CN103525852A - 一种基于自诱导培养和有色底物相结合的高通量筛选重组菌的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于自诱导培养和有色底物相结合的高通量筛选重组菌的方法，属于高通量筛选表达目的基因重组大肠杆菌的技术领域。本发明对该高通量筛选方法的灵敏性、高效性和可靠性进行了验证。设计了一种可视化的高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基，通过该筛选平板，获得稳定表达普鲁兰酶的重组菌株，其在液体LB培养基中能得到11U/mL的胞外重组普鲁兰酶酶活，SDS-PAGE分析发现目的蛋白表达正常。通过菌落PCR和质粒双酶切方法，验证了筛选获得重组菌均含有正确的重组质粒。本发明能够直观准确的从退化菌种中筛选到表达稳定的重组菌株，具有可视化、直观、方便、高效等优点，为保持重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶的稳定性提供了有效策略。

Description

一种基于自诱导培养和有色底物相结合的高通量筛选重组菌的方法

技术领域

一种基于自诱导培养和有色底物相结合的高通量筛选重组菌的方法，属于高通量筛选表达目的基因重组大肠杆菌的技术领域。

背景技术

作为工程菌构建过程中重要的一个环节，如何方便、准确地从转化的平板上挑选目标克隆将直接影响到后续工作的进展顺利与否。当前，在工程菌的构建过程中多是在转化平板上随机挑选克隆通过菌落PCR进行验证，或是将随机挑选的克隆接种到液体培养基中培养过夜后收集菌体提取质粒DNA进行酶切验证。这些筛选方法不仅操作复杂而且还可能因操作而引入杂菌的污染。

另外，工程菌在保存和发酵过程中会出现因质粒丢失等因素引起的菌种退化问题，导致工程菌的生产能力的下降甚至完全丧失。为了解决这样的问题，最直接的方法就是重新构建菌种。当然也有从退化的菌种中筛选生产能力较强克隆的方法，如双克隆筛选法。重新构建菌种过程复杂、周期较长，而且会使用大量价格昂贵的工具酶，成本较高。相比之下，从退化的菌种中挑选目标克隆就显得较为经济。但是，常规的筛选方法，如双克隆筛选需要至少两轮的平板划线（或涂布）、随机挑选、诱导生产和SDS-PAGE检测（或目标产物的测定），程序复杂也较为耗时。

自诱导培养是Studier等根据微生物对碳源利用的优先次序而提出的一种利用培养基中碳源转换而诱导外源基因表达的方法。与IPTG诱导方法相比，该方法具有操作简单，不需要添加额外诱导物的优点。由于用乳糖替代了价格昂贵的IPTG，使得该培养方法成本较低。而且还减少了因IPTG使用而引起的对细胞的毒害作用。使用该方法可以使细胞表达一些对细胞有毒害作用的产物。因此，该方法自提出之后就被研究人员广泛关注。

特定物质是指一类用活性颜料如Remazol亮蓝、Mikacion亮红、活性黄、荧光颜料等标记物质或不同环境下有不同形态的物质。当目标产物与特定物质作用之后，可引起特定物质颜色或形态的改变，从而很方便与其他物质区分开来。利用这种作用的灵敏性，特定物质被广泛应用于产多糖降解酶、蛋白酶降解酶脂肪酶等的微生物的筛选中。但是，在工程菌的构建过程中却很少见到类似的报道。

本发明针对工程菌构建过程中目标克隆的筛选问题，通过自诱导与特殊物质相结合的方法，建立了一种高效、快速、灵敏的高通量筛选方法。

发明内容

（1）要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种高通量筛选表达目的基因重组大肠杆菌的方法。本发明目的不仅仅在于通过一株表达普鲁兰酶重组大肠杆菌的构建以及从退化的菌种中筛选高产普鲁兰酶的重组菌株，对本方法的高效和可靠性进行说明，而且还为工程菌构建过程中准确挑选目的重组菌，提供了一种高效、快速、灵敏的高通量筛选方法。 

（2）技术方案

一种基于自诱导培养和有色底物相结合的高通量筛选重组菌的方法，以表达普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建为例所述的高通量筛选重组菌的方法进行说明。在此基础上，将本发明提供的方法应用到解决菌株保存与发酵过程中出现的菌株退化问题，并同时与现有的筛选方法进行对比。结果表明，本发明提供的高通量筛选方法可以准确地从退化的菌株中筛选出稳定的目的基因表达菌株，比现有方法如双克隆筛选等，更加直观、准确和高效。

一、表达普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建：

（1）普鲁兰酶基因的获得

出发菌株为黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108，

培养基以g/L计：可溶性淀粉 10，蛋白胨15，酵母膏5，KH₂PO₄ 5，MgSO₄·7H₂O 0.1，NH₄Cl 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.1，pH 6.5，双蒸水配制；

将CCTCC NO：M 2012108菌种接种于培养基，装液量为体积计10%的250 mL摇瓶中，于37℃、200 rpm振荡培养72 h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System（VIOGENE公司）提取基因组。

引物1：5'- CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3'，

引物2：5'- CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3' 。引物1含有NheI 限制性酶切位点，引物2含有EcoRI 限制性酶切位点。

PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP（25 mmol/L）0.5 μL，引物1（50 pmol/μL）1 μL，引物2（50 pmol/μL） 1 μL，基因组DNA 5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL。

PCR反应过程：94℃ 预变性5 min；98℃ 10 s，55℃ l min，72℃ 4 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。

利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能***生物科技有限公司）纯化DNA片断。

DNA溶液中加入1/10体积的乙酸钠溶液（3 mol/L，pH 5.2）和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1小时。于4℃、12000 rpm离心30 min。加入75%乙醇500 μL洗涤，于4℃、12000 rpm离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20℃保存。

