CN110591917A - 一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法 - Google Patents

一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法 Download PDF

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杨艳坤
赵天宇
王鹏程
聂简琪
孙杨
刘秀霞
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

本发明提供了一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其不仅操作简便，而且筛选效率高。一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将含有质粒的菌株进行传代培养；（2）将传代后的菌悬液在固体平板培养基上划线，培养至长出单菌落；（3）将含筛选压力培养基和不含筛选压力培养基分别分装至多孔板中；（4）挑取单菌落并接种至含有含筛选压力培养基的多孔板的培养孔中，同时挑取同一单菌落并接种至含有不含筛选压力培养基的多孔板的相对应位置的培养孔；（5）培养结束后，在含筛选压力培养基中无法生长而在不含筛选压力培养基中可以生长的菌株即为质粒丢失菌株；筛选压力为抗生素压力、营养缺陷型压力或温度压力。

Description

一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及菌株筛选，具体涉及一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法。
背景技术
质粒是进行基因编辑的常用载体，广泛应用于基因重组、外源蛋白表达、基因***和敲除等分子操作中。在一些情况下，质粒发挥功能后需要被人为地消除，以避免其带来的其他性状的改变。现有的可丢失质粒如温度敏感型、紫外线敏感型质粒等，由于需要使用特定的质粒，因此在进行基因编辑时存在一定的应用局限性。通过传代进行质粒丢失的方法适用于绝大多数质粒，但存在后续筛选工作量大的缺点。同时，传代进行质粒丢失的方法基于三角摇瓶进行筛选，筛选通量小且人力操作强调大，难以对大量的待筛菌株进行有效地筛选。
发明内容
本发明提供了一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其不仅操作简便，而且筛选效率高。
其技术方案是这样的，一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含有质粒的菌株进行传代培养；
（2）将传代后的菌悬液在固体平板培养基上划线，培养至长出单菌落；
（3）将含筛选压力培养基和不含筛选压力培养基分别分装至多孔板中；
（4）挑取单菌落并接种至含有含筛选压力培养基的多孔板的培养孔中，同时挑取同一单菌落并接种至含有不含筛选压力培养基的多孔板的相对应位置的培养孔中；
（5）培养结束后，在含筛选压力培养基中无法生长而在不含筛选压力培养基中可以生长的菌株即为质粒丢失菌株；
所述筛选压力为抗生素压力、营养缺陷型压力或温度压力。
进一步的，所述含有质粒的菌株为人工导入质粒后的改造菌株，或者，从自然界分离的含质粒菌株。
进一步的，所述步骤（1）中，采用100 mL三角摇瓶，培养条件为30°C，220 rpm/min，培养12 h为一代。
进一步的，所述步骤（3）和步骤（4）中所述多孔板为48孔板。
进一步的，所述筛选压力为营养缺陷型压力；
不含筛选压力培养基含有无氨基酸酵母氮源13.4 g·L-1，生物素0.4 mg·L-1，葡萄糖20 g·L-1，组氨酸0.04 g·L-1。
含筛选压力培养基含有无氨基酸酵母氮源 13.4 g·L-1，生物素0.4 mg·L-1，葡萄糖20 g·L-1。
本发明的上述高通量筛选方法具有以下有益效果：
（1）传统采用摇瓶培养传代进行质粒丢失菌株筛选时，由于需要采用液体筛选压力的培养基，需要用PBS清洗菌体3次，以避免残存培养基造成的影响，从而增加操作步骤且增加染菌风险，本发明筛选时采用固体培养基，并把单菌落作为种子接入多孔板中，无需清洗菌体，同时可将残余培养基影响降至最低；
(2) 本发明创新性地采用将同一单菌落进行两次挑取的方式，对质粒丢失菌株进行筛选，含筛选压力的培养基中能否生长，与不含筛选压力的培养基进行对比，可以结果明显地进行阴性筛选，同时不含筛选压力培养基中的培养物可进行后续实验或菌种保藏，兼顾了筛选的准确性和操作的简便性；
（3）本发明利用多孔板进行培养，可以实现高通量筛选，提高了筛选效率，增大了单次筛出的可能性。
