CN103626776B

CN103626776B - 吡唑并[1,5‑a]嘧啶氮芥衍生物及其制备方法和肿瘤治疗应用

Info

Publication number: CN103626776B
Application number: CN201310643711.6A
Authority: CN
Inventors: 齐传民; 赵明霞; 宁红玉; 常进; 任红玉; 李石磊; 贺勇
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2033-12-05
Also published as: CN103626776A

Abstract

本发明涉及具有式I结构的吡唑并[1，5‑a]嘧啶氮芥衍生物或其可药用盐，以及其用途。药理实验表明，该类化合物或其可药用盐对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。不仅如此，该类化合物还具有毒性较小，对肿瘤细胞具有选择性的优势，是一种具有双功能的抗肿瘤药物。同时，该类化合物易于合成，总产率较高。种种优势，显示此类化合物具有成为肿瘤治疗药物的巨大潜力。

Description

吡唑并[1,5-a]嘧啶氮芥衍生物及其制备方法和肿瘤治疗应用

技术领域

本发明涉及新的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥类衍生物及其制备方法和作为肿瘤治疗药物的应用。

背景技术

氮芥类药物属于细胞毒类药物，是最早应用于临床的非结构专一性抗肿瘤生物烷化剂。自问世以来，氮芥类药物研究开发活跃，在***方面发挥了重要作用，在国内外得到了广泛的应用。但氮芥类化合物在抑制和杀伤肿瘤细胞的同时会产生许多严重的副反应，如恶心、呕吐、骨髓抑制、脱发等。因此，如何减少氮芥类化合物存在的不良反应，提高治疗效率，降低其毒性和增加其选择性等问题成为药物领域的研究热点，吸引和鼓舞着无数科研工作者致力于此类药物的研究与开发。氮芥类抗肿瘤化合物一般包括烷基化部分和载体部分。通过对载体部分的修饰可以改善此类药物在体内的吸收、分布等药动学性质，从而影响其抗肿瘤活性。目前对氮芥类化合物的研究大致集中在三个方面：一是通过在药物分子中引入糖及其衍生物，二是在药物分子中引入氮基酸或小肽，三是在药物分子中引入亲肿瘤的杂环。其中，研究最多的是第三个方面，即引入亲肿瘤的杂环对氮芥类化合物的载体部分进行结构修饰，以达到提高选择性和降低毒性的目的。

细胞周期依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases，CDKs)是一组丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，其活性的精确调控对细胞的增殖和转录至关重要。通过抑制CDKs的活性就可以达到治疗癌症等增生性疾病的目的。CDK₂是CDKs家族中的一员，是完成G₁期和进入S期的一个非常关键的细胞周期依赖性蛋白激酶，在细胞周期中具有重要的作用。该酶不仅可以与细胞周期蛋白E(CyclinE)结合并活化，维持G₁后期pRb磷酸化，使细胞顺利通过G₁期进入S期，还可以与细胞周期蛋白A(CyclinA)结合作用于细胞周期的S期初期，使E2F转录因子钝化，进而导致细胞S期停滞或凋亡，并且还有可能作用于细胞周期的G₂期，是目前公认的一个重要的肿瘤治疗靶点。CDK₂的晶体结构在1993年已经得到确认，随着人们对其蛋白结构的不断认识，越来越多的ATP竞争性小分子CDK₂抑制剂被研究报道。近年来对CDK₂具有选择性抑制的小分子抑制剂如Flavopiridol、R-roscovitine(CYC202)、7-羟基十字孢碱(UCN-01)及氨基噻唑类化合物(BMS-387032)等已进入临床研究，有望为临床医师在将来提供更多的选择。

吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物是一类新型的CDK₂抑制剂，是近年来抗肿瘤药物的研究热点之一。该类化合物的母环是由一个吡唑环和一个嘧啶环组成的稠杂环，其7位氨基中的氢和CDK₂骨架中Leu83的羰基氧原子之间、吡唑环的1位氮原子和CDK₂骨架中Leu83的氨基氢原子之间、吡唑环的2位氢原子和CDK₂骨架中Glu81的羰基氧原子之间均可以形成氢键。由于CDK₂在肿瘤细胞中有过度表达，作为CDK₂抑制剂的吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物为载体与氮芥类化合物相连接后，有其成为特异性和靶向性肿瘤的潜在可能性。至今，关于以吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物为载体的氮芥类化合物作为抗肿瘤药物的研究尚未见报道，这也使得这一发明具有较高的创新性。

