CN102676480A

CN102676480A - 一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法

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Publication number: CN102676480A
Application number: CN2012101870667A
Authority: CN
Inventors: 聂尧; 徐岩; 陈文波
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-06-08
Also published as: CN102676480B

Abstract

一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。本发明将黑座克雷伯氏菌（Klebsiellavariicola）CCTCC NO：M2012108普鲁兰酶编码基因***表达载体pET28a(+)中构建重组质粒，并转化大肠杆菌获得含有目的普鲁兰酶基因的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA。利用自诱导培养基，并采用先37℃培养2~4小时后25℃继续培养48~72小时的双温度调控方式，将重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA进行培养和发酵产酶。采用优化后的自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到60~70U/mL。本发明为重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶提供了有效策略，对于今后开发新型重组普鲁兰酶的生产工艺和应用价值具有重要意义。

Description

一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法

技术领域

一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。

背景技术

普鲁兰酶（pullulanase，EC 3.2.1.41）是专一性分解普鲁兰、淀粉、支链淀粉和相应分支低聚糖中α-1,6-糖苷键的一种脱支酶。与其他普鲁兰水解酶相比，普鲁兰酶特异地水解普鲁兰中α-1,6-糖苷键，生成以麦芽三糖为主的末端产物。该性质决定了它在改善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新的产品方面有着相当巨大的价值，在淀粉加工工业、食品、洗涤剂、纺织等中有着重要的用途和良好的市场前景。

普鲁兰酶最早是Bender在出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）的发酵液中发现并对其酶学性质做了研究。此后，科研工作者从自然界中分离得到了大量产普鲁兰酶的微生物及植物。这些来源的酶性质差别较大，如来源于Klebsiella planticola，最适pH在5.0，最适温度在40℃；而来源于植物的普鲁兰酶（称R-enzyme），最适的pH和温度分别是5.6和37℃。尽管如此，从普鲁兰酶的发现到20世纪70年代末，普鲁兰酶的研究一直处于产酶微生物的筛选和酶学性质的鉴定上，并没有出现普鲁兰酶的规模化生产。直到20世纪80年代初，丹麦诺维信公司从马来西亚的土壤中筛选到一株可以产普鲁兰酶的芽孢杆菌（Bacillus acidopullulytics）。该菌株所生产的普鲁兰酶具有耐热耐酸的特性（60℃，pH4.5）比较适合于淀粉糖化工业的需要。此后，诺维信公司投入巨资对该普鲁兰酶进行研究，并于1983年在日本和欧洲市场同时推出商品化的普鲁兰酶（商品名为Promozyme）。目前，诺维信公司占据了中国乃至世界的普鲁兰酶市场。直到1995年杰能科公司利用地衣芽孢杆菌异源表达了Bacillus deramificans的普鲁兰酶，其酶学性质与B. acidopullulytics普鲁兰酶相近，从而使杰能科成为了普鲁兰酶的第二大生产商。

由于普鲁兰酶工业化生产菌株较少，我国在普鲁兰酶上的研究主要集中在产普鲁兰酶菌株的筛选、诱变及优化等方面，效果均不太理想。如1998年山东大学肖敏等人从白酒发酵现场分离得到一株产普鲁兰酶的微生物，其生产的普鲁兰酶耐热性较差，当温度大于50℃后迅速失活，但是pH稳定性较好，在中性和微酸性条件下可于冰箱中长期保存。2001年唐宝英等人从土壤中分离得到一株产普鲁兰酶的芽孢杆菌，其产普鲁兰酶有较好的酶学性质（75℃，pH 4.6），但是野生菌株的产酶能力不高，只有1.6 U/mL，经过诱变育种最终才使其产酶水平提高到8.8 U/mL。近年来随着分子生物学发展，人们开始利用基因工程手段表达外源普鲁兰酶基因，如2006年夏子芳等利用大肠杆菌表达***表达海栖热袍菌的普鲁兰酶基因，但仅获得胞内酶活；2008年张明焱等将来源于Bacillus licheniformis的普鲁兰酶编码基因克隆到大肠杆菌中进行表达，但是最终的酶活也只有5.6 U/mL；2010年，王淑军等利用大肠杆菌的表达***实现了来源于深海古菌Thermococcus siculi HJ21的普鲁兰酶编码基因的异源表达，但是异源表达的效果较差，且仅获得胞内酶活。综上所述，在普鲁兰酶的微生物发酵生产过程中，不论是野生菌还是工程菌，主要存在的问题就是胞外酶活较低，造成了普鲁兰酶的生产成本上升，形成工业化生产的障碍。

