CN113880816A - 一种含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有通式Ⅰ结构的含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，该类化合物属于激酶CDK4、CDK6和/或CDK9抑制剂，可更广泛地用于多种癌症的治疗，具有巨大的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物及应用。具体而言，该嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物，属于周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，并提供了该类化合物的制备方法，及该类化合物用于预防或治疗与CDK相关疾病的制药用途。
背景技术
周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDKs)是一类丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶，作为细胞内重要的信号转导分子，和周期素(cyclin)形成的CDK-cyclin复合物，参与细胞的生长、增殖、休眠或者进入凋亡。其中CDK4/6(cyclin-dependent kinase4/6)通过与细胞周期素D(cyclin D)结合，从而调节细胞由G1期向S期转换。细胞周期失控是癌症发生、发展的一个重要因素，CDK4/6是细胞周期失控的关键因素。而CDK9与cyclin T结合则被证明与细胞转录调控有关，CDK9的抑制剂被认为可用于多种癌症的治疗。
CDK与细胞周期蛋白结合形成杂二聚复合物使其在丝肢酸及苏肢酸残基上的受质磷酸化，其转而引发细胞周期转录及进展所需的事件。由于不受控的细胞增殖为癌症的特点，且大部分癌细胞展现CDK的失调，所以抑制CDK已成为多种癌症的可能疗法，对CDK4/6具有选择性抑制剂目前被视为有前景的一类潜在抗癌剂或消炎剂，归因于CDK 4/6二者在调控细胞增殖中的重要作用以及与抑制CDK家族的其他成员相关联的毒性作用。
癌症靶向治疗是一种有效的治疗方案，其特异性强、毒副作用小，基本上不损伤正常组织，可更为有效地为临床治疗方案的选择提供进一步的参考。伴随药理学和分子生物学研究的深入，靶向药物的研究和应用取得了突破性进展，新治疗靶点药物的研发已成为人们关注的热点，引领癌症治疗步入个性化、精准化时代，为更多的癌症患者带来福音。相比许多现有的抗肿瘤药物，开发CDK类小分子抑制剂应用于靶向抗癌治疗具有更多的潜在性优点，能够降低继发的肿瘤发展的风险。
现有已公开的CDK类小分子抑制剂，多为CDK4/6抑制剂，例如已获批上市的CDK4/6抑制剂为：Palbociclib(辉瑞，2015年2月FDA获批，2018年9月CFDA获批)、Ribociclib(诺华，2017年3月FDA获批，尚未在CFDA获批)、Abemaciclib(礼来，2017年10月FDA获批，尚未在CFDA获批)。但，未曾有CDK9抑制剂的获批上市。
经检索，涉及Abemaciclib及围绕Abemaciclib进行结构修饰、改造的专利文献具体为：
公开号为WO 2010075074A1(中国同族为CN 102264725A)的专利文献中公开了结构式1的化合物，其结构特点在于：与氨基嘧啶中的氨基相连的，系带取代基R4的含氮芳杂环。
公开号为CN 105294683A的专利文献中公开了结构式2的化合物，其结构特点在于：与氨基嘧啶中的氨基相连的，系B环，B环为对位取代(二取代)的苯环或含氮芳杂环。
公开号为WO 2016014904A1(中国同族为CN 106687454A)的专利文献中公开了结构式3和结构式4的化合物，其结构特点在于：与氨基嘧啶中的氨基相连的，系嘧啶。
前述几篇专利文献中，仅披露了部分化合物在酶学水平或细胞水平对CDK4、CDK6的活性抑制数据(IC50值)，未曾表明对CDK9也存在活性抑制。
此外，还检索到一篇涉及苯氨基嘧啶类衍生物的专利，即公开号为WO2018019204A1(中国同族为CN 108602802A)的专利文献中公开了结构式5的化合物，其结构特点在于：与氨基嘧啶中的氨基相连的，系带取代基Y和R2的苯环。
综上所述，如何开发出一种新CDK抑制剂，对CDK4、CDK6或CDK9的活性抑制效果更优于Abemaciclib，甚至在肺癌、脑胶质瘤、乳腺癌等特定肿瘤疾病上仍有效，并以此为基础上研制出具有自主知识产权的中国创新药，是本领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供了一种结构全新的含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，能够抑制CDK4、CDK6或CDK9激酶活性，具有显著的抗肿瘤活性。
为解决上述技术问题，本发明采取了以下技术方案：
一种含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，为式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，W选自C1-C6烷基、-(CH2)nCO(CH2)m-；
环A为被一个或多个取代基R8取代的哌嗪、或被一个或多个取代基R8取代的哌嗪酮；
R1和R2各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基或卤代C1-C6烷氧基；
R3、R4和R7各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基、羟基、羧基、氰基、氨基、C1-C6烷胺基、3-10元环烷基或3-10元杂环烷基；
R5、R6和R11各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羰基、羧基、氨基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9和R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
m、n各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6，且m和n不同时为0。
优选的，为式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，W选自C1-C6烷基、-(CH2)nCO(CH2)m-；
环A为
R3和R4各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或卤代C1-C6烷基；
R5和R6各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9、R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
n选自0、1、2、3、4、5或6，m选自1、2、3、4、5或6。
更优选的，为式Ⅱa所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，W选自C1-C6烷基、-(CH2)nCO(CH2)m-；