发明内容

本发明提供了新的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥类衍生物或其可药用盐，其特征在于：一端具有氮芥烷化基团；另一端具有母体结构3-氰基吡唑并[1，5-a]嘧啶，其5位有取代基R₁，分别是甲基、氯甲基，其7位胺基通过苯环与取代基R相连，R为3-、4-的氮芥基团。它们表现出对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用和选择性及体内较小的毒性，具有成为抗肿瘤药物的巨大潜力。结构如式I：

其中：

R₁是烷基、卤代烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷基取代的杂芳基、杂脂环基或-NR₄R₅；

R₄和R₅独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R₄和R₅合起来形成一个杂芳基或杂脂环基；

R是N(CH₂CH₂Cl)₂。

上述化合物或其可药用盐，结构如式II：

其中：

R₁是烷基或卤代烷基；

R₂=N(CH₂CH₂Cl)₂，R₃=H，或者R₂=H，R₃=N(CH₂CH₂Cl)₂。

其具体合成步骤包括三部分，路线如下：

吡唑并[1，5-a]嘧啶母环合成路线：

苯胺氮芥合成路线：

目标化合物合成路线：

路线A的合成步骤

1.乙氧亚甲基丙二睛的合成

将丙二睛9.9g(0.15mol)、原甲酸三乙酯33.3g(0.23mol)和醋酸酐38.4g(0.38mol)加入到250mL单口烧瓶中。回流反应6h后，冷却，加入活性炭后加热回流30min，热过滤，用热乙醇洗涤滤饼后，滤液置于冰箱中过夜，抽滤，烘干得淡黄色固体15.4g，产率84.3％。

2.3-氨基-4-氰基吡唑的合成

乙氧亚甲基丙二睛15g(0.12mol)在室温下缓慢加入到85％水合肼12mL(0.25mol)中，水浴加热反应1h，在反应体系中加入10mL水。冰箱中放置过夜，抽滤，水洗滤饼，烘干得淡黄色固体10.6g，产率81.7％。

3.3-氰基-5-(氯)甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

将3-氨基-4-氰基吡唑4g(37mmol)和(氯)乙酰乙酸乙酯(38mmol)加入33mL冰乙酸中，回流反应4h。反应完毕后冷却至室温，过滤，依次用冰醋酸和水淋洗滤，得黄色固体。用乙酸乙酯重结晶得到纯品，产率80-89％。

4.3-氰基-5-(氯)甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

在250mL的四颈瓶中加入3-氰基-5-(氯)甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶(9.95mmol)和吡啶0.82mL(10.55mmol)后，缓慢滴加三氯氧磷4.05mL(43.2mmol)，加毕缓慢加热至85℃后开始搅拌，于120℃反应1h。冷却至60℃以下后加入氯仿150mL。回流反应1h。冷却至0-5℃时加入冷水90mL，抽滤除去不溶物，分出有机相，水洗两次，每次水90mL。旋蒸除去氯仿后得固体3-氰基-5-(氯)甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶，产率81-87％。

路线B的合成步骤

1.N,N-二(2-羟乙基)-4-硝基苯胺的合成

取4-氯硝基苯10.34g(0.07mol)，二乙醇胺17.56g(0.17mol)，于250mL圆底烧瓶中混合均匀，120℃搅拌6h，趁热倒入90℃热水中，充分搅拌。趁热过滤，静置后滤液析出固体，抽滤，滤饼用***洗涤后用乙醇重结晶得黄色固体5.46g，产率36.3％。

2.N,N-二(2-羟乙基)-3-硝基苯胺的合成

取3-硝基苯胺5.52g(0.04mol)，加入80mL25％的醋酸水溶液中，冰浴下滴加环氧乙烷10mL。升温至室温，搅拌24h，抽滤，用水洗涤滤饼，烘干后得橙黄色固体8.02g，产率88.7％。

3.N,N-二(2-甲磺酸酯乙基)硝基苯胺的合成

取N,N-二(2-羟乙基)硝基苯胺2.26g(0.01mol)，加入30mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下，加入3.32mL(0.025mol)三乙胺，后加入甲磺酰氯1.93mL(0.025mol)。TLC检测，10min后反应完全。反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液洗涤后，有机相用无水硫酸钠干燥。旋去溶剂后得到橙色固体，产率90-98％。

