CN103045565A

CN103045565A - 一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用

Info

Publication number: CN103045565A
Application number: CN2012105407123A
Authority: CN
Inventors: 裴建军; 庞倩; 赵林果; 王飞
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: CN103045565B

Abstract

一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。与现有的β-葡萄糖苷酶相比，本发明提供的融合酶（BGL-CBD）具有以下特点：（1）纤维素结合能力强，融合酶（1μg/μL）与4%wt微晶纤维素孵育30min，98%融合酶被纤维素吸附；（2）能有效降解纤维二糖，融合酶（0.15μg/μL）在8h内对10%wt的纤维二糖降解率为95%；（3）能耐高浓度的葡萄糖，其耐糖系数Ki为1000mmol/L。

Description

一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物质利用领域，具体涉及对耐高糖β-葡萄糖苷酶和纤维素结合结构域融合及其基因的重组表达与应用。

背景技术

随着人们生产和生活水平的提高，能源、资源和环境问题日益受到关注，利用农林废弃物制备生物能源、通过生物技术改善农林产品的品质、提高产品的附加值成为科学家关注的热点，也是发展绿色经济的希望所在。β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21）又称β-D-葡萄糖苷水解酶、龙胆二糖酶、纤维二糖酶、苦杏仁苷酶，是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键的酶（Science,2006,311:484-489.），因而被广泛应用纤维素水解领域。

纤维素作为植物光合作用的主要多糖类物质，是地球上最为丰富的可再生资源，这在石化能源日渐枯竭的今天是一个亟待开发的天然宝库。在纤维素水解过程中，β-葡萄糖苷酶的主要作用是降解纤维二糖生成葡萄糖，从而解除酶解体系中纤维二糖对内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)活性的抑制，从而提高酶解效率并降低成本(Biotechnology Advances,2000,18:355-383.)。目前使用的商业化纤维素酶主要来源于木霉（Trichoderma sp.），其具有高活力的内切和外切葡聚糖酶，但β-葡萄糖苷酶的活力很低，因此为了解决纤维二糖的抑制作用和提高酶解效率，在降解过程中需加入外源的β-葡萄糖苷酶。目前主要添加黑曲霉（Aspergillus niger）来源的β-葡萄糖苷酶（Novozymes SP188），该酶主要是由水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶组成，对纤维二糖具有较高的降解速率，但其耐葡萄糖系数Ki仅为3.4mM（纤维二糖为底物），因而随体系中葡萄糖浓度的升高，其降解纤维二糖的活力将受到极大的抑制，从而影响纤维素的连续酶解速率和效果(Biotechnology for Biofuels,2012,5:31.)。另外，木霉来源的内切和外切葡聚糖酶具有很好的纤维素结合结构域，在纤维素连续降解过程中，大部分内切和外切葡聚糖酶能和没降解的纤维素结合在一起，通过过滤可以实现内切和外切葡聚糖酶的回收，因而可以直接使用在下一次的纤维素降解。但目前使用的β-葡萄糖苷酶没有纤维素结合结构域，与纤维素结合能力很弱，因此主要存在于液体中，在连续酶解过程中需再次添加β-葡萄糖苷酶，增加了成本。因此，得到具有纤维素结合能力、耐高浓度葡萄糖、能有效降解纤维二糖的β-葡萄糖苷酶成为了纤维素低成本降解的关键。

本实验室在前期的研究中发现一个来源于Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticumDSM571的耐高糖β-葡萄糖苷酶，其具有优异的耐葡萄糖系数（Ki为600mM）和纤维二糖降解能力，并对其进行了克隆、表达研究(Biotechnology forBiofuels,2012,5:31.)。但是关于该β-葡萄糖苷酶与纤维素结合结构域的融合还没有文献报道。

发明内容

解决的技术问题：针对现有纤维素水解***中β-葡萄糖苷酶在应用中的缺点，本发明的目的是获得一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用。

技术方案：

一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

表达上述耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

包含上述核苷酸序列的重组质粒。

包含上述核苷酸序列的重组质粒pET-BGL-CBD。

包含耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶基因的重组质粒制备方法，步骤为：

（1）以Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571的基因组为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的PCR扩增产物，所述引物为：