自诱导（auto-induction）是最早由纽约厄普顿的布鲁克黑文国家实验室的Studier等提出的一种利用培养基中碳源转换而诱导外源基因表达的方法，即首先以葡萄糖为碳源支持大肠杆菌生长至饱和，待葡萄糖消耗殆尽，培养基中另一种成分乳糖在lac Y与lac Z的基因产物透过酶（lactose permease）和β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的协助下，乳糖穿过细胞膜并部分转化为异乳糖开启T7表达***的方法。乳糖除了作为诱导物之外，其代谢产物葡萄糖和半乳糖（半乳糖在gal操纵子的作用下也将转化成葡萄糖）也可作为细菌生长的碳源。与传统的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导方法相比，在接种之后自诱导表达过程不需要对细胞的生长情况进行监测，从而减少了在培养过程中对培养物的处理，极大地方便了高通量筛选。而且，以价格低廉、无毒的乳糖替代价格高昂的IPTG可以大大地降低生产的成本，在重组蛋白的发酵生产中有着重要的意义。此外，针对重组蛋白的诱导分泌表达，采用双温度分阶段调控策略已成功用于葡萄糖基转移酶分泌蛋白的活性表达，如先在37℃条件下培养增加菌体量，然后降低温度到25℃减缓重组蛋白的合成速率以促进其分泌至胞外。然而，目前自诱导培养基主要应用于核磁共振分析的同位素标记重组蛋白的表达，尚无将自诱导培养基用于重组普鲁兰酶发酵生产的报道。而且，将自诱导培养方式和双温度调控的联合策略用于重组普鲁兰酶发酵生产也鲜有报道。

本发明将自诱导培养基和双温度调控方式成功应用于普鲁兰酶基因工程菌的培养和酶蛋白表达，与传统的LB培养基和IPTG诱导方法相比，胞外重组普鲁兰酶的发酵酶活从11 U/mL提升到70 U/mL。

发明内容

（1）要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法。本发明目的不仅仅在于通过微生物菌株发酵生产胞外普鲁兰酶，而是将普鲁兰酶基因在大肠杆菌中重组表达，而且利用自诱导培养基和双温度调控方式进一步提高重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶的能力和产量，从而开发新型重组普鲁兰酶的生产工艺和应用价值。

（2）技术方案

本发明首先将来源于黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行重组表达，在此基础上，将自诱导培养基和双温度调控方式用于重组菌的培养和重组普鲁兰酶的发酵生产。

一、普鲁兰酶基因的获得

黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108培养基：可溶性淀粉 10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L，KH₂PO₄ 5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L，NH₄Cl 0.5 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1 g/L，pH 6.5。

将黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108菌种接种于培养基装液量为10%的250 mL摇瓶中，于37℃、200 rpm振荡培养72 h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System（VIOGENE公司）提取基因组。

合成引物1：5'- CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3'，合成引物2：5'- CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3' 。引物1含有NheI 限制性酶切位点，引物2含有EcoRI 限制性酶切位点。

PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP（25 mmol/L）0.5 μL，引物1（50 pmol/μL）1 μL，引物2（50 pmol/μL） 1 μL，基因组DNA 5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL。

PCR反应过程：94℃ 预变性5 min；98℃ 10 s，55℃ l min，72℃ 4 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。

利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能***生物科技有限公司）纯化DNA片断。

DNA溶液中加入1/10体积的乙酸钠溶液（3 mol/L，pH 5.2）和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1小时。12000 rpm于4℃离心30 min。加入75%乙醇500 μL洗涤，12000 rpm于4℃离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20℃保存。

二、含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建

目的基因及质粒pET28a(+)的酶切

利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒pET28a(+)。

按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。

反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，NheI 2 μL，EcoRI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL。

目的基因与质粒pET28a(+)的连接

将外源基因与质粒pET28a(+)连接，反应体系组成如下：质粒pET28a(+) 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，ddH₂O将体系补足10 μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12 h。

利用限制性内切酶NheI 和EcoRI对扩增得到的CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶编码基因与载体pET28a(+)进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接获得带有目的基因片断的重组质粒pET28a(+)-pul A；

重组质粒转化大肠杆菌

在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中，冷却2 min。加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 rpm摇床温育培养1 h。培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养。获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A。

诱导表达培养

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0。需要时使用前加入卡那霉素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度0~1 mmol/L，在培养温度30~37℃下进行诱导培养12小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。利用LB培养基和IPTG诱导方式，获得胞外重组普鲁兰酶活力为11 U/mL。