4.N,N-二(2-氯乙基)硝基苯胺的合成

将N,N-二(2-甲磺酸酯乙基)硝基苯胺1.58g(4.98mmol)溶于3mL DMF中，加入氯化锂0.42g(10mmol)，加热至110℃。TLC检测，10min后反应完全，冷却后向反应液中加入45mL水，二氯甲烷萃取。有机相用饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥。旋去溶剂后得黄色固体，产率90-95％。

5.N,N-二(2-氯乙基)苯二胺的合成

取N,N-二(2-氯乙基)硝基苯胺1.04g(4mmol)溶于5mL甲醇，加入0.1g钯碳(10％)催化氢化。TLC检测，1h后反应完全，抽滤除去钯碳，迅速旋去溶剂后直接进行下一步反应。

路线C的合成步骤

3-氰基-5-(氯)甲基-7-(N,N-二(2-氯乙基)氨基苯氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

将还原所得的N,N-二(2-氯乙基)苯二胺(2mmol)溶于10mL乙醇中，加入3-氰基-5-(氯)甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(2.2mmol)，加热回流2.5-3h，TLC检测反应完全，静置后有固体析出。抽滤，得黄色固体产品，产率76-88％。

在优选的实施方案中，本发明提供了具有较好的抗肿瘤效果的式A的氮芥衍生物或其可药用盐：

相应地，提供了式A的氮芥衍生物或其可药用盐的制备方法，其特征在于如下的合成路线：以丙二腈为原料合成7-氯取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶母环，以对硝基氯苯为原料合成苯胺氮芥，通过将所得的两类化合物在乙醇中回流的方法得到A。

在优选的实施方案中，本发明提供了具有较好的抗肿瘤效果的式B的氮芥衍生物或其可药用盐：

相应地，提供了式B的氮芥衍生物或其可药用盐的制备方法，其特征在于化合物的合成路线：以丙二腈为原料合成7-氯取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶母环，以间硝基苯胺为原料合成苯胺氮芥，通过将所得的两类化合物在乙醇中回流的方法得到B。

在优选的实施方案中，本发明提供了具有较好的抗肿瘤效果的式C的氮芥衍生物或其可药用盐：

相应地，提供了式C的氮芥衍生物或其可药用盐的制备方法，其特征在于如下的合成路线：以丙二腈为原料合成7-氯取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶母环，以对硝基氯苯为原料合成苯胺氮芥，通过将所得的两类化合物在乙醇中回流的方法得到C。

在优选的实施方案中，本发明提供了具有较好的抗肿瘤效果的式D的氮芥衍生物或其可药用盐：

相应地，提供了式D的氮芥衍生物或其可药用盐的制备方法，其特征在于化合物的合成路线：以丙二腈为原料合成7-氯取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶母环，以间硝基苯胺为原料合成苯胺氮芥，通过将所得的两类化合物在乙醇中回流的方法得到D。

本发明的优势：

1)本发明中目标化合物的合成步骤产率较高，易于制得。

2)本发明中目标化合物的体外活性测试表明该类化合物具有较好的抗肿瘤活性和选择性。

3)本发明中目标化合物的体内毒性相对较小，是一般氮芥类化合物所不具备的特点。

具体实施方式

以下通过具体实施方式可以使本发明得到更清楚的说明，但它们不应解释为限制本发明的范围，而仅仅是其例证和代表。

生物学实施例

实施例A.对五种常见的肿瘤细胞的抑制

抑制细胞增殖测定方法采用常用的MTT法，该测定方法可用于测定不同的本发明目标化合物对五种癌细胞增殖的抑制能力，利用本领域熟知的方法，可以对任意癌细胞使用相似的测定方法。将处于对数生长期的肿瘤细胞(HepG2、SH-SY5Y、MCF-7、A549、DU145)用0.25％胰酶消化，然后用培养液(DMEM+10％FBS或者PRMI1640+10％FBS)将细胞稀释悬浮成单细胞悬液，调整细胞密度为2.0×10⁴个／mL，每孔加入100μL接种于96孔板中，在37℃、饱和湿度、5％二氧化碳的培养箱中培养24h后，按实验设计分别加入0.1μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、50μM、100μM的式A-D化合物，每个浓度平行5个复孔，并分别设置实验组和对照组，继续孵育72h后，向每孔中加入10μLMTT溶液(5mg／mL)，然后37℃下孵育4h，再向每孔中加入100μL细胞裂解液(10％SDS+0.1％NH₄Cl)，避光孵育过夜。次日用酶标仪测定各孔在570nm处的吸光度(OD)值，参考波长650nm。根据吸光度值计算细胞生长抑制率：抑制率 (100％)=[1-(实验组OD均值-空白组OD均值)／(对照组OD均值-空白组OD均值)]×100％。以药物浓度为横坐标，细胞抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制曲线。上述实验重复3次。用IBM SPSSTMStatistics20统计软件中的Probit模块，概率单位回归法，计算IC₅₀值。