P1：CCCCATATGTCGGACTTTAACAAGGAC，下划线表示Nde I位点；

P2：CCCGGATCCAATGGTCCTAGTGGAAATAAG，下划线表示BamH I位点，并去除终止密码子；

（2）将步骤（1）所得PCR扩增产物和pET-20b分别用Nde I和BamH I双酶切，并分别割胶回收，16℃过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒pET-BGL；

（3）以Clostridium cellulovorans743B的基因组为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增，得到纤维素结合结构域基因的PCR产物，所述引物为：

P3：CCCGGATCCCCACCACCAATGTCAGTTGAATTTTACAA，下划线表示BamH I位点，斜体表示加入的连接肽，

P4：CCCCTCGAGTGGTGCTGTACCAAGAACT，下划线Xho I位点；

（4）将步骤（3）所得的PCR扩增产物和pET-BGL分别用BamH I和Xho I双酶切，并分别割胶回收，16℃过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有融合纤维素结合结构域的耐高糖β-葡萄糖苷酶的融合酶基因的重组质粒pET-BGL-CBD。

包含上述重组质粒的大肠杆菌宿主细胞。

上述的耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶在纤维二糖降解中的应用。

具体方案内容为：

包括相关基因的克隆、基因的融合和重组表达和融合酶的定性。

1.参照NCBI上已发表的T.thermosaccharolyticum DSM571β-葡萄糖苷酶的基因序列（登录号：YP_003852393.1）设计引物，以提取的T.thermosaccharolyticum DSM571基因组DNA为模板进行PCR，获得耐高糖β-葡萄糖苷酶基因全序列，并将基因克隆到pET-20b载体，得到重组质粒pET-BGL。

2.参照NCBI上已发表的C.cellulovorans743B纤维素结合结构域的基因序列（登录号:ZP_07630535.1）设计引物，以直接购买的C.cellulovorans743B基因组DNA为模板进行PCR，获得纤维素结合结构域的基因序列，并将该序列克隆到重组质粒pET-BGL，得到重组质粒pET-BGL-CBD。

3.将重组质粒pET-BGL-CBD转化大肠杆菌JM109(DE3)，挑单菌落到摇瓶培养基，培养至合适的浓度，加入诱导剂诱导融合酶（BGL-CBD）的表达，并利用Ni亲和层析柱进行重组酶的纯化，最终得到融合酶（BGL-CBD）的纯酶

4.融合酶（BGL-CBD）的定性。融合酶BGL-CBD最适pH为6.0，最适反应温度为65℃，其耐葡萄糖系数Ki为1000mmol/L。融合酶BGL-CBD浓度为1μg/μL时，微晶纤维素浓度为4%wt时，可以吸附98%的融合酶BGL-CBD。0.15μg/μL融合酶BGL-CBD在8h内对10%wt的纤维二糖降解率为95%。

有益效果：与现有的β-葡萄糖苷酶相比，本发明提供的融合酶（BGL-CBD）具有以下特点：（1）纤维素结合能力强，融合酶（1μg/μL）与4%wt微晶纤维素孵育30min，98%融合酶被纤维素吸附；（2）能有效降解纤维二糖，融合酶（0.15μg/μL）在8h内对10%wt的纤维二糖降解率为95%；（3）能耐高浓度的葡萄糖，其耐糖系数Ki为1000mmol/L。

附图说明

图1是耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶（BGL-CBD）的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图2是微晶纤维素吸附融合酶BGL-CBD的SDS-PAGE蛋白电泳图（1：蛋白marker，2：微晶纤维素吸附融合酶（BGL-CBD）后的上清，3：微晶纤维素吸附融合酶（BGL-CBD）后的沉淀，4：吸附前的融合酶（BGL-CBD）；

图3是耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶（BGL-CBD）对纤维二糖的降解图。

具体实施方式

实施例1：T.thermosaccharolyticum DSM571耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的获得及重组质粒pET-BGL的构建

