CN102994425A

CN102994425A - 一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法

Info

Publication number: CN102994425A
Application number: CN2012104817493A
Authority: CN
Inventors: 聂尧; 徐岩; 严伟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-11-24
Filing date: 2012-11-24
Publication date: 2013-03-27

Abstract

一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明将质粒pET20b(+)的信号肽PelB与长野芽孢杆菌（Bacillusnaganoensis）CCTCC NO：M2012388普鲁兰酶基因pul连接，并共同***表达载体pET28a(+)中，构建带有信号肽和目的基因的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-PelB-pul。将自诱导培养和添加甘氨酸调控细胞透性的策略用于胞外普鲁兰酶的发酵生产，采用乳糖浓度10g/L的自诱导培养基，于37℃、200rpm震荡培养约2h后，添加终浓度6g/L的甘氨酸并转入20℃下培养70h，胞外普鲁兰酶酶活达505U/mL，比野生菌出发菌株的酶活力提高1260倍。本发明的应用具有重要意义。

Description

一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法

技术领域

一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。

背景技术

普鲁兰酶（pullulanase, EC.3.2.1.41）是一类可以特异性水解普鲁兰、支链淀粉及其极限糊精中的α-1，6-糖苷键的脱支酶。在淀粉糖化过程中，普鲁兰酶与糖化酶共同作用，普鲁兰酶切割支链淀粉分支点，糖化酶只需切割线性的低聚糖，即可显著地提高淀粉的水解效率。使用普鲁兰酶不仅可降低糖化酶用量，还可使DE值提高到97%以上，提高水解产物葡萄糖或麦芽糖的质量和纯度。

目前已发现多种产普鲁兰酶的微生物，但大部分都无法应用于工业生产，主要原因有：（1）酶的耐热耐酸性差，淀粉的糖化过程在55℃-60℃、pH 4.5-5.0的范围内进行，而大多数种类的普鲁兰酶在此范围内活性很低；（2）酶活水平低，很多普鲁兰酶产生菌胞外分泌普鲁兰酶的能力不强，分泌的普鲁兰酶又容易遭到蛋白酶的降解，因此难以进行工业化生产。目前，普鲁兰酶的工业化生产菌株极少，只有诺维信公司和杰能科公司有能力工业化生产并销售此酶。诺维信公司的普鲁兰酶产品占领了中国乃至世界95%以上的市场份额，其价格相当昂贵。我国关于普鲁兰酶的研究主要集中在产普鲁兰酶菌株的筛选和优化等方面，效果均不太理想。随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术改造菌种，进一步提高酶的产量及活性，降低生产成本成为可能，并在世界范围内越来越得到重视。近几年，我国学者利用基因工程技术构建基因工程菌株，取得了一定的效果。例如，2006年，夏子芳用大肠杆菌表达***表达海栖热胞菌普鲁兰酶基因，得到少量酶活；2008年，张明焱在大肠杆菌表达***中表达Bacillus licheniforms的普鲁兰酶编码基因，获得5.6 U/mL酶活；2010年，王淑军等从深海古菌Thermococcus siculi HJ21中PCR扩增出一种新的普鲁兰酶基因，并在大肠杆菌中得到表达，但酶活较低。综上所述，在普鲁兰酶的微生物发酵生产过程中，不论是野生菌还是工程菌，主要存在的问题就是胞外酶活较低，造成了普鲁兰酶的生产成本上升，形成工业化生产的障碍。

本发明利用基因工程表达调控技术，构建了适用于普鲁兰酶表达分泌的基因工程菌株，在自诱导培养基中实现过量表达普鲁兰酶，并通过添加甘氨酸改变细胞通透性而进一步提高胞外普鲁兰酶的产量，为工业化生产奠定了基础。

发明内容

（1）要解决的技术问题

本发明的目的是提供基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法。本发明目的不仅仅在于通过微生物菌株发酵生产胞外普鲁兰酶，而是通过构建适合的大肠杆菌表达***将具有优良的耐酸耐热性能的长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在大肠杆菌中获得高效重组表达，而且利用自诱导培养基并通过添加甘氨酸调控细胞透性的策略进一步提高重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶的能力和产量，从而开发新型重组普鲁兰酶的生产工艺和应用价值。