（2）含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建

a、目的基因及质粒pET-28a(+)的酶切

利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒pET-28a(+)。

按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收PCR产物片段或质粒DNA片段，浓缩。

反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，NheI 2 μL，EcoRI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL。

b、目的基因与质粒pET-28a(+)的连接

将普鲁兰酶基因与质粒pET-28a(+)连接，反应体系组成如下：质粒pET-28a(+) 0.8 μL，普鲁兰酶基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL。混合均匀后，将其置于16℃培养箱中连接12 h。

c、重组质粒转化大肠杆菌

在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中，冷却2 min。加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 rpm摇床温育培养1 h。培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养。获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET-28a(+)-pul A。挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃ 200 rpm振荡培养过夜。取500 μL菌液，加入500 μL 30%甘油溶液，混合均匀后，于-70℃中冷冻保存，作为菌种保存冷冻甘油管。

二、从退化菌种中高通量筛选稳定表达普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌，步骤为：

高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基：α-乳糖 10 g /L，葡萄糖0.5 g /L，甘油5 g /L，KH₂PO₄ 13.3 g /L，MgSO₄ 0.59 g/L，蛋白胨10 g /L，(NH₄)₂HPO₄ 4 g/L，柠檬酸1.55 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，琼脂粉18-20 g/L，红色普鲁兰多糖1 g/L，1000×痕量元素溶液 200μL，pH 6.8-7.0，双蒸水配制。

痕量元素溶液： FeCl₃ 3 g/L，CaCl₂·2H₂O 20 g/L，MnCl₂·4H₂O 15 g/L， Zn(CH₃COO)₂·4H₂O 34 g/L，CoCl₂·6H₂O 2.5 g/L，CuCl₂  1.5 g/L，NiCl₂ 2 g/L， Na₂Mo₇O₂₄ 2.1 g/L，Na₂SeO₃ 2 g/L，H₃B₄O₇ 3 g/L，Titriplex III（二水合乙二胺四乙酸二钠盐）14.1 g/L，双蒸水配制。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0，双蒸水配制。需要时使用前加入卡那霉素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

将重组菌冷冻甘油管直接划线或适当稀释后，涂布于高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基，于37℃培养过夜。次日，察看高通量筛选平板，通过平板菌落周围的透明圈的形成情况，从中选择具有较大透明圈的菌落接种于LB液体培养基中，考察其在LB培养基中表达重组普鲁兰酶的情况，并用SDS-PAGE检测普鲁兰酶表达情况。同时，将确定的目标菌株用菌落PCR、质粒双酶切的方法进行进一步验证。

（1）诱导培养

挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度0.5~1 mmol/L，在30~37℃下进行诱导培养12小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。

普鲁兰酶测定方法

取100 μL用100 mM、pH 5.0的醋酸缓冲适当稀释的酶液与等体积的溶于100 mM、pH 5.0醋酸缓冲中的10 g/L 普鲁兰相混合于50℃水浴中保温30min。加入DNS试剂300 μL摇匀，置于沸水中煮沸15min，取出以流动水迅速冷却后，于540 nm波长处，以0.5 cm比色杯，测定反应液的吸光度值。

酶活单位定义：在上述指定的条件下，每分钟催化分解普鲁兰多糖生成相当于1 μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活单位（U）。

（2）重组大肠杆菌的胞内外蛋白的SDS-PAGE分析

重组大肠杆菌经诱导培养后，取0.5 mL诱导培养物，离心去除微生物细胞，得发酵上清。取20 μL发酵上清与5 μL 5×上样缓冲液相混合，然后于沸水浴中煮沸10 min，用于SDS-PAGE分析上清的蛋白情况。菌体沉淀用0.5 mL蒸馏水洗涤两次之后，重悬于0.5 mL蒸馏水中，按同样的方法处理用于SDS-PAGE分析胞外蛋白情况。SDS-PAGE浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为9%，电泳结束后用考马斯亮蓝R-250显色蛋白条带。

（3）阳性克隆的菌落PCR和质粒双酶切方法验证

采用菌落PCR的方法对转化平板上阳性克隆进行确认。具体操作如下：

在冰上混合下列各成分：dH₂O 136 μL，10× PCR Buffer 20 μL，dNTP (2.5 mM) 32 μL，引物1 (20 mM) 4 μL，引物2 (20 mM) 4 μL，TaKaRa LA Taq (5 U/μL) 4 μL。将上述成分混合均匀后，20 μL每管分装于200 μL PCR管中；挑选平板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，置于装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下，盖紧管子；将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中进行PCR扩增，PCR反应过程：94℃ 预变性5 min，98℃ 10 s，55℃ l min，72℃ 4 min，进行30个循环，72℃延伸10 min；电泳检测是否得到目的片断。

为了进一步确定阳性克隆，将所得质粒进行酶切验证。将已确认的阳性克隆接种于含有卡那抗生素的LB液体培养基中于37℃培养过夜后用于提取质粒。质粒的提取方法按照E.Z.N.A. TMPlasmid Mini Kit的操作说明进行。重组质粒pET-28a(+)-pul双酶切反应体系组成：重组质粒pET-28a(+)-pul (50 ng/μL) 10 μL，10×M buffer 2 μL，NheI 1 μL，EcoRI 1 μL，dH₂O 6 μL。按照水、缓冲液、质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于37℃水浴酶切反应2-3 h后，在管中加入4 μL的6×Loading Buffer终止酶切反应。取5 μL的酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