具体实施方式
试剂来源和配制说明。
无氨基酸酵母氮源（YNB），Solarbio，Y8040-100g。
生物素（Biotin），上海沪试实验室器材股份有限公司，67000260。
葡萄糖（Glucose），上海沪试实验室器材股份有限公司，63005518。
组氨酸（Histidine），上海沪试实验室器材股份有限公司，62014234。
500×Biotin溶液：称取20 mg Biotin溶于100 mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。
10×Glucose溶液：称取20 g Glucose溶于100 mL去离子水，121℃灭菌20 min，4℃保存。
100×Histidine溶液：称取400 mg Histidine溶于100 mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。
不含筛选压力培养基：准确称取13.4 g YNB溶于1 L去离子水，定容后分装50 mL培养基至250 mL锥形瓶，115℃灭菌30 min；使用前加入相应稀释倍数的Biotin、Glucose和Histidine，并达到下述浓度要求，Biotin 0.4 mg·L-1，Glucose 20 g·L-1，Histidine0.04 g·L-1。
含筛选压力培养基：准确称取13.4 g YNB溶于1 L去离子水，定容后分装50 mL培养基至250 mL锥形瓶，115℃灭菌30 min；使用前加入相应稀释倍数的Biotin和Glucose，使用前加入相应稀释倍数的Biotin、Glucose，并达到下述浓度要求，Biotin 0.4 mg·L-1，Glucose 20 g·L-1。
实施例1
一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，包括以下步骤：
（1）将含有质粒的菌株进行传代培养，采用100 mL三角摇瓶，培养条件为30°C，220rpm/min，培养12 h为一代，可以是第5、10、15、20代等，含有质粒的菌株为人工导入质粒后的改造菌株，或者，从自然界分离的含质粒菌株，；
（2）将传代后的菌悬液在固体平板培养基上划线，培养至长出单菌落；
（3）将含筛选压力培养基和不含筛选压力培养基分别分装至多孔板中，多孔板优选为48孔板；
（4）挑取单菌落并接种至含有含筛选压力培养基的多孔板的培养孔中，同时挑取同一单菌落并接种至含有不含筛选压力培养基的多孔板的相对应位置的培养孔中；
（5）培养结束后，在含筛选压力培养基中无法生长而在不含筛选压力培养基中可以生长的菌株即为质粒丢失菌株；
不含筛选压力培养基含有无氨基酸酵母氮源13.4 g·L-1，生物素0.4 mg·L-1，葡萄糖20 g·L-1，组氨酸0.04 g·L-1。
含筛选压力培养基含有无氨基酸酵母氮源 13.4 g·L-1，生物素0.4 mg·L-1，葡萄糖20 g·L-1。
应用例1
将具有基因敲除功能的pHOT1sg1电转至GS115-Cas9菌株中进行HOT1基因的敲除，之后通过测序验证敲除成功的改造菌株（质粒已发挥完其功能）。
其中，
pHOT1sg1构建：针对靶基因HOT1设计sgRNA，再针对HOT1的sgRNA序列设计引物，并在引物的3’端设计同源臂，利用PCR得到重组片段。将PCR产物和BamHⅠ线性化的sgRNA-BamHⅠ质粒进行Gibson组装，形成完整质粒pHOT1sg1；
GS115-Cas9的构建：Cas9为细菌来源的Cas9序列针对毕赤酵母进行密码子优化的序列，之后将其进行PCR扩增后连接至pGAPZB上的GAP启动子后，然后单酶切重组质粒的GAP启动子处，回收后电转至GS115，筛选得到重组菌株GS115-Cas9。
使用实施例1的方法对获得的改造菌株进行筛选，得到质粒丢失菌株，具体步骤如下。
（1）传代培养
将测序验证敲除成功后的敲除菌株接种至10 mL不含筛选压力的液体培养基MDH中，在100 mL摇瓶中培养12 h，培养条件为30℃，220 rpm/min。每12小时传一代，传代时以1%接种量接种，同上条件培养。
（2）划线
将传至第10代的菌液取10μL在MDH固体培养基平板上划线，于30℃培养箱中培养3-5天，直至长出较大单菌落。
（3）多孔板筛选
将含筛选压力液体培养基MD分装至48孔板，将不含筛选压力液体培养基MDH分装至48孔板。用接种环或无菌枪头挑取同一单菌落分别接种至MD和MDH中，一一对应标号。于30℃，220 rpm/min条件下培养2-3天（确保充足的培养时间）。培养结束后，在含筛选压力培养基中无法生长而在不含筛选压力培养基中可以生长的菌株即为质粒丢失菌株。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含有质粒的菌株进行传代培养；
