CN112126655A

CN112126655A - 一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN112126655A
Application number: CN202011098618.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡肖; 张建宏; 江振兴; 迟吉娜; 刘存敬; 唐丽媛; 张素君; 李兴河; 王海涛
Original assignee: Institute Of Cotton Hebei Academy Of Agriculture And Forestry Sciences Hebei Special Economic Crop Research Institute Academy Of Agriculture And Forestry Sciences
Current assignee: Institute Of Cotton Hebei Academy Of Agriculture And Forestry Sciences Hebei Special Economic Crop Research Institute Academy Of Agriculture And Forestry Sciences
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2020-12-25

Abstract

本发明公开了一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用。属于植物基因工程技术领域。本发明还提供一种培育提高抗旱性转基因植物的方法，即通过植物过表达载体pBI121‑GaNCED3将目标核苷酸序列导入受体植物中，增加受体植物中GaNCED3的活性或增加目的植物中GaNCED3的含量，或者促进GaNCED3编码蛋白的表达，得到的转基因植物抗旱性高于对照受体植物。本发明中抗旱性提高表现在，在甘露醇模拟的干旱胁迫下，转基因植物种子萌发率、绿苗率以及根长高于受体植物，并且在自然干旱下，转基因植株叶片丙二醛含量小于受体植株，游离脯氨酸的积累量大于受体植株。

Description

一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用。

背景技术

干旱是影响植物生长发育的主要因素之一。棉花是我国重要的经济作物。在全国水资源形势异常严峻的情况下，要保持棉花产业的可持续发展、稳定全国棉花产量，必须提高棉花的抗旱性。利用基因工程手段培育抗旱棉花材料是解决该问题的一条有效途径。植物抗旱反应机理复杂，涉及多种抗旱机制和信号传导途径，目前虽然已克隆到了一些棉花抗旱相关基因，但是数量有限，还有许多未知的重要基因等待发掘。

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是ABA合成过程中的关键限速酶，被证实广泛参与植物生长发育进程及对非生物胁迫的应答。挖掘棉花中干旱相关的NCED基因，并应用于培育抗旱棉花材料，对于利用基因工程手段遗传改良棉花具有重要意义。

因此，如何提供一种具有抗旱功能的基因、蛋白质，以及一种提高植物抗旱性的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗旱性调控基因GaNCED3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了含有上述GaNCED3的生物材料，生物材料为表达载体、克隆载体或工程菌。

优选的：表达载体包括：

A：以GaNCED3-V-F：GAGTAAGGTTACCGAATTCTCTTCATTTGCCTAAGCAACAATCAC，SEQ IDNO：3和GaNCED3-V-R：TGAGCTCGGTACCGGATCCTAGACTCCTTGTATGCAATCCGG，SEQ ID NO：4为引物，以PEG处理2h的叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，得到长度为300bp的PCR产物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；采用限制性内切酶Eco RI和BamHI双酶切所述PCR产物和pTRV-RNA2载体，构建能够抑制GaN CED3编码蛋白表达的重组质粒pTRV2-GaNCED3；

或，

B：以GaNCED3-F：GAACACGGGGGACTCTAGAATGGCTTCATCAACAGCAGC，SEQ ID NO：6和GaNCED3-R：TGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAGGCCTGTTTTTCCAAGTCC，SEQ ID NO：7为引物，以PEG处理2h的叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，采用限制性内切酶XbaI和ScaI双酶切PCR产物和pBI121载体，构建抗旱基因GaNCED3过表达载体pBI121-GaNCED3。

本发明还提供了上述GaNCED3或上述生物材料在提高植物抗旱性中的应用，其中，植物为单子叶植物或双子叶植物。

本发明还提供了上述GaNCED3或上述生物材料在制备转基因植物中的应用，其中，植物为单子叶植物或双子叶植物。

本发明还提供了上述GaNCED3或上述生物材料在植物育种中的应用，其中，植物为单子叶植物或双子叶植物。

优选的：育种的目的为提高植物抗旱性，双子叶植物为棉花或拟南芥；棉花为亚洲棉。

本发明还提供了一种提高植物抗旱性的方法，方法包括：使植物过表达上述GaNCED3；其中，植物为单子叶植物或双子叶植物；双子叶植物为棉花或拟南芥；棉花为亚洲棉。

本发明还提供了一种鉴定植物的方法，植物是包含上述GaNCED3的单子叶植物或双子叶植物，或包含上述生物材料的单子叶植物或双子叶植物，或者由上述方法获得的单子叶植物或双子叶植物，其包括如下步骤：测定植物是否包含上述GaNCED3；检测为qPCR检测，检测引物序列为：GaNCED3-qPCR-F:5’-TTCTGAATCCGAGCAAGTGA-3’，SEQ ID NO：8；GaNCED3-qPCR-R:5’-CTTTGGCGAATCCTGACACT-3’，SEQ ID NO：9。

优选的：qPCR反应程序：94℃，3min；35个循环的程序包括94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；最后72℃延伸5min；反应体系：总体积20μl，包括2×Taq PCRMix 10μl，GaNCED3-qPCR-F 0.5μl，GaNCED3-qPCR-R 0.5μl，模板2.0μl，ddH₂O 7.0μl。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用，取得的技术效果：