结果表明，通过高通量红色固体平板培养基筛选得到的表达普鲁兰酶重组菌在液体LB培养基中进行产酶实验时均能得到11 U/mL的胞外重组普鲁兰酶酶活，而且将所得到的发酵液用于SDS-PAGE分析蛋白表达情况时，可发现表达正常的目的蛋白条带。此外，通过菌落PCR和质粒双酶切方法，可验证筛选获得重组菌均含有正确的重组质粒。这些结果说明，通过本筛选方法能够直观准确的从退化菌种中筛选到稳定的重组菌株。该方法与已报道的双克隆筛选方法相比，由于稳定表达重组蛋白的菌株菌落清晰可见，使得后续IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析等步骤在实际操作中可以省略（图1、图2）。因此，本发明提出的高通量筛选方法具有可视化、直观、方便、高效等优点。

三、稳定表达目的基因的重组大肠杆菌表达的目标蛋白可与培养基中的有色物质作用产生可视化的变化；

在高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基上生长的重组大肠杆菌能够通过自诱导自动表达目标蛋白普鲁兰酶，该目标蛋白普鲁兰酶能够与添加在培养基中的红色普鲁兰产生可视化的变化；将重组菌冷冻甘油管直接划线或适当稀释后，涂布于高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基上，于37℃培养过夜；次日，在高通量筛选平板上，观察到有些菌落周围形成由红色到无色的透明圈，这些菌落即为稳定表达目的基因的重组大肠杆菌；

四、应用自诱导的方法使工程菌在筛选过程中就表现相应的生产能力，该能力可以通过添加于培养基的有色物质鉴定出来；自诱导不仅指因为特定物质的摄入而导致蛋白的表达或代谢产物的积累，也包括培养条件的改变而导致的目标产物的生成。

（3）有益效果

成功克隆了黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶编码基因，该基因全长3309 bp，编码1102个氨基酸残基，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。利用表达载体pET-28a(+)，成功构建带有目的基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET-28a(+)-pul A。

设计了一种可视化的高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基，通过该筛选平板，获得稳定表达普鲁兰酶的重组菌株，其在液体LB培养基中能得到11 U/mL的胞外重组普鲁兰酶酶活，SDS-PAGE分析发现目的蛋白表达正常。通过菌落PCR和质粒双酶切方法，验证了筛选获得重组菌均含有正确的重组质粒。本发明能够直观准确的从退化菌种中筛选到表达稳定的重组菌株，与已报道的双克隆筛选方法相比，本方法具有可视化、直观、方便、高效等优点。这些工作为保持重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶的稳定性提供了有效策略，对于今后开发重组普鲁兰酶的生产工艺和应用价值具有重要意义。

黑座克雷伯氏菌(Klebsiella varricola) CCTCC M2012108；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简写CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2012108，保藏日期为2012年4月11日。此菌在中国专利ZL 201210187070.3“一种产胞外普鲁兰酶的方法及其专用微生物”中已公开，并已授权，公告号CN 102676437B。

附图说明

图1. 本发明高通量筛选方法与常规传统筛选方法筛选重组菌的比较

图2. 本发明高通量筛选方法与双克隆筛选稳定重组菌方法的比较。

具体实施方式

实施例1

高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基：α-乳糖 10 g /L，葡萄糖0.5 g /L，甘油5 g /L，KH₂PO₄ 13.3 g /L，MgSO₄ 0.59 g/L，蛋白胨10 g /L，(NH₄)₂HPO₄ 4 g/L，柠檬酸1.55 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，琼脂粉18-20 g/L，红色普鲁兰多糖1 g/L，1000×痕量元素溶液 200μL，pH 6.8-7.0，双蒸水配制。

痕量元素溶液： FeCl₃ 3 g/L，CaCl₂·2H₂O 20 g/L，MnCl₂·4H₂O 15 g/L，Zn(CH₃COO)₂·4H₂O 34 g/L，CoCl₂·6H₂O 2.5 g/L，CuCl₂ 1.5 g/L，NiCl₂ 2 g/L， Na₂Mo₇O₂₄ 2.1 g/L，Na₂SeO₃ 2 g/L，H₃B₄O₇ 3 g/L，Titriplex III 14.1 g/L，双蒸水配制。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0，双蒸水配制。需要时使用前加入卡那霉素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

将重组菌冷冻甘油管直接划线或适当稀释后，涂布于高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基，于37℃培养过夜。次日，察看高通量筛选平板，通过平板菌落周围的透明圈的形成情况，从中选择具有较大透明圈的菌落作为阳性克隆。挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度1 mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养12小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。通过高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基，获得稳定表达普鲁兰酶的重组菌株，其在液体LB培养基中能得到11 U/mL的胞外重组普鲁兰酶酶活。

实施例2

高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基：α-乳糖 10 g /L，葡萄糖0.5 g /L，甘油5 g /L，KH₂PO₄ 13.3 g /L，MgSO₄ 0.59 g/L，蛋白胨10 g /L，(NH₄)₂HPO₄ 4 g/L，柠檬酸1.55 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，琼脂粉18-20 g/L，红色普鲁兰多糖1 g/L，1000×痕量元素溶液 200μL，pH 6.8-7.0，双蒸水配制。

痕量元素溶液： FeCl₃ 3 g/L，CaCl₂·2H₂O 20 g/L，MnCl₂·4H₂O 15 g/L， Zn(CH₃COO)₂·4H₂O 34 g/L，CoCl₂·6H₂O 2.5 g/L，CuCl₂ 1.5 g/L，NiCl₂ 2 g/L， Na₂Mo₇O₂₄ 2.1 g/L，Na₂SeO₃ 2 g/L，H₃B₄O ₇ 3 g/L，Titriplex III 14.1 g/L，双蒸水配制。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0，双蒸水配制。需要时使用前加入卡那霉素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