1.1T.thermosaccharolyticum DSM571的培养

T.thermosaccharolyticum DSM571购于DSMZ菌种保藏中心（www.dsmz.de）编号为571。其培养基配方为：10g/L淀粉（starch），5g/L胰蛋白胨（tryptone），3g/L酵母抽提物(yeastextract)，5g/L肉膏（meat extract）,10g/L2-吗啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic）,10mg/LFeSO₄·7H₂O,1mg/L resazurin,调整pH为7.2，煮沸充氮气，去除氧气，培养基在无氧条件下装入厌氧瓶灭菌。用注射器按照0.5%wt接种量接种，63℃静止培养24h，收集细胞。

1.2基因组DNA的提取

（1）静置培养T.thermosaccharolyticum DSM57124h，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。

（2）用9.5mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL10％wt十二烷基硫酸钠（SDS）和50μL蛋白酶K（20mg/mL），混合均匀，37℃保温1h。

（3）加入1.8mL5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）/NaCl，混匀，65℃温育20min。

（4）加入等体积氯仿/异戊醇（体积比24:1），混匀，6,000g离心10min。

（5）为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（体积比25:24:1）混匀，6,000g离心10min。

（6）另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。

（7）用吸管将DNA缠绕其上，在70％wt酒精中清洗。

（8）用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。

（9）室温下风干，加500μL TE缓冲液溶解。

（10）取50μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。

1.3重组质粒pET-BGL的构建

按照已知的T.thermosaccharolyticum DSM571耐高糖β-葡萄糖苷酶基因设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。P1：CCCCATATGTCGGACTTTAACAAGGAC，下划线表示NdeI位点。P2：CCCGGATCCAATGGTCCTAGTGGAAATAAG，下划线表示BamH I位点，并去除终止密码子。以提取的T.thermosaccharolyticum DSM571的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环（94℃，50s；51℃，90s；72℃，1min）；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到T.thermosaccharolyticumDSM571耐高糖β-葡萄糖苷酶基因。

得到T.thermosaccharolyticum DSM571耐高糖β-葡萄糖苷酶基因和pET-20b分别用Nde I和BamH I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒pET-BGL。

实施例2：重组质粒pET-BGL-CBD的构建

2.1Clostridium cellulovorans743B的基因组DNA

C.cellulovorans743B基因组DNA直接购于DSMZ菌种保藏中心（www.dsmz.de）编号为3052。

2.2重组质粒pET-BGL-CBD的构建

按照已知的C.cellulovorans743B纤维素结合结构域（CBD）的基因序列（登录号:ZP_07630535.1）设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。P3：CCCGGATCCCCACCACCAATGTCAGTTGAATTTTACAA，下划线表示BamH I位点，斜体表示加入的连接肽，连接肽的作用是将纤维素结合结构域和耐高糖β-葡萄糖苷酶进行功能性连接（自然科学进展，2008,18(7):742-745）。P4：CCCCTCGAGTGGTGCTGTACCAAGAACT，下划线Xho I位点。以购买的C.cellulovorans743B基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环（94℃，50s；51℃，90s；72℃，30s）；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到C.cellulovorans743B纤维素结合结构域（CBD）的基因序列。

将得到C.cellulovorans743B纤维素结合结构域（CBD）的基因序列和pET-BGL分别用BamH I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶基因的重组质粒pET-BGL-CBD。

实施例3：重组融合酶（BGL-CBD）的制备

将重组质粒pET-BGL-CBD转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌（Novagen），在含有氨苄青霉素（50μg/mL）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L）上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中（50μg/mL氨苄青霉素）37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，30℃培养6h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。

由于重组质粒pET-BGL-CBD中含有His-tag标签，通过His·Bind Purification Kit（Novagen）进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：