R3和R4各自独立地选自卤素、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基；
R5和R6各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9、R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
n选自0、1、2、3、4、5或6，m选自1、2、3、4、5或6。
更优选的，为式Ⅱb所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，W选自C1-C6烷基、-(CH2)nCO(CH2)m-；
R3和R4各自独立地选自卤素、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基；
R5和R6各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9、R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
n选自0、1、2、3、4、5或6，m选自1、2、3、4、5或6。
更优选的，为式Ⅲ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R3和R4各自独立地选自卤素、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基；
R5和R6各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9、R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
R11选自卤素、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基；
所述的3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
n选自0、1、2、3、4、5或6，m选自1、2、3、4、5或6。
优选的，卤素为F或Cl；3-10元杂环基、5-12元杂芳基中包含一个或多个杂原子，杂原子为N、O、S中的一种或几种。
一种含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，选自如下结构的化合物或其药学上可接受的盐，化合物的编号为BT-A-1-0、BT-A-1至BT-A-14：
本发明所述的“化合物”，包括所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。
本发明所述的“化合物”，可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本发明中含有不对称碳原子的化合物，可以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。
本发明所述的“化合物”，还包括互变异构体形式。互变异构体形式来源于一个单键与相邻的双键交换并一起伴随一个质子的迁移。
本发明所述的“化合物”，其溶剂化合物选自水合物、乙醇合物、甲醇合物、丙酮合物、***合物或异丙醇合物。
本发明还包括所有同位素的原子，无论是在中间体或最后的化合物。同位素的原子包括具有相同的原子数、但不同质量数的。例如，氢的同位素包括氘和氚。
含有前述通式结构的化合物，本文中所用的术语具有如下含义：
术语“羟基”，指-OH。
术语“羧基”，指-COOH。
术语“羰基”，指-CO。
术语“氰基”，指-CN。
术语“卤素”，指氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。
术语“烷基”，指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的饱和脂族烃基，如C1-C20烷基，优选为C1-C6烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙基(包括正丙基、异丙基)、丁基(包括正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(包括正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基己基等。
术语“烷氧基”，指通过氧原子相连的直链或支链烷基，如C1-C6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基(包括正丙氧基、异丙氧基)、丁氧基(包括正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基)、戊氧基(包括正戊氧基、异戊氧基、新戊氧基)、正己氧基、2-甲基己氧基等。
术语“氨基”，指-NH2。
术语“烷胺基”，指含有氮原子的开链烷基，如C1-C6烷胺基，包括但不限于甲胺基、乙胺基、异丙胺基、二甲基胺基、甲基乙基胺基、二乙基胺基等。
术语“环烷基”，指由碳原子和氢原子组成的饱和的单环、双环或多环烷基，且其可经由任何适宜的碳原子通过单键与分子的其余部分连接；当为多环时，可为并环连接、桥环连接或螺环连接。在某一方案中，典型的单环环烷基，包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
术语“杂环烷基”，指具有杂原子的饱和的环状基团，含1个或多个独立选自N、O、S的杂原子，其余为碳组成的稳定的3-10元饱和杂环***的基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂环烷基的基团可以是单环的、双环的或多环的环体系；当为多环时，可为并环连接、桥环连接或螺环连接。在某一方案中，典型的含1个或多个独立选自N、O、S的杂原子的4-6元单环的杂环烷基，包括但不限于
等。在某一方案中，典型的含1个或多个独立选自N、O、S的杂原子的7-10元双环的杂环烷基，包括但不限于
等。
术语“芳基”，指具有完全共轭的π电子体系的全碳芳香基团，可为单环或稠合环，通常具有6-14个碳原子，优选具有6-12个碳原子，最优选具有6个碳原子。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。
术语“杂芳基”，指含有杂原子的芳香基团，可为单环或稠合环，优选含有1-4个独立选自N、O、S的5-12元杂芳基，包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、***基、吲哚基等。在某一方案中，典型的含1个或多个独立选自N、O、S的杂原子的5-6元单环的杂芳基，包括但不限于
等。
术语“卤代C1-C6烷基”、“卤代C1-C6烷氧基”，指其中一个或多个(尤其是1至3个)氢原子被卤素原子取代，特别是氟或氯原子。
本发明中，“包括”、“包含”均为开放式表达并非封闭式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
本发明中，当所列举的基团中没有明确指明其具有取代基时，这种基团仅指未被取代。例如当“C1-C6烷基”前没有“取代或未取代的”的限定时，仅指“C1-C6烷基”本身或“未取代的C1-C6烷基”。