本发明克隆了亚洲棉GaNCED3基因，并通过构建GaNCED3转基因拟南芥和利用VIGS技术构建GaNCED3基因沉默棉花植株，进行了GaNCED3基因抗旱的功能验证。实验证明：GaNCED3过量表达的拟南芥植株抗旱能力增强；GaNCED3沉默棉花植株的抗旱能力降低。

过表达GaNCED3基因有助于获得抗旱性提高的植物新种质，为抗旱育种提供新思路。

本发明提供的GaNCED3是具有抗旱功能的蛋白质，可应用于棉花或其他植物的抗旱育种中，具有重要的应用价值；同时，GaNCED3抗旱功能的揭示，丰富了对棉花NCED类基因功能和作用机制的认识。

通过植物过表达载体pBI121-GaNCED3将目标核苷酸序列导入受体植物中，增加受体植物中GaNCED3的活性或增加目的植物中GaNCED3的含量，或者促进GaNCED3编码蛋白的表达，得到的转基因植物抗旱性高于对照受体植物。

本发明中抗旱性提高表现在，在甘露醇模拟的干旱胁迫下，转基因植物种子萌发率、绿苗率以及根长高于受体植物，并且在自然干旱下，转基因植株叶片丙二醛含量小于受体植株，游离脯氨酸的积累量大于受体植株。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的GaNCED3在组织样品各器官中相对表达量示意图。

图2附图为本发明提供的GaNCED3基因在PEG模拟的干旱胁迫下的表达变化示意图。

图3附图为本发明提供的VIGS重悬菌体接种2周后植株表型变化示意图。

图4附图为本发明提供的VIGS重悬菌体接种2周后GaNCED3基因表达量检测示意图。

图5附图为本发明提供的VIGS沉默植株在干旱胁迫10d的抗旱表型示意图。

图6附图为本发明提供的干旱胁迫下GaNCED3沉默植株的生理指标分析示意图。

图7附图为本发明提供的干旱胁迫下GaNCED3沉默植株中胁迫相关基因的表达分析示意图。

图8附图为本发明提供的转基因拟南芥T0代种子的抗生素筛选示意图。

图9附图为本发明提供的转基因拟南芥T1代部分植株的qPCR检测示意图。其中，MarKer：DL2000，泳道1～7：转基因株系OE-1～OE-7中nptⅡ基因677bp片段。

图10附图为本发明提供的GaNCED3基因过表达对不同浓度甘露醇胁迫下拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响示意图。

图11附图为本发明提供的转基因和野生型拟南芥种子在不同甘露醇浓度下培养12d的萌发率和绿苗率示意图。

图12附图为本发明提供的转基因和野生型拟南芥幼苗在对照培养基和添加300mM甘露醇培养基上的根长分析示意图。

图13附图为本发明提供的自然干旱下转基因和野生型拟南芥的生长情况示意图。

图14附图为本发明提供的对照和自然干旱处理下不同拟南芥株系的生理指标分析示意图。

图15附图为本发明提供的对照和自然干旱处理下不同拟南芥株系中抗旱相关基因的表达分析示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用。

实施例中，试验材料及试剂：

1.1试验材料为市售亚洲棉石系亚1号，由河北省农林科学院棉花研究所种植、保存。

1.2 DNA聚合酶

HS DNA Polymerase、各种限制性内切酶、cDNA反转录、实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司，植物总RNA提取试剂盒、胶回收和纯化试剂盒、快速DNA提取检测试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，克隆载体、大肠杆菌感受态购自北京全式金生物技术有限公司。引物合成和测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例1

GaNCED3基因的克隆与表达分析

2.1总RNA提取及cDNA第一链合成

脱绒后的石系亚1号种子播种在湿沙中，27℃培养箱中培养，光周期为16h光照/8h黑暗。5天后，将棉苗转移到含1/2Hoagland营养液的水培盒中，培养条件不变。待棉苗3片真叶时，进行PEG模拟的干旱胁迫处理，处理方法为向水培营养液中添加17％PEG6000(w/v)，分别在处理0、1、2、3、5h时，剪取棉苗幼嫩叶片和根，使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取总RNA。cDNA合成采用反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit，之后参照荧光定量PCR试剂盒TB Green^TM Premix Ex Taq^TM II说明进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)。

2.2 GaNCED3基因克隆

根据亚洲棉基因组中Cotton_A_12895基因(GenBank Accession XM_017784246.1)序列，设计引物GaNCED3-T3-F：5’-ATGGCTTCATCAACAGCAGC-3’，SEQ ID NO：10；GaNCED3-T3-R：5’-TTAGGCCTGTTTTTCCAAGTCC-3’，SEQ ID NO：11。以石系亚1号PEG处理2h的叶片cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物连接到克隆载体pEASY-T3上进行测序。