普鲁兰酶测定方法

取100 μL用100 mM、pH 5.0的醋酸缓冲适当稀释的酶液与等体积的溶于100 mM、pH 5.0醋酸缓冲中的10 g/L 普鲁兰相混合于50 ℃水浴中保温30分钟。加入DNS试剂300 μL摇匀，置于沸水中煮沸15分钟，取出以流动流动水迅速冷却后，于540 nm波长处，以0.5 cm比色杯，测定反应液的吸光度值。

酶活单位定义：在上述指定的条件下，每分钟催化分解普鲁兰多糖生成相当于1 μmol葡萄糖的还原糖所需的醒为1个酶活单位（U）。

三、重组大肠杆菌的自诱导培养和双温度调控发酵产酶

自诱导培养基：α-乳糖 10 -20g /L，葡萄糖 0.5-1 g /L，甘油 5 g /L，KH₂PO₄ 6.8 g /L，MgSO₄ 0.24 g/L，蛋白胨 10 g /L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.9 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，NH₄Cl 2.67 g/L，痕量元素溶液 200 μL/L，用超纯水配置。

痕量元素溶液：

50 μM FeCl₃，20 μM CaCl₂·2H₂O，10 μM MnCl₂·4H₂O，10 μM ZnSO₄·7H₂O，2 μM CoCl₂·6H₂O，2 μM CuCl₂，2 μM NiCl₂，2 μM Na₂Mo₇O₂₄，2 μM Na₂SeO₃，2 μM H₃B₄O₇，用超纯水配置。

将重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养上过夜活化培养，从固体平板上挑取单个菌落接种于3 mL含有50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中于37℃，200 rpm振荡培养，随时监测培养基中OD₆₀₀的变化情况。待OD₆₀₀达到2~3时，按5%~10%接种量接种于50 mL含50 μg/mL 卡那霉素的自诱导培养基中。将接种之后的自诱导培养基于37℃，200 rpm培养2~4小时后，将培养的温度降低到25℃继续培养48~72小时。培养结束后，10000 rpm离心去除菌体，收集发酵上清液为普鲁兰酶的粗酶液。

自诱导培养基成分及发酵条件的优化

分别考察了碳源、氮源及培养基添加物对工程菌E. coli BL21/pET28a(+)-pulA生长及分泌重组普鲁兰酶的影响，最终确定了发酵生产胞外普鲁兰酶的优化自诱导培养基组成：

α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 1 g/L，甘油 5 g/L，KH₂PO₄ 6.8 g/L，MgSO₄ 0.24 g/L，蛋白胨, 10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.9g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，NH₄Cl 2.67 g/L，Tween-80 9 g/L，痕量元素溶液200 μL/L。

分别考察了起始pH、装液量、温度、培养时间对胞外酶活的影响，最终确定了工程菌E. coli BL21/pET28a(+)-pulA产酶的培养条件为：起始pH5.0~8.0，装液量10%~20%，培养温度为37℃先培养4小时后，再转入25℃培养56小时。

采用优化自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到60~70 U/mL。

（3）有益效果

成功克隆了黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶编码基因，该基因全长3309 bp，编码1102个氨基酸残基，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。

将黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶编码基因***表达载体pET28a(+)中并转化入相应表达宿主E. coli BL21(DE3)中成功构建带有目的基因的重组菌株E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A。

将自诱导培养基和双温度调控方式用于重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的培养和普鲁兰酶的发酵产酶，优化自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到60~70 U/mL。这些工作为重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶的能力和产量的提高提供了有效策略，对于今后开发新型重组普鲁兰酶的生产工艺和应用价值具有重要意义。

生物材料样品保藏：黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）SHN-1；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简写CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2012108，保藏日期为2012年4月11日。

具体实施方式

实施例1

自诱导培养基：α-乳糖 10 g/L，葡萄糖 0.5 g/L，甘油 5 g/L，KH₂PO₄ 6.8 g/L，MgSO₄ 0.24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.9 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，NH₄Cl 2.67 g/L，痕量元素溶液200 μL/L。

将重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌种划线于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上于37℃培养箱中培养过夜。从平板上挑取单个菌落接种于装有50 mL LB培养基（50 μg/mL卡那霉素）的250 mL三角瓶中，置于37℃、200 rpm摇床中震荡培养，至OD₆₀₀达到2.0~3.0左右。将此种子培养液以5%的接种量接种于装有50 mL上述自诱导培养基的250 mL三角瓶中，于37℃培养60小时（此时OD₆₀₀达到15左右），结束发酵。

