CN103565928A

CN103565928A - 一种番石榴降糖活性组分、制备方法及用途

Info

Publication number: CN103565928A
Application number: CN201310528407.7A
Authority: CN
Inventors: 曹庸; 欧阳文; 邵祥辉; 蔡喆俊; 朱晓艾; 陈雪香
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-11-01
Filing date: 2013-11-01
Publication date: 2014-02-12

Abstract

本发明提供一种番石榴降糖活性组分、制备方法及其用途，是将番石榴叶原料粉碎、8-10倍体积50％乙醇回流提取，60℃以下减压浓缩，所得乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取后采用乙酸乙酯充分萃取，在60℃以下减压浓缩，所得乙酸乙酯萃取物过60-200目聚酰胺层析柱，乙醇水溶液由低到高梯度洗脱，收集用30％-50％浓度乙醇洗脱的组分，60℃以下减压浓缩后继续过60-200目聚酰胺层析，10％乙醇洗脱后，30％乙醇等度洗脱，洗脱液在60℃以下减压浓缩、70％乙醇溶剂重结晶即得降糖活性组分。本发明方法简便，有效部分化学成分组成清楚、化学性质稳定性好。本发明产品能够显著降低四氧嘧啶诱导的高血糖，可用于制备降血糖药物或保健品。

Description

一种番石榴降糖活性组分、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种降血糖保健品领域，特别是一种番石榴降糖活性组分、制备方法及用途。

背景技术

2型糖尿病是多种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等引发的一系列代谢紊乱综合征。世界卫生组织指出，世界范围内的糖尿病形势仍然非常严峻，而发展中国家的形势尤其令人担忧。

石榴叶作为民间用药用来预防和治疗糖尿病已有悠久的历史，有大量的关于番石榴叶在2型糖尿病病人疾病防治过程的文献报道，且大量的临床试验证明其疗效确切，因此国内外许多学者对其降糖效果展开了大量的研究，但到目前为止，番石榴叶中降血糖活性成分和作用机制尚未得到确切证实。中国专利申请公开的“一种具有降血糖功效的药物组合物或保健品”(201210505096.8)，提供了一种由苦瓜提取物、橄榄提取物、肉桂提取物、番石榴提取物、苦荞麦提取物、虾青素、叶黄素、酵母铬、木糖醇组成的降血糖药物，但其并未说明其中的番石榴提取物的提取方法和具体成分。番石榴叶资源在我国非常丰富，如果对番石榴叶进行深入***的研究，确定其降糖作用物质基础、鉴定其降糖单体的化学结构、明析其作用机理，并在此基础上开发出防治2型糖尿病发生发展的降糖药物或功能食品，不仅可以充分利用番石榴叶资源，而且还可以减少糖尿病人的痛苦、创造出较大的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从番石榴叶提取的降糖活性组分，可有效用于制备降糖药物或功能食品，用于2型糖尿病病人的防治，为高血糖患者提供健康。本发明还提供一种番石榴降糖活性组分的制备方法以及该番石榴降糖活性组分在制备降糖药物和保健品方面的用途。

为达到上述目的，本发明的实施方案为：一种番石榴叶降糖活性组分，由包括以下步骤的方法制备而成：

(1)将番石榴叶原料、粉碎，8-10倍体积50％乙醇回流提取2次，提取液60℃以下减压浓缩得乙醇提取物；

(2)乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取后采用乙酸乙酯充分萃取，合并乙酸乙酯萃取液，60℃以下减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；

(3)乙酸乙酯萃取物过60-200目聚酰胺层析柱，用浓度为0％-95％的乙醇水溶液由低到高梯度洗脱，收集用30％-50％浓度乙醇洗脱的组分，60℃以下减压浓缩后继续过60-200目聚酰胺层析，10％乙醇洗脱后，30％乙醇等度洗脱，收集洗脱液，60℃以下减压浓缩、70％乙醇溶剂重结晶即得降糖活性组分。

