CN111500579A

CN111500579A - 棉花miR164a和NAC100L及其在调控植物黄萎病抗性中的应用

Info

Publication number: CN111500579A
Application number: CN202010325587.9A
Authority: CN
Inventors: 吴家和; 胡广; 胡保民; 陈爱民; 雷煜; 姜辉; 权永刚; 闻甜; 武晓刚
Original assignee: Join Hope Seed Industry Co ltd; Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Join Hope Seed Industry Co ltd; Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明公开了棉花miR164a和NAC100L及其在调控植物黄萎病抗性中的应用。本发明提供了GhNAC100L蛋白(SEQ ID No.2)和ghr‑miR164a(SEQ ID No.1)。实验证明，本发明所提供的ghr‑miR164a和GhNAC100L作为一个抗病模块正向调控抗病，可以作为棉花抗黄萎病育种的候选基因。

Description

棉花miR164a和NAC100L及其在调控植物黄萎病抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及棉花miR164a和NAC100L及其在调控植物黄萎病抗性中的应用。

背景技术

棉花属于锦葵科棉属植物，其栽培种目前有4种，包括陆地棉、海岛棉、草棉和亚洲棉，其中陆地棉为主栽品种。棉花是一种重要的经济作物，棉花纤维是纺织工业的重要原料，棉籽油是食品和化工用油的主要来源之一，棉籽粕是牛羊等反刍动物饲料的蛋白添加成分。棉花的产量和品质易受到各种生物胁迫和非生物胁迫的影响，其中棉花黄萎病严重制约着棉花的生产。棉花黄萎病是一种土传性的维管束病害，其病原菌主要为大丽轮枝菌，该真菌属于半知菌亚门轮枝菌属。病原菌从棉花根部入侵，引起植株病变，严重影响着棉花的纤维产量和品质。由于棉花黄萎病分布范围广，危害严重，传播途径多和生存时间长等特点，为解决当前这个棘手的问题，培育抗病品种是最经济有效的方法。然而，棉花抗病品种培育的难点在于抗病种质资源的获得。目前，由于缺乏抗病免疫的种质资源，所以利用常规育种方法很难有效地培育抗病品种。因此，利用基因工程技术挖掘抗病相关基因，创制抗病新品种，成为当前解决棉花黄萎病危害的重要研究方向。总之，提高棉花的抗病性对于棉花的安全生产及人民美好生活具有重要意义。

microRNAs(miRNAs)是长度约为19-24个核苷酸的非编码蛋白的小RNA家族，在转录后调控靶标基因表达。miRNA在植物纤维发育、信号传导、逆境响应、激素合成、形态建成等方面发挥着重要作用。

植物抗病基因的挖掘主要涉及一些调控基因表达的调控因子，主要包括调控蛋白和转录因子。其中转录因子又称反式作用因子，特异结合到真核基因启动子区域顺式作用元件上，并激活或抑制下游基因的转录。这些转录因子主要包括NAC、MYB、bZIP、WRKY等，他们在植物生长发育和防卫反应中发挥着重要的作用。本发明涉及的NAC转录因子是植物转录因子家族中重要的一类转录因子家族，参与植物生长发育和防卫反应等过程。

近年来，一些文献报道miRNA和NAC转录因子参与植物抗病反应，然而，参与棉花抗黄萎病反应的miRNA-NAC转录因子的研究较少，尤其深入评析这些基因的抗病性研究很少。

发明内容

本发明的目的是提供棉花miR164a和NAC100L及其在调控植物黄萎病抗性中的应用。

第一方面，本发明要求保护一种生物材料。

本发明要求保护的生物材料由(A)和(B)组成。

(A)蛋白质或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够表达所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

(B)miRNA或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够转录成所述miRNA的DNA分子或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述蛋白质为如下(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

(A2)将(A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

所述miRNA为成熟miRNA或所述成熟miRNA对应的前体miRNA；所述成熟miRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

进一步地，在(A)中，所述核酸分子可为如下任一：

(B1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

进一步地，在(B)中，所述DNA分子的核苷酸序列可如SEQ ID No.5所示。

其中，所述重组载体可为重组表达载体或者重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

第二方面，本发明要求保护蛋白质或其相关生物材料。

本发明所要求保护的蛋白质或其相关生物材料如前文第一方面中(A)所示。

第三方面，本发明要求保护前文第一方面所述生物材料或前文第二方面所述蛋白质或其相关生物材料或前文第一方面中(B)所示的miRNA或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(C1)调控植物对黄萎病的抗性；

(C2)调控植物对大丽轮枝菌的抗性；

(C3)调控植物对维管束寄生病原菌的抗性。

在所述应用中，前文第一方面中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越高，和/或前文第一方面中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越低，所述植物对黄萎病的抗性越弱；前文第一方面中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越低，和/或前文第一方面中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越高，所述植物对黄萎病的抗性越强。

在所述应用中，前文第一方面中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越高，和/或前文第一方面中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越低，所述植物对大丽轮枝菌的抗性越弱；前文第一方面中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越低，和/或前文第一方面中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越高，所述植物对大丽轮枝菌的抗性越强。

在所述应用中，前文第一方面中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越高，和/或前文第一方面中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越低，所述植物对维管束寄生病原菌的抗性越弱；前文第一方面中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越低，和/或前文第一方面中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越高，所述植物对维管束寄生病原菌的抗性越强。