通过此重组菌培养和发酵产酶工艺，发酵上清中胞外普鲁兰酶的酶活达到15 U/mL。

实施例2

自诱导培养基：α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 1 g/L，甘油 5 g/L，KH₂PO₄ 6.8 g/L，MgSO₄ 0.24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.9 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，NH₄Cl 2.67 g/L，痕量元素溶液200 μL/L。

将重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌种划线于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上于37℃培养箱中培养过夜。从平板上挑取单个菌落接种于装有50 mL LB培养基（50 μg/mL卡那霉素）的250 mL三角瓶中，置于37℃、200 rpm摇床中震荡培养，至OD₆₀₀达到2.0~3.0左右。将此种子培养液以5%的接种量接种于装有50 mL上述自诱导培养基的250 mL三角瓶中，于25℃培养60小时（此时OD₆₀₀达到15左右），结束发酵。

通过此重组菌培养和发酵产酶工艺，发酵上清中胞外普鲁兰酶的酶活达到35 U/mL。

实施例3

将重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌种划线于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上于37℃培养箱中培养过夜。从平板上挑取单个菌落接种于装有50mL LB培养基（50 μg/mL卡那霉素）的250 mL三角瓶中，置于37℃、200 rpm摇床中震荡培养，至OD₆₀₀达到2.0~3.0左右。将此种子培养液以5%的接种量接种于装有50 mL上述自诱导培养基的250 mL三角瓶中，先于37℃、200 rpm摇床中培养4小时后，再将摇床的温度调低到25℃继续培养56小时（此时OD₆₀₀达到15左右），结束发酵。

通过此重组菌培养和发酵产酶工艺，发酵上清中胞外普鲁兰酶的酶活达到50 U/mL。

实施例4

自诱导培养基：α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 1 g/L，甘油 5 g/L，KH₂PO₄ 6.8 g/L，MgSO₄ 0.24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.9 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，NH₄Cl 2.67 g/L，Tween-80 9 g/L，痕量元素溶液200 μL/L。

将重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌种划线于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上于37℃培养箱中培养过夜。从平板上挑取单个菌落接种于装有50 mL LB培养基（50 μg/ml卡那霉素）的250 mL三角瓶中，置于37℃、200 rpm摇床中震荡培养，至OD₆₀₀达到2.0~3.0左右。将此种子培养液以5%的接种量接种于装有25 mL上述自诱导培养基的250 mL三角瓶中，先于37℃、200 rpm摇床中培养4小时后，再将摇床的温度调低到25℃继续培养56小时（此时OD₆₀₀达到15左右），结束发酵。