步骤(3)中，聚酰胺层析柱层析时，萃取物和吸附剂重量比为1：10～1：30。乙醇梯度洗脱时，乙醇浓度依次为：0％、10％、30％、50％、70％、95％。

经分析测定并确定该降糖组分含有五种黄酮单体化合物，分别为金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷、番石榴苷、广寄生苷。五种单体含量之和50％～95％，番石榴苷和广寄生苷含量之和25％～75％。

本发明方法简便，有效部分化学成分组成清楚，化学性质稳定性好，开辟了番石榴叶降糖功能应用的新局面，是功能食品领域的一个创新。经整体降糖动物实验表明，本发明产品能够显著降低四氧嘧啶诱导的高血糖，可用于制备降血糖药物或保健品。

附图说明

图1为番石榴叶粗体物脂肪细胞培养液中葡萄糖含量比较(注：*p<0.01，#p<0.05vs对照组)；

图2为番石榴叶粗体物脂肪细胞培养液中葡萄糖含量比较(注：*p<0.01，#p<0.05vs对照组)；

图3为柱层析1各组分脂肪细胞培养液中葡萄糖含量比较(注：*p<0.01，#p<0.05vs对照组)；

图4为C1-D色谱分析结果。

具体实施方式

以下结合实际情况，对本发明的具体实施方式进行详细说明。

实施例1：

称取9月份番石榴叶原料1.2kg，10L50％乙醇回流提取2次，每次1小时，提取液60℃以下减压浓缩得乙醇提取物；乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取至溶液颜色变浅时，换成乙酸乙酯萃取6次，至最后一次萃取液颜色很浅后即可，合并浓缩萃取液得乙酸乙酯萃取物35.6g，萃取物过100目聚酰胺柱400g，水洗、10％乙醇各洗脱4倍柱体积，50％乙醇洗脱8倍柱体积，浓缩得10.3g固体，再过200目聚酰胺柱，10％乙醇洗脱3倍柱体积，后30％乙醇等度洗脱10倍柱体积，浓缩，70％乙醇结晶得降糖活性组分4.97g，液相测定计算含有广寄生苷1.19g，番石榴苷1.03g，槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷0.57g，异槲皮苷0.19g，金丝桃苷0.45g。

实施例2：

称取10月份番石榴叶原料20kg，200L50％乙醇回流提取2次，每次2小时，提取液60℃以下减压浓缩得乙醇提取物；乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取至溶液颜色变浅时，换成乙酸乙酯萃取10次，至最后一次萃取液颜色很浅后即可，合并浓缩萃取液得乙酸乙酯萃取物519.2g，萃取物过80目聚酰胺柱，水洗、10％乙醇充分洗脱，50％乙醇洗脱10倍柱体积，浓缩得177.8g固体，再过100目聚酰胺柱，10％乙醇洗脱6倍柱体积，后30％乙醇等度洗脱，浓缩，70％乙醇结晶得降糖活性组分103.54g，液相测定计算含有广寄生苷19.72g，番石榴苷23.49g，槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷4.56g，异槲皮苷1.38g，金丝桃苷6.95g。

为阐明、验证本发明降低高血糖的效果，特作了以下降糖实验。

1.葡萄糖消耗降糖脂肪细胞模型的建立

雄性SD大鼠断颈处死，无菌开腹，取附睾外层白色脂肪组织，剔除附带血管，剪碎至约1mm³大小，加I型胶原酶消化1h，收集上层脂肪细胞，加入适量Hanks缓冲液洗涤细胞三次即得原代脂肪细胞。96孔板中建立200μL反应体系：浓度为2×10⁶cells/mL细胞悬液100μL+30μL6mg/mL葡萄糖+30μL胎牛血清+40μL样品溶液(包括各萃取物或各柱层析洗脱组分)，以饱和湿度、37℃、5％CO₂培养反应30min，每孔再加入1μL2mmol/L肾上腺素溶液，再以同样条件培养3h，冰浴终止反应。采用微量葡萄糖氧化酶法显色，酶标仪上读数，测定并计算各孔葡萄糖浓度，并和对照组比较计算各组葡萄糖的消耗浓度，由此评价各萃取物或各柱层析组分的摄取葡萄糖能力，具体计算公式如下：

glucose-uptake level=C_ctrl-C_compound(mmol/L)