A.样品的处理

（1）将洗涤过的菌体，用1×Binding Buffer 8mL重悬，超声波破壁。

（2）破壁后，13,000g离心30min，取上清即为样品。

B.处理柱子

（1）取1mL填料装柱。

（2）用3mL的无菌水洗柱子。

（3）用5mL的1×Charge Buffer洗柱子。

（4）用3mL的1×Binding Buffer洗柱子。

C.上样

（1）将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。

（2）用3mL1×Binding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。

（3）用4mL含有20mM咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。

（4）用80mmol/L咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。

（5）用4mL1×Strip Buffer洗柱子。

通过此过程得到纯化的融合酶BGL-CBD，纯化的融合酶BGL-CBD的纯度鉴定采用SDS-PAGE方法进行，结果如图1所示。

实施例4：融合酶（BGL-CBD）的定性及对纤维二糖的降解

4.1酶活测定

反应体系100μL，5μL20mmol/L对硝基苯β-D葡萄糖苷（pNPG）中加入85μL100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH6.0），先在65℃孵育5min，再加入10μL酶液（稀释到合适的倍数）反应10min，显色后再加入1mol/L的碳酸钠溶液600μL终止反应。在405nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmol p-硝基苯酚所用的酶量为1个酶活力单位。

4.2最适反应温度的测定

在35-80℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲为100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH6.0，发现融合酶BGL-CBD的最适反应温度为65℃。

4.3最适反应pH的测定

在不同的pH（4.0-8.2，100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）条件下，65℃分别测定酶活，发现融合酶BGL-CBD的最适反应pH为6.0。

4.4温度稳定性的测定

在pH6.0下，使酶在55℃，60℃，65℃温度下分别保温不同的时间（0，20，40，60，90，120min），再测定相对酶活，以未保温（4℃保存）的酶样活性为100%，发现融合酶（BGL-CBD）在60℃保温1h，残存酶活还有70%。

4.5pH稳定性的测定

将纯化的融合酶BGL-CBD在不同的pH（4.0-8.0，100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）下55℃处理2h，与不保温酶的酶活相比，发现融合酶BGL-CBD在5.5-7.5都很稳定。

4.6融合酶（BGL-CBD）对葡萄糖的耐糖系数的测定

在反应体系中，加入不同浓度的葡萄糖浓度（0mmol/L,50mmol/L,100mmol/L,200mmol/L,400mmol/L,600mmol/L，800mmol/L,1000mmol/L，1200mmol/L），发现葡萄糖浓度不超过200mmol/L对融合酶BGL-CBD酶活有激活作用，而融合酶BGL-CBD对葡萄糖的耐糖系数Ki为1000mmol/L，较没有融合CBD原始的β-葡萄糖苷酶的耐糖系数Ki（600mmol/L）有大幅度提高。

4.7融合酶（BGL-CBD）的纤维素吸附能力的测定

吸附体系为400μL：40μL的融合酶BGL-CBD（10μg/μL），0.016g微晶纤维素，360μLpH6.0100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，50℃，100rpm孵育30min，离心，通过SDS-PAGE和测酶活确定上清和沉淀中的融合酶（BGL-CBD）的量，发现98%的融合酶（BGL-CBD）被纤维素吸附而在沉淀中，吸附后上清基本没有融合酶（BGL-CBD）（图2）。

4.8融合酶（BGL-CBD）对纤维二糖的降解

降解体系为200μL：3μL的融合酶BGL-CBD（10μg/μL），0.02g纤维二糖，197μL pH6.0100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，60℃，反应不同时间（1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h）取样，用葡萄糖检测试剂盒（上海荣盛生物医药有限公司）测定葡萄糖的量，结果如图3所示，8h时95%的纤维二糖被降解，葡萄糖的浓度为560mmol/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asp Phe Asn Lys Asp Phe Leu Phe Gly Val Ala Thr Ala Ser

1 5 10 15

Tyr Gln Val Glu Gly Ala Tyr Asn Glu Asp Gly Arg Ser Met Ser Ile

20 25 30

Trp Asp Thr Phe Cys Arg Gln Asp Gly Lys Val Tyr Lys Gly His Asn

35 40 45

Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Leu Tyr Lys Asp Asp Val Lys

50 55 60

Met Met Lys Asp Leu Gly Ile Glu Ala Tyr Arg Phe Ser Ile Ala Trp

65 70 75 80

Pro Arg Ile Phe Pro Glu Lys Gly His Tyr Asn Pro Lys Gly Ile Asp

85 90 95

Phe Tyr Lys Arg Leu Thr Asp Glu Leu Leu Lys Asn Asp Ile Lys Pro

100 105 110

Phe Val Thr Ile Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Trp Ala Asp Asp Leu