第四方面，本发明要求保护一种培育植物品种的方法。

本发明所要求保护的培育植物品种的方法，可为如下任一：

方法A1：一种培育对黄萎病抗性提高的植物品种的方法，包括如下步骤(a1)和/或(a2)：

(a1)使受体植物中特定蛋白质的表达量和/或活性降低；所述特定蛋白质为前文第一方面中(A)所示的蛋白质；

(a2)使受体植物中特定miRNA的表达量升高；所述特定miRNA为前文第一方面中(B)所示的miRNA。

方法A2：一种培育对大丽轮枝菌抗性提高的植物品种的方法，包括如下步骤(a1)和/或(a2)：

方法A3：一种培育对维管束寄生病原菌抗性提高的植物品种的方法，包括如下步骤(a1)和/或(a2)：

方法B1：一种培育对黄萎病抗性降低的植物品种的方法，包括如下步骤(b1)和/或(b2)：

(b1)使受体植物中特定蛋白质的表达量和/或活性升高；所述特定蛋白质为前文第一方面中(A)所示的蛋白质；

(b2)使受体植物中特定miRNA的表达量降低；所述特定miRNA为前文第一方面中(B)所示的miRNA。

方法B2：一种培育对大丽轮枝菌抗性降低的植物品种的方法，包括如下步骤(b1)和/或(b2)：

方法B3：一种培育对维管束寄生病原菌抗性降低的植物品种的方法，包括如下步骤(b1)和/或(b2)：

第五方面，本发明要求保护一种培育转基因植物的方法。

本发明所要求保护的培育转基因植物的方法，可为如下任一：

方法C1：一种培育对黄萎病抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中特定核酸分子进行抑制表达，和/或向所述受体植物中导入特定DNA分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对黄萎病抗性提高；所述特定核酸分子为前文第一方面中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为前文第一方面中(B)所示的DNA分子。

方法C2：一种培育对大丽轮枝菌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中特定核酸分子进行抑制表达，和/或向所述受体植物中导入特定DNA分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对大丽轮枝菌抗性提高；所述特定核酸分子为前文第一方面中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为前文第一方面中(B)所示的DNA分子。

方法C3：一种培育对维管束寄生病原菌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中特定核酸分子进行抑制表达，和/或向所述受体植物中导入特定DNA分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对维管束寄生病原菌抗性提高；所述特定核酸分子为前文第一方面中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为前文第一方面中(B)所示的DNA分子。

方法D1：一种培育对黄萎病抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入特定核酸分子，和/或对所述受体植物中的特定DNA分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对黄萎病抗性降低；所述特定核酸分子为前文第一方面中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为前文第一方面中(B)所示的DNA分子。

方法D2：一种培育对大丽轮枝菌抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入特定核酸分子，和/或对所述受体植物中的特定DNA分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对大丽轮枝菌抗性降低；所述特定核酸分子为前文第一方面中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为前文第一方面中(B)所示的DNA分子。

方法D3：一种培育对维管束寄生病原菌抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入特定核酸分子，和/或对所述受体植物中的特定DNA分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对维管束寄生病原菌抗性降低；所述特定核酸分子为前文第一方面中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为前文第一方面中(B)所示的DNA分子。

在所述方法C1-C3中，所述“对受体植物中特定核酸分子进行抑制表达”可通过任何技术手段实现。在本发明的具体实施方式中，具体是通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术实现的。所用VIGS载体为烟草脆裂病毒(TRV)，具体为SEQ ID No.4(即SEQ ID No.3的第451-781位)所示DNA片段克隆到pYL156载体中所得重组载体。

在所述方法C1-C3中，所述“向所述受体植物中导入特定DNA分子”可通过任何技术手段实现，如通过重组表达载体的形式将所述特定DNA分子导入所述受体植物中。在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为SEQ ID No.5所示DNA片段克隆到pYL156载体中所得重组载体。

在所述方法D1-D3中，所述“向受体植物中导入特定核酸分子”可通过任何技术手段实现，如通过重组表达载体的形式将所述特定核酸分子导入所述受体植物中。

在所述方法D1-D3中，所述“对所述受体植物中的特定DNA分子进行抑制表达”可通过任何技术手段实现的。所用VIGS载体为烟草脆裂病毒(TRV)，具体为SEQ ID No.6所示DNA片段克隆到pYL156载体中所得重组载体。