将重组菌冷冻甘油管直接划线或适当稀释后，涂布于高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基，于37℃培养过夜。次日，察看高通量筛选平板，通过平板菌落周围的透明圈的形成情况，从中选择具有较大透明圈的菌落作为阳性克隆。挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度1 mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养12小时。重组大肠杆菌经诱导培养后，取0.5 mL诱导培养物，离心去除微生物细胞，得发酵上清。取20 μL发酵上清与5 μL 5×上样缓冲液相混合，然后于沸水浴中煮沸10 min，用于SDS-PAGE分析上清的蛋白情况。菌体沉淀用0.5 mL蒸馏水洗涤两次之后，重悬于0.5 mL蒸馏水中，按同样的方法处理用于SDS-PAGE分析胞外蛋白情况。SDS-PAGE浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为9%，电泳结束后用考马斯亮蓝R-250显色蛋白条带。通过高通量红色固体平板培养基筛选得到表达普鲁兰酶重组菌，在液体LB培养基中的发酵液用于SDS-PAGE分析蛋白表达情况时，可发现表达正常的目的蛋白条带。

实施例3

高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基：α-乳糖 10 g /L，葡萄糖 0.5 g /L，甘油 5 g /L，KH₂PO₄ 13.3 g /L，MgSO₄ 0.59 g/L，蛋白胨10 g /L，(NH₄)₂HPO₄ 4 g/L，柠檬酸1.55 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，琼脂粉18-20 g/L，红色普鲁兰多糖1 g/L，1000×痕量元素溶液 200μl，pH 6.8-7.0，双蒸水配制。

痕量元素溶液： FeCl₃ 3 g/L，CaCl₂·2H₂O 20 g/L，MnCl₂·4H₂O 15 g/L， Zn(CH₃COO)₂·4H₂O 34 g/L，CoCl₂·6H₂O 2.5 g/L，CuCl ₂ 1.5 g/L，NiCl₂ 2 g/L， Na₂Mo₇O₂₄ 2.1 g/L，Na₂SeO₃ 2 g/L，H₃B₄O₇ 3 g/L，Titriplex III 14.1 g/L，双蒸水配制。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0，双蒸水配制。需要时使用前加入卡那霉素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

将重组菌冷冻甘油管直接划线或适当稀释后，涂布于高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基，于37℃培养过夜。次日，察看高通量筛选平板，通过平板菌落周围的透明圈的形成情况，从中选择具有较大透明圈的菌落作为阳性克隆。

采用菌落PCR的方法对转化平板上阳性克隆进行确认。在冰上混合下列各成分：dH₂O 136 μL，10× PCR Buffer 20 μL，dNTP (2.5 mM) 32 μL，引物1 (20 mM) 4 μL，引物2 (20 mM) 4 μL，TaKaRa LA Taq (5 U/μL) 4 μL。将上述成分混合均匀后，20 μL每管分装于200 μL PCR管中；挑选平板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，置于装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下，盖紧管子；将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中进行PCR扩增，PCR反应过程：94℃ 预变性5 min，98℃ 10 s，55℃ l min，72℃ 4 min，进行30个循环，72℃延伸10 min；电泳检测是否得到目的片断。为了进一步确定阳性克隆，将所得质粒进行酶切验证。将已确认的阳性克隆接种于含有卡那抗生素的LB液体培养基中于37℃培养过夜后用于提取质粒。重组质粒pET-28a(+)-pul双酶切反应体系组成：重组质粒pET-28a(+)-pul (50 ng/μL) 10 μL，10×M buffer 2 μL，NheI 1 μL，EcoRI 1 μL，dH₂O 6 μL。按照水、缓冲液、质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于37℃水浴酶切反应2-3 h后，在管中加入4 μL的6×Loading Buffer终止酶切反应。通过高通量红色固体平板培养基筛选得到表达普鲁兰酶重组菌，其重组质粒经过菌落PCR和质粒双酶切方法验证，均可确认为正确的重组质粒。

<210>SEQ ID NO: 1

<211>3309

<212>DNA

<213>黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108

 