下表1显示了其中取代基R₁=甲基且R₂=氮芥，R₃=H的式A或R₂=H，R₃=氮芥的式B化合物和其中R₁=氯甲基且R₂＝氮芥，R₃=H的式C或R₂=H，R₃=氮芥的式D化合物对五种常见细胞的IC₅₀：

表1：

由上表可以看出，该类化合物对以上五种肿瘤细胞具有很好的抑制效果。其中，式C对肝癌(HepG2)、神经母细胞瘤(SH-SY5Y)和肺癌(A549)的抑制效果最好；式D对肝癌(HepG2)和神经母细胞瘤(SH-SY5Y)的抑制效果较好；式A对神经母细胞瘤(SH-SY5Y)和肺癌(A549)的抑制效果较好。

实施例B.急性毒性实验

针对实施例A的结果，对当取代基R₁=氯甲基，且R₂=氮芥，R₃＝氢的式C化合物的体内毒性进行了测定。试验对象为昆明小白鼠(18-22g，雌雄各半)，试验前禁食12h，不禁水。将式C配制成不同浓度的注射液于紫外灯下照射15min待用。取小白鼠10只，以2只为一组(雌性各半)，分5组，选择剂量间距较大的一系列剂量，分别给各组老鼠注射不同浓度的式C的注射液，获得0％和100％致死量范围。正式实验选取各剂量组动物数为10只(雌雄各半)，体重和性别分层随机分配，完成动物分组和剂量计算后尾静脉注射给药。给药时先从中剂量组开始，以便能从最初的几组动物接受药物后的反应来判断两组的剂量是否合适，否则可随时进行调整，尽可能使动物的死亡率在50％上下，死亡率为0％或100％时，不能用于计算。给药后观察小白鼠活动改变情况和死亡数，连续观察3天。用加权机率单位(Bliss法)计算小白鼠的半致死量(LD₅₀)及其95％可信限，结果见下表2。

表2：

通过与卡氮芥(45.2mg／kg)、美法仑(32mg/kg)和喜树碱(57.3mg／kg)的体内毒性比较，上表数据表明式C化合物的体内毒性较低。

合成实施例

实施例1

按照以下步骤制备的是式A的取代基R₁＝甲基，R₂=氮芥，R₃=氢的化合物。

1.1 乙氧亚甲基丙二睛的合成

将丙二睛9.9g(0.15mol)、原甲酸三乙酯33.3g(0.23mol)和醋酸酐38.4g(0.38mol)加入到250mL单口烧瓶中。回流反应6h后，冷却，加入活性炭后加热回流30min，热过滤，用热乙醇洗涤滤饼后，滤液置于冰箱中过夜，抽滤，烘干得淡黄色固体15.4g，产率84.3％。所得谱图与文献报道的一致。

1.2 3-氨基-4-氰基吡唑的合成

乙氧亚甲基丙二睛15.0g(0.12mol)在室温下缓慢加入到85％水合肼12mL(0.25mol)中，水浴加热回流反应1h，在反应体系中加入10mL水。冰箱中放置过夜，抽滤，水洗滤饼，烘干得淡黄色固体10.6g，产率81.7％。所得谱图与文献报道的一致。

1.3 3-氰基-5-甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

将3-氨基-4-氰基吡唑4.0g(37mmol)和乙酰乙酸乙酯(38mmol)加入33mL冰乙酸中，回流反应4h。反应完毕后冷却至室温，过滤，依次用冰醋酸和水淋洗滤饼各3次，得黄色固体。用乙酸乙酯重结晶得到纯品，产率80.8％。所得谱图与文献报道的一致。