在上述方法中，将各重组载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。

在上述各方面中，所述植物可为能够感染黄萎病或者大丽轮枝菌或者维管束寄生病原菌的植物。

进一步地，所述植物可为锦葵科植物。

更进一步地，所述锦葵科植物可为棉属植物(如陆地棉)。

在本发明的具体实施方式中，所述植物具体为陆地棉品种中棉所35。

在本发明的具体实施方式中，所述大丽轮枝菌具体为大丽轮枝菌‘V991’菌株。

在本发明的具体实施方式中，所述对黄萎病的抗性、所述对大丽轮枝菌的抗性和所述对维管束寄生病原菌的抗性的高低具体体现在病株率和/或病情指数上。

第六方面，本发明要求保护前文第一方面中(B)所示的miRNA在调控前文第一方面中(A)所示蛋白质的表达量中的应用。

本发明根据miRNA数据库(http://www.mirbase.org/)公布的基因序列设计特异性引物，利用PCR技术，从棉花叶中克隆得到ghr-miR164a(SEQ ID No.1，其前体编码基因如SEQ ID No.5所示)。从棉花基因组数据库(https://www.cottongen.org/)公布的基因序列设计特异性引物，利用PCR技术，从棉花叶中克隆得到GhNAC100L基因(SEQ ID No.3)。利用qRT-PCR分析发现ghr-miR164a在棉花的根茎叶中均表达，在根中为优势表达，在叶中的表达量较低；GhNAC100L则相反，在根中表达量最低。同时ghr-miR164a和GhNAC100L表达受到大丽轮枝菌的诱导，ghr-miR164a在病原菌诱导下上调表达，然而GhNAC100L表达受到抑制。通过病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术获得GhNAC100L基因沉默植株。对基因沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析，结果显示沉默植株的病株率和病指均低于对照植株，表明沉默GhNAC100L基因能够提高棉株抗病性。同时，使用VIGS技术获得ghr-miR164a过表达和沉默植株。对这些植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析，结果显示ghr-miR164a过表达植株可以增强棉株抗病性，ghr-miR164a沉默棉株则成为易感病棉株。GUS染色试验结果表明，ghr-miR164a可以在转录后直接切割GhNAC100L的mRNA。因此ghr-miR164a和GhNAC100L作为一个抗病模块正向调控抗病，可以作为棉花抗黄萎病育种的候选基因。

附图说明

图1为棉花GhNAC100L与其他植物NAC100***发育树分析对比图。

图2为ghr-miR164a和GhNAC100L在棉花不同组织器官的特异性表达分析图。

图3为大丽轮枝菌侵染棉花后GhNAC100L在不同时间点的表达谱分析示意图。

图4为ghr-miR164a和GhNAC100L在烟草叶片GUS染色分析示意图。

图5为棉花GhPDS基因沉默分析示意图。

图6为棉花ghr-miR164a沉默和过表达植株表达分析示意图。

图7为棉花ghr-miR164a沉默和过表达植株及对照植株发病情况示意图。

图8为棉花ghr-miR164a沉默和过表达植株及对照植株病情指数统计示意图。

图9为棉花GhNAC100L基因沉默分析示意图。

图10为棉花GhNAC100L基因沉默植株和对照植株发病情况示意图。

图11为棉花GhNAC100L基因沉默植株和对照植株病情指数统计示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

有关试剂盒使用参照所购试剂盒的应用说明；所用限制性内切酶和其它工具酶均为TaKaRa公司产品。

棉花材料为中棉所35，来自山西农业科学院棉花研究所种苗公司。烟草材料、大肠杆菌‘DH5α’感受态细胞和根癌农杆菌菌株‘GV3101’由植物基因组学国家重点实验室保存。黄萎病菌菌株(大丽轮枝菌，V.dahliae)‘V991’，由中国农业科学院植物保护研究所简桂良研究员馈赠。各种限制性内切酶及Buffer为TaKaRa公司产品。各类化学试剂、培养基、柱式植物总RNA分离提取纯化试剂盒和植物DNA提取试剂盒均为上海生工生物工程股份有限公司产品。质粒小量制备试剂盒(升级版离心柱型)为上海捷瑞生物工程有限公司产品。TaqDNA聚合酶、dNTPs、Taq Buffer、T4 DNA连接酶、PCR纯化回收试剂盒；PCR切胶回收试剂盒、克隆载体pEASY-T1试剂盒、EasyScript One-Step gDNA Removel and cDNA SynthesisSuperMix试剂盒、TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒均为北京全式金生物技术有限公司产品。植物表达载体pBI121为上海捷瑞生物工程有限公司产品。

实施例1、棉花GhNAC100L基因的克隆和表达分析

1、总RNA的提取和cDNA第一链的合成

将中棉所35的种子用无菌水浸泡，置于37℃浸泡过夜，然后移置到培养盒中，置于25℃的光照培养箱中处理48h，光周期为12h光照8h黑暗，等种子发芽后移置到充满水的培养盒中，放置到培养箱中进行培养。棉花幼苗长出真叶后分别摘取棉花幼苗的根、茎和叶样品，使用柱式植物总RNA分离提取纯化试剂盒提取棉花RNA。cDNA第一链的合成参照EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明进行。

2、棉花GhNAC100L基因克隆

根据拟南芥NAC100序列在棉花基因组数据库(https://www.cottongen.org/)进行直系同源比对，找到与拟南芥NAC100高保守性的直系同源基因，命名为GhNAC100L。根据GhNAC100L基因序列设计引物，引物为：

GhNAC100L-F：5’-ATGGCAAACATTGGTGAAGAAG-3’；

GhNAC100L-R：5’-TCAGTAATGCCAAAAACAAT C-3’。

本实验所有引物均由北京梓熙生物科技有限公司合成。以棉花叶的cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物连接到T载体上进行测序，测序由北京擎科生物技术有限公司完成。结果表明获得的片段大小与预期的大小一致，该片段全长999bp，包含了从ATG开始TGA结束完整的ORF阅读框，编码了332个氨基酸残基，分子量为37.5KDa，等电点pI＝5.11。GhNAC100L基因序列如SEQ ID N0.3所示，编码SEQ ID N0.2所示蛋白质。