本发明中描述了连接取代基，当该结构清楚地需要连接基团时，针对该基团所列举的马库什变量应理解为连接基团。例如，如果该结构需要连接基团并且针对该变量的马库什基团定义列举了“烷基”或“芳基”，则应该理解，该“烷基”或“芳基”分别代表连接的亚烷基基团或亚芳基基团。
在一些具体的结构中，当烷基基团清楚地表示为连接基团时，则该烷基基团代表连接的亚烷基基团，例如，基团“卤代C1-C6烷基”中的C1-C6烷基应当理解为C1-C6亚烷基。
除非另有说明，本发明采用质谱、元素分析的传统方法，各步骤和条件可参照本领域常规的操作步骤和条件。
本领域技术人员可以理解，根据本领域中使用的惯例，本发明中在描述基团的结构式时所使用的
是指，相应的基团通过该位点与化合物中的其它片段、基团进行连接。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳的实施例。
本发明还提供了一种如前所述的含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物的制备方法，步骤如下：氮气保护下，在反应溶剂中，分别加入中间体A、中间体B、碱试剂和钯催化剂，通过偶联反应，得到具有式Ⅰ结构的终产物。反应式如下：
本发明还提供了一种药物组合物，包含如前所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成份，以及一种或多种药学上可接受的载体。
本发明所述的“药物组合物”，指一种或多种本发明的化合物或其盐与在本领域中通常接受的用于将生物活性化合物输送至有机体(例如人)的载体的制剂。药物组合物的目的是有利于对有机体给药输送。
术语“药学上可接受的载体”，指与活性成份共同给药的、且有利于活性成份给药的物质，包括但不限于药监局许可的可接受的用于人或动物(例如家畜)的任何助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、崩解剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。例如，包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
本发明所述的药物组合物，可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等等。
本发明所述的药物组合物，可以采用本领域熟知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。
本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物的给药途径，包括但不限于口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、***内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。优选的给药途径是口服给药。
对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体混合，来配制该药物组合物。这些载体能使本发明的化合物被配制成片剂、丸剂、锭剂、糖衣剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、浆剂、悬浮剂等，以用于对患者的口服给药。例如，用于口服给药的药物组合物，可采用如下方式获得片剂：将活性成分与一种或多种固体载体合并，如果需要将所得混合物制粒，并且如果需要加入少量的赋形剂加工成混合物或颗粒，以形成片剂或片芯。片芯可与任选适合肠溶的包衣材料结合，加工成更有利于有机体(例如人)吸收的包衣制剂形式。
本发明还提供了一种如前所述的化合物或药物组合物在制备预防或治疗细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)活性介导的疾病的药物中的用途。
优选的，制药用途为用于预防或治疗与CDK4、CDK6或CDK9活性改变相关的疾病。
更优选的，制药用途为用于预防或治疗癌症，所述的癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、肠癌、小细胞肺癌、黑色素癌、脑胶质瘤、淋巴瘤、***癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、套细胞淋巴癌、急性髓性白血病或慢性髓性白血病。
与现有技术相比，本发明研发的含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，基于靶标科学、合理地设计化合物结构，通过基团的取代修饰，获得了一系列结构新颖的化合物；并结合体外、体内实验的评价，优化筛选出一系列具有抗肿瘤活性的化合物，能对CDK4或CDK6有效，部分化合物在肺癌、乳腺癌、胶质瘤等癌症中表现出较好的活性，系更优于Abemaciclib的CDK抑制剂，对癌症的预防或治疗具有极大的临床应用价值，市场潜力可观。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1化合物BT-A-1：1-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)胺)苯基)哌嗪-2-酮
化合物BT-A-1的合成路线如下：
中间体A1(322mg,1mmol)、中间体B1(323mg,1mmol)、碳酸铯(651mg,2mmol)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos,116mg,0.2mmol)溶于1,4-二氧六环(10mL)中，氮气保护下加入三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3,183mg,0.2mmol)，90℃反应3小时至反应完全，反应液冷却至室温倒入10mL水中，乙酸乙酯萃取三次(30mL×3)，合并有机相，有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干后固体用硅胶柱纯化(DCM:CH3OH＝20:1)，得到黄色固体，即前体目标化合物BT-A-1-0(317mg,52％)，化合物BT-A-1-0经TFA/DCM脱去-Boc保护基，得到目标化合物BT-A-1(265mg,100％)。
MS(m/z)：510.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.04(s,1H),8.69(d,J＝3.6Hz,1H),8.24(d,J＝1.2Hz,1H),7.83(dd,J＝13.2,2.0Hz,1H),7.66(d,J＝12.0Hz,1H),7.52(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.22(t,J＝8.4Hz,1H),4.85(p,J＝6.8Hz,1H),4.51(s,2H),3.28(s,2H),3.21-3.15(m,3H),2.87(t,J＝5.6Hz,2H),2.65(s,3H),1.62(d,J＝6.8Hz,6H)。
中间体A1的合成路线如下：
步骤1：异丙基乙酰胺(3)的合成
异丙胺(1,59.1g,1mol)，三乙胺(101.2g,1mol)溶于二氯甲烷(DCM,300mL)中，-10℃下滴加入乙酸酐(2,102.1g,1mol)，滴加完后，移至室温反应，反应结束，减压蒸馏除去溶剂，加乙酸乙酯(500mL)、碳酸钾(200g)，搅拌3小时，抽滤，减压蒸馏除去溶剂，得到油状物，即化合物3(93.2g,92.1％)。