结果表明，从亚洲棉石系亚1号中PCR扩增获得了片段大小为1794bp的DNA片段，其序列的1～1794位包含了完整的ORF阅读框(ATGGCTTCATCAACAGCAGCATCAGTGGCTAGTGGGAGCTGTTGTGTTAAGGTTAAACTCCCTGTTTCAACTCCTCAGTCTTCGTCTTCTTCTTCTTCTTGTATTGGTTTTAAAAAGCGCTACATTTCATGTTCTTTGCAAACCCCTTCAATTCTTCATTTGCCTAAGCAACAATCACCAGCTTTTCCACCATCACCTTCTTCTACTCCTCCAACGAAAAACACCGAGAAAACTACTCAATCCCAACAATGGAATCCTTTGCAAAGAGCGGCGGCTATGGCTTTAGATGCGGTGGAGAATGCTTTGGTTTCTCATGAGCGTCAACATCCTTTGCCGAAAACAGCTGACCCTGGTGTACAAATTTCCGGTAACTTTGCTCCGGTCCCTGAACAAACTGTTAAACAAAGGCTTCCCGTTATTGGAACAATCCCGGATTGCATACAAGGAGTCTACGCTCGAAACGGTGCCAACCCGCTTCATGAACCGGTGGCTGGACACCATTTCTTCGATGGGGATGGGATGGTTCATGCGGTTCAGTTCAAAAATGGCTCAGCTAGCTATGCTTGTAGGTTCACTGAAACCAACCGTTTGGTTCAAGAACGAGCTTTTGGGCGTCCTGTTTTCCCTAAAGCCATAGGTGAACTCCATGGTCATTCAGGCATAGCTAGACTGTTACTTTTCTATGCTCGAGGTTTATGTGGACTCGTTGATCCAAGCCATGGCACTGGTGTTGCTAACGCGGGACTTGTTTACTTCAACGGCCACCTTCTAGCCATGTCTGAAGATGATTTGCCGTACCATGTTCGTATTACTCCATCTGGTGACTTGAAAACCATTGGCAGATACGATTTTGATGGTCAGTTGAAATCCACAATGATTGCTCACCCCAAAGTTGATCCACAAACTGGTGAATTCTTTGCTCTTAGCTATGATGTTATCCAAAAACCGCATCTCAAGTACTTCAAAATTTCACCCGGTGGTAAGAAATCACCTGATGTTGAAATCCCAGTTGATGGTCCAACAATGATGCACGACTTCGCCATCACTGAAAATTTTGTGGTGATACCAGACCAACAAGTTGTTTTCAAATTGGGTGAAATGGTTCATGGTGGTTCACCCGTTGTGTATGATCAGAACAAGGTATCAAGGTTTGGGGTATTGAACAAGAATGCCATTGATGCTTCTGGGATTAAATGGATTGAAGCACCTGATTGCTTTTGTTTCCATCTTTGGAATGCTTGGGAAGAACCAGAAACTAACGAAGTTGTTGTGATTGGTTCTTGCATGACACCCCCAGATTCCATTTTCAATGAATGTGAAGAGAATCTCAAGAGTGTTCTGTCTGAAATTAGATTGAATTTGAAGACCGGGAAATCGACTCGCCGTGCCATTATTTCTGAATCCGAGCAAGTGAACTTGGAAGCAGGGATGGTGAACAAGAATTTACTGGGAAGAAAGACTCGGTTTGCATATTTAGCTCTAGCTGAGCCTTGGCCTAAAGTGTCAGGATTCGCCAAAGTCGATCTCTCGACCGGGGAAGTTAACAAGTATATCTATGGAGATCAAAGGTATGGTGGTGAGCCTTTGTTCTTCCCTCGAAACCCCCATTCGGAGAACGAAGACGACGGCTATATTTTAGCCTTCGTTCACGACGAGAAGGCTTGGAAATCGGAACTGCAAATTGTGAACGCCATGGACTTAAAGCTAGAAGCCACGGTTCAACTTCCGTCTCGAGTTCCATACGGTTTTCATGGAACATTCATAAGCTCAAAGGACTTGGAAAAACAGGCCTAA，SEQ ID NO：1)，编码597个氨基酸残基(MASSTAASVASGSCCVKVKLPVSTPQSSSSSSSCIGFKKRYISCSLQTPSILHLPKQQSPAFPPSPSSTPPTKNTEKTTQSQQWNPLQRAAAMALDAVENALVSHERQHPLPKTADPGVQISGNFAPVPEQTVKQRLPVIGTIPDCIQGVYARNGANPLHEPVAGHHFFDGDGMVHAVQFKNGSASYACRFTETNRLVQERAFGRPVFPKAIGELHGHSGIARLLLFYARGLCGLVDPSHGTGVANAGLVYFNGHLLAMSEDDLPYHVRITPSGDLKTIGRYDFDGQLKSTMIAHPKVDPQTGEFFALSYDVIQKPHLKYFKISPGGKKSPDVEIPVDGPTMMHDFAITENFVVIPDQQVVFKLGEMVHGGSPVVYDQNKVSRFGVLNKNAIDASGIKWIEAPDCFCFHLWNAWEEPETNEVVVIGSCMTPPDSIFNECEENLKSVLSEIRLNLKTGKSTRRAIISESEQVNLEAGMVNKNLLGRKTRFAYLALAEPWPKVSGFAKVDLSTGEVNKYIYGDQRYGGEPLFFPRNPHSENEDDGYILAFVHDEKAWKSELQIVNAMDLKLEATVQLPSRVPYGFHGTFISSKDLEKQA，SEQ ID NO：2)，将该蛋白质命名为GaNCED3。

2.3 GaNCED3基因的表达模式

设计基因特异引物GaNCED3-qPCR-F:5’-TTCTGAATCCGAGCAAGTGA-3’，SEQ ID NO：8；和GaNCED3-qPCR-R:5’-CTTTGGCGAATCCTGACACT-3’，SEQ ID NO：9。检测GaNCED3基因在石系亚1号中的表达模式。以GhHIS3基因为内参，其引物为：GhHis3-F：5’-TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA-3’，SEQ ID NO：12；GhHis3-R：5’-GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC-3’SEQID NO：13，三次重复。