3、GhNAC100L基因序列***进化树构建

在NCBI中选取不同植物的NAC100的氨基酸序列，它们分别是：大豆GmNAC100(XP_003524726)、木薯MeNAC100(XP_021614789)、橡胶树HbNAC100(XP_021642379)、葡萄VvNAC100(XP_002284825)和拟南芥AtNAC100(AT5G61430)。利用MEGA5.2程序将它们与棉花GhNAC100L进行***进化树的构建，由图1我们可以看出，GhNAC100L与木薯MeNAC100(XP_021614789)和橡胶树HbNAC100(XP_021642379)蛋白具有较高的亲缘关系。

4、GhNAC100L基因在不同组织和不同处理条件下的表达分析

(1)样品的采集和处理设置

大丽轮枝菌接种：将发好芽的中棉所35种子种植到水培培养盒中，置于光照16h、黑暗8h、28℃的培养箱中进行培养，选取长势一致并具有两片真叶的棉苗接种大丽轮枝菌V991孢子悬液。对棉株主根进行统一伤根处理后放到含有10⁶个/mL大丽轮枝菌V991孢子液中浸泡50min，然后再转到水培盒中，置于培养箱中继续培养。按照相应的时间点取棉株根样(1、4、7、10和13天)，保存于-80℃冰箱待用。

(2)Quantitative Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法

利用qRT-PCR方法，检测ghr-miR164a和GhNAC100L在棉花根、茎和叶中的表达情况及其病原菌和激素诱导后的表达情况。

miRNA反转录引物：

miR164-RT：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCACG-3’；

5.8S-R：5’-TGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGTGA-3’。

扩增ghr-miR164a的引物为：

miR164-F：5’-GCGGCGTGGAGAAGCAGGCA-3；

miR164-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

以棉花5.8S作为内参基因，扩增引物为：

5.8S-F：5’-ATTAGGCCGAGGGCACGTCTG-3’；

5.8S-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

qRT-PCR所用的反应体系为20μL，以不同处理后的棉花样本cDNA为模板，具体反应体系按照试剂盒使用说明进行配制。扩增条件为：95℃预变性2min，40个循环：95℃10s，58℃15s，72℃15s。以5.8S基因为内参，生物学实验重复3次。

扩增GhNAC100L的引物为：

qGhNAC100L-F：5’-CCAATCCTATCGGTCCTCAAG-3’；

qGhNAC100L-R：5’-AAATCAGCAGCGTAGAACGG-3’。

以棉花UBQ7作为内参基因，扩增引物为：

UBQ7-F：5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’；

UBQ7-R：5’-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’。

qRT-PCR所用的反应体系为20μL，以不同处理后的棉花样本cDNA为模板，具体反应体系按照试剂盒使用说明进行配制。扩增条件为：95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；72℃，30s；40个循环。以UBQ7基因为内参，生物学实验重复3次。

基因的相对表达量通过2^–ΔΔCT方法计算。

(3)织特异表达分析

抽取棉花的根、茎和叶器官的总RNA，反转录成cDNA，利用该cDNA作为模板进行qRT-PCR分析，结果表明ghr-miR164a和GhNAC100L基因在这些组织器官中均表达(图2)，ghr-miR164a在根里的表达量较高，茎次之，叶中的表达量最低，GhNAC100L基因则相反，暗示这个两个基因的表达存在负相关关系，其模块功能可能存在组织特异性。

(4)大丽轮枝菌入侵对棉花ghr-miR164a和GhNAC100L诱导表达分析

为了分析ghr-miR164a和GhNAC100L基因是否参与棉花的抗病性，用大丽轮枝菌的孢子液对棉苗进行接菌，提取棉花根RNA并反转录成cDNA，利用该cDNA作为模板，通过qRT-PCR方法分析ghr-miR164a和GhNAC100L基因对大丽轮枝菌的响应，结果表明接种后7天之前，ghr-miR164a表达略有增加，而在10和13天时，与对照(水处理的平行试验)相比显著上调表达；与对照(水处理的平行试验)处理相比，GhNAC100L表达水平显著降低(图3)。表明ghr-miR164a和GhNAC100L基因受到大丽轮枝菌的诱导，可能参与棉花对黄萎病的抗性。

实施例2、GhNAC100L在转录后被ghr-miR164a调控表达分析

1、构建pBI121-MIR164质粒

用植物DNA提取试剂盒提取中棉所35DNA，以提取的DNA为模板，加入正向和反向引物(F：5’-GCGGATCCCATGAAAACTTAGACCCCAGAGC-3’，下划线为BamH I酶切位点，和R：5’-CGGAGCTCCCGCTGATGATTGCAGGTG-3’，下划线为Sac I酶切位点)扩增ghr-miR164a前体基因(SEQ ID No.5)，扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；35个循环。扩增产物***植物表达载体pBI121,替换了原pBI121载体上的GUS基因，构建pBI121-MIR164质粒，并经测序验证正确。

2、构建pBI121-NAC100和pBI121-NAC100mu质粒

使用中棉所35的cDNA为模板，加入正向引物GhNAC100-F(5’-GCTCTAGAATGGCAAACATTGGTGAAGAAG-3’)，引物序列中引入Xba I限制性酶切位点(下划线部分)和反向引物GhNAC100-R(5’-CGGGATCCTCAGTAATGCCAAAAACAATCAAG-3’)，引物序列中引入BamH I限制性酶切位点(下划线部分)，扩增基因GhNAC100。扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，60s；35个循环。扩增产物***植物表达载体pBI121，融合GUS基因表达，构建pBI121-NAC100质粒，并经测序验证正确。