MS(m/z)：102.1[M+H]+。
步骤2：N’-(4-溴-2-6-二氟苯基)-N-异丙基乙脒(5)的合成
4-溴-2,6-二氟苯胺(4,20.56g,98.9mmol)，异丙基乙酰胺(3,20g,197.7mmol)溶于甲苯(150mL)中，降温至-10℃，氮气保护下滴加三氯氧磷(POCl3,22.7g,148.3mmol)，滴加三乙胺(15.0g,148.3mmol)，滴加完毕，移至油浴锅中，115℃加热回流反应3小时。将反应液冷却至室温后，倒入饱和碳酸氢钠水溶液(3000mL)中，加乙酸乙酯，充分混合后分液，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(200mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用石油醚(100mL)浆洗1小时，过滤，滤饼干燥，得到固体，即化合物5(24.2g,84.1％)。
MS(m/z)：291.0[M+H]+。
步骤3：1-异丙基-2-甲基-4-氟-6-溴-1H-苯并[d]咪唑(6)的合成
化合物5(24.2g,83.1mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF,120mL)中，于0℃加入叔丁醇钾(10.3g,91.4mmol)，氮气保护下加热至110℃，反应2小时。将反应液冷却至室温后倒入水(700mL)中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用石油醚(100mL)浆洗1小时，过滤，滤饼干燥，得到固体，即化合物6(20.0g,88.9％)。
MS(m/z)：271.0[M+H]+。
步骤4：1-异丙基-2-甲基-4-氟-6-硼酸频哪醇酯-1H-苯并[d]咪唑(8)的合成
化合物6(9.7g,35.8mmol)、双联硼酸频那醇酯(7,B2(pin)2,13.6g,53.7mmol)、三环己基膦(PCy3,1.71g,6.1mmol)、醋酸钾(10.5g,107.2mmol)溶于二甲基亚砜(DMSO，100mL)中，氮气保护下，加入醋酸钯(Pd(OAc)2,0.80g,3.6mmol)，升温至80℃反应4小时。将反应液冷却至室温后，倒入水(300mL)中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化(PE/EA＝4:1)得到固体，即化合物8(7.64g,67％)。
MS(m/z)：319.2[M+H]+。
步骤5：1-异丙基-2-甲基-4-氟-6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑(A1)的合成
2,4-二氯5-氟嘧啶(9,3.23g,19.36mmol)，碳酸钠(3.66g,34.57mmol)溶于1,4-二氧六环/水(18mL/4.5mL)中，氮气保护下加入双三苯基膦二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2,0.29g，0.42mmol)，升温至80℃滴加化合物8(4.4g,13.83mmol)的1,4-二氧六环溶液(22.5mL)，滴毕，80℃反应5小时。将反应液冷却至室温，倒入冰水(100mL)中，析出白色固体，过滤得到滤渣，异丙醇打浆，得到化合物A1(3.5g,78.5％)。
MS(m/z)：323.1[M+H]+。
中间体B2的合成路线如下：
步骤1:2-氟-4-硝基苯甲醇(11)的合成
2-氟-4-硝基苯甲酸(10,9.25g,50mmol)溶于四氢呋喃(30mL)中，降温至-15℃，搅拌10分钟后缓慢加入BH3的THF溶液(1mol/L,150mL,150mmol)，滴毕，转移至室温反应2小时。反应完全后，向反应液中缓慢倒入甲醇(50mL)淬灭，浓缩有机相，得到白色固体，即化合物11(7.7g,90％)。
MS(m/z)：170.2[M-H]-。
步骤2：2-氟-4-硝基苯基-4-甲基苯磺酸甲酯(12)的合成
化合物11(3.42g,20mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，加入三乙胺(4.04g,40mmol)、4-甲基苯磺酰氯(5.72g,30mmol)，氮气保护下室温反应2小时。反应完全后向反应液中加入5mL水洗涤，分离有机相，加饱和食盐水、无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，得到黄色油状物，即化合物12(5.85g,90％)。
MS(m/z)：326.3[M+H]+。
步骤3：叔丁基4-(2-氟-4-硝基苯基)-3-哌嗪酮-1-羧酸酯(13)的合成
化合物12(1.63g,5mmol)溶于乙腈(10mL)中，加入三乙胺(757mg,7.5mmol)、tert-butyl3-哌嗪酮-1-羧酸酯(1.50g,7.5mmol)，氮气保护下室温反应过夜。反应完全后，减压浓缩除去溶剂，向体系中加入水(10mL)洗涤，加入乙酸乙酯萃取三次(20mL×3)，合并有机相，加入饱和食盐水、无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，得到黄色油状物，即化合物13(1.62g,92％)。
MS(m/z)：239.2[M+H]+。
步骤4：叔丁基4-(2-氟-4-氨基苯基)-3-哌嗪酮-1-羧酸酯(B1)的合成
化合物13(1.41g,4mmol)溶于12mL乙醇和4mL水组成的混合溶剂中，加入氯化铵(384mg,7.2mmol)、还原铁粉(1.57g,28mmol)，升温至80℃反应2小时。反应完全后体系降温、抽滤，乙醇洗滤渣。浓缩滤液并加入饱和碳酸钾溶液，调节pH至碱性。加入乙酸乙酯萃取三次(20mL×3)，合并有机相，加入饱和食盐水、无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，得到黄色油状物，即化合物B1(1.12g,87％)。
MS(m/z)：324.3[M+H]+。
实施例2化合物BT-A-2：4-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-羧酸乙酯
化合物BT-A-2的合成路线如下：
参考实施例1之BT-A-1的合成方法，可得到黄色固体，即化合物BT-A-2。
MS(m/z)：582.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.25(s,1H),8.73(d,J＝3.6Hz,1H),8.22(s,1H),7.98(dd,J＝13.2,2.0Hz,1H),7.66(d,J＝12.0Hz,1H),7.55(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.2Hz,1H),4.85(p,J＝6.8Hz,1H),4.06(q,J＝6.4Hz,2H),3.68-3.62(m,2H),3.50-3.28(m,6H),2.65(s,3H),1.62(d,J＝6.8Hz,6H),1.18(t,J＝6.4Hz,3H)。