（2）技术方案

本发明首先构建表达长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）CCTCC M 2012388普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌，将来源于长野芽孢杆菌的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行重组表达，在此基础上，将重组大肠杆菌在自诱导培养基中发酵培养以高效表达普鲁兰酶，并通过添加甘氨酸获得胞外普鲁兰酶的高效生产。

一种长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）LBMAE-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2012388；

来源于CCTCC NO：M 2012388菌株的普鲁兰酶基因pul，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。

用CCTCC NO：M 2012388菌株构建重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul的方法，将来源于CCTCC NO：M 2012388菌株的普鲁兰酶基因pul在大肠杆菌中进行重组表达；步骤为：

一、普鲁兰酶基因pul的获得

CCTCC NO：M 2012388培养基：CaCl₂ 0.25 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，

（NH₄）₂SO₄ 0.2 g/L，酵母提取物 2 g/L，无水葡萄糖 5 g/L，KH₂PO₄ 3 g/L，无机盐溶液1 mL/L，用双蒸水配制，pH 5.0。无机盐溶液：ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L，MnCl₂·H₂O 0.03 g/L，H₃BO₃ 0.3 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.2 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.01 g/L，NiCl₂·6H₂O 0.02 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.03 g/L。

将CCTCC NO：M 2012388菌种接种于含有25 mL培养基的250 mL摇瓶中，于37℃、200 rpm振荡培养72 h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System（VIOGENE公司）提取基因组DNA。

合成引物1：5’- gaacaGGATCCagatgggaacaccacaaaC -3’，

合成引物2：5’- attccctcgagtttaccatcagatgggct -3’。

引物1含有BamHI限制性酶切位点，引物2含有XhoI限制性酶切位点。

PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP（25 mmol/L）0.5 μL，引物1（50 pmol/μL）1 μL，引物2（50 pmol/μL） 1 μL，基因组DNA 5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL。

以CCTCC NO：M 2012388基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增普鲁兰酶基因。PCR反应过程：95℃预变性5 min；95℃ 1 min、60℃ 0.5 min、72℃ 2 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。

利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能***生物科技有限公司）纯化DNA片断。

DNA溶液中加入1/10体积的乙酸钠溶液（3 mol/L，pH 5.2）和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1h。12000 rpm于4℃离心30 min。加入75%乙醇500 μL洗涤，12000 rpm于4℃离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，所得普鲁兰酶基因pul立即使用或-20℃保存。

二、含有普鲁兰酶基因pul的重组大肠杆菌的构建

目的基因pul及质粒pET20b(+)的酶切

利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒pET20b(+)。

按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。

反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，基因组DNA 10 μL，BamHI 2 μL，XhoI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL。

目的基因pul与质粒pET20b(+)的连接

将目的基因pul与质粒pET20b(+)连接，反应体系组成如下：质粒pET20b(+) 0.8 μL，目的基因pul4.2 μL，Ligation Solution 5 μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接反应12小时，得重组质粒pET20b(+)-pul。

重组质粒pET20b(+)-pul转化大肠杆菌

在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL重组质粒pET20b(+)-pul，轻轻混匀，冰浴中静置30分钟。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。加入700 μL的LB液体培养基，37℃、100 rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3000 rpm离心2min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 氨苄抗生素的LB平板上，37℃倒置培养。获得含有目的普鲁兰酶基因pul的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET20b(+)-pul。

带有信号肽PelB的目的基因与质粒pET28a(+)的连接

将重组质粒pET20b(+)-pul及表达载体pET28a(+)分别用限制性内切酶XbaI及XhoI分步单酶切。按照水、缓冲液、重组质粒pET20b(+)-pul或表达载体pET28a(+)、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，pET20b(+)-pul或pET28a(+) 10 μL，XbaI 2 μL，XhoI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL。

将胶回收线性化的目标片段PelB-pul与pET28a(+)载体连接，反应体系组成如下：载体pET28a(+) 1 μL，目标片段PelB-pul4 μL，Ligation Solution 5 μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接反应12小时，得重组质粒pET28a(+)-PelB-pul。

重组质粒pET28a(+)-PelB-pul转化大肠杆菌

在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL pET28a(+)-PelB-pul，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。加入700 μL的LB液体培养基，37℃、100 rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3000 rpm离心2min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养。获得含有目的普鲁兰酶基因pul的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul。