通过此重组菌培养和发酵产酶工艺，发酵上清中胞外普鲁兰酶的酶活达到70 U/mL。

<210>SEQ ID NO: 1

<211>3309

<212>DNA

<213>黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108

<400>1

atgctcagat atacctgtca tgccctattt cttggatcgt tagtattatt gagtggctgt 60

gataacagct cttcctcttc accctctggc tcaccgggtt caccaggcaa tcctggcaac 120

ccaggcacgc ccggtacgcc cgacccgcag gatgtggtcg tccgcttacc ggacgttgcc 180

gtccctggcg aagcggcgca ggcttccgcc aaccaggctg tcattcacct tgtcgatatc 240

gccggcatca ccagcagcac gccggccgac tatgcgacta aaaacctcta tctatggaat 300

aacgaaacct gtgatgcgct gagcgcgccg gtggcggact ggaatgatgt cagcactacg 360

ccgaccggca gcgacaaata tggcccttac tgggtgatcc cgctgactaa agagagcgga 420

tgtatcaacg ttatcgtccg cgatggcacc aataagctta tcgacagcga cctgcgcgtc 480

tcttttggcg atttcaccga tcgcacggta tcggtcatcg ccggcaacag cgcggtctat 540

gactcccgcg ccgacgcctt ccgcgccgcc tttggcgtgg cgctggccga tgcgcactgg 600

gtcgataaaa ccaccctgct gtggccgggc ggcgaaaata aacccattgt gcgcctctat 660

tacagccaca gcagtaaggt ggccgccgac agtaacggcg aatttagcga taaatatgtc 720

aagctgaccc ccactactgt cagccagcag gtgagcatgc gcttcccgca tctcgccagc 780

tatcctgcct ttaagctgcc ggatgatgtc aacgtcgatg aattgctgca gggcgagacg 840

gtggcgatat ccgccgaaag cgacgggatc cttagctccg ccacccaggt gcagaccgcc 900

ggcgtgctgg acgataccta tgccgctgcc gccgaggcgc tgagctatgg cgcccagcta 960

actgatagcg gcgtgacctt ccgcgtctgg gcgcccacgg cgcagcaggt tgagctggtg 1020

gtctacagcg ccgacaagaa ggtggtggcc agccatccga tgacccgcga cagcgcctcc 1080

ggcgcctggt cctggcaggg cgggagcgac ctgaagggcg cgttctaccg ctacgcgatg 1140

accgtctacc acccgcagtc gcgtaaagtc gagcagtacg aagtgaccga tccctacgcc 1200

catagtttgt cgaccaactc ggagtacagc caggtggtcg atctcaacga cagcgcgctg 1260

aagccggaag gctgggacgg gctgacgatg ccgcacgcgc agaaaaccaa agccgacctg 1320

gcgaaaatga cgatccacga gtcgcatatt cgcgatctct ctgcctggga tcaaaccgtt 1380

cccgccgaac tgcgcggtaa gtatctggcg ctcaccgccc aggagagcaa tatggtccag 1440

catctgaaac agctgtcggc ctcgggagtg acccatattg agctgctgcc ggtcttcgat 1500

ctggcgacgg tcaatgagtt cagcgacaaa gtcgccgata ttcagcagcc gttcagtcgc 1560

ctgtgcgaga tcaacagcgc ggtgaagagc agcgagttcg cgggctattg cgacagcggt 1620

tcgacggtcg aagaggtgct gacccagctg aagcagaacg acagcaagga taacccgcag 1680

gtgcaggcgt tgaatacgct ggtggcgcag accgactcct ataactgggg ctacgatccg 1740

ttccactaca cggtgccgga aggatcctac gccaccgatc cggaaggcac ggcgcgcatt 1800

aaagagttcc gcaccatgat tcaggcgatc aagcaggatc tgggaatgaa cgtcattatg 1860

gacgtggtgt acaaccacac caacgccgcc ggcccgaccg accgcacctc ggtgctggat 1920

aagatcgtcc cctggtacta tcagcgcctg aatgaaacca ccggcagcgt ggaatcggcc 1980

acctgttgct ccgactcggc gccagagcac cggatgttcg ccaagcttat cgccgattca 2040

ctggcggtat ggaccaccga ttataagatc gatggcttcc gcttcgacct gatgggctat 2100

catccgaaag cgcagatcct ctcggcctgg gagcgcatta aagcgctgaa cccggacatt 2160

tatttctttg gtgaaggttg ggattccaac cagagcgatc gctttgaaat tgcctcgcaa 2220

atcaatctga aaggcaccgg gatcggcacg ttctccgatc gtctgcgcga cgccgtgcgc 2280

ggtggcgggc cgttcgattc cggcgatgca ttgcgccaga atcagggggt gggcagcggc 2340

gccggcgttc agccgaatga gctgaccagc atgaccgacg atcaggcgcg ccacctcgcc 2400

gatctgaccc gtctgggcat ggccggtaac ctcgcggact tcgtgctgat cgacaaagac 2460

ggcgcggtga agaaaggcag cgagattgac tataacggcg cgcctggcgg ctatgcggct 2520

gacccgacgg aagtcgtgaa ttatgtgtca aaacacgaca accaaacgct gtgggacatg 2580

atcagctata aagctgctca ggaggcggat ctcgataccc gcgtccggat gcaggcggtg 2640

tcgctggcga cggtgatgct cggccagggg atcgcctttg accagcaggg ctcggagctg 2700

ctgcgctcta aatcttttac ccgcgattcg tatgattccg gtgactggtt taaccgcgtg 2760

gattactccc tgcaggacaa caactacaac gtcggtatgc cgcgcagcag cgatgatggc 2820

agcaactatg acattatcgc ccgggtgaaa gacgcggtgg ctactccggg tgaagcggag 2880

ctcaagcaga tgaccgcgtt ttatcaggag ctgaccgcgc tgcgtaaatc gtctccgctg 2940

tttacccttg gtgacggcgc gacggtgatg aagcgcgtgg acttccgcaa caccggcgcc 3000

gatcagcaga cgggtctgct ggtgatgacc atcgatgatg ggatgcaggc tggcgccagt 3060

ctggacagcc gtgtcgacgg catcgtggtg gcgatcaacg ccgcaccgga aagccggacg 3120

ctgcaggact tcgccggcac atcgctgcag ctgagcgcca tccagcaggc ggcaggcgac 3180

cgttcgctgg cgagcggcgt gcaggttgcc gctgacggct cggtcacgct gccggcctgg 3240

tcggtagcgg tcctcgagct gccacagggg gaatcgcagg gcgctggcct gccggtgagc 3300

agtaaataa 3309

<210>SEQ ID NO: 2

<211>1102

<212>PRT

<213>黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108

<400>2

Met Leu Arg Tyr Thr Cys His Ala Leu Phe Leu Gly Ser Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Ser Gly Cys Asp Asn Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Gly