中间体A1的合成路线与合成步骤，同实施例1之A1的合成路线与合成步骤，此处不赘述。
中间体B2的合成路线如下：
步骤1:乙基4-(2-氟-4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸酯(14)的合成
2-氟-4-硝基苯甲酸(10,1.85g,10mmol)溶于30mL DMF中，缓慢加入CDI(1.64g,10mmol)，氮气保护下70℃反应2小时。反应完全后，降至室温，缓慢加入吗啉(0.96g,11mmol)，在40℃条件下反应2小时。反应完全后，向反应液中倒入水(50mL)，加入乙酸乙酯萃取三次(20mL×3)，合并有机相，加入饱和食盐水、无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，得到深褐色油状物，即化合物14(2.76g,85％)。
MS(m/z)：324.3[M-H]-。
步骤2：乙基4-(2-氟-4-氨基苯基)哌嗪-1-羧酸酯(B2)的合成
化合物14(1.63g,5mmol)溶于12mL乙醇和4mL水组成的混合溶剂中，加入氯化铵(481mg,9.0mmol)、还原铁粉(1.96g,35mmol)，升温至80℃反应2小时。反应完全后体系降温、抽滤，乙醇洗滤渣。浓缩滤液并加入饱和碳酸钾溶液，调节pH至碱性。加入乙酸乙酯萃取三次(20mL×3)合并有机相，加入饱和食盐水、无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，得到黄色油状物，即化合物B2(1.37g,93％)。
MS(m/z)：296.2[M+H]+。
实施例3化合物BT-A-3：4-硝基苯基4-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-羧酸盐
化合物BT-A-3的合成路线如下：
参考实施例1之BT-A-1的合成步骤，得到化合物BT-A-3-0。
化合物BT-A-3-0(124mg,0.24mmol)溶于无水DCM(10mL)中，加入TEA(303mg,3mmol)，缓慢滴加对硝基苯基氯甲酸酯(123mg,0.61mmol),滴加完毕后充分置换氮气。在氮气保护下室温反应1.5小时，反应完全后，加入饱和NaHCO3溶液(10mL)，搅拌，DCM萃取，合并有机相，饱和食盐水、无水硫酸钠干燥过滤，减压浓缩后残留物用硅胶柱纯化(DCM:CH3OH＝20:1)，得到黄色固体，即目标化合物BT-A-3(150mg,91％)。
MS(m/z)：675.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δppm 8.44(d,J＝3.6Hz,1H),8.28(s,1H),8.26(s,1H),8.22(s,1H),8.10(d,J＝9.2Hz,1H),7.97(d,J＝12.4Hz,1H),7.86(d,J＝11.2Hz,1H),7.64(s,1H),7.43(t,J＝8.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.09(d,J＝9.2Hz,1H),4.80(p,J＝6.8Hz,1H),3.95-3.85(m,2H),3.81-3.61(m,4H),3.55-3.46(m,2H),2.82(s,3H),1.75(d,J＝6.8Hz,6H)。
中间体A1的合成路线与合成步骤，同实施例1之A1的合成路线与合成步骤，此处不赘述。
中间体B3的合成路线如下：
参考实施例2之B2的合成方法，仅步骤1将
替换成
其余步骤同实施例2之B2，可得到黄色油状物，即化合物B3。
MS(m/z)：324.2[M+H]+。
实施例4化合物BT-A-4：异丙基2-(4-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酯
化合物BT-A-4的合成路线如下：
参考实施例3之BT-A-3的合成方法，仅将
替换成
得到黄色固体，即目标化合物BT-A-4。
MS(m/z)：596.4[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δppm 8.42(d,J＝3.6Hz,1H),8.21(d,J＝1.2Hz,1H),7.97(d,J＝11.6Hz,1H),7.79(d,J＝11.2Hz,1H),7.57(s,1H),7.39(t,J＝8.0Hz,1H),7.25(td,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.95(p,J＝6.4Hz,1H),4.75(p,J＝6.8Hz,1H),3.85-3.75(m,2H),3.63-3.55(m,2H),3.50-3.45(m,2H),3.43-3.35(m,2H),2.73(s,3H),1.72(d,J＝7.2Hz,6H),1.26(d,J＝6.4Hz,6H)。
实施例5化合物BT-A-5：4-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)胺)苯基)哌嗪-1-羧酸甲酯
化合物BT-A-5的合成路线如下：
参考实施例1之BT-A-1的合成方法，可得到黄色固体，即化合物BT-A-5。
MS(m/z)：568.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.25(s,1H),8.73(d,J＝3.6Hz,1H),8.22(d,J＝1.2Hz,1H),7.98(dd,J＝13.2,2.0Hz,1H),7.66(d,J＝12.0Hz,1H),7.55(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.35(t,J＝8.4Hz,1H),4.85(p,J＝6.8Hz,1H),3.68-3.60(m,5H),3.50-3.20(m,6H),2.65(s,3H),1.62(d,J＝6.8Hz,6H)。
中间体A1的合成路线与合成步骤，同实施例1之A1的合成路线与合成步骤，此处不赘述。
中间体B4的合成路线如下：
参考实施例2之B2的合成方法，仅步骤1将
替换成
其余步骤同实施例2之B2，可得到黄色油状物，即化合物B4。
MS(m/z)：282.2[M+H]+。
实施例6化合物BT-A-6：正己基2-(4-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酯
化合物BT-A-6的合成路线如下：
参考实施例3之BT-A-3的合成方法，仅将
替换成
得到黄色固体，即目标化合物BT-A-6。
MS(m/z)：638.4[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δppm 8.42(d,J＝3.6Hz,1H),8.22(d,J＝1.2Hz,1H),7.96(dd,J＝12.0,2.0Hz,1H),7.81(d,J＝11.2Hz,1H),7.55(s,1H),7.39(t,J＝8.0Hz,1H),7.24(td,J＝8.8,2.0Hz,1H),4.77(p,J＝6.8Hz,1H),4.10(t,J＝6.8Hz,2H),3.84-3.76(m,2H),3.64-3.56(m,2H),3.52-3.45(m,2H),3.44-3.36(m,2H),3.14-3.07(m,6H),2.77(s,3H),1.73(d,J＝6.8Hz,6H),1.68-1.60(m,2H),0.94-0.85(t,J＝6.4Hz,3H)。
