CN109876021B - 富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法及其降糖用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法及其降糖用途，通过以荷叶离褶伞为研究对象，对荷叶离褶伞提取物进行了提取工艺和生物活性的研究，发现得到的富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物，能够显著促进3T3‑L1细胞葡萄糖摄取活性，增敏胰岛素，抑制胰岛素抵抗，可作为降糖药物用于糖代谢异常相关疾病的防治。

Description

富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法及其降糖 用途

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种真菌提取物，具体地说涉及一种富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法及该提取物作为活性成分用于制备降糖药物中的应用。

背景技术

随社会经济的发展，人们饮食结构和生活方式的改变，糖尿病的发病率日益升高，成为世界上最常见和最严重的代谢性疾病之一，影响着近5亿人。根据不同发病机制，糖尿病分为四种主要形式，即I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他类型糖尿病。其中II型糖尿病是流行主体，其患病人数约占糖尿病患者总数的90-95%，主要发病机制为胰岛素抵抗，伴或不伴不同程度的胰岛功能受损，常常伴发其他代谢紊乱。近年来越来越多儿童和青少年人群患II型糖尿病。根据世界卫生组织（WHO）报道，中国约有1.1亿名糖尿病患者，约占中国成年人总数的1/10。预计到2040年将增至1.5亿人，给民众健康和社会经济带来严重影响。因此，迫切需要全社会预防和控制糖尿病及其并发症。

从天然产物中寻找安全、低毒、高效的糖代谢调控物质是当前研究热点。荷叶离褶伞[ Lyophyllum decastes (Fr. : Fr.) Sing.]，隶属为伞菌目（Agaricales），离褶伞科（Lyophyllaceae），离褶伞属（ Lyophyllum ），有荷叶蘑、鹿茸菇、路基蘑、铁道蘑、粟窝、冻菌冷香菌、一窝羊等别称，是一种十分珍贵的野生食药兼用菌。大量的研究证明菌物的子实体、菌丝体多糖具有降脂降糖、抗氧化、抗癌的生物活性。而对其活性小分子物质研究较少。

发明内容

本发明以荷叶离褶伞为研究对象，提供了一种富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法，将得到的活性小分子作为活性成分应用于降糖用途。

本发明采用的技术方案如下：

首先，本发明提供了一种富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1).以荷叶离褶伞子实体为原料，粉碎后按一定比例加入有机溶剂A或B中浸泡2-10小时；

步骤2).然后在10-100℃内进行提取，过滤收集提取液；

步骤3).对提取液进行减压浓缩，获取荷叶离褶伞提取物；

步骤4).用有机溶剂C对荷叶离褶伞提取物进行超声溶解，并将所得溶解液滴加到装有大孔树脂的柱床中进行静止吸附至少2小时，用水和不同浓度的有机溶剂对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离；

步骤5).收集洗脱液，浓缩获得富含聚炔类化合物提取物。

本发明所述步骤1)中，有机溶剂A，为C1-4低级醇(如：甲醇、乙醇、丁醇等)或C1-4低级醇的水溶液，优选30-80(v/v)乙醇的水溶液。

有机溶剂B，为100%v/v乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或任意2-3种的混合物，优选100%乙酸乙酯。

优选的，所述荷叶离褶伞子实体与所述溶剂的质液比为1:2.5～8（w/v）。

本发明所述步骤2)中，提取选用热水回流提取、冷水提取、超声波处理或常规提取中的任意一种，每次提取2-3小时。

所述步骤3）中减压浓缩时，提取液浓缩温度为35～55℃。

所述步骤4）中，所述有机溶剂C，为100%v/v的乙酸乙酯、70%～100%v/v的甲醇、70%～95%v/v的乙醇、100%v/v的丙酮或100%v/v的二氯甲烷中的任意一种。

所述步骤4）中，大孔树脂可以是极性、中等极性、弱极性或非极性大孔树脂。

所述步骤4）中，用水和浓度分别为40%v/v、75%v/v、100%v/v的甲醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，每一浓度洗脱3-5个保留体积；或用水和浓度分别为40%v/v、75%v/v、95%v/v的乙醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，每一浓度洗脱3-5个保留体积；或用水和浓度分别为35%v/v、70%v/v、95%v/v的丙酮溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，每一浓度洗脱3-5个保留体积。

本发明还提供了一种通过上述方法制备的提取物作为活性成分应用于制备降糖药物组合物中。

产品中含有对治疗和预防糖尿病有效量的富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物。基于组合物的总重量，用于治疗和预防炎性、过敏性或肿瘤疾病的组合物可以包含按重量计0.1至99％、优选0.1至50％。

所述药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的辅料，辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、缓释剂等。