115 120 125

Gly Gly Trp Leu Asn Arg Glu Val Val Asp Trp Phe Gly Glu Tyr Val

130 135 140

Ser Lys Leu Phe Asn Glu Leu Gly Gly Tyr Ile Arg Asn Trp Ile Thr

145 150 155 160

Leu Asn Glu Pro Trp Cys Ser Ser Phe Leu Ser Tyr Phe Ile Gly Glu

165 170 175

His Ala Pro Gly His Lys Asp Leu Gly Glu Ala Val Leu Val Ser His

180 185 190

Asn Leu Leu Leu Ala His Gly Lys Ala Val Glu Ile Phe Arg Asp Ile

195 200 205

Asn Ser Ser Asp Ser Lys Ile Gly Ile Thr Leu Asn Leu Asn Glu Val

210 215 220

Phe Pro Ala Thr Asp Ser Pro Glu Asp Lys Ala Ala Ala Arg Ile Ala

225 230 235 240

Asp Gly Phe Gln Asn Arg Trp Phe Leu Asp Pro Ile Phe Lys Gly Glu

245 250 255

Tyr Pro Lys Asp Met Leu Glu Leu Phe Gly Lys Tyr Ala Lys Thr Asp

260 265 270

Phe Ile Thr Asp Gly Asp Leu Lys Arg Ile Ser Gln Lys Leu Asp Phe

275 280 285

Leu Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Ala Val Val Lys Lys Gly Asn Asp

290 295 300

Gly Ile Leu Asn Ala Glu Gln Ile Asp Val Asp Asn Glu Lys Thr Glu

305 310 315 320

Met Gly Trp Glu Val Tyr Pro Glu Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Met Arg

325 330 335

Leu Lys Asn Glu Tyr Thr Phe Asp Leu Pro Leu Tyr Ile Thr Glu Asn

340 345 350

Gly Ala Ala Tyr Lys Asp Val Val Ser Asp Asp Gly His Val His Asp

355 360 365

Glu Lys Arg Val Glu Phe Leu Lys Lys His Phe Lys Gln Ala Lys Arg

370 375 380

Phe Ile Asp Asp Gly Gly Asn Leu Arg Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu

385 390 395 400

Met Asp Asn Phe Glu Trp Ala His Gly Tyr Ser Lys Arg Phe Gly Ile

405 410 415

Val Tyr Val Asp Tyr Glu Thr Glu Lys Arg Ile Leu Lys Asp Ser Ala

420 425 430

Leu Trp Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Thr Arg Thr Ile Gly Ser Pro Pro

435 440 445

Pro Met Ser Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Lys Ser Ala Gln Thr Asn

450 455 460

Ser Ile Thr Pro Ile Ile Lys Ile Thr Asn Thr Ser Asp Ser Asp Leu

465 470 475 480

Asn Leu Asn Asp Val Lys Val Arg Tyr Tyr Tyr Thr Ser Asp Gly Thr

485 490 495

Gln Gly Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Gly Ala Leu Leu Gly Asn

500 505 510

Ser Tyr Val Asp Asn Thr Ser Lys Val Thr Ala Asn Phe Val Lys Glu

515 520 525

Thr Ala Ser Pro Thr Ser Thr Tyr Asp Thr Tyr Val Glu Phe Gly Phe

530 535 540

Ala Ser Gly Ala Ala Thr Leu Lys Lys Gly Gln Phe Ile Thr Ile Gln

545 550 555 560

Gly Arg Ile Thr Lys Ser Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Thr Asn Asp

565 570 575

Tyr Ser Phe Asp Ala Ser Ser Ser Thr Pro Val Val Asn Pro Lys Val

580 585 590

Thr Gly Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Val Leu Gly Thr Ala Pro *