其中，C_ctrl为对照组葡萄糖的浓度，C_compound为样品或分离得到的有效成分经过3小时培养后残留培养基中的葡萄糖浓度。在此模型中，用0.1％DMSO Hanks缓冲液做空白对照组，胰岛素做阳性对照。

2.番石榴叶粗提物活性结果与分析

建立细胞模型，分别检测粗提物WE(水提取物)、50AE(50％乙醇提取物)、85AE(85％乙醇提取物)、EAE(乙酸乙酯提取物)、PE(石油醚提取物)五个组分在浓度为1.6mg/mL、1.2mg/mL、和0.8mg/mL下，对脂肪细胞葡萄糖代谢的影响，结果见图1。

图1显示，不同组分对脂肪细胞培养液中葡萄糖含量有一定的影响。随着胰岛素浓度的增加，培养液中葡萄糖含量逐渐减少，表现出剂量依赖关系。在5个样品组分中，对比对照组，50AE能显著降低细胞液中葡萄糖含量，培养液中葡萄糖含量最低，并且呈剂量依赖关系，且当50AE浓度在1.6mg/mL时，降糖效果与8U/mL的胰岛素相当。整体降糖效果比较排序：50AE>WE>85AE>EAE>PE，从排序观察可知，当极性为50％乙醇时，其提取物具有最强的降血糖活性，当提取液的极性向增大或缩小变化时，提取物的降血糖活性随着极性变化而降低，活性表现为极性依赖关系。

3.番石榴叶萃取物活性结果与分析

50AE样品采用极性由低到高溶剂***溶剂萃取分别得石油醚萃取物(PS)、乙酸乙酯萃取物(EAS)。乙酸乙酯萃取后，放出剩余的水溶液和乳化层，减压浓缩，分别命名为WS和EL。用石油醚提取EAS浸膏，过滤，用少量多次提取的方法直至滤液澄清无色，将滤液合并，减压浓缩得P-EAS，剩余的滤渣为R-EAS。利用细胞模型，分别检测萃取物EL、WS、R-EAS、P-EAS四个组分在浓度为1.2mg/mL、和0.8mg/mL和0.6mg/mL下，对脂肪细胞葡萄糖代谢的影响，并加50AE组分对照。结果见图2。

图2显示，各萃取组分对脂肪细胞培养液中葡萄糖含量的影响。由于50AE组分为粗提物，成分比萃取物多且复杂，且其活性显著表现为剂量依赖关系，所以设计50AE对照时，其浓度比萃取物高一个等级。在4个萃取组分中，对比对照组，R-EAS能显著降低细胞液中葡萄糖含量，培养液中葡萄糖含量最低，并且呈剂量依赖关系，且当R-EAS浓度在1.2mg/mL时，降糖效果比8U/mL的胰岛素和1.6mg/mL的50AE更强。整体降糖效果比较排序：R-EAS>EL>WS>P-EAS。分析各组分萃取液，萃取组分所用的萃取液极性排序是：R-EAS>EL>WS>P-EAS(EL是乳化层，因此极性介于水和乙酸乙酯之间)。从降糖效果和极性排序观察可知，萃取物的降血糖活性与其极性变化相关，同样表现为极性依赖关系。

4.柱层析1各组分活性结果与分析

R-EAS进行聚酰胺柱层析，获得11个组分，分别命名为C1-A—C1-K。利用细胞模型对11个组分在浓度为0.6mg/mL的条件下，进行降血糖活性检测。并加1.2mg/mL的R-EAS组分作对照。结果见图3。