所述药物组合物可为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、喷剂等剂型。各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备，可通过口服、胃肠内给药、注射、喷射、物理或化学介导等方法给药，或是被其他物质混合或包裹后给药。

本发明的有益效果在于：

1.本发明以荷叶离褶伞为研究对象，对荷叶离褶伞提取物进行了提取工艺和生物活性的研究，发现了活性小分子-富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物，其能够显著促进3T3-L1细胞葡萄糖摄取活性，增敏胰岛素，抑制胰岛素抵抗，可用于降糖药物。

2.本发明的富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物还可用于糖代谢异常相关疾病的防治。

3.本发明通过研究发现，荷叶离褶伞可采用任何常规的溶剂，包括超声波提取，提取方法简单高效，提取物中含有较大量的聚炔类化合物，并经验证具有显著的抗氧化作用，因此，富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物具有广阔的药用应用前景。

附图说明

图1为本发明不同溶剂制备富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的高效液相色谱分析结果图；

图中：紫外检测波长为220纳米；其中，保留时间在15.2分钟的吸收峰（图中峰a）为化合物4；保留时间在21.9分钟的吸收峰（图中峰b）为化合物1；保留时间在22.2分钟的吸收峰（图中峰c）为化合物2；保留时间在26.8分钟的吸收峰（图中峰d）为化合物3；图中不同样品的同一物质保留时间误差均在可接受范围内；

图2为图1的化合物1-4的化学结构式；

图3.为富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物促进3T3-L1细胞葡萄糖摄取图；

图4.为富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物增敏胰岛素作用图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明的试剂：

荷叶离褶伞子实体采集自甘肃焉支山自然保护区，经鉴定为 Lyophyllumdecastes 。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1 一种富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法：

将荷叶离褶伞子实体粉碎，称重500克。用3L（6倍量）体积百分含量4：1的乙醇/水浸泡3小时，回流提取3次，每次2小时。合并提取液，在40℃下减压浓缩干燥得到13.6克荷叶离褶伞提取物。将荷叶离褶伞提取物用100%甲醇加热超声溶解，以5mL/min速度将样品溶液滴加在D101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用水、40%乙醇、75%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集75%乙醇、95%乙醇洗脱液浓缩后，合并得到富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe为3.8g，计算收率为0.76%。

实施例2 富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的指纹图谱检测实验：

高效液相化学指纹图谱分析条件如下：使用Waters 2998高效液相色谱仪，四元梯度泵，DAD检测器，Waters色谱工作站。色谱柱 YMC C8分析柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相为乙腈-体积百分含量0.01%的三氟乙酸的水溶液，温度室温（20~30℃）的条件下进行梯度洗脱（洗脱程序以及各成分的体积百分含量如下所示），流速 1.00 mL/min。将粗提物LPe用乙腈溶解，配成10mg/mL的溶液，进样量10μL，紫外检测波长为210nm。

表1.梯度洗脱步骤：

按照上述洗脱条件得到提取物LPe的HPLC图谱如图1所示。

实施例3 富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法：

将荷叶离褶伞子实体粉碎，称重500克。用3L（6倍量）体积百分含量4：1的甲醇/水浸泡3小时，回流提取3次，每次2小时。合并提取液，在40℃下减压浓缩干燥得到12.1克荷叶离褶伞提取物。将荷叶离褶伞提取物用100%甲醇加热超声溶解，以5mL/min速度将样品溶液滴加在D101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用40%、75%、100%v/v的甲醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集75%乙醇、100%乙醇洗脱液浓缩后，合并得到富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe为3.2g，计算收率为0.64%。

实施例4 富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法：

将荷叶离褶伞子实体粉碎，称重500克。用3L（6倍量）的100%二氯甲烷浸泡3小时，回流提取3次，每次2小时。合并提取液，在40℃下减压浓缩干燥得到11.9克荷叶离褶伞提取物。将荷叶离褶伞提取物用100%甲醇加热超声溶解，以5mL/min速度将样品溶液滴加在D101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用40%、75%、100%v/v的甲醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集75%乙醇、100%乙醇洗脱液浓缩后，合并得到富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe为2.6g，计算收率为0.52%。

实施例5 富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法：

将荷叶离褶伞子实体粉碎，称重500克。用3L（6倍量）的100%丙酮浸泡3小时，回流提取3次，每次2小时。合并提取液，在40℃下减压浓缩干燥得到11.9克荷叶离褶伞提取物。将荷叶离褶伞提取物用100%甲醇加热超声溶解，以5mL/min速度将样品溶液滴加在D101大孔树脂上，静止吸附2小时，依次用水、35%、70%v、95%v/v的丙酮进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集70%、95%丙酮洗脱液浓缩后，合并得到富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe为2.9g，计算收率为0.58%。