20 25 30

Ser Pro Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Asn Pro Gly Thr Pro Gly

35 40 45

Thr Pro Asp Pro Gln Asp Val Val Val Arg Leu Pro Asp Val Ala

50 55 60

Val Pro Gly Glu Ala Ala Gln Ala Ser Ala Asn Gln Ala Val Ile

65 70 75

His Leu Val Asp Ile Ala Gly Ile Thr Ser Ser Thr Pro Ala Asp

80 85 90

Tyr Ala Thr Lys Asn Leu Tyr Leu Trp Asn Asn Glu Thr Cys Asp

95 100 105

Ala Leu Ser Ala Pro Val Ala Asp Trp Asn Asp Val Ser Thr Thr

110 115 120

Pro Thr Gly Ser Asp Lys Tyr Gly Pro Tyr Trp Val Ile Pro Leu

125 130 135

Thr Lys Glu Ser Gly Cys Ile Asn Val Ile Val Arg Asp Gly Thr

140 145 150

Asn Lys Leu Ile Asp Ser Asp Leu Arg Val Ser Phe Gly Asp Phe

155 160 165

Thr Asp Arg Thr Val Ser Val Ile Ala Gly Asn Ser Ala Val Tyr

170 175 180

Asp Ser Arg Ala Asp Ala Phe Arg Ala Ala Phe Gly Val Ala Leu

185 190 195

Ala Asp Ala His Trp Val Asp Lys Thr Thr Leu Leu Trp Pro Gly

200 205 210

Gly Glu Asn Lys Pro Ile Val Arg Leu Tyr Tyr Ser His Ser Ser

215 220 225

Lys Val Ala Ala Asp Ser Asn Gly Glu Phe Ser Asp Lys Tyr Val

230 235 240

Lys Leu Thr Pro Thr Thr Val Ser Gln Gln Val Ser Met Arg Phe

245 250 255

Pro His Leu Ala Ser Tyr Pro Ala Phe Lys Leu Pro Asp Asp Val

260 265 270

Asn Val Asp Glu Leu Leu Gln Gly Glu Thr Val Ala Ile Ser Ala

275 280 285

Glu Ser Asp Gly Ile Leu Ser Ser Ala Thr Gln Val Gln Thr Ala

290 295 300

Gly Val Leu Asp Asp Thr Tyr Ala Ala Ala Ala Glu Ala Leu Ser

305 310 315

Tyr Gly Ala Gln Leu Thr Asp Ser Gly Val Thr Phe Arg Val Trp

320 325 330

Ala Pro Thr Ala Gln Gln Val Glu Leu Val Val Tyr Ser Ala Asp

335 340 345

Lys Lys Val Val Ala Ser His Pro Met Thr Arg Asp Ser Ala Ser

350 355 360

Gly Ala Trp Ser Trp Gln Gly Gly Ser Asp Leu Lys Gly Ala Phe

365 370 375

Tyr Arg Tyr Ala Met Thr Val Tyr His Pro Gln Ser Arg Lys Val

380 385 390

Glu Gln Tyr Glu Val Thr Asp Pro Tyr Ala His Ser Leu Ser Thr

395 400 405

Asn Ser Glu Tyr Ser Gln Val Val Asp Leu Asn Asp Ser Ala Leu

410 415 420

Lys Pro Glu Gly Trp Asp Gly Leu Thr Met Pro His Ala Gln Lys

425 430 435

Thr Lys Ala Asp Leu Ala Lys Met Thr Ile His Glu Ser His Ile

440 445 450

Arg Asp Leu Ser Ala Trp Asp Gln Thr Val Pro Ala Glu Leu Arg

455 460 465

Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Ala Gln Glu Ser Asn Met Val Gln

