CN107365336A - 一种从番石榴叶中提取的新化合物、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从番石榴叶中分离出的新化合物,化学名称为:3,5‑二羟基‑2,4‑二甲基‑1‑O‑(6′‑O‑没食子酰基l‑β‑D‑葡萄吡喃基)‑ 二苯甲酮,结构式为:该化合物由番石榴叶经过提取、萃取、硅胶柱层析、中压柱层析、薄层层析和结晶分离所得,经细胞活性实验证明,该化合物具有降血糖和抗肿瘤的作用。
Description
技术领域
本发明涉及食品、生物医药领域,特别涉及一种从番石榴叶中分离出的新化合物及制备方法和用途。
背景技术
番石榴(Psidium guajava Linn.)俗称拔子、鸡矢果、芭乐、红心果、喇叭果等,是桃金娘科(Myrtaceae)番石榴属植物,原产于美洲,广泛分布于美洲、亚洲等的热带和亚热带地区,在我国南方各省区如广东、广西等地区有较大的种植面积。番石榴叶含黄酮类、多酚类、三萜类、杂源萜类、挥发油和多糖等功能活性成分,这些化学成分赋予了番石榴叶广泛的生物活性。大量研究表明番石榴叶提取物除了具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗腹泻、降血糖和降血压等多种药理活性。在秘鲁、墨西哥、加勒比、非洲和亚洲等国家有着很长的药用历史。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从番石榴叶中分离出的新化合物及制备方法和用途,且该化合物具有降血糖和抗肿瘤的用途,可有效用于制备降血糖、抗肿瘤功能食品或药物。
本发明提供的一种从番石榴叶中分离出的新化合物,新化合物的化学名为:3, 5-二羟基-2, 4-二甲基-1-O-(6′-O-没食子酰基l-β-D-葡萄吡喃基)- 二苯甲酮,化学结构式为:
本发明提供的从番石榴叶中分离出的新化合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)提取:将番石榴叶原料粉碎,用5-10倍体积30-90%低碳醇提取2-3次,每次1-2 h,合并提取液,真空浓缩回收溶剂,得提取物浸膏;
(2)萃取:将提取物浸膏加水溶解,用乙酸乙酯充分萃取,合并乙酸乙酯萃取液,真空浓缩得乙酸乙酯萃取物;
(3)硅胶柱层析富集:乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析分离,洗脱剂选用石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱,经薄层层析检测,显色,合并相同组分。
(4)中压柱层析富集:将上述洗脱液进行中压硅胶柱层析分离纯化,用乙腈和水进行梯度洗脱,经薄层层析检测,显色,合并相同组分,经甲醇重结晶得新化合物。
步骤(1)中,所述低碳醇为甲醇或乙醇。
步骤(3)中,硅胶柱层析分离,硅胶可选100-300目硅胶。用石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱时,洗脱的流速为1/2-1/5 BV/h,石油醚和乙酸乙酯的体积配比依次为1:0、1:1、1:2、1:3、1:4,经薄层层析检测,显色,合并相同组分1:2、1:3、1:4,其中组分1:3新化合物的含量最高。
步骤(4)中,用乙腈和水进行梯度洗脱时,洗脱的流速为10-30 mL/min,乙腈和水的体积配比依次为10:90、20:80、30:70、40:60, 经薄层层析检测,显色,取乙腈和水的体积配比为40:60的洗脱液进行甲醇重结晶。
上述方法制备的新化合物可作为降血糖及抗肿瘤保健食品或功能食品添加物。亦可用于制备降血糖及抗肿瘤药物。
本发明提供的新化合物,其本身植物来源无毒,在体外细胞实验中对正常细胞无毒性,同时体外细胞实验表明其具有确切的降血糖和抗肿瘤活性。本发明可有效用于降血糖、抗肿瘤功能食品或药物的大量生产制备,为糖尿病和肿瘤患者的健康提供保障。
附图说明
图1是本发明新化合物HMBC(氢检测的碳氢多键相关)相关图。
图2是本发明新化合物对结肠癌HCT116细胞生长抑制作用试验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明的具体实施方式进行详细说明:
实施例1:
称取粉碎的番石榴叶粉末3.0 kg,加入10倍体积的 70%乙醇提取3次,每次2小时,提取液真空浓缩得提取物浸膏;提取物浸膏分散于水中,用乙酸乙酯萃取3次,合并浓缩萃取液得乙酸乙酯萃取物100 g,萃取物过200目硅胶柱,石油醚和乙酸乙酯的体积配比依次为1:0、1:1、1:2、1:3、1:4,每个比例5 BV,洗脱的流速为1/2 BV/h,薄层层析检测,合并相同组分1:2、1:3、1:4,再经中压柱层析,乙腈-水梯度洗脱10:90、20:80、30:70、40:60,经薄层层析检测,组分40:60该新化合物含量最高,经甲醇重结晶得到该化合物40.3 mg.