（2）将传代后的菌悬液在固体平板培养基上划线，培养至长出单菌落；
（3）将含筛选压力培养基和不含筛选压力培养基分别分装至多孔板中；
（4）挑取单菌落并接种至含有含筛选压力培养基的多孔板的培养孔中，同时挑取同一单菌落并接种至含有不含筛选压力培养基的多孔板的相对应位置的培养孔中；
（5）培养结束后，在含筛选压力培养基中无法生长而在不含筛选压力培养基中可以生长的菌株即为质粒丢失菌株；
所述筛选压力为抗生素压力、营养缺陷型压力或温度压力。
2.根据权利要求1所述的一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其特征在于：所述含有质粒的菌株为人工导入质粒后的改造菌株，或者，从自然界分离的含质粒菌株。
3.根据权利要求1所述的一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤（1）中，采用100 mL三角摇瓶，培养条件为30°C，220 rpm/min，培养12 h为一代。
4.根据权利要求1所述的一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤（3）和步骤（4）中所述多孔板为48孔板。
5.根据权利要求1所述的一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其特征在于：所述筛选压力为营养缺陷型压力；
不含筛选压力培养基含有无氨基酸酵母氮源13.4 g·L-1，生物素0.4 mg·L-1，葡萄糖20 g·L-1，组氨酸0.04 g·L-1；
含筛选压力培养基含有无氨基酸酵母氮源 13.4 g·L-1，生物素0.4 mg·L-1，葡萄糖20 g·L-1。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1292689A1 (en) * 2000-05-18 2003-03-19 Anadys Pharmaceuticals, Inc. Regulated gene expression in yeast and methods of use
CN103525852A (zh) * 2013-10-24 2014-01-22 江南大学 一种基于自诱导培养和有色底物相结合的高通量筛选重组菌的方法
CN106222162A (zh) * 2016-07-26 2016-12-14 江南大学 一种基于流式细胞术的高通量筛选阿维菌素高产菌株的方法
CN109825495A (zh) * 2019-03-01 2019-05-31 江南大学 一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1292689A1 (en) * 2000-05-18 2003-03-19 Anadys Pharmaceuticals, Inc. Regulated gene expression in yeast and methods of use
CN103525852A (zh) * 2013-10-24 2014-01-22 江南大学 一种基于自诱导培养和有色底物相结合的高通量筛选重组菌的方法
CN106222162A (zh) * 2016-07-26 2016-12-14 江南大学 一种基于流式细胞术的高通量筛选阿维菌素高产菌株的方法
CN109825495A (zh) * 2019-03-01 2019-05-31 江南大学 一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WENYAO CHEN等: "IncHI2 Plasmids Are Predominant in Antibiotic-Resistant SalmonellaIsolates", 《FRONT MICROBIOL》 *
于源华主编: "《生物工程与技术专业实验教程》", 30 September 2009, 兵器工业出版社 *
刘彦晶等: "中药黄芩对NDM-1乙酸钙不动杆菌的抑菌及质粒消除的研究", 《中国药学杂志》 *
徐小静编著: "《分子生物学与基因工程技术和实验》", 31 May 2018 *
柳国霞等: "乳酸乳球菌的质粒消除", 《东北农业大学学报》 *
邹向宏等: "海南根瘤菌S_(25)的质粒生物学特性", 《农业生物技术学报》 *

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