470 475 480

His Leu Lys Gln Leu Ser Ala Ser Gly Val Thr His Ile Glu Leu

485 490 495

Leu Pro Val Phe Asp Leu Ala Thr Val Asn Glu Phe Ser Asp Lys

500 505 510

Val Ala Asp Ile Gln Gln Pro Phe Ser Arg Leu Cys Glu Ile Asn

515 520 525

Ser Ala Val Lys Ser Ser Glu Phe Ala Gly Tyr Cys Asp Ser Gly

530 535 540

Ser Thr Val Glu Glu Val Leu Thr Gln Leu Lys Gln Asn Asp Ser

545 550 555

Lys Asp Asn Pro Gln Val Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Ala Gln

560 565 570

Thr Asp Ser Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Phe His Tyr Thr Val

575 580 585

Pro Glu Gly Ser Tyr Ala Thr Asp Pro Glu Gly Thr Ala Arg Ile

590 595 600

Lys Glu Phe Arg Thr Met Ile Gln Ala Ile Lys Gln Asp Leu Gly

605 610 615

Met Asn Val Ile Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Asn Ala Ala

620 625 630

Gly Pro Thr Asp Arg Thr Ser Val Leu Asp Lys Ile Val Pro Trp

635 640 645

Tyr Tyr Gln Arg Leu Asn Glu Thr Thr Gly Ser Val Glu Ser Ala

650 655 660

Thr Cys Cys Ser Asp Ser Ala Pro Glu His Arg Met Phe Ala Lys

665 670 675

Leu Ile Ala Asp Ser Leu Ala Val Trp Thr Thr Asp Tyr Lys Ile

680 685 690

Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Tyr His Pro Lys Ala Gln

695 700 705

Ile Leu Ser Ala Trp Glu Arg Ile Lys Ala Leu Asn Pro Asp Ile

710 715 720

Tyr Phe Phe Gly Glu Gly Trp Asp Ser Asn Gln Ser Asp Arg Phe

725 730 735

Glu Ile Ala Ser Gln Ile Asn Leu Lys Gly Thr Gly Ile Gly Thr

740 745 750

Phe Ser Asp Arg Leu Arg Asp Ala Val Arg Gly Gly Gly Pro Phe

755 760 765

Asp Ser Gly Asp Ala Leu Arg Gln Asn Gln Gly Val Gly Ser Gly

770 775 780

Ala Gly Val Gln Pro Asn Glu Leu Thr Ser Met Thr Asp Asp Gln

785 790 795

Ala Arg His Leu Ala Asp Leu Thr Arg Leu Gly Met Ala Gly Asn

800 805 810

Leu Ala Asp Phe Val Leu Ile Asp Lys Asp Gly Ala Val Lys Lys

815 820 825

Gly Ser Glu Ile Asp Tyr Asn Gly Ala Pro Gly Gly Tyr Ala Ala

830 835 840

Asp Pro Thr Glu Val Val Asn Tyr Val Ser Lys His Asp Asn Gln

845 850 855

Thr Leu Trp Asp Met Ile Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Glu Ala Asp

860 865 870

Leu Asp Thr Arg Val Arg Met Gln Ala Val Ser Leu Ala Thr Val

875 880 885

Met Leu Gly Gln Gly Ile Ala Phe Asp Gln Gln Gly Ser Glu Leu

890 895 900

Leu Arg Ser Lys Ser Phe Thr Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Gly Asp

905 910 915

Trp Phe Asn Arg Val Asp Tyr Ser Leu Gln Asp Asn Asn Tyr Asn

920 925 930

Val Gly Met Pro Arg Ser Ser Asp Asp Gly Ser Asn Tyr Asp Ile

935 940 945

Ile Ala Arg Val Lys Asp Ala Val Ala Thr Pro Gly Glu Ala Glu

950 955 960

Leu Lys Gln Met Thr Ala Phe Tyr Gln Glu Leu Thr Ala Leu Arg

965 970 975

Lys Ser Ser Pro Leu Phe Thr Leu Gly Asp Gly Ala Thr Val Met

980 985 990

Lys Arg Val Asp Phe Arg Asn Thr Gly Ala Asp Gln Gln Thr Gly

995 1000 1005

Leu Leu Val Met Thr Ile Asp Asp Gly Met Gln Ala Gly Ala Ser

1010 1015 1020

Leu Asp Ser Arg Val Asp Gly Ile Val Val Ala Ile Asn Ala Ala

1025 1030 1035

Pro Glu Ser Arg Thr Leu Gln Asp Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln

1040 1045 1050

Leu Ser Ala Ile Gln Gln Ala Ala Gly Asp Arg Ser Leu Ala Ser

1055 1060 1065

Gly Val Gln Val Ala Ala Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro Ala Trp