设计突变正向引物NAC100mu-F(5’-GTTTTTGCCGATTCAACGTATGTACCGTGTTTTAGTGATCCTATCGGTC-3’)，和反向引物NAC100mu-R(5’-GACCGATAGGATCACTAAAACACGGTACATACGTTGAATCGGCAAAAAC-3’)。以质粒pBI121-NAC100为模板，利用引物GhNAC100-F和NAC100mu-R，NAC100mu-F和GhNAC100-R扩增，扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，60s；35个循环，分别得到扩增产物α和β。以扩增产物α和β为模板，加入引物GhNAC100-F和GhNAC100-R，扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，60s；35个循环。将得到的扩增产物(将SEQ ID No.3第639-659位突变)***植物表达载体pBI121，融合GUS基因表达，构建pBI121-NAC100mu质粒。

3、工程农杆菌的培养

将已构建正确的质粒pBI121-MIR164、pBI121-NAC100和pBI121-NAC100mu用电击法转化到农杆菌GV3101中，经卡那霉素(50mg/mL)、庆大霉素(50mg/mL)和利福平(25mg/mL)筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和测序验证，结果表明这些质粒都已经转入农杆菌GV3101。

4、农杆菌介导转化烟草叶片

将农杆菌菌种接种到含有卡那霉素(50mg/mL)、庆大霉素(50mg/mL)和利福平(25mg/mL)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；室温4000g离心10min；弃上清，用MMA缓冲液重悬菌体，调节菌液OD600＝0.8，室温静置约2h；注射前将重悬菌液按照试验需要混合，用注射器的针头轻点烟草叶片下表皮，注射器吸取适当菌液，于针头轻点处注射，直到叶片充分被重悬菌液浸润；注射后第三天可进行GUS报告基因染色检测。

5、GUS组织染色

将整片烟草叶片剪下，浸泡在90％丙酮中，4℃过夜；用0.1M PBS缓冲液清洗三次；将烟草叶片浸泡在GUS染液(X-Gluc，Triton X-100，EDTA，PBS缓冲液，亚铁***，六氰合铁酸钾)中，37℃过夜；使用70％乙醇反复洗涤至叶片黄色褪去。

6、在本氏烟叶中瞬时表达ghr-miR164a调控其靶基因GhNAC100L

将ghr-miR164a表达载体pBI121-MIR164与其靶基因GhNAC100L表达载体pBI121-NAC100和突变靶基因mGhNAC100L表达载体pBI121-NAC100mu利用农杆菌GV3101介导转化烟草叶片瞬时表达。单独转化农杆菌pBI121-NAC100，报告基因GUS可以正常表达，有明显的蓝色，说明载体构建正常。共转化农杆菌pBI121-MIR164和pBI121-NAC100mu，报告基因GUS也可以正常表达，有明显的蓝色，表明突变的靶基因mGhNAC100L可以干涉ghr-miR164a降解其靶基因GhNAC100L。然而，共转化农杆菌pBI121-MIR164和pBI121-NAC100报告基因GUS表达则明显受到抑制，蓝色较浅，说明在本氏烟叶片中ghr-miR164a可以降解其靶基因GhNAC100L的表达(图4)。

实施例3、ghr-miR164a和GhNAC100L基因沉默及过表达植株对大丽轮枝菌的抗性分析

1、病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)植株的培育

(1)病毒沉默载体pYL156-ST164a的构建

由上海捷瑞生物工程有限公司化学合成，STTM164a(5’-GGGGTACCTGCACGTGCCCAGTTGCTTCTCCAGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAATTGCACGTGCCCAGTTGCTTCTCCACCCGGGGGGA-3’)，在STTM164a合成片段(SEQ ID No.6)的5'端和3'端分别加上酶切位点Kpn I和Xmal I。将STTM164a合成片段酶切，***病毒载体pYL156的相应酶切位点，构建沉默载体pYL156-ST164a并经测序验证正确。

(2)病毒过表达载体pYL156-OE164a的构建

以中棉所35DNA为模板，使用正向引物MIR164a-F(5’-CCACTAGTCATGAAAACTTAGACCCCAGAGC-3’)，引物序列中引入酶切位点Spe I(下划线部分)和反向引物MIR164a-R(5’-GGGGTACCCCGCTGATGATTGCAGGTG-3’)，引物序列中引入酶切位点KpnI(下划线部分)，扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；35个循环。扩增产物(SEQ ID No.5)***病毒载体pYL156的相应酶切位点，构建过表达ghr-miR164a病毒载体pYL156-OE164a，并经测序验证正确。

(3)病毒沉默载体pYL156-GhNAC100L的构建

病毒沉默表达载体pYL156由清华大学刘玉乐教授惠赠。首先利用PCR技术克隆GhNAC100L基因的目的片段，扩增所用引物为VGhNAC100L-F：5’-CGGGATCCGCCAAGAATGAATGGGTG-3’；VGhNAC100L-R：5’-GGGGTACCAATCAGCAGCGTAGAACGG-3’(下划线分别是BamH I和Kpn I酶切位点)。用限制性内切酶BamH I和Kpn I酶切该扩增产物(在SEQ ID No.4两端添加相应的酶切位点识别序列和保护碱基)和pYL156载体，然后进行连接反应，将片段***到pYL156载体的BamH I和Kpn I位点之间构建成病毒沉默载体pYL156-GhNAC100L。将构建成功的病毒沉默载体pYL156-GhNAC100L转化大肠杆菌DH5α后，挑选阳性克隆，进行BamH I和Kpn I酶切以及测序鉴定，结果表明所获得的片段是所要克隆的GhNAC100L基因的目的片段。