实施例7化合物BT-A-7：乙基2-(4-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酯
化合物BT-A-7的合成路线如下：
参考实施例1之BT-A-1的合成步骤，得到化合物BT-A-3-0。
化合物BT-A-3-0(1.20g,2.36mmol)溶于无水DMF(10mL)中，加入碳酸钾(488mg,3.54mmol)，缓慢滴加溴甲基乙酸乙酯(472mg,2.83mmol)，滴加完毕后充分置换氮气。在氮气保护下70℃反应2小时，反应完全后，加入10mL水洗，搅拌，DCM萃取，合并有机相，饱和食盐水、无水硫酸钠干燥过滤，减压浓缩后残留物用硅胶柱纯化(PE/EA/TEA＝5:5:1)，得到黄色固体，即目标化合物BT-A-7(1.20g,85.5％)。
MS(m/z)：596.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.25(s,1H),8.73(d,J＝3.6Hz,1H),8.22(s,1H),7.97(dd,J＝13.2,2.0Hz,1H),7.66(d,J＝12.0Hz,1H),7.54(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.31(t,J＝8.4Hz,1H),4.85(p,J＝6.8Hz,1H),4.09(q,J＝7.2Hz,2H),3.70-3.60(m,2H),3.32-3.25(m,6H),2.65(s,3H),2.61-2.55(s,2H),1.62(d,J＝6.8Hz,6H),1.19(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例8化合物BT-A-8：4-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)-N-甲基哌嗪-1-甲酰胺
化合物BT-A-8的合成路线如下：
参考实施例3之BT-A-3的合成方法，仅将
替换成
得到黄色固体，即目标化合物BT-A-8。
MS(m/z)：567.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δppm 8.41(d,J＝3.6Hz,1H),8.20(d,J＝1.2Hz,1H),7.97(dd,J＝12.4,2.0Hz,1H),7.76(d,J＝11.6Hz,1H),7.59(s,1H),7.38(t,J＝8.0Hz,1H),7.23(td,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.74(p,J＝6.8Hz,1H),4.60(d,J＝5.2Hz,1H),3.81(s,2H),3.55-3.42(m,6H),2.84(d,J＝4.4Hz,3H),2.70(s,3H),1.71(d,J＝6.8Hz,6H)。
实施例9化合物BT-A-9：N-乙基-4-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-甲酰胺
化合物BT-A-9的合成路线如下：
参考实施例3之BT-A-3的合成方法，仅将
替换成
得到黄色固体，即目标化合物BT-A-9。
MS(m/z)：581.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δppm 8.41(d,J＝3.6Hz,1H),8.20(d,J＝1.2Hz,1H),7.97(dd,J＝12.4,2.0Hz,1H),7.78(d,J＝11.6Hz,1H),7.52(s,1H),7.39(t,J＝8.0Hz,1H),7.24(t,J＝8.8,2.4Hz,1H),4.74(p,J＝6.8Hz,1H),4.55-4.45(m,1H),3.82(s,2H),3.47-3.40(m,6H),3.30-3.26(m,2H),2.72(s,3H),1.72(d,J＝6.8Hz,6H),1.16(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例10化合物BT-A-10：4-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)-N,N-二甲基哌嗪-1-甲酰胺
化合物BT-A-10的合成路线如下：
参考实施例3之BT-A-3的合成方法，仅将
替换成
得到黄色固体，即目标化合物BT-A-10。
MS(m/z)：581.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δppm 8.40(d,J＝3.6Hz,1H),8.21(d,J＝1.2Hz,1H),7.96(dd,J＝12.4,2.0Hz,1H),7.77(dd,J＝9.6,1.6Hz,2H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),7.24(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.75(p,J＝6.8Hz,1H),3.82(t,J＝4.8Hz,2H),3.46-3.40(m,2H),3.34(t,J＝5.2Hz,2H),3.26-3.20(m,2H),2.87(s,6H),2.71(s,3H),1.72(d,J＝6.8Hz,6H)。
实施例11化合物BT-A-11：1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-(2-氟-4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)胺)苯基)乙酰基-1-酮
化合物BT-A-11的合成路线如下：
参考实施例1之BT-A-1的合成方法，可得到黄色固体，即化合物BT-A-11。
MS(m/z)：552.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.96(s,1H),8.68(d,J＝4.0Hz,1H),8.22(d,J＝1.2Hz,1H),7.79(dd,J＝13.2,2.0Hz,1H),7.66(d,J＝12.0Hz,1H),7.45(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.15(t,J＝8.4Hz,1H),4.85(p,J＝6.8Hz,1H),3.66(s,2H),3.51-3.45(m,4H),2.65(s,3H),2.46-2.18(m,6H),1.62(d,J＝6.8Hz,6H),1.10-0.95(m,3H)。
中间体A1的合成路线与合成步骤，同实施例1之A1的合成路线与合成步骤，此处不赘述。
中间体B5的合成路线如下：
参考实施例2之B2的合成方法，仅步骤1将
替换成
其余步骤同实施例2之B2，可得到黄色油状物，即化合物B5。
MS(m/z)：266.3[M+H]+。
实施例12化合物BT-A-12：N-(4-溴-3-(4-乙基哌嗪-1-基)-5-氟苯基)-5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-胺
化合物BT-A-12的合成路线如下：