三、重组大肠杆菌的培养和胞外普鲁兰酶的生产

自诱导培养

自诱导培养基(g/L)：β-乳糖 1~50，无水葡萄糖0.5，甘油5，KH₂PO₄6.8，MgSO₄0.24，胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na₂HPO₄7.1，Na₂SO₄0.71，NH₄Cl 2.67，痕量元素溶液 400 μL/L，pH 7.5~8.0。

痕量元素溶液(g/L)：FeCl₃ 8.125，CaCl₂ 2.22，MnCl₂ 2.52，ZnSO₄ 1.61，CoCl₂ 0.26，CuCl₂ 0.27，NiCl₂ 0.26，Na₂MoO₄ 0.41，Na₂SeO₃ 0.346，H₃BO₃ 0.124，HCl 2.19。

将重组菌E.coliBL21(DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上过夜活化培养，从固体平板上挑取单个菌落接种于3 mL含有50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中于37℃、200 rpm振荡培养，随时监测培养基中OD₆₀₀的变化情况，待OD₆₀₀达到2~3时，按5%~10%接种量接种于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的自诱导培养基中，于10~40℃、200rpm震荡培养2~20h后，添加终浓度1~25 g/L的甘氨酸，温度转为10~40℃培养60~70h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。

分别考察了诱导温度、甘氨酸使用浓度、37℃下培养时间和乳糖浓度的影响，最终确定了自诱导条件为：自诱导培养基中乳糖浓度为10 g/L，在37℃下培养2h后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸并转入20℃下培养70h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。

采用优化的自诱导培养基和发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到505 U/mL。

普鲁兰酶测定方法

取100 μL用100 mM、pH 5.0的醋酸缓冲液适当稀释的酶液与等体积的溶于100 mM、pH 5.0醋酸缓冲液中的10 g/L 普鲁兰相混合于50 ℃水浴中保温30min。加入DNS试剂300 μL摇匀，置于沸水中煮沸15min，取出以流动水迅速冷却后，于540 nm波长处，以0.5 cm比色杯，测定反应液的吸光度值。

酶活单位定义：在上述指定的条件下，每min催化分解普鲁兰多糖生成相当于1 μmol葡萄糖的还原糖所需的酶为1个酶活单位（U）。

（3）有益效果

成功克隆了长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）CCTCC NO：M 2012388普鲁兰酶编码基因，该基因全长2781 bp，编码926个氨基酸残基，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。

将质粒pET20b(+)的信号肽PelB与长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）CCTCC NO：M 2012388普鲁兰酶编码基因pul连结，并共同***表达载体pET28a(+)中，转化入相应表达宿主E. coli BL21(DE3)中成功构建带有信号肽和目的基因pul的重组菌株E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul。

将自诱导培养基和添加甘氨酸调控细胞透性的策略用于重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul的培养和普鲁兰酶的发酵产酶，优化自诱导培养基和发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到505 U/mL，比长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）CCTCC M 2012388出发菌株的酶活力（0.4 U/mL）提高1260倍。这些工作为重组大肠杆菌高效生产胞外普鲁兰酶提供了有效策略，对于开发新型重组胞外普鲁兰酶的生产工艺和应用价值具有重要意义。

生物材料样品保藏：长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）LBMAE-1已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简写CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2012388，保藏日期为2012年9月28日。

具体实施方式

实施例1

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0。需要时使用前加入卡那霉素（50 μg/mL），固体培养基添加15 g/L琼脂粉。

挑取重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度0.8 mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养12h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。利用LB培养基和IPTG诱导方式，获得胞外重组普鲁兰酶活力为8 U/mL。

实施例2

挑取重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度0.4 mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养12h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。利用LB培养基和IPTG诱导方式，获得胞外重组普鲁兰酶活力为11 U/mL。

实施例3

自诱导培养基(g/L)：β-乳糖 10，无水葡萄糖0.5，甘油5，KH₂PO₄6.8，MgSO₄0.24，胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na₂HPO₄7.1，Na₂SO₄0.71，NH₄Cl 2.67，痕量元素溶液 400 μL /L，pH 7.5~8.0。痕量元素溶液(g/L)：FeCl₃ 8.125，CaCl₂ 2.22，MnCl₂ 2.52，ZnSO₄ 1.61，CoCl₂ 0.26，CuCl₂ 0.27，NiCl₂ 0.26，Na₂MoO₄ 0.41，Na₂SeO₃ 0.346，H₃BO₃ 0.124，HCl 2.19。