2.3.1GaNCED3基因在不同组织中的表达模式

选取组织为子叶、胚轴、胚根、叶、茎、根、花瓣、不同发育时期的胚珠(-3、0和3DPA)和纤维(5、10、15、20和25DPA)。DPA(Days post anthesis)代表开花后的天数。

结果显示，在生殖器官中，GaNCED3在5DPA纤维中表达量最高，花瓣中次之，而在胚珠中表达量最低。在营养器官中，GaNCED3基因在根和茎中表达量较高，在叶片中表达量最低(参见图1)。这说明GaNCED3可能在提高抗旱性方面有重要作用。

2.3.2干旱胁迫下GaNCED3基因的表达变化

提取干旱处理0、1、2、3和5h的植株叶片和根中的总RNA，并反转录cDNA，RT-qPCR分析不同干旱处理时间下GaNCED3的表达变化。结果表明，GaNCED3基因受干旱诱导上调表达。其中，该基因在胁迫处理不同时间的根中上调表达明显，其中在胁迫处理3h的根中表达量最高，达到了对照根中的27.6倍(参见图2)。这表明GaNCED3可能在棉花干旱响应中发挥重要作用。

实施例2

GaNCED3基因沉默可以降低棉花植株的抗旱性

1、GaNCED3基因VIGS沉默载体的构建

以PEG处理2h的叶片cDNA为模板，用GaNCED3-V-F和GaNCED3-V-R为引物进行PCR扩增，得到长度为300bp的PCR产物。

GaNCED3-V-F:5’-GAGTAAGGTTACCGAATTCTCTTCATTTGCCTAAGCAACAATCAC-3’，SEQID NO：3；

GaNCED3-V-R:5’-TGAGCTCGGTACCGGATCCTAGACTCCTTGTATGCAATCCGG-3’，SEQ IDNO：4；其中下划线GAATTC和GGATCC分别表示限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列，GAGTAAGGTTACC和TGAGCTCGGTACC为保护碱基。

采用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切PCR产物，回收酶切产物。采用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切pTRV-RNA2载体，回收载体骨架。连接酶切产物和载体骨架，构建重组质粒，对重组质粒进行测序验证。

结果表明，重组质粒将(TCTTCATTTGCCTAAGCAACAATCACCAGCTTTTCCACCATCACCTTCTTCTACTCCTCCAACGAAAAACACCGAGAAAACTACTCAATCCCAACAATGGAATCCTTTGCAAAGAGCGGCGGCTATGGCTTTAGATGCGGTGGAGAATGCTTTGGTTTCTCATGAGCGTCAACATCCTTTGCCGAAAACAGCTGACCCTGGTGTACAAATTTCCGGTAACTTTGCTCCGGTCCCTGAACAAACTGTTAAACAAAGGCTTCCCGTTATTGGAACAATCCCGGATTGCATACAAGGAGTCTA，SEQ ID NO：5)目标DNA片段替换pTRV-RNA2载体EcoRI和BamHI酶切位点间的序列片段，且pTRV-RNA2载体上其它序列不变，将构建的重组质粒命名为pTRV2-GaNCED3。

2、GaNCED3基因沉默植株的获得

将重组质

粒pTRV2-GaNCED3转入农杆菌GV3101，获得重组菌液。pTRV-RNA1(pTRV1)辅助载体菌液、pTRV-RNA2(pTRV2)空载体菌液、pTRV2-CLA载体菌液(白化阳性对照)和pTRV2-GaNCED3载体菌液各50μL，分别加入1ml灭菌的LB(含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)液体培养基中，置于200rpm的摇床上活化16h。分别将活化好的菌液接种到含50ml LB培养基的三角瓶中，继续在200rpm、28℃的条件下培养，直至菌液的OD₆₀₀值为0.8～1.0时，4000rpm离心15min收集菌液。用VIGS重悬液(10mmol/L MES，200μmol/L乙酰丁香酮10mmol/LMgCl₂)重悬菌体，调整浓度至OD₆₀₀＝1.0，用于接种。将重组载体pTRV2-GaNCED3、pTRV2-CLA、pTRV2空载体重悬菌液分别与pTRV1重悬菌液等体积混匀，室温下放置3h。取一支1mL的一次性注射器，吸取菌液，在叶背部注射接种。接种后植株置于培养箱中黑暗培养24h，然后置于25/20℃，光照16h/8h条件下培养。

接种约2周后，参见图3，pTRV2-CLA接种植株叶片出现漂白色。同时将各个接种植株分别编号取样，RT-qPCR检测目的基因GaNCED3的表达量。检测引物序列为：GaNCED3-qPCR-F:5’-TTCTGAATCCGAGCAAGTGA-3’，SEQ ID NO：8；GaNCED3-qPCR-R:5’-CTTTGGCGAATCCTGACACT-3’，SEQ ID NO：9。反应程序：94℃，3min；35个循环的程序包括94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；最后72℃延伸5min。反应体系：总体积20μl，包括2×Taq PCRMix 10μl，GaNCED3-qPCR-F 0.5μl，GaNCED3-qPCR-R 0.5μl，模板2.0μl，ddH₂O 7.0μl。