<214>

atgctcagat atacctgtca tgccctattt cttggatcgt tagtattatt gagtggctgt       60

gataacagct cttcctcttc accctctggc tcaccgggtt caccaggcaa tcctggcaac      120

ccaggcacgc ccggtacgcc cgacccgcag gatgtggtcg tccgcttacc ggacgttgcc      180

gtccctggcg aagcggcgca ggcttccgcc aaccaggctg tcattcacct tgtcgatatc      240

gccggcatca ccagcagcac gccggccgac tatgcgacta aaaacctcta tctatggaat      300

aacgaaacct gtgatgcgct gagcgcgccg gtggcggact ggaatgatgt cagcactacg      360

ccgaccggca gcgacaaata tggcccttac tgggtgatcc cgctgactaa agagagcgga      420

tgtatcaacg ttatcgtccg cgatggcacc aataagctta tcgacagcga cctgcgcgtc      480

tcttttggcg atttcaccga tcgcacggta tcggtcatcg ccggcaacag cgcggtctat      540

gactcccgcg ccgacgcctt ccgcgccgcc tttggcgtgg cgctggccga tgcgcactgg      600

gtcgataaaa ccaccctgct gtggccgggc ggcgaaaata aacccattgt gcgcctctat      660

tacagccaca gcagtaaggt ggccgccgac agtaacggcg aatttagcga taaatatgtc      720

aagctgaccc ccactactgt cagccagcag gtgagcatgc gcttcccgca tctcgccagc      780

tatcctgcct ttaagctgcc ggatgatgtc aacgtcgatg aattgctgca gggcgagacg      840

gtggcgatat ccgccgaaag cgacgggatc cttagctccg ccacccaggt gcagaccgcc      900

ggcgtgctgg acgataccta tgccgctgcc gccgaggcgc tgagctatgg cgcccagcta      960

actgatagcg gcgtgacctt ccgcgtctgg gcgcccacgg cgcagcaggt tgagctggtg     1020

gtctacagcg ccgacaagaa ggtggtggcc agccatccga tgacccgcga cagcgcctcc     1080

ggcgcctggt cctggcaggg cgggagcgac ctgaagggcg cgttctaccg ctacgcgatg     1140

accgtctacc acccgcagtc gcgtaaagtc gagcagtacg aagtgaccga tccctacgcc     1200

catagtttgt cgaccaactc ggagtacagc caggtggtcg atctcaacga cagcgcgctg     1260

aagccggaag gctgggacgg gctgacgatg ccgcacgcgc agaaaaccaa agccgacctg     1320

gcgaaaatga cgatccacga gtcgcatatt cgcgatctct ctgcctggga tcaaaccgtt     1380

cccgccgaac tgcgcggtaa gtatctggcg ctcaccgccc aggagagcaa tatggtccag     1440

catctgaaac agctgtcggc ctcgggagtg acccatattg agctgctgcc ggtcttcgat     1500

ctggcgacgg tcaatgagtt cagcgacaaa gtcgccgata ttcagcagcc gttcagtcgc     1560

ctgtgcgaga tcaacagcgc ggtgaagagc agcgagttcg cgggctattg cgacagcggt     1620

tcgacggtcg aagaggtgct gacccagctg aagcagaacg acagcaagga taacccgcag     1680

gtgcaggcgt tgaatacgct ggtggcgcag accgactcct ataactgggg ctacgatccg     1740

ttccactaca cggtgccgga aggatcctac gccaccgatc cggaaggcac ggcgcgcatt     1800

aaagagttcc gcaccatgat tcaggcgatc aagcaggatc tgggaatgaa cgtcattatg     1860

gacgtggtgt acaaccacac caacgccgcc ggcccgaccg accgcacctc ggtgctggat     1920

aagatcgtcc cctggtacta tcagcgcctg aatgaaacca ccggcagcgt ggaatcggcc     1980

acctgttgct ccgactcggc gccagagcac cggatgttcg ccaagcttat cgccgattca     2040

ctggcggtat ggaccaccga ttataagatc gatggcttcc gcttcgacct gatgggctat     2100

catccgaaag cgcagatcct ctcggcctgg gagcgcatta aagcgctgaa cccggacatt     2160

tatttctttg gtgaaggttg ggattccaac cagagcgatc gctttgaaat tgcctcgcaa     2220

atcaatctga aaggcaccgg gatcggcacg ttctccgatc gtctgcgcga cgccgtgcgc     2280

ggtggcgggc cgttcgattc cggcgatgca ttgcgccaga atcagggggt gggcagcggc     2340

gccggcgttc agccgaatga gctgaccagc atgaccgacg atcaggcgcg ccacctcgcc     2400

gatctgaccc gtctgggcat ggccggtaac ctcgcggact tcgtgctgat cgacaaagac     2460

ggcgcggtga agaaaggcag cgagattgac tataacggcg cgcctggcgg ctatgcggct     2520

gacccgacgg aagtcgtgaa ttatgtgtca aaacacgaca accaaacgct gtgggacatg     2580

atcagctata aagctgctca ggaggcggat ctcgataccc gcgtccggat gcaggcggtg     2640

tcgctggcga cggtgatgct cggccagggg atcgcctttg accagcaggg ctcggagctg     2700

ctgcgctcta aatcttttac ccgcgattcg tatgattccg gtgactggtt taaccgcgtg     2760

gattactccc tgcaggacaa caactacaac gtcggtatgc cgcgcagcag cgatgatggc     2820

agcaactatg acattatcgc ccgggtgaaa gacgcggtgg ctactccggg tgaagcggag     2880

ctcaagcaga tgaccgcgtt ttatcaggag ctgaccgcgc tgcgtaaatc gtctccgctg     2940

tttacccttg gtgacggcgc gacggtgatg aagcgcgtgg acttccgcaa caccggcgcc     3000

gatcagcaga cgggtctgct ggtgatgacc atcgatgatg ggatgcaggc tggcgccagt     3060

ctggacagcc gtgtcgacgg catcgtggtg gcgatcaacg ccgcaccgga aagccggacg     3120

ctgcaggact tcgccggcac atcgctgcag ctgagcgcca tccagcaggc ggcaggcgac     3180

cgttcgctgg cgagcggcgt gcaggttgcc gctgacggct cggtcacgct gccggcctgg     3240

tcggtagcgg tcctcgagct gccacagggg gaatcgcagg gcgctggcct gccggtgagc     3300

agtaaataa                                                             3309

 

<210>SEQ ID NO: 2

<211>1102

<212>PRT

<213>黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108

 