重组菌E.coliBL21(DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul菌液接种于50 mL含50mg/L卡那霉素的自诱导培养基中，于37℃、200rpm震荡培养3小时后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸，温度转为20℃培养60小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。采用自诱导培养基和优化的发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到306.5 U/mL。

实施例4

自诱导培养基(g/L)：β-乳糖 10，无水葡萄糖0.5，甘油5，KH₂PO₄6.8，MgSO₄0.24，胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na₂HPO₄7.1，Na₂SO₄0.71，NH₄Cl 2.67，痕量元素溶液 400 μL/L，pH 7.5~8.0。痕量元素溶液(g/L)：FeCl₃ 8.125，CaCl₂ 2.22，MnCl₂ 2.52，ZnSO₄ 1.61，CoCl₂ 0.26，CuCl₂ 0.27，NiCl₂ 0.26，Na₂MoO₄ 0.41，Na₂SeO₃ 0.346，H₃BO₃ 0.124，HCl 2.19。

重组菌E.coliBL21(DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul菌液接种于50 mL含50mg/L卡那霉素的自诱导培养基中，于37℃、200rpm震荡培养2h后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸，温度转为20℃培养60h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。采用自诱导培养基和优化的发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到440.7 U/mL。

实施例5

重组菌E.coliBL21(DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul菌液接种于50 mL含50mg/L卡那霉素的自诱导培养基中，于37℃、200rpm震荡培养3h后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸，温度转为20℃培养70h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。采用自诱导培养基和优化的发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到405.2 U/mL。

实施例6

重组菌E.coliBL21(DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul菌液接种于50 mL含50mg/L卡那霉素的自诱导培养基中，于37℃、200rpm震荡培养2h后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸，温度转为20℃培养70h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。采用自诱导培养基和优化的发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到505 U/mL。