(4)工程农杆菌的培养

将已构建正确的病毒沉默载体pYL156-GhNAC100L、辅助载体pYL192、阳性对照载体pYL156-PDS(植物基因组学国家重点实验室保存)和阴性对照载体pYL156用电击法转化到农杆菌GV3101中，经卡那霉素(50mg/mL)、庆大霉素(50mg/mL)和利福平(25mg/mL)筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和测序验证，结果表明病毒沉默载体pYL156-GhNAC100L、辅助载体pYL192、阳性对照载体pYL156-PDS和阴性对照载体pYL156已经转入农杆菌GV3101。

同样的方法将pYL156-ST164a和pYL156-OE164a质粒也分别转入农杆菌GV3101。

(5)GhNAC100L基因沉默植株、ghr-miR164a沉默和过表达植株的培育

上述验证正确的工程农杆菌加到含有卡那霉素(50mg/mL)、庆大霉素(50mg/mL)和利福平(25mg/mL)的液体LB培养基中于28℃，200rpm过夜培养，培养液经离心后倒去上清，用MMA(10mM MES，10mM MgCl2，200mM AS)溶液重悬菌体，调节至终浓度OD600为1.2，放到黑暗处静置2-3小时，然后将含有pYL156-GhNAC100L、pYL156-ST164a、pYL156-OE164a、pYL156-PDS和pYL156质粒的农杆菌悬浮液分别与含pYL192质粒的农杆菌悬浮液按1:1混合均匀备用。当中棉所35两片子叶完全展开后，可用于农杆菌注射侵染；先用针头在子叶背面轻轻划出伤口，然后用1mL去掉针头的无菌注射器将菌液从子叶背面的伤口处注射进去，尽量使整片子叶全部被侵染，将注射后的植株放到黑暗处处理12h，然后放到光照培养箱进行培养。

2、过表达ghr-miR164a植株对大丽轮枝菌的抗性分析

农杆菌转化棉株两周后，观察到阳性对照TRV:PDS植株新长出来的真叶出现白化表型，这表明同批次处理的其他基因也可能发生沉默(图5)。分别取阴性对照组TRV:00植株和试验组TRV:OE164a植株幼嫩叶片，提取总RNA，反转录成cDNA，以反转录后稀释的cDNA为模板，用qRT-PCR方法分别检测ghr-miR164a在过表达棉株中的表达情况(具体方法见前文)。TRV:OE164a植株中ghr-miR164a相对表达量与对照组TRV:00植株相比，相对表达量上升了近250％(图6)。将过表达植株接种大丽轮枝菌V991孢子液，具体同实施例1中4(1)。第21天后观察棉花植株的抗病表型并计算病情指数。

利用叶片分级法统计棉花病情指数(disease index,DI)，将遭受病原菌侵染程度的轻重划分为5个等级：

0级：植株总叶片生长正常，无萎蔫，褪绿；

1级：植株总叶片发黄、萎蔫面积＜25％；

2级：植株总叶片发黄、萎蔫面积≥25％,＜50％；

3级：植株总叶片发黄、萎蔫面积≥50％,＜75％；

4级：植株总叶片发黄、萎蔫面积≥75％，或脱落死亡。

结果显示：TRV:OE164a植株与对照组TRV:00植株相比，抵抗棉花黄痿病菌V991入侵的能力更强，对照组TRV:00植株叶片黄化、萎蔫、坏死现象较严重(图7)。同时，病情指数统计结果也表明，TRV:OE164a植植株的抗性更强(图8)。

3、ghr-miR164a沉默植株对大丽轮枝菌的抗性分析

VIGS处理两周后，取阴性对照组TRV:00和试验组TRV:ST164a植株的幼嫩叶片，提取总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，检测ghr-miR164a在TRV:ST164a植株是否发生了沉默(qRT-PCR法，具体见前文)。TRV:ST164a植株中ghr-miR164a相对表达量与对照组沉默植株相比，其相对表达量下降了约60％(图6)。在确认ghr-miR164a被沉默后，将沉默植株和对照组植株分别接种大丽轮枝菌V991的孢子液，具体同实施例1中4(1)。第21天观察棉花植株的抗病表型并计算病情指数(同上)。

结果显示：TRV:ST164a与TRV:00植株相比，抵抗棉花黄痿病菌V991侵染的能力较差，TRV:ST164a植株出现的叶片失水、坏死现象更严重，甚至出现有枯死棉株(图7)。同时，病情指数统计结果也表明，相比对照组TRV:00植株，TRV:ST164a沉默植株更易被病原菌侵染(图8)。

4、GhNAC100L沉默植株对大丽轮枝菌的抗性分析

利用qRT-PCR技术检测GhNAC100L基因在沉默植株和对照植株中的表达情况(取材为幼嫩叶片，qRT-PCR具体方法见前文)，结果表明该基因在沉默植株中表达水平下降了约60％(图9)。选取沉默效果较好的植株接种大丽轮枝菌V991孢子液，具体同实施例1中4(1)。接菌21天后，对照植株表现出明显的叶片黄化，萎蔫脱落等发病症状，而GhNAC100L沉默植株表现出更强的抗病性(图10)。GhNAC100L沉默植株病情指数与接菌表型一致(图11)，表明GhNAC100L沉默植株对大丽轮枝菌具有更强的抗性。说明GhNAC100L负调控棉花对大丽轮枝菌的抗病性。