结果表明，注射GaNCED3沉默载体的植株(VIGS-NCED3-1～3-12)中GaNCED3的表达量仅为注射空载体的对照植株(VIGS-TRV2)的0.08-0.56倍(参见图4)，表明利用VIGS技术获得了目的基因GaNCED3表达量明显下降的沉默植株。

3、沉默植株的抗旱性鉴定

3.1干旱胁迫下沉默植株的表型变化

在亚洲棉石系亚1号中沉默GaNCED3基因，接种后3周开始停止浇水，10d干旱处理后观察植株表型变化，以正常浇水植株为对照。结果参见图5，VIGS-GaNCED3植株与未接种植株(CK)和接种空载体植株(VIGS-TRV2)相比，幼嫩叶片失水变薄、萎蔫、下垂现象更明显，生长势较弱。这表明，沉默GaNCED3降低了植株对干旱的抵抗能力。

3.2干旱胁迫下沉默植株的生理指标分析

干旱胁迫处理10d，对沉默植株和空载体对照分别取样，测定离体叶片失水率，游离脯氨酸和丙二醛(MDA)含量。结果显示，GaNCED3沉默植株的失水率在1h和2h时显著高于对照植株(P<0.05)，3h以后的失水率则极显著高于对照植株(P<0.01)(参见图6a)。GaNCED3基因沉默的植株叶片中游离脯氨酸的积累量显著小于对照(参见图6b)，MDA含量则显著高于对照(P<0.05)(参见图6c)。综合以上结果，说明GaNCED3沉默降低了植株对干旱胁迫的抵抗力。

3.3干旱胁迫下沉默植株中非生物胁迫相关基因的表达分析

选取胁迫相关基因RD29A，DREB1A和SOS1，分别检测对照和干旱胁迫下各株系中基因的表达变化。参见图7可见，在正常条件下(CK)，沉默植株、注射空载体的对照植株和未注射的空白对照植株中胁迫相关基因的表达量差异不大。干旱处理后(Drought)，RD29A和DREB1A基因在各个株系均表现出明显的上调表达，但在沉默植株中上调倍数比对照中低。各株系中SOS1基因在干旱处理前、后表达量变化不明显。研究结果说明，GaNCED3基因的沉默可能降低了RD29A和DREB1A基因的表达活性，从而使沉默植株抗旱性降低。

实施例3

GaNCED3基因过表达可以提高转基因拟南芥的抗旱性

1、重组质粒构建

以PEG处理2h的叶片cDNA为模板，用GaNCED3-F和GaNCED3-R为引物进行PCR扩增。

GaNCED3-F:5’-GAACACGGGGGACTCTAGAATGGCTTCATCAACAGCAGC-3’，SEQ ID NO：6；GaNCED3-R:5’-TGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAGGCCTGTTTTTCCAAGTCC-3’，SEQ ID NO：7；其中下划线TCTAGA和GAGCTC分别表示限制性内切酶XbaI和ScaI识别序列，GAACACGGGGGAC和TGAACGATCGGGGAAATTC为保护碱基。

采用限制性内切酶XbaI和ScaI双酶切上述PCR产物和pBI121载体。连接回收的酶切产物和载体骨架，构建重组质粒，对重组质粒进行测序验证。

结果表明，重组质粒将目标DNA(SEQ ID NO：1)片段替换了pBI121载体EcoRI和BamHI酶切位点间的序列片段，载体上其它序列不变，将构建的重组质粒命名为pBI121-GaNCED3。

2、转GaNCED3拟南芥的获得

将构建的重组质粒pBI121-GaNCED3采用沾花法转化野生型Col-0拟南芥，收获T0代转基因拟南芥种子，在含50mg/L卡那霉素的培养基上对T0代种子进行筛选(参见图8)。以表达载体上nptII基因序列设计引物(nptII-F：5’-TGACTGGGCACAACAGACAAT-3’，SEQ IDNO：14；nptII-R：5’-CGGCGATACCGTAAAGCAC-3’，SEQ ID NO：15)，结合PCR鉴定T1代阳性植株(部分结果参见图9)。将T1代阳性植株移栽到营养土中继续种植、单株收获，并在含卡那霉素的MS平板上对T2、T3代进行分离比鉴定，最终获得纯合转基因拟南芥株系5个。

qRT-PCR检测5个转基因株系中GaNCED3基因的表达水平，检测引物序列为：GaNCED3-qPCR-F:5’-TTCTGAATCCGAGCAAGTGA-3’，SEQ ID NO：8；GaNCED3-qPCR-R:5’-CTTTGGCGAATCCTGACACT-3’，SEQ ID NO：9。反应程序：94℃，3min；35个循环的程序包括94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；最后72℃延伸5min。反应体系：总体积20μl，包括2×Taq PCRMix 10μl，GaNCED3-qPCR-F 0.5μl，GaNCED3-qPCR-R 0.5μl，模板2.0μl，ddH₂O 7.0μl。选取GaNCED3基因表达量高的纯合株系OE-1、OE-16和OE-27，用于后续GaNCED3基因抗旱功能验证。