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 2781

<212> DNA

<213> 长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）CCTCC NO：M 2012388

<214>

gatgggaaca ccacaaacat cgtagtccat tattttcgtc ctagtgggga ttatacggat 60

tggaatcttt ggatgtggcc ggagaacggt gatggggctg agtatgattt taatcaaccg 120

actgattctt atggggaggt tgcaagtgtg gacattcctg gaaacccaag tcaagtaggg 180

attattgtcc gtaaaggaaa ttgggatgcg aaagacattg atagtgaccg ctacatcgat 240

ttaagcaaag ggcatgagat ttggctcgtc caaggaaaca gccagatttt ctatagtgaa 300

aaggatgctg aggcagccgc acaacctgct gtaagtaacg cttatttaga tgcttccaac 360

caagtgttgg tcaagcttag ccagccgttt actcttggtg aaggttcaag cggttttacg 420

gttcatgatg acacagcaaa taaggatatt ccagttacat ctgttagtga tgccaatcag 480

gtaacggctg ttttagcagg tactttccag catatttttg gggggagtga ttgggcaccg 540

gataatcaca atactttact aaaaaaggtg aatagcaatc tctatcaatt ttcaggaaat 600

cttcctgaag gaaactacca atataaagtg gctttaaatg atagctggaa taatccgagc 660

tacccatctg ataacattaa tttgacagtg ccagctggtg gtgcccatgt tacattttct 720

tatatcccat ccacccatgc tgtttatgac acgattaaca atcctaatgc ggatttacaa 780

gtagatagca gcggtgttaa gacggatctc gtggcggtta ctcttggaga aaatcctgat 840

gtaagccata ccctgtccat tcaaacagag gactatcagg caggacaggt catacctcgt 900

aaggtgcttg attcatccca gtactactat tccggagatg atctcgggaa tacctataca 960

aagaatgcaa ctacctttaa ggtctgggcg cctacatcca ctcaagtaaa tgtccttctt 1020

tataatagtg caaccggcgc ggtaactaaa acggttccaa tgaccgcatc aggccatggt 1080

gtatgggaag caacagtcaa ccaagacctt gaaaattggt attacatgta tgaggtaaca 1140

ggacaaggct caacccgaac ggctgttgat ccgtatgcaa cagctattgc accaaacgga 1200

acgagaggca tgattgtgga cctagccaaa acagacccgg ccggatggga gagtgacaaa 1260

catattacgc caaagaatat agaagatgaa gtcatctatg aaatggatgt tcgtgacttt 1320

tccatcgact ctaattcggg tatgaaaaat aaaggaaagt atttggcact tacagaaaaa 1380

ggaactaaag gccctgacaa tgtaaagaca ggggtagatt ccttaaaaca acttgggatt 1440

actcatgttc agcttcagcc tgttttcgca tttaatagtg tcaatgaaaa cgatccaact 1500

caatataatt ggggttatga ccctcgcaac tacaatgttc ctgagggaca atatgctact 1560

aatgcaaacg gaacaactcg gattaaagag tttaaggaaa tggttctttc actccatcag 1620

gaccacattg gggttaatat ggatgttgtt tataatcata cctttgccac gcaaatctct 1680

gacttcgata agattgtacc agaatattac taccgcacgg atgatgctgg taactacact 1740

aacggctcag gtactggaaa cgaaatcgca gccgaaagac caatggttca aaaatttatt 1800

atcgattcac ttaagttttg ggtcaatgag taccacgttg acggtttccg ttttgactta 1860

atggcgttgc ttggaaaaga tacaatgtct aaagctgcca cgcagcttca tgccattgat 1920

ccaggaattg ctctctacgg tgagccatgg acaggaggaa catccgcgct gccagccgat 1980

cagcttttaa caaaaggagc tcaaaaaggc atgggagtgg ctgtatttaa tgacaatctg 2040

cgaaacggtt tggacggcag tgtctttgat tcatctgctc aaggttttgc gacaggtgct 2100

actggtttaa cggatgctat taaaaatgga gttgaaggaa gtattaatga cttcaccgct 2160

tcaccaggcg agacgatcaa ctatgtcaca agtcatgata actataccct ttgggacaag 2220

attgcccaaa gcaatccaaa cgattctgaa gcggatcgaa ttaaaatgga tgagctcgct 2280

caagcgatcg tcatgacctc acaaggcatt cctttcatgc agggcgggga agaaatgctt 2340

cgtacgaaag gcggcaacga caatagctat aatgctggtg atgtagtgaa cgagtttgat 2400

tggagcagaa aagctcaata tccagatgtt ttcaattatt atagcgggct gattcatctt 2460

cgtcttgatc acccagcctt ccgcatgacg acagctaatg aaatcaatag ccacctccaa 2520

ttcctaaata gcccagagaa cacagtggcc tatgaattat ctgatcatgc aaataaagat 2580

acatggggta atattgtggt tatttataat ccaaataaaa cggcagaaac cattaatttg 2640

ccaagcggga aatgggaaat caatgcgacg agcggtaagg tgggagaatc cacacttggt 2700

caagcagagg gcagtgttca agttccaggc atatctatga tgattcttca tcaagaagta 2760

agcccatctg atggtaaata g 2781

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 926

<212> PRT

<213> 长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）CCTCC NO：M 2012388

<400>1

Asp Gly Asn Thr Thr Asn Ile Val Val His Tyr Phe Arg Pro Ser

1 5 10 15

Gly Asp Tyr Thr Asp Trp Asn Leu Trp Met Trp Pro Glu Asn Gly

20 25 30

Asp Gly Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Thr Asp Ser Tyr Gly

35 40 45

Glu Val Ala Ser Val Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly

50 55 60

Ile Ile Val Arg Lys Gly Asn Trp Asp Ala Lys Asp Ile Asp Ser

65 70 75

Asp Arg Tyr Ile Asp Leu Ser Lys Gly His Glu Ile Trp Leu Val

80 85 90

Gln Gly Asn Ser Gln Ile Phe Tyr Ser Glu Lys Asp Ala Glu Ala

95 100 105

Ala Ala Gln Pro Ala Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn

110 115 120

Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro Phe Thr Leu Gly Glu Gly

125 130 135

Ser Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr Ala Asn Lys Asp Ile

140 145 150

Pro Val Thr Ser Val Ser Asp Ala Asn Gln Val Thr Ala Val Leu

155 160 165

Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly Gly Ser Asp Trp Ala Pro

170 175 180

Asp Asn His Asn Thr Leu Leu Lys Lys Val Asn Ser Asn Leu Tyr

185 190 195

Gln Phe Ser Gly Asn Leu Pro Glu Gly Asn Tyr Gln Tyr Lys Val

200 205 210

Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro Ser Asp Asn

215 220 225

Ile Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr Phe Ser

230 235 240

Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn Pro

245 250 255

Asn Ala Asp Leu Gln Val Asp Ser Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu

260 265 270

Val Ala Val Thr Leu Gly Glu Asn Pro Asp Val Ser His Thr Leu

275 280 285

Ser Ile Gln Thr Glu Asp Tyr Gln Ala Gly Gln Val Ile Pro Arg

290 295 300

Lys Val Leu Asp Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu

305 310 315

Gly Asn Thr Tyr Thr Lys Asn Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala

320 325 330

Pro Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Thr

335 340 345

Gly Ala Val Thr Lys Thr Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly

350 355 360

Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln Asp Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr

365 370 375

Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp

380 385 390

Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly Met Ile

395 400 405

Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp Glu Ser Asp Lys

410 415 420

His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met

425 430 435

Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ser Asn Ser Gly Met Lys Asn

440 445 450

Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly Pro

455 460 465

Asp Asn Val Lys Thr Gly Val Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile

470 475 480

Thr His Val Gln Leu Gln Pro Val Phe Ala Phe Asn Ser Val Asn

485 490 495

Glu Asn Asp Pro Thr Gln Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn

500 505 510

Tyr Asn Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Thr

515 520 525

Thr Arg Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Gln

530 535 540

Asp His Ile Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe

545 550 555

Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr

560 565 570

Tyr Arg Thr Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr

575 580 585

Gly Asn Glu Ile Ala Ala Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile

590 595 600

Ile Asp Ser Leu Lys Phe Trp Val Asn Glu Tyr His Val Asp Gly

605 610 615

Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser

620 625 630

Lys Ala Ala Thr Gln Leu His Ala Ile Asp Pro Gly Ile Ala Leu

635 640 645

Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Ala Asp

650 655 660

Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val

665 670 675

Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Gly Leu Asp Gly Ser Val Phe Asp

680 685 690

Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Asp

695 700 705

Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ala

710 715 720

Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr

725 730 735

Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Gln Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu

740 745 750

Ala Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Ile Val Met

755 760 765

Thr Ser Gln Gly Ile Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu

770 775 780

Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Val

785 790 795

Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val

800 805 810

Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro

815 820 825

Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln

830 835 840

Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr Glu Leu Ser Asp

845 850 855

His Ala Asn Lys Asp Thr Trp Gly Asn Ile Val Val Ile Tyr Asn

860 865 870

Pro Asn Lys Thr Ala Glu Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp

875 880 885

Glu Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu Gly

890 895 900

Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile

905 910 915

Leu His Gln Glu Val Ser Pro Ser Asp Gly Lys ***

920 925 926

Claims

1.一种长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）LBMAE-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2012388；

2.用权利要求1所述CCTCC NO：M 2012388菌株构建重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul的方法，其特征在于将来源于CCTCC NO：M 2012388菌株的普鲁兰酶基因pul在大肠杆菌中进行重组表达；步骤为：

（1）普鲁兰酶基因pul的获得

CCTCC NO：M 2012388培养基：CaCl₂ 0.25 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.2 g/L，酵母提取物 2 g/L，无水葡萄糖 5 g/L，KH₂PO₄ 3 g/L，无机盐溶液1 mL/L，用双蒸水配制，pH 5.0；

无机盐溶液：ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L，MnCl₂·H₂O 0.03 g/L，H₃BO₃ 0.3 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.2 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.01 g/L，NiCl₂·6H₂O 0.02 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.03 g/L；

将CCTCC NO：M 2012388菌种接种于含有25 mL培养基的250 mL摇瓶中，于37℃、200 rpm振荡培养72 h，培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞，利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因组DNA；

引物1：5’- gaacaGGATCCagatgggaacaccacaaaC -3’，

引物2：5’- attccctcgagtttaccatcagatgggct -3’；

引物1含有BamHI限制性酶切位点，引物2含有XhoI限制性酶切位点；

PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL的引物1取1 μL，50 pmol/μL的引物2取1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的Taq DNA polymerase 0.5 μL；

以CCTCC NO：M 2012388基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增普鲁兰酶基因，PCR反应过程：95℃预变性5 min；95℃ 1 min、60℃ 0.5 min、72℃ 2 min，进行30个循环；72℃延伸10 min；