<110> 九圣禾种业股份有限公司；中国科学院微生物研究所

<120> 棉花miR164a和NAC100L及其在调控植物黄萎病抗性中的应用

<130> GNCLN200899

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

uggagaagca gggcacgugc a 21

<210> 2

<211> 332

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Ala Asn Ile Gly Glu Glu Asp Asp Ile Met Asp Leu Pro Pro Gly

1 5 10 15

Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ile His Gln Tyr Leu Tyr

20 25 30

Lys Lys Val Leu Gly Ile Ser Phe Ser Ser Ile Ala Ile Gly Glu Val

35 40 45

Asp Leu Asn Lys Ser Glu Pro Trp Asp Leu Pro Trp Lys Ala Lys Met

50 55 60

Gly Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Cys Val Arg His Arg Lys Tyr Pro

65 70 75 80

Thr Gly Leu Arg Thr Asn Arg Ala Thr Asp Ser Gly Tyr Trp Lys Ala

85 90 95

Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Tyr Met Gly Lys Ser Leu Val Gly Met

100 105 110

Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Gln Gly Arg Ala Pro Lys Gly Ala Lys

115 120 125

Thr Asn Trp Val Met His Glu Tyr Arg Leu Asp Gly Lys Phe Ser Ile

130 135 140

Gln Asn Leu Pro Lys Thr Ala Lys Asn Glu Trp Val Ile Cys Arg Val

145 150 155 160

Phe Gln Lys Ser Ser Asp Gly Lys Lys Ile Pro Ile Ser Ser Leu Val

165 170 175

Lys Ala Ser Cys Leu Ser Asn Glu Leu Gly Pro Ala Thr Gly Leu Pro

180 185 190

Pro Leu Met Asp Ser Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Lys Cys Glu Pro Val

195 200 205

Phe Ala Asp Ser Thr Tyr Val Pro Cys Phe Ser Asn Pro Ile Gly Pro

210 215 220

Gln Ala Asn Gln Gln Ile Thr Ile Asp His Asn Phe Asn Asn Arg Thr

225 230 235 240

Leu His Val Ser Ser Asn Pro Cys His Val Phe Pro Gln Asn Pro Phe

245 250 255

Tyr Ala Ala Asp Phe Glu Ser Leu Gly Ser Val Gln Glu Gln Ser Met

260 265 270

Leu Arg Thr Leu Ile Glu Asn His Gly Ser Lys Val Gln Ala Glu Arg

275 280 285

Lys Ile Val Arg Lys Pro Glu Met Leu Ser Val Val Ser Asn Arg Glu

290 295 300

Ser Gly Lys Lys Thr Phe Asp Asp Gln His Ala Pro Ser Ser Ser Ser

305 310 315 320

Ala Gly Pro Val Asp Leu Asp Cys Phe Trp His Tyr

325 330

<210> 3

<211> 999

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggcaaaca ttggtgaaga agatgatata atggatttgc ccccaggttt cagatttcac 60

ccaacagatg aagagcttat tcaccaatat ttatacaaaa aagttcttgg catcagtttc 120

agttcaatag ctattggaga ggtggatttg aacaaatctg agccctggga tttaccatgg 180

aaggcgaaaa tgggagaaaa agaatggtat tttttctgtg tgagacatag aaaataccca 240

actggtttga gaacaaatag agccactgat tctgggtatt ggaaagccac tgggaaagat 300

aaagagattt acatgggaaa atcattggtt ggaatgaaga aaactcttgt tttttaccaa 360

ggcagagctc ctaaaggagc taaaaccaat tgggtcatgc atgaatatag acttgatgga 420

aaattctcaa tccaaaatct ccctaaaact gccaagaatg aatgggtgat ttgcagggta 480

tttcaaaaga gttcagatgg gaaaaaaatt cctatttcaa gcctggttaa ggctagttgt 540

ttaagcaatg aattaggtcc tgctactggt ttaccaccat taatggattc ttcaccgtac 600

aatggcggca aatgcgaacc tgtttttgcc gattcaacat acgtgccctg cttctccaat 660

cctatcggtc ctcaagcaaa ccaacaaatc acgatcgatc acaatttcaa taatcgcact 720

cttcacgttt cgtcgaatcc ttgtcatgtt ttcccgcaaa acccgttcta cgctgctgat 780

tttgaatccc ttggttcggt gcaagaacag tcgatgttga ggactttgat tgaaaaccat 840

ggatcgaagg ttcaagcgga gaggaagatt gttagaaaac cagaaatgtt atctgttgta 900

tcgaatcggg agagtggaaa gaagacattt gatgatcaac atgcaccttc ttcttcttca 960

gctggaccag tggatcttga ttgtttttgg cattactga 999

<210> 4

<211> 331

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gccaagaatg aatgggtgat ttgcagggta tttcaaaaga gttcagatgg gaaaaaaatt 60