3、转GaNCED3基因拟南芥的抗旱性鉴定

3.1干旱胁迫下种子的萌发率和绿苗率分析

分别将野生型(WT)和三个转基因拟南芥纯系(OE1、OE16、OE27)的种子经无菌处理后，播种在含不同浓度甘露醇(100、200和300mM)的培养基上，以MS空白培养基为对照。每个培养皿中分别播种野生型和3个转基因株系的种子120粒，每个浓度设3次重复。培养第12d时，统计露白的种子数量，计算种子萌发率。种子萌发后其子叶展开且为绿色的视为绿苗，第12d时统计绿苗率。

如图10所示，随着甘露醇浓度的增加，拟南芥种子的萌发和生长受到了不同程度的抑制。

在对照和100mM甘露醇处理条件下，转基因拟南芥纯合株系OE-1、OE-16和OE-27的萌发率和绿苗率略高于野生型，但并无极显著差异。在200mM甘露醇条件下，3个转基因株系的萌发率虽略高于野生型，但并无极显著差异，但转基因株系的绿苗率极显著高于野生型的绿苗率。在300mM甘露醇条件下，转基因和对照野生型株系的种子萌发均受到明显抑制，但转基因拟南芥株系的种子萌发率极显著高于野生型，说明转GaNCED3基因提高了拟南芥种子和苗期的抗旱性(参见图11)。

3.2干旱胁迫下植株根长分析

在MS培养基上生长7d的拟南芥幼苗，选取初始根长基本相等的幼苗移至含有300mM甘露醇的培养基上并平行排列，以MS空白培养基为对照处理，培养7d后，每个处理选择10株幼苗统计根长。

结果如图12所示，在对照处理中(CK)，各个转基因株系和野生型拟南芥根长的差异没有达到极显著水平(P<0.01)，但在含甘露醇的干旱胁迫培养基上培养7d，转基因株系的根长均极显著高于野生型(P>0.01)，说明转GaNCED3a基因的拟南芥株系对干旱胁迫的抵抗力更高。

3.3自然干旱下植株表型变化

营养土：蛭石按2:1混合，然后将MS空白培养基上生长7d的拟南芥幼苗移至营养土中，在培养箱中培养。3周后对拟南芥植株停止浇水，进行自然干旱处理，以正常浇水为对照。自然干旱处理12d后，观察记录植株表型变化。

从图13可以看出，正常培养条件下，野生型拟南芥与转基因植株表型无明显差异。干旱处理12d后，野生型拟南芥叶片严重萎蔫、失水皱缩甚至整株死亡，而转基因各株系胁迫后植株生长基本正常，大多数叶片颜色变深，呈***，仅个别植株叶片略显萎蔫，这表明转GaNCED3基因的拟南芥的抗旱能力比野生型拟南芥更强。

3.4自然干旱下植株叶片生理指标分析

自然干旱处理前和处理后10d，分别取样，3个生物学重复，测定丙二醛(MDA)含量和游离脯氨酸(Pro)含量含量。以正常浇水组为对照。

图14结果显示，正常浇水条件下，转基因和野生型植株叶片中的MDA含量和脯氨酸含量差异不显著(P>0.01)。自然干旱处理8d后，野生型植株叶片MDA含量极显著高于转基因植株(P<0.01)，游离脯氨酸含量极显著低于转基因植株(P<0.01)，这表明转GaNCED3基因的拟南芥植株对干旱胁迫的耐性高于野生型植株。

3.5自然干旱下转基因和野生型拟南芥中胁迫相关基因的表达分析

选取胁迫相关基因ABF4，RD29A，CBF3和SOS1，分别检测正常浇水条件下(对照)和干旱胁迫下各株系中基因的表达变化。从图15可见，在正常条件下，转基因和野生型拟南芥中ABF4，RD29A，CBF3和SOS1基因的表达量差异不大。干旱处理后，RD29A和CBF3基因在3个转基因株系和野生型拟南芥中均明显上调，但在转基因株系中上调倍数更高，ABF4基因则在野生型拟南芥中显著上调表达，而SOS1基因的表达量在干旱处理后较对照中略上调，但各株系间表达量差异不明显。研究结果说明，转基因拟南芥中的GaNCED3基因可能通过激活RD29A、CBF3和ABF4等非生物胁迫相关基因的表达来调控转基因植株的抗旱性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河北省农林科学院棉花研究所（河北省农林科学院特种经济作物研究所）

<120> 一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1794

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcttcat caacagcagc atcagtggct agtgggagct gttgtgttaa ggttaaactc 60