<400>1

Met Leu Arg Tyr Thr  Cys His Ala Leu Phe  Leu Gly Ser Leu Val

1                    5                      10                      15

Leu Leu Ser Gly Cys  Asp Asn Ser Ser Ser  Ser Ser Pro Ser Gly

                    20                      25                      30

Ser Pro Gly Ser Pro  Gly Asn Pro Gly Asn  Pro Gly Thr Pro Gly

                    35                      40                      45

Thr Pro Asp Pro Gln  Asp Val Val Val Arg  Leu Pro Asp Val Ala

                    50                      55                      60

Val Pro Gly Glu Ala  Ala Gln Ala Ser Ala  Asn Gln Ala Val Ile

                    65                      70                      75

His Leu Val Asp Ile  Ala Gly Ile Thr Ser  Ser Thr Pro Ala Asp

                    80                      85                      90

Tyr Ala Thr Lys Asn  Leu Tyr Leu Trp Asn  Asn Glu Thr Cys Asp

                    95                     100                     105

Ala Leu Ser Ala Pro  Val Ala Asp Trp Asn  Asp Val Ser Thr Thr

                   110                     115                     120

Pro Thr Gly Ser Asp  Lys Tyr Gly Pro Tyr  Trp Val Ile Pro Leu

                   125                     130                     135

Thr Lys Glu Ser Gly  Cys Ile Asn Val Ile  Val Arg Asp Gly Thr

                   140                     145                     150

Asn Lys Leu Ile Asp  Ser Asp Leu Arg Val  Ser Phe Gly Asp Phe

                   155                     160                     165

Thr Asp Arg Thr Val  Ser Val Ile Ala Gly  Asn Ser Ala Val Tyr

                   170                     175                     180

Asp Ser Arg Ala Asp  Ala Phe Arg Ala Ala  Phe Gly Val Ala Leu

                   185                     190                     195

Ala Asp Ala His Trp  Val Asp Lys Thr Thr  Leu Leu Trp Pro Gly

                   200                     205                     210

Gly Glu Asn Lys Pro  Ile Val Arg Leu Tyr  Tyr Ser His Ser Ser

                   215                     220                     225

Lys Val Ala Ala Asp  Ser Asn Gly Glu Phe  Ser Asp Lys Tyr Val

                   230                     235                     240

Lys Leu Thr Pro Thr  Thr Val Ser Gln Gln  Val Ser Met Arg Phe

                   245                     250                     255

Pro His Leu Ala Ser  Tyr Pro Ala Phe Lys  Leu Pro Asp Asp Val

                   260                     265                     270

Asn Val Asp Glu Leu  Leu Gln Gly Glu Thr  Val Ala Ile Ser Ala

                   275                     280                     285

Glu Ser Asp Gly Ile  Leu Ser Ser Ala Thr  Gln Val Gln Thr Ala

                   290                     295                     300

Gly Val Leu Asp Asp  Thr Tyr Ala Ala Ala  Ala Glu Ala Leu Ser

                   305                     310                     315

Tyr Gly Ala Gln Leu  Thr Asp Ser Gly Val  Thr Phe Arg Val Trp

                   320                     325                     330

Ala Pro Thr Ala Gln  Gln Val Glu Leu Val  Val Tyr Ser Ala Asp

                   335                     340                     345

Lys Lys Val Val Ala  Ser His Pro Met Thr  Arg Asp Ser Ala Ser

                   350                     355                     360

Gly Ala Trp Ser Trp  Gln Gly Gly Ser Asp  Leu Lys Gly Ala Phe

                   365                     370                     375

Tyr Arg Tyr Ala Met Thr Val Tyr His Pro Gln Ser Arg Lys Val

                   380                     385                    390

Glu Gln Tyr Glu Val  Thr Asp Pro Tyr Ala  His Ser Leu Ser Thr

                   395                     400                     405

Asn Ser Glu Tyr Ser  Gln Val Val Asp Leu  Asn Asp Ser Ala Leu

                   410                     415                     420

Lys Pro Glu Gly Trp  Asp Gly Leu Thr Met  Pro His Ala Gln Lys

                   425                     430                     435

Thr Lys Ala Asp Leu  Ala Lys Met Thr Ile  His Glu Ser His Ile

                   440                     445                     450

Arg Asp Leu Ser Ala  Trp Asp Gln Thr Val  Pro Ala Glu Leu Arg

                   455                     460                     465

Gly Lys Tyr Leu Ala  Leu Thr Ala Gln Glu  Ser Asn Met Val Gln

                   470                     475                     480

His Leu Lys Gln Leu  Ser Ala Ser Gly Val  Thr His Ile Glu Leu

                   485                     490                     495

Leu Pro Val Phe Asp  Leu Ala Thr Val Asn  Glu Phe Ser Asp Lys

                   500                     505                     510

Val Ala Asp Ile Gln  Gln Pro Phe Ser Arg  Leu Cys Glu Ile Asn

                   515                     520                     525

Ser Ala Val Lys Ser  Ser Glu Phe Ala Gly  Tyr Cys Asp Ser Gly

                   530                     535                     540

Ser Thr Val Glu Glu  Val Leu Thr Gln Leu  Lys Gln Asn Asp Ser

                   545                     550                     555

Lys Asp Asn Pro Gln  Val Gln Ala Leu Asn  Thr Leu Val Ala Gln

                   560                     565                     570

Thr Asp Ser Tyr Asn  Trp Gly Tyr Asp Pro  Phe His Tyr Thr Val

                   575                     580                     585

Pro Glu Gly Ser Tyr  Ala Thr Asp Pro Glu  Gly Thr Ala Arg Ile

                   590                     595                     600

Lys Glu Phe Arg Thr  Met Ile Gln Ala Ile  Lys Gln Asp Leu Gly

                   605                     610                     615

Met Asn Val Ile Met  Asp Val Val Tyr Asn  His Thr Asn Ala Ala

                   620                     625                     630