1.4 3-氰基-5-甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

在250mL的四颈瓶中加入3-氰基-5-甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶(9.95mmol)和吡啶0.82mL(10.55mmol)后，缓慢滴加三氯氧磷4.05mL(43.2mmol)，加毕缓慢加热至85℃后开始搅拌，于120℃反应1h。冷却至60℃以下后加入氯仿150mL。回流反应1h。冷却至0-5℃时加入冷水90mL，抽滤除去不溶物，分出有机相，水洗两次，每次水90mL。旋蒸除去氯仿后得黄色固体，产率81.7％。所得谱图与文献报道的一致。

1.5 N,N-二(2-羟乙基)-4-硝基苯胺的合成

取4-氯硝基苯10.3g(0.07mol)，二乙醇胺17.5g(0.17mol)，于250mL圆底烧瓶中，混合均匀，120℃搅拌6h，趁热倒入90℃热水中，充分搅拌。趁热过滤，静置后滤液析出固体，抽滤，滤饼用***洗涤后用乙醇重结晶得黄色固体5.5g，产率36.3％。所得谱图与文献报道的一致。

1.6 N,N-二(2-甲磺酸酯乙基)-4-硝基苯胺的合成

取N,N-二(2-羟乙基)硝基苯胺2.3g(0.01mol)，加入30mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下，加入3.3mL三乙胺，后加入甲磺酰氯1.9mL(0.025mol)。TLC检测，10min后反应完全。反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液洗涤后，有机相用无水硫酸钠干燥。旋去溶剂后得到橙色固体，产率90.6％。所得谱图与文献报道的一致。

1.7 N,N-二(2-氯乙基)-4-硝基苯胺的合成

将N,N-二(2-甲磺酸酯乙基)硝基苯胺1.6g(4.98mmol)溶于3mL DMF中，加入氯化锂0.4g(10mmol)，加热至110℃。TLC检测，10min后反应完全，冷却后向反应液中加入45mL水，二氯甲烷萃取。有机相用饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥。旋去溶剂后得黄色固体。产率90.3％。所得谱图与文献报道的一致。

1.8 N,N-二(2-氯乙基)1，4-苯二胺的合成

取N,N-二(2-氯乙基)硝基苯胺1.0g(4mmol)溶于5mL甲醇，加入0.1g钯碳(10％)催化氢化。TLC检测，1h后反应完全，抽滤除去钯碳，迅速旋去溶剂后直接进行下一步反应。

1.9 3-氰基-5-甲基-7-(4-N,N-二(2-氯乙基)氨基苯氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

将还原所得的N,N-二(2-氯乙基)-1，4-苯二胺(2mmol)溶于10mL乙醇中，加入3-氰基-5-甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(2.2mmol)，加热回流2.5h，TLC检测反应完全，静置后有固体析出。抽滤，得黄色固体产品，产率87.8％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.24(s，1H，-CH)，7.82(s，1H，-NH)，7.23(d，J=8.88Hz，2H，ArH)，6.78(d，J=8.88Hz，2H，ArH)，6.13(s，1H，-CH)，3.79(t，J＝6.76Hz，4H，-CH₂CH₂Cl)，3.68(t，J=6.60Hz，4H，-CH₂CH₂Cl)，2.52(s，3H，-CH₃).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ163.73，150.61，146.37，146.32，145.77，127.06，124.90，113.65，112.99，89.21，80.59，53.56，40.33，25.25.MS(ESI⁺)m／z：389.3(M+H⁺).IR(KBrpellet，cm^-1)：3352，2222，1616，1589，1519，1421，1184，918，808，719.

实施例2

按照以下步骤制备的是式B的取代基R₁=甲基，R₂=氢，R₃=氮芥的化合物。

2.1 N,N-二(2-羟乙基)-3-硝基苯胺的合成

取3-硝基苯胺5.52g(0.04mol)，加入80mL25％的醋酸水溶液中，冰浴下滴加环氧乙烷10mL。升温至室温，搅拌72h，抽滤，水洗涤滤饼，烘干得黄橙色固体8.02g，产率88.5％。所得谱图与文献报道的一致。

2.2 N,N-二(2-甲磺酸酯乙基)-3-硝基苯胺的合成

取N,N-二(2-羟乙基)-3-硝基苯胺2.26g(0.01mol)，加入30mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下，加入3.32mL(0.025mol)三乙胺，后加入甲磺酰氯1.93mL(0.025mol)。TLC检测，10min后反应完全。反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液洗涤后，有机相用无水硫酸钠干燥。旋去溶剂后得到橙色固体，产率90.8％。所得谱图与文献报道的一致。