1070 1075 1080

Ser Val Ala Val Leu Glu Leu Pro Gln Gly Glu Ser Gln Gly Ala

1085 1090 1095

Gly Leu Pro Val Ser Ser Lys***

1100 1102

Claims

1.一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于将重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A接种于自诱导培养基中，并采用双温度调控方式，即将接种之后的自诱导培养基于37℃、200 rpm培养2~4小时后，将培养的温度降低到25℃继续培养48~72小时，培养结束后，收集发酵上清液获得胞外普鲁兰酶；步骤为：

（1）将来源于黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行重组表达：

a、普鲁兰酶基因的获得

CCTCC NO：M 2012108培养基：可溶性淀粉 10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L，KH₂PO₄ 5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L，NH₄Cl 0.5 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1 g/L，用超纯水配制，pH 6.5；

CCTCC NO：M 2012108菌种接种于培养基装液量为10%的250 mL摇瓶中，于37℃、200 rpm振荡培养72 h；培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因组DNA；

黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2；

合成引物1：5'- CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3'，引物1含有NheI 限制性酶切位点；

合成引物2：5'- CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3'，引物2含有EcoRI 限制性酶切位点；

PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL引物1：1 μL，50 pmol/μL引物2：1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的Taq DNA polymerase 0.5 μL；

PCR反应过程：94℃ 预变性5 min；98℃ 10 s，55℃ 1 min，72℃ 4 min，进行30个循环；72℃延伸10 min；

利用上海申能***生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit纯化DNA片断：

DNA溶液中加入1/10体积的3 mol/L、pH 5.2的乙酸钠溶液和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1小时；于4℃、12000 rpm离心30 min；加入75%乙醇500 μL洗涤，于4℃、12000 rpm离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20℃保存；

b、含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建

将CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶编码基因与质粒pET28a(+)连接，重组质粒转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板筛选获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A；步骤为：

目的基因及质粒pET28a(+)的酶切：

利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit，北京博大泰克生物基因技术有限公司提供，提取质粒pET28a(+)；

按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；

反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，NheI 2 μL，EcoRI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL；

目的基因与质粒pET28a(+)的连接：

将CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶编码基因与质粒pET28a(+)连接，反应体系组成如下：质粒pET28a(+) 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL；混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12 h；

重组质粒转化大肠杆菌：

在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min；转入42℃水浴中，热击90 s；快速转移至冰浴中，冷却2 min；加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 rpm摇床温育培养1 h；培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养；获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A；

（2）重组大肠杆菌的自诱导培养和双温度调控发酵产酶

自诱导培养基：α-乳糖 10-20 g /L，葡萄糖 0.5-1 g /L，甘油 5 g /L，KH₂PO₄ 6.8 g /L，MgSO₄ 0.24 g/L，蛋白胨 10 g /L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.9 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，NH₄Cl 2.67 g/L，痕量元素溶液 200 μL/L，用超纯水配制；

痕量元素溶液：含50 μM FeCl₃，20 μM CaCl₂·2H₂O，10 μM MnCl₂·4H₂O，10 μM ZnSO₄·7H₂O，2 μM CoCl₂·6H₂O，2 μM CuCl₂，2 μM NiCl₂，2 μM Na₂Mo₇O₂₄，2 μM Na₂SeO₃和2 μM H₃B₄O₇，用超纯水配制；

产酶的培养条件为：将重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上过夜活化培养，从固体平板上挑取单个菌落接种于3 mL含有50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中于37℃、200 rpm振荡培养，随时监测培养基中OD₆₀₀的变化情况，待OD₆₀₀达到2~3时，按5%~10%接种量接种于50 mL含50 μg/mL 卡那霉素的自诱导培养基中，将接种之后的自诱导培养基于37℃、200 rpm培养2~4小时后，将培养的温度降低到25℃继续培养48~72小时，培养结束后，10000 rpm离心去除菌体，收集发酵上清液为普鲁兰酶的粗酶液。

2.根据权利要求1所述应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于发酵生产胞外普鲁兰酶的优化自诱导培养基组成为：

α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 1 g/L，甘油 5 g/L，KH₂PO₄ 6.8 g/L，MgSO₄ 0.24 g/L，蛋白胨10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.9g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，NH₄Cl 2.67 g/L，Tween-80 9 g/L，痕量元素溶液200 μL/L，用超纯水配制；

工程菌E. coli BL21/pET28a(+)-pulA产酶的优化培养条件为：起始pH5.0~8.0，装液量10%~20%，培养温度为37℃、200 rpm先培养4小时后，再转入25℃培养56小时；

采用优化自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活达到60~70 U/mL。