Gly Pro Thr Asp Arg  Thr Ser Val Leu Asp  Lys Ile Val Pro Trp

                   635                     640                     645

Tyr Tyr Gln Arg Leu  Asn Glu Thr Thr Gly  Ser Val Glu Ser Ala

                   650                     655                     660

Thr Cys Cys Ser Asp  Ser Ala Pro Glu His  Arg Met Phe Ala Lys

                   665                     670                     675

Leu Ile Ala Asp Ser  Leu Ala Val Trp Thr  Thr Asp Tyr Lys Ile

                   680                     685                     690

Asp Gly Phe Arg Phe  Asp Leu Met Gly Tyr  His Pro Lys Ala Gln

                   695                     700                     705

Ile Leu Ser Ala Trp  Glu Arg Ile Lys Ala  Leu Asn Pro Asp Ile

                   710                     715                     720

Tyr Phe Phe Gly Glu  Gly Trp Asp Ser Asn  Gln Ser Asp Arg Phe

                   725                     730                     735

Glu Ile Ala Ser Gln  Ile Asn Leu Lys Gly  Thr Gly Ile Gly Thr

                   740                     745                     750

Phe Ser Asp Arg Leu  Arg Asp Ala Val Arg  Gly Gly Gly Pro Phe

                   755                     760                     765

Asp Ser Gly Asp Ala  Leu Arg Gln Asn Gln  Gly Val Gly Ser Gly

                   770                     775                     780

Ala Gly Val Gln Pro  Asn Glu Leu Thr Ser  Met Thr Asp Asp Gln

                   785                     790                     795

Ala Arg His Leu Ala  Asp Leu Thr Arg Leu  Gly Met Ala Gly Asn

                   800                     805                     810

Leu Ala Asp Phe Val  Leu Ile Asp Lys Asp  Gly Ala Val Lys Lys

                   815                     820                     825

Gly Ser Glu Ile Asp  Tyr Asn Gly Ala Pro  Gly Gly Tyr Ala Ala

                   830                     835                     840

Asp Pro Thr Glu Val  Val Asn Tyr Val Ser  Lys His Asp Asn Gln

                   845                     850                     855

Thr Leu Trp Asp Met  Ile Ser Tyr Lys Ala  Ala Gln Glu Ala Asp

                   860                     865                     870

Leu Asp Thr Arg Val  Arg Met Gln Ala Val  Ser Leu Ala Thr Val

                   875                     880                     885

Met Leu Gly Gln Gly  Ile Ala Phe Asp Gln  Gln Gly Ser Glu Leu

                   890                     895                     900

Leu Arg Ser Lys Ser  Phe Thr Arg Asp Ser  Tyr Asp Ser Gly Asp

                   905                     910                     915

Trp Phe Asn Arg Val  Asp Tyr Ser Leu Gln  Asp Asn Asn Tyr Asn

                   920                     925                     930

Val Gly Met Pro Arg  Ser Ser Asp Asp Gly  Ser Asn Tyr Asp Ile

                   935                     940                     945

Ile Ala Arg Val Lys  Asp Ala Val Ala Thr  Pro Gly Glu Ala Glu

                   950                     955                     960

Leu Lys Gln Met Thr  Ala Phe Tyr Gln Glu  Leu Thr Ala Leu Arg

                   965                     970                     975

Lys Ser Ser Pro Leu  Phe Thr Leu Gly Asp  Gly Ala Thr Val Met

                   980                     985                     990

Lys Arg Val Asp Phe  Arg Asn Thr Gly Ala  Asp Gln Gln Thr Gly

                   995                    1000                    1005

Leu Leu Val Met Thr  Ile Asp Asp Gly Met  Gln Ala Gly Ala Ser

                  1010                    1015                    1020

Leu Asp Ser Arg Val  Asp Gly Ile Val Val  Ala Ile Asn Ala Ala

                  1025                    1030                    1035

Pro Glu Ser Arg Thr  Leu Gln Asp Phe Ala  Gly Thr Ser Leu Gln

                  1040                    1045                    1050

Leu Ser Ala Ile Gln  Gln Ala Ala Gly Asp  Arg Ser Leu Ala Ser

                  1055                    1060                    1065

Gly Val Gln Val Ala  Ala Asp Gly Ser Val  Thr Leu Pro Ala Trp

                  1070                    1075                    1080

Ser Val Ala Val Leu  Glu Leu Pro Gln Gly  Glu Ser Gln Gly Ala

                  1085                    1090                    1095

Gly Leu Pro Val Ser  Ser Lys***

                  1100      1102

Claims (1)

1.一种基于自诱导培养和有色底物相结合的高通量筛选重组菌的方法，其特征在于：以表达普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建为例所述的高通量筛选重组菌的方法步骤为：

一、表达普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建：

（1）普鲁兰酶基因的获得

出发菌株为黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108，在专利ZL 201210187070.3中已公开；

培养基以g/L计：可溶性淀粉 10，蛋白胨15，酵母膏5，KH₂PO₄ 5，MgSO₄·7H₂O 0.1，NH₄Cl 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.1，pH 6.5，双蒸水配制；

将CCTCC NO：M 2012108菌种接种于培养基，装液量为体积计10%的250 mL摇瓶中，于37℃、200 rpm振荡培养72 h，培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞，利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因组；

引物1：5'- CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3'，

引物2：5'- CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3' ，引物1含有NheI 限制性酶切位点，引物2含有EcoRI 限制性酶切位点；

PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 0.5 μL，引物1  50 pmol/μL  1 μL，引物2  50 pmol/μL  1 μL，基因组DNA  5 μL，Taq DNA polymerase  5 U/μL  0.5 μL；

PCR反应过程：94℃ 预变性5 min；98℃ 10 s，55℃ l min，72℃ 4 min，进行30个循环；72℃延伸10 min；

利用上海申能***生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit纯化DNA片断；

DNA溶液中加入1/10体积的pH 5.2、3 mol/L的乙酸钠溶液和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1h，于4℃、12000 rpm离心30 min，加入75%乙醇500 μL洗涤，于4℃、12000 rpm离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20℃保存；

（2）含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建

a、目的基因及质粒pET-28a(+)的酶切

利用北京博大泰克生物基因技术有限公司的质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit提取质粒pET-28a(+)，