cctatttcaa gcctggttaa ggctagttgt ttaagcaatg aattaggtcc tgctactggt 120

ttaccaccat taatggattc ttcaccgtac aatggcggca aatgcgaacc tgtttttgcc 180

gattcaacat acgtgccctg cttctccaat cctatcggtc ctcaagcaaa ccaacaaatc 240

acgatcgatc acaatttcaa taatcgcact cttcacgttt cgtcgaatcc ttgtcatgtt 300

ttcccgcaaa acccgttcta cgctgctgat t 331

<210> 5

<211> 427

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

catgaaaact tagaccccag agctctgtct ttaaagaatg cccacttcta gactcaatct 60

ctattactct cttctttttt ttctctctct ctctcttcgg aaaaacttgt atataaataa 120

atgtcacttc ctttgctttc tgcactcaac tcatgaactt gaaaagcttt acttggatgg 180

gttggttggg ggtgagtatc tcttgttgga gaagcagggc acgtgcaagt tcctatgttt 240

aagtgaactt tgcacgtgct ccccttctcc accgtgagtt tctcattctg attgctgatt 300

gcagtactga atctgcaact gcatctcacc tctttgaaac tacagatgtc gaccaggaca 360

aaaaaggtaa tctatcatat atatgtttat cttttacatt cctctcttca cctgcaatca 420

tcagcgg 427

<210> 6

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

tgcacgtgcc cagttgcttc tccagttgtt gttgttatgg tctaatttaa atatggtcta 60

aagaagaaga attgcacgtg cccagttgct tctcca 96

Claims

1.生物材料，由(A)和(B)组成；

(A)蛋白质或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够表达所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

(B)miRNA或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够转录成所述miRNA的DNA分子或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述蛋白质为如下(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

2.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于：在(A)中，所述核酸分子为如下任一：

(B1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

3.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于：在(B)中，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.蛋白质或其相关生物材料，如权利要求1-3任一中(A)所示。

5.权利要求1-3中任一所述生物材料或权利要求4所述的蛋白质或其相关生物材料或权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(C1)调控植物对黄萎病的抗性；

(C2)调控植物对大丽轮枝菌的抗性；

(C3)调控植物对维管束寄生病原菌的抗性。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：权利要求1-3任一中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越高，和/或权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越低，所述植物对黄萎病的抗性越弱；权利要求1-3任一中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越低，和/或权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越高，所述植物对黄萎病的抗性越强；

权利要求1-3任一中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越高，和/或权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越低，所述植物对大丽轮枝菌的抗性越弱；权利要求1-3任一中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越低，和/或权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越高，所述植物对大丽轮枝菌的抗性越强；

权利要求1-3任一中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越高，和/或权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越低，所述植物对大维管束寄生病原菌的抗性越弱；权利要求1-3任一中(A)所示的蛋白质在所述植物中的含量和/或活性越低，和/或权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA在所述植物中的含量越高，所述植物对维管束寄生病原菌的抗性越强。

7.一种培育植物品种的方法，为如下任一：

(a1)使受体植物中特定蛋白质的表达量和/或活性降低；所述特定蛋白质为权利要求1-3任一中(A)所示的蛋白质；

(a2)使受体植物中特定miRNA的表达量升高；所述特定miRNA为权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA；

(b1)使受体植物中特定蛋白质的表达量和/或活性升高；所述特定蛋白质为权利要求1-3任一中(A)所示的蛋白质；

(b2)使受体植物中特定miRNA的表达量降低；所述特定miRNA为权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA；

(b2)使受体植物中特定miRNA的表达量降低；所述特定miRNA为权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA。

8.一种培育转基因植物的方法，为如下任一：

方法C1：一种培育对黄萎病抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中特定核酸分子进行抑制表达，和/或向所述受体植物中导入特定DNA分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对黄萎病抗性提高；所述特定核酸分子为权利要求1-3任一中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为权利要求1-3任一中(B)所示的DNA分子；

方法C2：一种培育对大丽轮枝菌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中特定核酸分子进行抑制表达，和/或向所述受体植物中导入特定DNA分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对大丽轮枝菌抗性提高；所述特定核酸分子为权利要求1-3任一中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为权利要求1-3任一中(B)所示的DNA分子；

方法C3：一种培育对维管束寄生病原菌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中特定核酸分子进行抑制表达，和/或向所述受体植物中导入特定DNA分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对维管束寄生病原菌抗性提高；所述特定核酸分子为权利要求1-3任一中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为权利要求1-3任一中(B)所示的DNA分子；

方法D1：一种培育对黄萎病抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入特定核酸分子，和/或对所述受体植物中的特定DNA分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对黄萎病抗性降低；所述特定核酸分子为权利要求1-3任一中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为权利要求1-3任一中(B)所示的DNA分子；

方法D2：一种培育对大丽轮枝菌抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入特定核酸分子，和/或对所述受体植物中的特定DNA分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对大丽轮枝菌抗性降低；所述特定核酸分子为权利要求1-3任一中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为权利要求1-3任一中(B)所示的DNA分子；

方法D3：一种培育对维管束寄生病原菌抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入特定核酸分子，和/或对所述受体植物中的特定DNA分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对维管束寄生病原菌抗性降低；所述特定核酸分子为权利要求1-3任一中(A)所示的核酸分子；所述特定DNA分子为权利要求1-3任一中(B)所示的DNA分子。

9.根据权利要求5-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为能够感染黄萎病或者大丽轮枝菌或者维管束寄生病原菌的植物；

进一步地，所述植物为锦葵科植物；

更进一步地，所述锦葵科植物为棉属植物。

10.权利要求1-3任一中(B)所示的miRNA在调控权利要求1-3任一中(A)所示蛋白质的表达量中的应用。