实施例2:
本发明所提供的新化合物结构鉴定:
化合物为一黄色无定形粉末,三氯化铁反应阳性。
ESI-MS中出现595 (M+Na)的准分子离子峰,故推测其分子量为572道尔顿。氢谱中显示2个甲基 (δH 2.08, 2.14 (每个 3H, s) ); 一个典型的没食子酰基(δH 7.13 (2H,s))。δH 7.2-7.6 (5H, m)归属为单取代苯甲酰基苯环质子,而端基质子δH 4.18 (1H, d,J=7.8Hz)证明还有一个糖分子。碳谱中共含有23个碳,其中7个没食子酰基碳信号峰(δC110.40×2, 121.55, 139.83, 146.50×2, 168.38); 六个葡萄糖碳信号峰(δC 105.26,74.85, 77.42, 70.5, 75.18, 64.41);两个甲基碳信号峰(δC 9.22, 8.41),七个苯甲酰碳信号峰(δC 201.63, 143.20, 131.93, 130.55×2, 128.28×2)和具有间苯三酚全取代模式的苯碳信号峰(δC 160.95, 158.99, 153.40, 112.98, 111.15, 109.98). 氢谱和碳谱数据是通过仔细分析其HMBC, HSQC数据归属,仔细比较该新化合物和已知化合物guavinoside E,可以很清楚的得出,该新化合物是已知化合物guavinoside E的没食子酰基取代产物。在HMBC谱图1中可见,葡萄糖六位氢质子与没食子酰基羰基碳远程相关,因此可以确定没食子酰基取代在葡萄糖的六位,综上确定化合物为3, 5-二羟基-2, 4-二甲基-1-O-(6′-O-没食子酰基l-β-D-葡萄吡喃基)-二苯甲酮。
实施例3:
本发明中提供的新化合物降血糖和抗肿瘤活性测定
1.新化合物降血糖活性测定
雄性SD大鼠断颈处死,无菌开腹,取附睾外层白色脂肪组织,剔除附带血管,剪碎至约1mm3大小,加 Ⅰ 型胶原酶消化1 h,收集上层脂肪细胞,加入适量Hanks缓冲液洗涤细胞三次即得原代脂肪细胞。96孔板中建立200 μL反应体系:浓度为2×106 cell/mL细胞悬液100 μL+30 μL 6 mg/mL葡萄糖+30 μL胎牛血清+40 μL样品溶液(包括各萃取物或各柱层析洗脱组分),以饱和湿度、37℃、5%CO2培养反应30 min,每孔再加入1 μL 2 mmol/L肾上腺素溶液,再以同样条件培养3 h,冰浴终止反应。采用微量葡萄糖氧化酶法显色,酶标仪上读数,测定并计算各孔葡萄糖浓度,并和对照组比较计算各组葡萄糖的消耗浓度,由此评价各萃取物或各柱层析组分的摄取葡萄糖能力,具体计算公式如下:
葡萄糖摄取能力=C空白-C化合物(mmol/L),其中,C空白为对照组葡萄糖的浓度,C化合物为样品经过3小时培养后残留培养基中的葡萄糖浓度。
在无菌环境下,将新化合物溶于含DMSO的Hanks缓冲液(DMSO终浓度为0.1%),过0.22 μm微孔滤膜,配置成终浓度为20、40、60、80、100 μM的单体样品溶液,进行单体降糖活性分析,并以0.1%DMSO为空白对照组,结果如下表1所示。
表1. 本发明新化合物对脂肪细胞葡萄糖摄取量的影响(X±SD,n=6)
化合物浓度(μM) | 葡萄糖摄取量(mM) |
20 | 1.34±0.05 |
40 | 2.08±0.02 |
60 | 2.51±0.04 |
80 | 2.99±0.03 |
100 | 3.48±0.01 |
以对照组葡萄糖摄取量的基准值为0,表1为单体在不同浓度促葡萄糖摄取吸收的数值,其结果表明,本发明新化合物能够促进葡萄糖的摄取利用,且表现为剂量依赖关系,在20-100 μmol/L用量范围内,化合物的浓度越高,降糖效果越明显。
2.新化合物抗肿瘤活性测定