按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收PCR产物片段或质粒DNA片段，浓缩；

反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，NheI 2 μL，EcoRI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL；

b、目的基因与质粒pET-28a(+)的连接

将普鲁兰酶基因与质粒pET-28a(+)连接，反应体系组成如下：质粒pET-28a(+) 0.8 μL，普鲁兰酶基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL；混合均匀后，将其置于16℃培养箱中连接12 h；

c、重组质粒转化大肠杆菌

在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min，转入42℃水浴中，热击90 s；快速转移至冰浴中，冷却2 min，加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 rpm摇床温育培养1 h；培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养，获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET-28a(+)-pul A；挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃ 200 rpm振荡培养过夜，取500 μL菌液，加入500 μL 30%甘油溶液，混合均匀后，于-70℃中冷冻保存，作为菌种保存冷冻甘油管；

二、从退化菌种中高通量筛选稳定表达普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌，步骤为：

高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基：α-乳糖 10 g /L，葡萄糖 0.5 g /L，甘油 5 g /L，KH₂PO₄  13.3 g /L，MgSO₄ 0.59 g/L，蛋白胨 10 g /L，(NH₄)₂HPO₄ 4 g/L，柠檬酸1.55 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，琼脂粉18-20 g/L，红色普鲁兰多糖1 g/L，1000×痕量元素溶液 200μL，pH 6.8-7.0，双蒸水配制；

痕量元素溶液： FeCl₃ 3 g/L，CaCl₂·2H₂O 20 g/L，MnCl₂·4H₂O 15 g/L， Zn(CH₃COO)₂·4H₂O 34 g/L，CoCl₂·6H₂O 2.5 g/L，CuCl₂ 1.5 g/L，NiCl₂ 2 g/L， Na₂Mo₇O₂₄ 2.1 g/L，Na₂SeO₃ 2 g/L，H₃B₄O₇ 3 g/L，二水合乙二胺四乙酸二钠盐Titriplex III 14.1 g/L，双蒸水配制；

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0，双蒸水配制；需要时使用前加入卡那霉素50 μg/mL，固体培养基添加1.5%琼脂粉；

将重组菌冷冻甘油管直接划线或适当稀释后，涂布于高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基，于37℃培养过夜，次日，察看高通量筛选平板，通过平板菌落周围的透明圈的形成情况，从中选择具有较大透明圈的菌落接种于LB液体培养基中；

（1）诱导培养

挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜，取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.5~1 mmol/L，在30~37℃下进行诱导培养12h；培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定；

（2）重组大肠杆菌的胞内外蛋白的SDS-PAGE分析

重组大肠杆菌经诱导培养后，取0.5 mL诱导培养物，离心去除微生物细胞，得发酵上清；取20 μL发酵上清与5 μL 5×上样缓冲液相混合，然后于沸水浴中煮沸10 min，用于SDS-PAGE分析上清的蛋白情况；菌体沉淀用0.5 mL蒸馏水洗涤两次之后，重悬于0.5 mL蒸馏水中，按同样的方法处理用于SDS-PAGE分析胞外蛋白情况；SDS-PAGE浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为9%，电泳结束后用考马斯亮蓝R-250显色蛋白条带；

（3）阳性克隆的菌落PCR和质粒双酶切方法验证

采用菌落PCR的方法对转化平板上阳性克隆进行确认，具体操作如下：

在冰上混合下列各成分：dH₂O 136 μL，10× PCR Buffer 20 μL，2.5 mM的 dNTP 32 μL，20 mM的引物1  4 μL，20 mM的引物2  4 μL，5 U/μL的 TaKaRa LA Taq 4 μL；将上述成分混合均匀后，20 μL每管分装于200 μL PCR管中；挑选平板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，置于装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下，盖紧管子；将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中进行PCR扩增，PCR反应过程：94℃ 预变性5 min，98℃ 10 s，55℃ l min，72℃ 4 min，进行30个循环，72℃延伸10 min；电泳检测是否得到目的片断；

为了进一步确定阳性克隆，将所得质粒进行酶切验证；将已确认的阳性克隆接种于含有卡那抗生素的LB液体培养基中于37 ℃培养过夜后用于提取质粒；质粒的提取方法按照E.Z.N.A. TMPlasmid Mini Kit的操作说明进行；重组质粒pET-28a(+)-pul双酶切反应体系组成：50 ng/μL的重组质粒pET-28a(+)-pul 10 μL，10×M buffer 2 μL，NheI 1 μL，EcoRI 1 μL，dH₂O 6 μL；按照水、缓冲液、质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于37℃水浴酶切反应2-3 h后，在管中加入4 μL的6×Loading Buffer终止酶切反应；取5 μL的酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析；

通过高通量红色固体平板培养基筛选得到表达普鲁兰酶重组菌，在液体LB培养基中进行产酶实验时均能得到11 U/mL的胞外重组普鲁兰酶酶活，而且将所得到的发酵液用于SDS-PAGE分析蛋白表达情况时，出现表达正常的目的蛋白条带；此外，通过菌落PCR和质粒双酶切方法，可验证筛选获得重组菌均含有正确的重组质粒；

三、稳定表达目的基因的重组大肠杆菌表达的目标蛋白可与培养基中的有色物质作用产生可视化的变化；

在高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基上生长的重组大肠杆菌能够通过自诱导自动表达目标蛋白普鲁兰酶，该目标蛋白普鲁兰酶能够与添加在培养基中的红色普鲁兰产生可视化的变化；将重组菌冷冻甘油管直接划线或适当稀释后，涂布于高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基上，于37℃培养过夜；次日，在高通量筛选平板上，观察到有些菌落周围形成由红色到无色的透明圈，这些菌落即为稳定表达目的基因的重组大肠杆菌；

四、应用自诱导的方法使工程菌在筛选过程中就表现相应的生产能力，该能力可以通过添加于培养基的有色物质鉴定出来；自诱导不仅指因为特定物质的摄入而导致蛋白的表达或代谢产物的积累，也包括培养条件的改变而导致的目标产物的生成。

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