBank登录号：XM_016624824)和启动子的全长整段编码序列(CDS)，根据烟草基因组数据库中的序列数据设计特异性引物（表1）。利用Dnaman软件Version 6对多肽序列进行比对，用mega v5.0软件进行***发育分析。结果显示NtMYB 12是一个PFG型的MYB转录因子（图1），表明NtMYB 12可能参与了烟草中黄酮醇生物合成的调控。
在烟草表皮细胞中的亚细胞定位
扩增NtMYB12的整个编码序列(CDS)，通过LR反应（Gateway R Technology withClonase R II 试剂）构建N端绿色荧光蛋白(GFP)融合载体 pMDC43-NtMYB12，通过注射将该载体瞬时导入烟草表皮细胞。构建花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的N端GFP融合载体，并将其侵染烟草表皮细胞作为对照细胞。转化后，将烟草表皮样品在25℃的暗室保存16h，然后用共聚焦激光扫描显微镜(Nikon C2-ER)对GFP荧光进行成像观察。结果显示融合蛋白被限制于核质，而在表达p35S::GFP的对照转基因细胞中，在整个细胞中检测到GFP信号（图2），确认NTMYB12作为调节因子。
确定NTMYB12是由缺Pi调节
使用PlantCARE分析烟草中NTMYB12的启动子序列。野生型(WT)烟草种子经消毒，播种至1/2MS固体培养基，培养30天后移至装有石英砂的盆中，使用添加0.02mM Pi (LP)的营养液培养7天，检测NtMYB12在烟草根、茎、叶和花中的表达。结果表明NtMYB12在烟草应答和适应低Pi水平方面可发挥调控作用（图3）。
获得NtMYB12过表达转基因烟草植株
用图1中的特异性引物从烟叶中扩增出NtMYB 12的CDS，用于NtMYB 12的过表达。将PCR产物连接到由花椰花花叶病毒（CaMV）35S启动子和nopaline合酶终止子驱动的pCAMBIA 1305载体上。通过电泳将构建物转移到Agrobacteriumtumefaciens菌株EHA105，转化到烟草(Nicotianatabacum cv，云烟87)中去。通过引入NtMYB12过表达结构，获得了20个转基因烟草株系。两个独立的转基因株系(命名为Oe1和Oe2)在本研究中被证实和使用（图4）。
验证NtMYB 12过表达转基因烟草对低磷胁迫的耐受性。通过引入NtMYB12过表达结构，野生型烟草(WT)种子和NtMYB12-Oe转基因烟草种子(T2代)经消毒，播种至1/2MS固体培养基，培养10天后移至装有石英砂的盆中，均使用添加1mM Pi (HP)和0.02mM Pi (LP)的营养液处理培养21天。
对野生型和转基因株系样品进行以下研究：
1. 研究烟草的表型特征（图4A,4B）；表明在磷供应充足条件下(HP)，NtMYB12-Oe转基因植株的表型与野生型烟草(WT)植株没有明显差异，在低磷条件下(LP)，NtMYB12-Oe转基因植株的长势明显优于WT植株。
2. 用qRT-PCR法测定NtMYB 12的表达水平（图4C）；表明在不同磷供应处理条件下NtMYB12-Oe转基因植株的NtMYB 12基因的相对表达量显著高于WT植株。
3. 测定生物量、根冠比、最长根根长（图4D,4E,4F）；表明在低磷条件下(LP)，NtMYB12-Oe转基因烟草的生物量显著高于WT植株，根冠比、最长根根长和WT植株有差异，但差异不显著。
4. NBT染色、测定SOD、CAT、MDA的含量（图5）；表明通过NBT染色，在WT烟草植株叶片染色较深，检测到大量的ROS积累，但NtMYB12-Oe转基因植株中没有检测到大量的ROS积累。在低磷条件下(LP)，NtMYB12-Oe转基因烟草的SOD、CAT活性显著高于WT植株，MDA含量显著低于WT植株，NtMYB 12在烟草中的过表达显著提高了植物的抗氧化能力。
5. 测定全磷含量和Pht1基因家族的表达水平（图6）；表明在低磷条件下(LP)，NtMYB12-Oe转基因烟草的总磷（total P）含量、无机磷(Pi)含量以及Pht1基因家族NtPT1和NtPT2的相对表达量显著高于WT植株。
6. 测定黄酮醇的含量和参与黄酮生物合成的基因NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtFLS表达水平（图7）；表明：在磷供应充足条件下(HP)，WT植株的黄酮醇含量为0.0644 mg/g，NtMYB12-Oe转基因株系Oe1和Oe2的黄酮醇含量分别为0.8001 mg/g和0.9215 mg/g，Oe1和Oe2转基因株系的黄酮醇含量分别是WT植株的12.42倍和14.31倍；在低磷条件下(LP)，WT植株的黄酮醇含量为0.5093 mg/g，NtMYB12-Oe转基因株系Oe1和Oe2的黄酮醇含量分别为1.0391 mg/g和1.1432 mg/g，Oe1和Oe2转基因株系的黄酮醇含量分别是WT植株的2.04倍和2.24倍。同时，在磷供应充足条件下(HP)，Oe1和Oe2转基因株系参与黄酮生物合成的相关基因的相对表达量显著高于WT植株，其中Oe1和Oe2转基因株系中NtCHS的相对表达量分别是WT植株的25.34倍和27.52倍，NtCHI的相对表达量分别是WT植株的7.42倍和6.84倍，NtFLS的相对表达量分别是WT植株的15.25倍和16.15倍。