2.3 N,N-二(2-氯乙基)-3-硝基苯胺的合成

取N,N-二(2-甲磺酸酯乙基)-3-硝基苯胺将1.58g(4.98mmol)溶于3mL DMF中，加入氯化锂0.42g(10mmol)，加热至110℃。TLC检测，10min后反应完全，冷却后向反应液中加入45mL水，二氯甲烷萃取。有机相用饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥。旋去溶剂后得黄色固体，产率91.3％。所得谱图与文献报道的一致。

2.4 N,N-二(2-氯乙基)1，3-苯二胺的合成

取N,N-二(2-氯乙基)-3-硝基苯胺1.04g(4mmol)溶于5mL甲醇，加入0.1g钯碳(10％)催化氢化。 TLC检测，1h后反应完全，抽滤除去钯碳，迅速旋去溶剂后直接进行下一步反应。

2.5 3-氰基-5-甲基-7-(3-N，N-二(2-氯乙基)氨基苯氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

将还原所得的N,N-二(2-氯乙基)1，3-苯二胺(2mmol)溶于10mL乙醇中，加入3-氰基-5-甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(2.2mmol)，加热回流2.5h，TLC检测反应完全，静置后有固体析出。抽滤，得黄色固体产品。产率76.6％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.25(s，1H，-CH)，7.98(s，1H，-NH)，7.36(t，J=8.12Hz，1H，ArH)，6.77(d，J=7.76Hz，1H，ArH)，6.66(d，J=8.44Hz，1H，ArH)，6.62(s，1H，-CH)，6.41(s，1H，-ArH)，3.78(t，J=6.60Hz，4H，-CH₂CH₂Cl)，3.67(t，J=6.52Hz，4H，-CH₂CH₂Cl)，2.56(s，3H，-CH₃).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ163.90，150.57，147.85，146.31，145.21，137.01，131.16，113.53，112.79，110.67，107.44，89.76，80.90，53.37，40.29，25.35.MS(ESI⁺)m／z：389.3(M+H⁺).IR(KBr pellet，cm^-1)：3356，2224，1605，1570，1537，1500，1418，1280，1168，997，748.

实施例3

按照以下步骤制备的是式C的取代基R₁=氯甲基，R₂=氮芥，R₃=氢的化合物。

3.1 3-氰基-5-氯甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

将3-氨基-4-氰基吡唑4g(37mmol)和氯乙酰乙酸乙酯(38mmol)加入33ml冰乙酸中，回流反应4h。反应完毕后冷却至室温，过滤，依次用冰醋酸和水淋洗滤饼各3次，得黄色固体。用乙酸乙酯重结晶得到纯品，产率82.3％。所得谱图与文献报道的一致。

3.2 3-氰基-5-氯甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

在250mL的四颈瓶中加入3-氰基-5-氯甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶(9.95mmol)和吡啶0.82mL(10.55mmol)后，缓慢滴加三氯氧磷4.05mL(43.2mmol)，加毕缓慢加热至85℃后开始搅拌，于120℃反应1h。冷却至60℃以下后加入氯仿150mL。回流反应1h。冷却至0-5℃时加入冷水90ml，抽滤除去不溶物，分出有机相，水洗两次，每次水90mL。旋蒸除去氯仿后得黄色固体，产率81.2％。所得谱图与文献报道的一致。

3.3 3-氰基-5-氯甲基-7-(4-N，N-二(2-氯乙基)氨基苯氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

将还原所得的N，N-二(2-氯乙基)1，4-苯二胺(2mmol)溶于10mL乙醇中，加入3-氰基-5-氯甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(2.2mmol)，加热回流3h，TLC检测反应完全，静置后有固体析出。抽滤，得黄色固体产品，产率76.9％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.30(s，1H，-CH)，7.99(s，1H，-NH)，7.25(d，J=8.76Hz，2H，ArH)，6.79(d，J=8.76Hz，2H，ArH)，6.50(s，1H，-CH)，4.59(s，2H，-CH₂Cl)，3.80(t，J=6.68Hz，4H，-CH₂CH₂Cl)，3.69(t，J=6.64Hz，4H，-CH₂CH2Cl).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ161.03，150.08，147.13，146.82，145.92，126.86，124.37，113.22，112.94，88.05，81.75，53.51，46.19，40.26.MS(ESI⁺)m／z：423.3(M+H⁺).IR(KBr pellet，cm^-1)：3337，2225，1710，1616，1589，1520，1416，1205，823，729.