图3显示各柱层析组分对脂肪细胞培养液中葡萄糖含量的影响。R-EAS组分为萃取物，成分比柱层析后的组分复杂，非活性物质种类丰富且含量高，此外，由于其活性表现为剂量依赖关系，所以设计R-EAS对照时，其浓度比萃取物高一倍。在11个柱层析组分中，对比对照组，C1-C、C1-D、C1-E表现出非常强的降血糖活性，能显著降低细胞液中葡萄糖含量，培养液中葡萄糖含量以三者最低。从培养液中葡萄糖含量整体观察分析，11个组分对其影响呈抛物线状，其中以C1-C、C1-D、C1-E为抛物线的谷底，两边递增。在柱层析过程中，洗脱液是按照溶液极性变化进行梯度洗脱。因此可初步判断，经过柱层析纯化后，活性成分的降血糖活性同样表现为极性依赖关系。

另外在最强降糖组分C1-C、C1-D、C1-E中，以C1-D的收率高，而C1-C、C1-E得率较少，液相色谱检测分析，三个最强降糖组分所含化学成分几乎完全一致，故合并成一个组分进行后续分离分析。

5.“C1-D”的反相液相色谱分析

将“C1-D”溶于甲醇中，过0.22μm微孔滤膜，取5μL注入液相色谱，17％乙腈1mL/min等梯度洗脱，257nm检测分析，色谱如下图4显示。

由图4显示，降糖最佳组分“C1-D”中共含有5种单体化合物，并采用了制备液相色谱分析分得了全部5种单体化合物，峰1-峰5分别为金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷、番石榴苷、广寄生苷。同时，面积归一化法显示，5种单体含量总含量达90％，番石榴苷含量为28％、广寄生苷含量33％，番石榴苷和广寄生苷含量之和达63％。

6.制备液相分离纯化与结构鉴定

采用制备液相分离纯化C1-D中含有的单体化学成分。色谱条件：流动相为32％甲醇-水***，制备色谱柱为岛津Shim-pack ODS型C18柱(250mm×20mm，5μm)，检测波长257，柱温为室温，流速为12mL/min。对分离得到的单体采用核磁共振方法进行结构鉴定。

6.1峰1—金丝桃苷

峰1为黄色粉末，盐酸-镁粉反应显红色，示其可能为一黄酮类化合物。分析测定其波谱数据如下：

¹H NMR(CD₃OD，6in ppm，J in Hz)：6.21(1H，d，J=1.8，H-6)，6.40(1H，d，J=1.8，H-8)，7.83(1H，d，J=2.4，H-2′)，6.87(1H，d，J=8.4，H-5′)，7.58(1H，dd，J=2.4，8.4，H-6′)，5.15(1H，d，J=7.8，H-1″)，3.85(1H，d，J=2.4，H-4").

¹³C NMR(CD₃OD，6in ppm)：158.9(C-2)，135.9(C-3)，179.6(C-4)，105.7(C-4a)，163.0(C-5)，99.9(C-6)，166.0(C-7)，94.8(C-8)，158.5(C-8a)，122.9(C-1′)，117.9(C-2′)，145.9(C-3′)，149.9(C-4′)，116.1(C-5′)，123.0(C-6′)，105.5(C-1″).73.2(C-2")，75.1(C-3″)，70.0(C-4″)，77.2(C-5″)，62.0(C-6").

以上波谱数据证明峰1为槲皮素3-O-β-D-半乳糖苷，即金丝桃苷，结构式如下所示。

6.2峰2—异槲皮苷

峰2为黄色粉末，盐酸-镁粉反应显红色，示其可能为一黄酮类化合物。分析测定其波谱数据如下：

¹H NMR(CD₃OD，6in ppm，J in Hz)：6.20(1H，s，H-6)，6.39(1H，s，H-8)，7.71(1H，s，H-2′)，6.88(1H，d，J=7.8，H-5′)，7.58(1H，d，J=7.8，H-6′)，5.23(1H，d，J=7.2，H-1″).