将结肠癌HCT116细胞培养于含10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI 1640培养液中,37 ℃,5%CO2培养箱内常规传代培养。细胞以2000 个/孔的浓度接种于96孔培养板,于含10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养72 h,细胞贴壁后,实验组给药量为20 μM、40 μM、60 μM、80 μM、100 μM,阴性对照组加等量RPMI 1640 (DMSO含量为0.1%),空白对照组只加等量RPMI 1640。药物作用24 h后, 弃上清,于每孔中加入配制的0.5 mg/mL MTT 100 μL继续培养4 h,弃上清,加入100 μL DMSO,在混合振荡仪上振药约10 min,使结晶物充分溶解后,于酶联检测仪上570 nm波长测定各孔吸光值。计算细胞毒性值(CT%) ,CT%=(1-OD处理/OD对照)×100%。
上述新二萜化合物对HCT116结肠癌细胞生长的抑制作用对比试验结果见图2。
结果表明,所得的新化合物在受试五个浓度(20、40、60、80、100 μM)下对HCT116结肠癌细胞具有直接的抑制作用,其抑制作用与活性组分浓度呈正相关,抑制率分别为10.34%、20.02%、38.44%、70.53%、95%。空白对照的0.1%的DMSO对HCT116结肠癌细胞无直接的抑制作用。说明新化合物对HCT116结肠癌细胞有一定的抑制作用。
Claims (8)
1.一种从番石榴叶中分离出的新化合物,化学名为:3, 5-二羟基-2, 4-二甲基-1-O-(6′-O-没食子酰基l-β-D-葡萄吡喃基)- 二苯甲酮,化学结构式为:
。
2.一种从番石榴叶中分离出的新化合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将番石榴叶原料粉碎,用5-10倍体积30-90 %低碳醇提取2-3次,每次1-2 h,合并提取液,真空浓缩回收溶剂,得提取物浸膏;
(2将提取物浸膏加水溶解,用乙酸乙酯充分萃取,合并乙酸乙酯萃取液,真空浓缩得乙酸乙酯萃取物;
(3)乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析分离,洗脱剂选用石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱,经薄层层析检测,显色,合并相同组分;
(4)将上述洗脱液进行中压硅胶柱层析分离纯化,用乙腈和水进行梯度洗脱,经薄层层析检测,显色,合并相同组分,经甲醇重结晶得新化合物。
3.根据权利要求2所述的一种从番石榴叶中分离出的新化合物的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述低碳醇为甲醇或乙醇。
4.根据权利要求2所述的一种从番石榴叶中分离出的新化合物的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,硅胶柱层析分离时,选用100-300目硅胶。
5.根据权利要求2所述的一种从番石榴叶中分离出的新化合物的制备方法,其特征在于,用石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱时,洗脱的流速为1/2-1/5 BV/h,石油醚和乙酸乙酯的体积配比依次为1:0、1:1、1:2、1:3、1:4,经薄层层析检测,显色,合并相同组分1:2、1:3、1:4。
6.根据权利要求2所述的一种从番石榴叶中分离出的新化合物的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,用乙腈和水进行梯度洗脱时,洗脱的流速为10-30 mL/min,乙腈和水的体积配比依次为10:90、20:80、30:70、40:60, 经薄层层析检测,显色,取乙腈和水的体积配比为40:60的洗脱液进行甲醇重结晶。
7.一种如权利要求1所述的从番石榴叶中分离出的新化合物在制备降血糖和抗肿瘤保健食品或功能食品方面的用途。
8.一种如权利要求1所述的从番石榴叶中分离出的新化合物在制备降血糖及抗肿瘤药物方面的用途。
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