实施例4

按照以下步骤制备的是式C的取代基R₁=氯甲基，R₂=氢，R₃=氮芥的化合物。

3-氰基-5-氯甲基-7-(3-N，N-二(2-氯乙基)氨基苯氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成

将还原所得的N，N-二(2-氯乙基)1，3-苯二胺(2mmol)溶于10mL乙醇中，加入3-氰基-5-氯甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(2.2mmol)，加热回流3h，TLC检测反应完全，静置后有固体析出。抽滤，得黄色固体产品。产率78.7％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.32(s，1H，-CH)，8.14(s，1H，-NH)，7.38(t，J=8.16Hz，1H，ArH)，6.62(s，1H，-CH)，6.78(d，J=8.48Hz，1H，ArH)，6.69(d，J＝8.44Hz，1H，ArH)，6.64(s，1H，-ArH)，4.62(s，3H，-CH₃)，3.78(t，J=6.60Hz，4H，-CH₂CH₂Cl)，3.67(t，J=6.52Hz，4H，-CH₂CH₂Cl).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ161.23，150.03，147.90，146.82，146.10，136.61，131.34，113.08，112.68，110.99，107.23，88.55，82.06，53.41，46.21，40.28.MS(ESI⁺)m／z：423.3(M+H⁺).IR(KBr pellet，cm^-1)：3319，2227，1605，1570，1535，1500，1417，1283，1168，995，735.

Claims

1.用于肿瘤治疗的式I结构的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物或其可药用盐：

其中：

R₁是烷基、卤代烷基；

R是N(CH₂CH₂Cl)₂。

2.根据权利要求1所述的化合物或其可药用盐，其中所述吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物具有如下式II

其中：

R₁＝CH₃或CH₂Cl；

R₂＝N(CH₂CH₂Cl)₂，R₃＝H或者R₂＝H，R₃＝N(CH₂CH₂Cl)₂。

3.权利要求2所述的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物或其可药用盐的制备方法，其特征在于合成路线包括如下三部分：

吡唑并[1，5-a]嘧啶母环合成路线：

苯胺氮芥合成路线：

目标化合物合成路线：

4.根据权利要求2所述的化合物或其可药用盐，其中所述吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物具有如下式A：

5.根据权利要求2所述的化合物或其可药用盐，其中所述吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物具有如下式B：

6.根据权利要求2所述的化合物或其可药用盐，其中所述吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物具有如下式C：

7.根据权利要求2所述的化合物或其可药用盐，其中所述吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物具有如下式D：

8.权利要求4所述的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物或其可药用盐的制备方法，其特征在于如下合成路线：以丙二腈为原料合成7-氯取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶母环，以对硝基氯苯为原料合成苯胺氮芥，通过将所得的两类化合物在乙醇中回流的方法得到A。

9.权利要求5所述的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物或其可药用盐的制备方法，其特征在于如下合成路线：以丙二腈为原料合成7-氯取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶母环，以对硝基氯苯为原料合成苯胺氮芥，通过将所得的两类化合物在乙醇中回流的方法得到B。

10.权利要求6所述的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物或其可药用盐的制备方法，其特征在于如下合成路线：以丙二腈为原料合成7-氯取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶母环，以对硝基氯苯为原料合成苯胺氮芥，通过将所得的两类化合物在乙醇中回流的方法得到C。

11.权利要求7所述的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物或其可药用盐的制备方法，其特征在于如下合成路线：以丙二腈为原料合成7-氯取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶母环，以对硝基氯苯为原料合成苯胺氮芥，通过将所得的两类化合物在乙醇中回流的方法得到D。

12.一种药物组合物，包含权利要求1-2和4-7任一项所述的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物或其可药用盐并且包含可药用稀释剂或载体。

13.权利要求1-2和4-7中任一项所述的吡唑并[1，5-a]嘧啶氮芥衍生物或其可药用盐在制备肿瘤治疗药物中的应用。

14.权利要求13所述的应用，其中所述的肿瘤细胞为HepG2、SH-SY5Y、MCF-7、A549和DU145。