¹³C NMR(CD₃OD，6in ppm)：159.1(C-2)，135.7(C-3)，179.5(C-4)，105.7(C-4a)，163.0(C-5)，99.9(C-6)，166.0(C-7)，94.8(C-8)，158.5(C-8a)，122.1(C-1′)，117.6(C-2′)，145.9(C-3′)，149.9(C-4′)，116.1(C-5′)，123.2(C-6′)，104.4(C-1″)，75.8(C-2")，78.4(C-3″)，71.3(C-4")，78.3(C-5″)，62.6(C-6").

以上波谱数据证明峰2为槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷，即异槲皮苷，结构式如下所示。

6.3峰3—槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷

峰3为黄色粉末，盐酸-镁粉反应显红色，示其可能为一黄酮类化合物。分析测定其波谱数据如下：

¹H NMR(CD₃OD，6in ppm，J in Hz)：6.23(1H，d，J=1.8，H-6)，6.42(1H，d，J=1.8，H-8)，7.61(1H，d，J=1.8，H-2′)，6.88(1H，d，J＝8.4，H-5′)，7.58(1H，dd，J=1.8，8.4，H-6′)，5.16(1H，d，J=7.2，H-1″).

¹³C NMR(CD₃OD，6in ppm)：159.1(C-2)，135.4(C-3)，179.4(C-4)，105.7(C-4a)，162.9(C-5)，100.0(C-6)，166.0(C-7)，94.9(C-8)，158.5(C-8a)，123.0(C-1′)，117.3(C-2′)，146.0(C-3′)，149.8(C-4′)，116.2(C-5′)，123.4(C-6′)，104.5(C-1″)，75.2(C-2")，77.4(C-3″)，71.0(C-4″)，67.1(C-5″).

以上波谱数据证明峰3槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷，结构式如下所示。

6.4峰4—番石榴苷

峰4为黄色结晶，盐酸-镁粉反应显红色，示其可能为一黄酮类化合物。分析测定其波谱数据如下：

¹H NMR(DMSO-d6，6in ppm，J in Hz)：12.6(5-OH)，6.20(1H，d，J=1.8，H-6)，6.40(1H，d，J=1.8，H-8)，7.50(1H，d，J=2.4，H-2′)，6.83(1H，d，J=8.4，H-5′)，7.65(1H，dd，J=2.4，8.4，H-6′)，5.27(1H，d，J=4.8，H-1″).

¹³C NMR(DMSO-d6，6in ppm)：156.3(C-2)，133.8(C-3)，177.5(C-4)，103.9(C-4a)，161.2(C-5)，98.7(C-6)，164.2(C-7)，93.5(C-8)，156.3(C-8a)，120.9(C-1′)，115.8(C-2′)，144.9(C-3′)，148.6(C-4′)，115.4(C-5′)，122.0(C-6′)，101.4(C-1″)，70.7(C-2")，71.7(C-3″)，66.0(C-4″)，64.3(C-5").

以上波谱数据证明峰4为槲皮素3-O-α-L***吡喃糖苷，即番石榴苷，结构式如下所示。

6.5峰5—广寄生苷

峰5为黄色结晶，盐酸-镁粉反应显红色，示其可能为一黄酮类化合物。分析测定其波谱数据如下：

¹H NMR(DMSO-d6，6in ppm，J in Hz)：12.6(5-OH)，6.20(1H，d，J=1.8，H-6)，6.41(1H，d，J=1.8，H-8)，7.47(1H，d，J=2.4，H-2′)，6.84(1H，d，J=9.0，H-5′)，7.55(1H，dd，J=2.4，9.0，H-6′)，5.58(1H，d，J=1.2，H-1″).

¹³C NMR(DMSO-d6，6in ppm)：156.9(C-2)，133.3(C-3)，177.6(C-4)，103.9(C-4a)，161.1(C-5)，98.6(C-6)，164.1(C-7)，93.5(C-8)，156.2(C-8a)，120.9(C-1′)，115.5(C-2′)，145.0(C-3′)，148.4(C-4′)，115.5(C-5′)，121.6(C-6′)，107.8(C-1″)，82.0(C-2")，76.9(C-3″)，85.8(C-4″)，60.6(C-5″).