实施例6 富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物促进3T3-L1细胞葡萄糖摄取活性试验：

材料：被测样品溶液为实施例1和3～5所述的富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe。

3T3-L1细胞用含10%小牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基，CO 2 培养箱中培养传代，经CCK8法确定化合物1-4没有细胞毒性。

以每孔10000个细胞密度接种3T3-L1细胞到96孔板，37℃、含5%的CO 2 及饱和湿度培养箱中贴壁生长，待3T3-L1细胞基本长满后可进行诱导分化，首先用10%小牛血清的DMEM高糖培养液含10μM***、0.5mM IBMX及1.0μg/mL胰岛素诱导分化48h后，改用10%胎牛血清的DMEM高糖培养液含1.0μg/mL胰岛素作为培养液进行培养，诱导分化，连续分化10d后3T3-L1细胞镜下可见大量脂肪颗粒，脂肪颗粒占90%以上即为分化完成，再用于葡萄糖摄取使用。

NBDG法测定3T3-L1分化好的脂肪细胞。用KRPH缓冲液清洗分化好的3T3-L1细胞，并将细胞在KRPH缓冲液中饥饿1h，接下来用不同浓度的提取物LPe处理24h后，更换培养液，使用含100μM 2-NBDG DMEM培养液培养30min，弃上清，PBS清洗2次，立即于荧光酶标仪466nm和540nm波长处检测。通过比较荧光强度与空白组的相对比来评价富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe对3T3-L1细胞萄葡糖摄取活性的影响。胰岛素作为对照。

经试验证明，50μg/ml时，富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe对葡萄糖的摄取是空白组的1.3倍，如图3所示，说明该组合物对葡萄糖摄取有一定的促进作用。

实施例7 富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物增敏胰岛素，抑制胰岛素抵抗实验：

如实施例6所述分化好的3T3-L1脂肪细胞，用KRPH缓冲液清洗分化好的3T3-L1细胞，并将细胞在KRPH缓冲液中饥饿1h，接下来用含100nM胰岛素及不同浓度的提取物LPe处理24h，更换培养液，使用含100μM 2-NBDG DMEM培养液培养30min，弃上清，PBS清洗2次，立即于荧光酶标仪466nm和540nm波长处检测。通过比较荧光强度与空白组的相对比来评价富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的改善作用。

经试验证明，富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe（50μg/ml）则可以增敏胰岛素，进一步增加葡萄糖的摄取，是单纯使用胰岛素的1.17倍，如图4所示，可以改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗状态，增加脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用的能力，从体外细胞水平上可以说明富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物LPe具有改善胰岛素抵抗的作用。

需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，对本发明进行各种修改和替换，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法，其特征在于：包

括以下步骤：

步骤1).以荷叶离褶伞子实体为原料，粉碎后按一定比例加入有机溶剂A或B中浸泡2-10小时；有机溶剂A，为C1-4低级醇或C1-4低级醇的水溶液；所述荷叶离褶伞子实体与所述溶剂的质液比为1:2.5～8（w/v）；有机溶剂B，为100%v/v乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或任意2-3种的混合物；

步骤2).然后在10-100℃内进行提取，过滤收集提取液；

步骤3).对提取液进行减压浓缩，获取荷叶离褶伞提取物；

步骤4).用有机溶剂C对荷叶离褶伞提取物进行超声溶解，并将所得溶解液滴加到装有大孔树脂的柱床中进行静止吸附至少2小时，用水和不同浓度的有机溶剂对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离；所述有机溶剂C，为100%v/v的乙酸乙酯、70%～100%v/v的甲醇、70%～95%v/v的乙醇、100%v/v的丙酮或100%v/v的二氯甲烷中的任意一种；

步骤5).收集洗脱液，浓缩获得富含聚炔类化合物提取物；所述聚炔类化合物为：

。

2.根据权利要求1所述的富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法，其特征在于：步骤1)中，有机溶剂A为30-80(v/v)乙醇的水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法，其特征在于：步骤3）中减压浓缩时，提取液浓缩温度为35～55℃。

4.根据权利要求3所述的富含聚炔类化合物的荷叶离褶伞提取物的制备方法，其特征在于：步骤4）中，用水和浓度分别为40%v/v、75%v/v、100%v/v的甲醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，每一浓度洗脱3-5个保留体积；

或用水和浓度分别为40%v/v、75%v/v、95%v/v的乙醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，每一浓度洗脱3-5个保留体积；

或用水和浓度分别为35%v/v、70%v/v、95%v/v的丙酮溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，每一浓度洗脱3-5个保留体积。

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