结果显示NtMYB12上调NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtFLS的表达水平，从而导致黄酮醇在烟叶中的积累；NtMYB12过表达改善了Pi摄入量，增强了烟草对低磷胁迫的耐受性；为高黄酮醇烟草栽培技术和烟叶的综合利用提供依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 河南农业大学
<120> 一种高黄酮醇烟草的制备方法及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1254
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum L.
<220>
<223> gene
<222> （1）…（1254）
<400> 1
atgggaagag caccttgttg tgagaaagtg ggtctcaaaa gaggcagatg gactgcagaa 60
gaggatgaaa ttctcactaa atatattcaa actaacggcg aaggctcttg gagatcatta 120
cccaaaaatg ctggcttact tagatgtgga aagagttgcc gactgagatg gattaattac 180
ttgaggtctg atttgaggag aggtaacata acttctgaag aggaagacat aatcatcaag 240
ttacatgcaa ctttgggtaa cagatggtct ctaatagcgg cacatttacc aggtagaaca 300
gacaatgaga ttaaaaacta ctggaactct catctaagca gaaaagttga aagcttaagg 360
attccaagcg acgaaaagct gcctcaagct gtagttgatt tggctaagaa aggaactttg 420
aaccctatca aatgtagagt tggcaaaaca agccgaccct cagtaaagaa aaacaaaacg 480
tttaaaaagt ctagttcaag tttgtcagag cctaagcaac ctaaagaaag tagtgaacct 540
ttaaattcaa cagttcctat gccctcaact ccaaacatgg aaaaagaggc cttatctagc 600
accattagct catggttaga aggtaacaat gtcatggatt ccatgcaaga agaggtagca 660
aacgtagccg cgccaaatcc ttggtcggga tctagagagg cccagagcag ccttagttca 720
gatagtggga tggaatggct tgaggaaatt atgccaatgg tcattgccga tcaagatatg 780
gacccaaatg aattcatttt gacttattta gacaacgggc aaggagaaag cccggaaaaa 840
gtaaccaacg aggcagaaaa taactgcggg accacgaaca gaatcaatga acgtaacaac 900
aaagatcacg ttaataaaat ggtatcaagt gaaaatacac aactggagag tagtccagag 960
agtgagactg tatcaataaa tattctgaaa gatgtacaag agaatagcaa cgaatcgaaa 1020
ttattaatgg aagatagtac agttgaatgg gattggcaag agatagcaga tgacatgaga 1080
gaagtatggt catgggaaga aacagggcaa gacaacatgt taattaatca cagttggccg 1140
ctatgggata atactggcac tgagttcacg aatgaaataa cggtggaaat ggattccgtg 1200
ctgcacagtg aaaacccaaa ccatagtgcc cttgtcgctt ggcttttgtc ttag 1254

Claims (3)

1.一种高黄酮醇烟草的制备方法，其特征在于，步骤为：构建烟草基因NtMYB12的植物表达载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得NtMYB12-Oe转基因纯合系即为高黄酮醇烟草，所述NtMYB12序列如SEQ ID No.1所示，所述野生型烟草为云烟87。
2.根据权利要求1所述的高黄酮醇烟草的制备方法，其特征在于：所述植物表达载体上带有35S强启动子。
3.权利要求1或2所述的方法制备的高黄酮醇烟草作为培育耐低磷胁迫烟草植株的应用。
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CN110483629A (zh) * 2019-09-17 2019-11-22 华南农业大学 调控植物花色素苷积累的转录因子、重组真核表达载体及应用

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