以上波谱数据证明峰5为槲皮素3-O-α-L***呋喃糖苷，即广寄生苷，结构式如下所示。

7.单体降糖活性

在无菌环境下，将5种单体溶于含DMSO的Hanks缓冲液(DMSO终浓度为0.1％)，过0.22μm微孔滤膜，配置成终浓度为40μmol/L的各单体样品溶液，按照细胞模型进行单体降糖活性分析，结果如下表1所示

表1.番石榴叶5种单体对脂肪细胞葡萄糖摄取量的影响

以对照组葡萄糖摄取量的基准值为0，表1为5种单体均在40μmol/L时脂肪细胞摄取葡萄糖的数值，结果显示化合物以番石榴叶中主要有效成分番石榴苷、广寄生苷促糖吸收能力最强，分别为1.23±0.059mmol/L、1.86±0.194mmol/L，而金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷降糖能力较弱，这体现在这5种单体化合物中，化合物极性较小些，其降糖能力则更强些。

8.降糖活性组分对四氧嘧啶至小鼠高血糖水平的影响

取雄性小鼠60只，体重25±2克左右，取10只正常对照，其余50只禁食24h后，尾静脉注射50mg/kg四氧嘧啶混悬液造模，5天后禁食5h测定血糖值10-25mmol/L表示造模成功，随机分为五组，分别灌胃大、中、小剂量本发明番石榴叶降糖活性组分(400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg)生理盐水混悬液，二甲双胍混悬液170mg/kg，模型组和正常对照组灌服等体积的生理盐水溶液。连续给药4周，禁食5h后，小鼠眼眶静脉去血，分离血清，葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度，具体结果如下表2

表2.本发明番石榴降糖活性组分对四氧嘧啶致小鼠高血糖水平的影响

#与模型组比较P<0.05，*与模型组比较P<0.01

由上表2可知，与正常对照组比较，四氧嘧啶造模组血糖显著升高(P<0.01)，阳性降糖药物二甲双胍能够显著下降血糖值，与模型组比较P<0.01。本发明所获得番石榴降糖活性组分对四氧嘧啶致小鼠高血糖有显著下调作用，与模型组比较有显著意义，且体现量效关系，即所给药剂量越大，降糖效果越明显。

9.总结

通过建立葡萄糖消耗脂肪细胞模型，在活性指导下进行分离纯化，确定了番石榴叶中具有最优降糖效果的活性组分，通过液相色谱分析和制备液相色谱纯化及波谱分析确定了降糖活性组分中5种单体分别为金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷、番石榴苷、广寄生苷；且这5种单体降糖活性以极性较低的广寄生苷、番石榴苷活性最强。并将该降糖活性物进行整体降糖动物实验，结果显示本发明产品能够显著降低四氧嘧啶诱导的高血糖。

Claims

1.一种番石榴叶降糖活性组分，其特征在于，由包括以下步骤的方法制备而成：

(1)将番石榴叶原料、粉碎、8-10倍体积50％乙醇回流提取2次，提取液60℃以下减压浓缩得乙醇提取物；

2.根据权利要求1所述的番石榴叶降糖活性组分，其特征在于，含有金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷、番石榴苷、广寄生苷，上述五种单体含量之和50％～95％，番石榴苷和广寄生苷含量之和25％～75％。

3.一种如权利要求1所述的番石榴叶降糖活性组分的制备方法，其特征在于，

由包括以下步骤的方法制备而成：

4.根据权利要求2所述的番石榴叶降糖活性组分的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，聚酰胺层析柱层析时，萃取物和吸附剂重量比为1：10-1：30。乙醇梯度洗脱时，乙醇浓度依次为：0％、10％、30％、50％、70％、95％。

5.如权利要求1所述的番石榴叶降糖活性组分在制备降糖保健品方面的用途。

6.如权利要求1所述的番石榴叶降糖活性组分在制备降糖药品方面的用途。