595 600 605

<210> 2

<211> 1821

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtcggact ttaacaagga ctttttattt ggagtagcaa cagcttcata tcaagttgaa 60

ggtgcttaca atgaggatgg caggagtatg tcaatctggg atacgttttg caggcaggat 120

ggaaaggtat acaaaggcca caatggcgat gtggcttgtg atcactatca tctttacaaa 180

gatgatgtaa agatgatgaa agacttaggc attgaagctt atagattctc tattgcatgg 240

cctagaattt ttccagagaa aggtcattac aatccaaaag gcattgattt ttataagagg 300

ctgacagatg agctccttaa aaatgatata aaaccatttg tcacaatcta tcattgggat 360

ttgcctcaat gggctgatga tttaggtgga tggcttaata gagaagttgt agattggttt 420

ggcgaatatg tatcaaagct ttttaacgag cttggcgggt acataagaaa ttggataact 480

ttaaatgagc cttggtgttc atcattctta tcatacttta taggtgagca cgctcctgga 540

cacaaagact tgggagaagc agttttagtt tcacacaacc ttttgcttgc acatggcaag 600

gctgtagaaa tattcagaga cataaattca agtgattcta aaataggtat aacactaaat 660

ttaaatgaag tatttccagc tacagatagt cctgaggata aagctgccgc tcgaatagct 720

gatggattcc aaaacagatg gtttttagat ccgatattta aaggtgaata tccaaaggat 780

atgctggagt tatttggtaa atatgcaaag actgatttta taacagatgg cgatttaaaa 840

cggatttcac agaaattaga ttttcttggc gtcaattatt atactagagc tgttgttaag 900

aaaggcaatg acggtatttt aaatgctgag caaatagatg ttgataatga aaaaactgag 960

atgggatggg aggtttatcc tgaatcactt tacaatatat tgatgagatt gaaaaatgaa 1020

tatacttttg atttgccatt atatattaca gaaaatggtg ctgcctataa agatgtggta 1080

tcagatgatg gacacgtcca tgatgaaaaa agggtcgagt ttttgaagaa acattttaaa 1140

caggctaagc gtttcataga cgatggagga aatttgaggg gatattttgt gtggtcattg 1200

atggacaatt ttgaatgggc tcatggttat tcaaagaggt ttggaatagt atatgtagat 1260

tatgaaacag agaaaaggat attgaaagat agcgcattgt ggtacaagaa tcttatttcc 1320

actaggacca ttggatcccc accaccaatg tcagttgaat tttacaactc taacaaatca 1380

gcacaaacaa actcaattac accaataatc aaaattacta acacatctga cagtgattta 1440

aatttaaatg acgtaaaagt tagatattat tacacaagtg atggtacaca aggacaaact 1500

ttctggtgtg accatgctgg tgcattatta ggaaatagct atgttgataa cactagcaaa 1560

gtgacagcaa acttcgttaa agaaacagca agcccaacat caacctatga tacatatgtt 1620

gaatttggat ttgcaagcgg agcagctact cttaaaaaag gacaatttat aactattcaa 1680

ggaagaataa caaaatcaga ctggtcaaac tacactcaaa caaatgacta ttcatttgat 1740

gcaagtagtt caacaccagt tgtaaatcca aaagttacag gatatatagg tggagctaaa 1800

gttcttggta cagcaccata a 1821

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccccatatgt cggactttaa caaggac 27

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccggatcca atggtcctag tggaaataag 30

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccggatccc caccaccaat gtcagttgaa ttttacaa 38

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccctcgagt ggtgctgtac caagaact 28

Claims

1.一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.表达权利要求1所述耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶的基因，其DNA序列如SEQ IDNO.2所示。

3.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒。

4.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒pET-BGL-CBD。

5.包含耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶基因的重组质粒制备方法，其特征在于：

P1：CCCCATATGTCGGACTTTAACAAGGAC，下划线表示Nde I位点;

（2）将步骤（1）所得PCR扩增产物和pET-20b分别用Nde I和BanH I双酶切，并分别割胶回收，16℃过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒pET-BGL；

P4：CCCCTCGAGTGGTGCTGTACCAAGAACT，下划线Xho I位点；

6.包含权利要求4所述重组质粒的大肠杆菌宿主细胞。

7.权利要求1所述的耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶在纤维二糖降解中的应用。