利用上海申能***生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit纯化DNA片断：

DNA溶液中加入1/10体积pH 5.2、3 mol/L的乙酸钠溶液和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1h，12000 rpm于4℃离心30 min，加入75%乙醇500 μL洗涤，12000 rpm于4℃离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，所得普鲁兰酶基因pul立即使用或-20℃保存；

（2）含有普鲁兰酶基因pul的重组大肠杆菌的构建

目的基因pul及质粒pET20b(+)的酶切：

利用北京博大泰克生物基因技术有限公司的质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit提取质粒pET20b(+)；

按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；

反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，基因组DNA 10 μL，BamHI 2 μL，XhoI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL；

目的基因pul与质粒pET20b(+)的连接：

将目的基因pul与质粒pET20b(+)连接，反应体系组成如下：质粒pET20b(+) 0.8 μL，目的基因pul 4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接反应12h，得重组质粒pET20b(+)-pul；

重组质粒pET20b(+)-pul转化大肠杆菌：

在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL重组质粒pET20b(+)-pul，轻轻混匀，冰浴中静置30min，转入42℃水浴中，热击90s；快速转移至冰浴中，冷却2 min，加入700 μL的LB液体培养基，37℃、100 rpm摇床温育培养1h，培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 氨苄抗生素的LB平板上，37℃倒置培养，获得含有目的普鲁兰酶基因pul的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET20b(+)-pul；

带有信号肽PelB的目的基因与质粒pET28a(+)的连接：

将重组质粒pET20b(+)-pul及表达载体pET28a(+)分别用限制性内切酶XbaI及XhoI分步单酶切，按照水、缓冲液、重组质粒pET20b(+)-pul或表达载体pET28a(+)、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，pET20b(+)-pul或pET28a(+) 10 μL，XbaI 2 μL，XhoI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL；

将胶回收线性化的目标片段PelB-pul与pET28a(+)载体连接，反应体系组成如下：载体pET28a(+) 1 μL，目标片段PelB-pul 4 μL，Ligation Solution 5 μL，混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接反应12h，得重组质粒pET28a(+)-PelB-pul；

重组质粒pET28a(+)-PelB-pul转化大肠杆菌：

在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL pET28a(+)-PelB-pul，轻轻混匀，冰浴中静置30 min，转入42℃水浴中，热击90s，快速转移至冰浴中，冷却2 min，加入700 μL的LB液体培养基，37℃、100 rpm摇床温育培养1h，培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养，获得含有目的普鲁兰酶基因pul的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul。

3.用权利要求2所述重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于：自诱导培养

自诱导培养基g/L：β-乳糖 1~50，无水葡萄糖0.5，甘油5，KH₂PO₄6.8，MgSO₄0.24，胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na₂HPO₄7.1，Na₂SO₄0.71，NH₄Cl 2.67，痕量元素溶液 400 μL/L，用双蒸水配制，pH 7.5~8.0；

痕量元素溶液g/L：FeCl₃ 8.125，CaCl₂ 2.22，MnCl₂ 2.52，ZnSO₄ 1.61，CoCl₂ 0.26，CuCl₂ 0.27，NiCl₂ 0.26，Na₂MoO₄ 0.41，Na₂SeO₃ 0.346，H₃BO₃ 0.124，HCl 2.19；

将重组菌E.coli BL21(DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上过夜活化培养，从固体平板上挑取单个菌落接种于3 mL含有50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中于37℃、200 rpm振荡培养，随时监测培养基中OD₆₀₀的变化情况，待OD₆₀₀达到2~3时，按5%~10%接种量接种于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的自诱导培养基中，于10~40℃、200rpm震荡培养2~20h后，添加终浓度1~25g/L的甘氨酸，温度转为10~40℃培养60~70h；培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10 min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。

4.根据权利要求3所述重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-pul生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于：分别考察了诱导温度、甘氨酸使用浓度、37℃下培养时间和乳糖浓度的影响，最终确定了自诱导条件为：自诱导培养基中乳糖浓度为10 g/L，在37℃下培养2h后，添加终浓度6g/L的甘氨酸并转入20℃下培养70h；培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10 min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定；胞外普鲁兰酶酶活达505 U/mL。