参考实施例1之BT-A-1的合成方法，可得到黄色固体，即目标化合物BT-A-12。
MS(m/z)：588.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.09(s,1H),8.71(d,J＝3.6Hz,1H),8.17(s,1H),7.70(m,2H),7.43(s,1H),4.85(p,J＝6.8Hz,1H),3.00(m,4H),2.65(s,3H),2.54(m,4H),2.40(q,J＝7.2Hz,2H),1.61(d,J＝6.8Hz,6H),1.04(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体A1的合成路线与合成步骤，同实施例1之A1的合成路线与合成步骤，此处不赘述。
中间体B6的合成路线如下：
步骤1：1-(2-溴-3-氟-5-硝基苯基)-4-乙基哌嗪(19)的合成
2-溴-1,3-二氟硝基苯(19,2.37g,10mmol)溶于20mL DMF中，并加入三乙胺(1.52g,15mmol)，在65℃条件下反应过夜。反应完全后向反应液中缓慢加水(50mL)洗涤，加入乙酸乙酯萃取三次(20mL×3)，合并有机相，加入饱和食盐水、无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，得到红褐色固体，即化合物21(1.49g,45.0％)。
MS(m/z)：332.2[M+H]+。
步骤2：1-(2-溴-3-氟-5-氨基苯基)-4-乙基哌嗪(B6)的合成
化合物20(993mg,3mmol)溶于12mL乙醇和4mL水组成的混合溶剂中，加入氯化铵(288mg,5.4mmol)、还原铁粉(1.176g,21mmol)，升温至80℃反应2小时。反应完全后，体系降温、抽滤，浓缩滤液并加入饱和碳酸钾溶液，调节；pH至碱性。加入乙酸乙酯萃取三次(20mL×3)合并有机相，加入饱和食盐水、无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，得到黄色油状物，即化合物B7(815mg,90％)。
MS(m/z)：302.3[M+H]+。
实施例13化合物对CDK4和CDK6激酶的抑制作用
将本发明所述化合物用DMSO溶解制成浓度为1000μM的原溶液。取20μL原溶液用60μL DMSO的比例逐步稀释成10个浓度的化合物。将100μL DMSO加到两个空孔中，作为无化合物对照和无酶对照组。准备一张中间板，取10μL的不同浓度的样品溶液加入中间板中，加入90μL激酶缓冲液，充分振荡混匀。分别将适量的CDK4、CDK6和CDK9激酶用缓冲液稀释成终浓度的2.5倍，将荧光标记肽和ATP用1×激酶缓冲液稀释成终浓度的2.5倍。
向384孔板中加入稀释后的激酶10μL和不同浓度的样品溶液5μL，无化合物对照和无酶对照组分别用10％的DMSO替代。室温孵育1小时后，向反应体系中加入稀释后的10μL荧光标记肽和ATP，室温孵育30分钟。加入终止试验缓冲液25μL。用酶标仪检测荧光强度(发射波长：445nm和520nm，激发波长：400nm)，并用Graphpad Prism V5.0软件计算得到IC50值。
本发明化合物对CDK4和CDK6激酶的抑制活性，结果见下表。
本发明化合物对CDK4和CDK6活性的抑制率
| 化合物 | CDK4激酶IC<sub>50</sub>(nM) | CDK6激酶IC<sub>50</sub>(nM) |
| Abemaciclib | 2.6 | 18 |
| BT-A-1-0 | <2 | <10 |
| BT-A-1 | <2 | <10 |
从上表中可知，本发明化合物对CDK4、CDK6激酶中的一个或多个激酶活性，有很强的抑制作用，抑制效果比阳性对照药Abemaciclib更佳。
实施例14 SRB法测定化合物抑制癌细胞增殖实验
采用磺酰罗丹明B(SRB)细胞增殖和毒性检测试剂盒测定受试化合物和阳性对照药Abemaciclib对人乳腺癌细胞MCF-7、人脑胶质瘤细胞U87-MG、人脑胶质瘤细胞A172的增殖抑制活性，其活性用IC50值表示。
实验方案：取对数生长期的细胞，常规消化后制成2×104/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL，然后放入37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱中培养12小时，加入不同浓度梯度的受试化合物。置于37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱中培养72小时；用SRB方法检测受试化合物OD值，严格按照SRB试剂盒说明书操作，并用GraphPad Prim5.0软件计算IC50值，结果见下表。
本发明化合物对不同癌细胞的抑制作用(IC50 nM)
注：NA表示未测。
从上表中可知，本发明化合物对乳腺癌细胞MCF-7、脑胶质瘤细胞U87-MG、脑胶质瘤细胞A172中的一种或多种细胞增殖，有很强的抑制作用，抑制效果比阳性对照药Abemaciclib更佳。
实施例15 CCK-8法测定化合物抑制小细胞肺癌细胞增殖作用
采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖和毒性检测试剂盒测定受试化合物和阳性对照药Abemaciclib对人小细胞肺癌细胞H69的增殖抑制活性，其活性用IC50值表示。
实验方案：取一定数量的细胞，接种于96孔培养板中，每孔100μL，然后放入37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱中培养12小时，加入不同浓度梯度的受试化合物。置于37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱中培养72小时；加入10μL CCK-8液再孵育2小时，用酶标仪于450nm波长处测定OD值，用GraphPad Prim5.0软件计算IC50值，结果见下表。
本发明化合物对小细胞肺癌细胞株H69的抑制作用(IC50 nM)
| 化合物 | 小细胞肺癌细胞H69 |
| Abemaciclib | 469.70 |
| BT-A-1-0 | <200 |
| BT-A-1 | <200 |
| BT-A-4 | <300 |
| BT-A-3 | <400 |
| BT-A-5 | <100 |
| BT-A-7 | <100 |
| BT-A-8 | <200 |
| BT-A-9 | <300 |
| BT-A-10 | <50 |
| BT-A-11 | <50 |
| BT-A-12 | <200 |
从表中可知，本发明化合物对小细胞肺癌细胞H69中的细胞增殖，有很强的抑制作用，抑制效果比阳性对照药Abemaciclib更佳。
Claims (12)
1.一种含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，为式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，W选自C1-C6烷基、-(CH2)nCO(CH2)m-；
环A为被一个或多个取代基R8取代的哌嗪、或被一个或多个取代基R8取代的哌嗪酮；
R1和R2各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基或卤代C1-C6烷氧基；