cctgtttcaa ctcctcagtc ttcgtcttct tcttcttctt gtattggttt taaaaagcgc 120

tacatttcat gttctttgca aaccccttca attcttcatt tgcctaagca acaatcacca 180

gcttttccac catcaccttc ttctactcct ccaacgaaaa acaccgagaa aactactcaa 240

tcccaacaat ggaatccttt gcaaagagcg gcggctatgg ctttagatgc ggtggagaat 300

gctttggttt ctcatgagcg tcaacatcct ttgccgaaaa cagctgaccc tggtgtacaa 360

atttccggta actttgctcc ggtccctgaa caaactgtta aacaaaggct tcccgttatt 420

ggaacaatcc cggattgcat acaaggagtc tacgctcgaa acggtgccaa cccgcttcat 480

gaaccggtgg ctggacacca tttcttcgat ggggatggga tggttcatgc ggttcagttc 540

aaaaatggct cagctagcta tgcttgtagg ttcactgaaa ccaaccgttt ggttcaagaa 600

cgagcttttg ggcgtcctgt tttccctaaa gccataggtg aactccatgg tcattcaggc 660

atagctagac tgttactttt ctatgctcga ggtttatgtg gactcgttga tccaagccat 720

ggcactggtg ttgctaacgc gggacttgtt tacttcaacg gccaccttct agccatgtct 780

gaagatgatt tgccgtacca tgttcgtatt actccatctg gtgacttgaa aaccattggc 840

agatacgatt ttgatggtca gttgaaatcc acaatgattg ctcaccccaa agttgatcca 900

caaactggtg aattctttgc tcttagctat gatgttatcc aaaaaccgca tctcaagtac 960

ttcaaaattt cacccggtgg taagaaatca cctgatgttg aaatcccagt tgatggtcca 1020

acaatgatgc acgacttcgc catcactgaa aattttgtgg tgataccaga ccaacaagtt 1080

gttttcaaat tgggtgaaat ggttcatggt ggttcacccg ttgtgtatga tcagaacaag 1140

gtatcaaggt ttggggtatt gaacaagaat gccattgatg cttctgggat taaatggatt 1200

gaagcacctg attgcttttg tttccatctt tggaatgctt gggaagaacc agaaactaac 1260

gaagttgttg tgattggttc ttgcatgaca cccccagatt ccattttcaa tgaatgtgaa 1320

gagaatctca agagtgttct gtctgaaatt agattgaatt tgaagaccgg gaaatcgact 1380

cgccgtgcca ttatttctga atccgagcaa gtgaacttgg aagcagggat ggtgaacaag 1440

aatttactgg gaagaaagac tcggtttgca tatttagctc tagctgagcc ttggcctaaa 1500

gtgtcaggat tcgccaaagt cgatctctcg accggggaag ttaacaagta tatctatgga 1560

gatcaaaggt atggtggtga gcctttgttc ttccctcgaa acccccattc ggagaacgaa 1620

gacgacggct atattttagc cttcgttcac gacgagaagg cttggaaatc ggaactgcaa 1680

attgtgaacg ccatggactt aaagctagaa gccacggttc aacttccgtc tcgagttcca 1740

tacggttttc atggaacatt cataagctca aaggacttgg aaaaacaggc ctaa 1794

<210> 2

<211> 597

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ser Ser Thr Ala Ala Ser Val Ala Ser Gly Ser Cys Cys Val

1 5 10 15

Lys Val Lys Leu Pro Val Ser Thr Pro Gln Ser Ser Ser Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Cys Ile Gly Phe Lys Lys Arg Tyr Ile Ser Cys Ser Leu Gln Thr