R3、R4和R7各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基、羟基、羧基、氰基、氨基、C1-C6烷胺基、3-10元环烷基或3-10元杂环烷基；
R5、R6和R11各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羰基、羧基、氨基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9和R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
所述的3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
m、n各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6，且m和n不同时为0。
2.根据权利要求1所述的含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，其特征在于，为式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，W选自C1-C6烷基、-(CH2)nCO(CH2)m-；
环A为
R3和R4各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或卤代C1-C6烷基；
R5和R6各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9、R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
所述的3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
n选自0、1、2、3、4、5或6，m选自1、2、3、4、5或6。
3.根据权利要求2所述的含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，其特征在于，为式Ⅱa所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，W选自C1-C6烷基、-(CH2)nCO(CH2)m-；
R3和R4各自独立地选自卤素、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基；
R5和R6各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9、R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
所述的3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
n选自0、1、2、3、4、5或6，m选自1、2、3、4、5或6。
4.根据权利要求2所述的含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，其特征在于，为式Ⅱb所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，W选自C1-C6烷基、-(CH2)nCO(CH2)m-；
R3和R4各自独立地选自卤素、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基；
R5和R6各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9、R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
所述的3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
n选自0、1、2、3、4、5或6，m选自1、2、3、4、5或6。
5.一种含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，其特征在于，为式Ⅲ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R3和R4各自独立地选自卤素、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基；
R5和R6各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氰基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
且，R5和R6不同时为氢；
R8选自C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nCOR9、-(CH2)nCOOR9、-(CH2)nCONHR9、-(CH2)nCONR9R10、-(CH2)nNHR9或-(CH2)nNR9R10；
R9、R10各自独立地选自C1-C6烷基、氨基、取代或未取代的3-10元环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基、取代或未取代的5-12元芳基、或取代或未取代的5-12元杂芳基；
R11选自卤素、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基；
所述的3-10元环烷基、3-10元杂环烷基、5-12元芳基、5-12元杂芳基上的取代基选自氢、C1-C6烷基、羟基或氨基；
n选自0、1、2、3、4、5或6，m选自1、2、3、4、5或6。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，其特征在于，所述的卤素为F或Cl；所述的3-10元杂环基、5-12元杂芳基中包含一个或多个杂原子，杂原子为N、O、S中的一种或几种。
7.一种含哌嗪类的氨基嘧啶衍生物，选自如下结构的化合物或其药学上可接受的盐：
8.一种药物组合物，包含如权利要求1～7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成份，以及一种或多种药学上可接受的载体。
9.一种如权利要求1～7中任一项所述的化合物或权利要求8所述的药物组合物在制备预防或治疗细胞周期蛋白依赖性激酶活性介导的疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的细胞周期蛋白依赖性激酶活性介导的疾病为与CDK4、CDK6或CDK9活性改变相关的疾病。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的疾病为癌症。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的癌症选自乳腺癌、肺癌、肠癌、小细胞肺癌、黑色素癌、脑胶质瘤、淋巴瘤、***癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、套细胞淋巴癌、急性髓性白血病或慢性髓性白血病。
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