35 40 45

Pro Ser Ile Leu His Leu Pro Lys Gln Gln Ser Pro Ala Phe Pro Pro

50 55 60

Ser Pro Ser Ser Thr Pro Pro Thr Lys Asn Thr Glu Lys Thr Thr Gln

65 70 75 80

Ser Gln Gln Trp Asn Pro Leu Gln Arg Ala Ala Ala Met Ala Leu Asp

85 90 95

Ala Val Glu Asn Ala Leu Val Ser His Glu Arg Gln His Pro Leu Pro

100 105 110

Lys Thr Ala Asp Pro Gly Val Gln Ile Ser Gly Asn Phe Ala Pro Val

115 120 125

Pro Glu Gln Thr Val Lys Gln Arg Leu Pro Val Ile Gly Thr Ile Pro

130 135 140

Asp Cys Ile Gln Gly Val Tyr Ala Arg Asn Gly Ala Asn Pro Leu His

145 150 155 160

Glu Pro Val Ala Gly His His Phe Phe Asp Gly Asp Gly Met Val His

165 170 175

Ala Val Gln Phe Lys Asn Gly Ser Ala Ser Tyr Ala Cys Arg Phe Thr

180 185 190

Glu Thr Asn Arg Leu Val Gln Glu Arg Ala Phe Gly Arg Pro Val Phe

195 200 205

Pro Lys Ala Ile Gly Glu Leu His Gly His Ser Gly Ile Ala Arg Leu

210 215 220

Leu Leu Phe Tyr Ala Arg Gly Leu Cys Gly Leu Val Asp Pro Ser His

225 230 235 240

Gly Thr Gly Val Ala Asn Ala Gly Leu Val Tyr Phe Asn Gly His Leu

245 250 255

Leu Ala Met Ser Glu Asp Asp Leu Pro Tyr His Val Arg Ile Thr Pro

260 265 270

Ser Gly Asp Leu Lys Thr Ile Gly Arg Tyr Asp Phe Asp Gly Gln Leu

275 280 285

Lys Ser Thr Met Ile Ala His Pro Lys Val Asp Pro Gln Thr Gly Glu

290 295 300

Phe Phe Ala Leu Ser Tyr Asp Val Ile Gln Lys Pro His Leu Lys Tyr

305 310 315 320

Phe Lys Ile Ser Pro Gly Gly Lys Lys Ser Pro Asp Val Glu Ile Pro

325 330 335

Val Asp Gly Pro Thr Met Met His Asp Phe Ala Ile Thr Glu Asn Phe

340 345 350

Val Val Ile Pro Asp Gln Gln Val Val Phe Lys Leu Gly Glu Met Val

355 360 365

His Gly Gly Ser Pro Val Val Tyr Asp Gln Asn Lys Val Ser Arg Phe

370 375 380

Gly Val Leu Asn Lys Asn Ala Ile Asp Ala Ser Gly Ile Lys Trp Ile

385 390 395 400

Glu Ala Pro Asp Cys Phe Cys Phe His Leu Trp Asn Ala Trp Glu Glu

405 410 415

Pro Glu Thr Asn Glu Val Val Val Ile Gly Ser Cys Met Thr Pro Pro

420 425 430

Asp Ser Ile Phe Asn Glu Cys Glu Glu Asn Leu Lys Ser Val Leu Ser

435 440 445

Glu Ile Arg Leu Asn Leu Lys Thr Gly Lys Ser Thr Arg Arg Ala Ile

450 455 460

Ile Ser Glu Ser Glu Gln Val Asn Leu Glu Ala Gly Met Val Asn Lys

465 470 475 480

Asn Leu Leu Gly Arg Lys Thr Arg Phe Ala Tyr Leu Ala Leu Ala Glu

485 490 495

Pro Trp Pro Lys Val Ser Gly Phe Ala Lys Val Asp Leu Ser Thr Gly

500 505 510

Glu Val Asn Lys Tyr Ile Tyr Gly Asp Gln Arg Tyr Gly Gly Glu Pro

515 520 525

Leu Phe Phe Pro Arg Asn Pro His Ser Glu Asn Glu Asp Asp Gly Tyr

530 535 540

Ile Leu Ala Phe Val His Asp Glu Lys Ala Trp Lys Ser Glu Leu Gln

545 550 555 560

Ile Val Asn Ala Met Asp Leu Lys Leu Glu Ala Thr Val Gln Leu Pro

565 570 575

Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe His Gly Thr Phe Ile Ser Ser Lys Asp

580 585 590

Leu Glu Lys Gln Ala

595

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagtaaggtt accgaattct cttcatttgc ctaagcaaca atcac 45

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgagctcggt accggatcct agactccttg tatgcaatcc gg 42

<210> 5

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcttcatttg cctaagcaac aatcaccagc ttttccacca tcaccttctt ctactcctcc 60

aacgaaaaac accgagaaaa ctactcaatc ccaacaatgg aatcctttgc aaagagcggc 120

ggctatggct ttagatgcgg tggagaatgc tttggtttct catgagcgtc aacatccttt 180

gccgaaaaca gctgaccctg gtgtacaaat ttccggtaac tttgctccgg tccctgaaca 240

aactgttaaa caaaggcttc ccgttattgg aacaatcccg gattgcatac aaggagtcta 300

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaacacgggg gactctagaa tggcttcatc aacagcagc 39

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaacgatcg gggaaattcg agctcttagg cctgtttttc caagtcc 47

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttctgaatcc gagcaagtga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctttggcgaa tcctgacact 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggcttcat caacagcagc 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttaggcctgt ttttccaagt cc 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcaagactga tttgcgtttc ca 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcgcaaaggt tggtgtcttc 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgactgggca caacagacaa t 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggcgatacc gtaaagcac 19

Claims

1.一种抗旱性调控基因GaNCED3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.含有权利要求1所述GaNCED3的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达载体、克隆载体或工程菌。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述表达载体包括：

A：以GaNCED3-V-F：GAGTAAGGTTACCGAATTCTCTTCATTTGCCTAAGCAACAATCAC，SEQ ID NO：3和GaNCED3-V-R：TGAGCTCGGTACCGGATCCTAGACTCCTTGTATGCAATCCGG，SEQ ID NO：4为引物，以PEG处理2h的叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，得到长度为300bp的PCR产物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；采用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切所述PCR产物和pTRV-RNA2载体，构建能够抑制GaNCED3编码蛋白表达的重组质粒pTRV2-GaNCED3；

或，

4.权利要求1所述GaNCED3或权利要求2所述生物材料在提高植物抗旱性中的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

5.权利要求1所述GaNCED3或权利要求2或3所述生物材料在制备转基因植物中的应用，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.权利要求1所述GaNCED3或权利要求2所述生物材料在植物育种中的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述育种的目的为提高植物抗旱性，所述双子叶植物为棉花或拟南芥；所述棉花为亚洲棉。

8.一种提高植物抗旱性的方法，其特征在于，所述方法包括：使植物过表达权利要求1所述GaNCED3；其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物为棉花或拟南芥；所述棉花为亚洲棉。

9.一种鉴定植物的方法，其特征在于，所述植物是包含权利要求1所述GaNCED3的单子叶植物或双子叶植物，或包含权利要求2所述生物材料的单子叶植物或双子叶植物，或者由权利要求8所述方法获得的单子叶植物或双子叶植物，其包括如下步骤：测定所述植物是否包含权利要求1所述GaNCED3；所述检测为qPCR检测，检测引物序列为：

GaNCED3-qPCR-F:5’-TTCTGAATCCGAGCAAGTGA-3’，SEQ ID NO：8；

GaNCED3-qPCR-R:5’-CTTTGGCGAATCCTGACACT-3’，SEQ ID NO：9。

10.根据权利要求9所述的鉴定植物的方法，其特征在于，所述qPCR反应程序：94℃，3min；35个循环的程序包括94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；最后72℃延伸5min；反应体系：总体积20μl，包括2×Taq PCR Mix 10μl，GaNCED3-qPCR-F 0.5μl，GaNCED3-qPCR-R 0.5μl，模板2.0μl，ddH₂O 7.0μl。