CN104946561B - 蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株，该菌株是肠杆菌(Enterobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015071。同时，本发明公开了该菌株的培养方法，通过富集培养、分离培养以及复筛等步骤得到该菌株。本发明以蒺藜为材料，在富集培养基中通过合理调整各组分含量，有利于弱势菌株的存活与培养；通过DNS法，对该菌株的普鲁兰酶活性测定表明，该菌株具有较高的普鲁兰酶活性，在30℃、180r/min、pH6.0条件下发酵培养56h，产酶量可达4.19U/mL，可作为良好的诱变出发菌株和构建工程菌的普鲁兰酶基因备选菌株。

Description

蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株及其培养方法
技术领域
本发明属于微生物培养领域，具体涉及一种蒺藜内生菌中具有普鲁兰酶活性的菌株及其培养方法。
背景技术
蒺藜Tribulus terrestris L.为一年生草本植物，全国各地均有分布，其鲜嫩营养器官可做牲畜饲料，果实则可入药，具有治疗头痛眩晕、胸胁胀痛、乳闭乳痈、目赤翳障、风疹瘙痒之功效。植物内生菌是重要的微生物遗传资源组成部分，因特殊的寄生或腐生环境，往往具有与土壤微生物不同的生理特性。关于传统药用植物蒺藜的内生菌研究尚未见报道。
普鲁兰酶产生菌一直是微生物功能酶中的研究热点之一。普鲁兰酶是一种能够专性水解α-1，6糖苷键的脱支酶，既是支链淀粉降解不可或缺的关键酶，也是洗涤工业的一种常见添加剂。截至目前，世界范围内普鲁兰酶商品的绝大部分市场份额仍然是由丹麦NOVO公司所占有。国内外也有不少关于普鲁兰酶产生菌的报道，但绝大多数野生菌株活性较低，即使是通过基因工程技术构建的工程菌株，也往往难以达到理想的发酵效果，酶活性稳定性较差。自然界的微生物资源极其丰富，被人们培养、鉴定和开发利用的仅占极少部分，所以，通过试验材料、试验方法、培养基创新等研究手段的改进，不断的筛选和积累产功能酶菌株仍然是一项长期而艰巨的研究工作。
目前，各类文献报道的普鲁兰酶产生菌的筛选及鉴定方法大同小异，主要技术环节如下：
筛选普鲁兰酶产生菌常用的样品类型主要有：常规大田土壤、河水、海水、河底和海底淤泥、淀粉厂区土壤等。
筛选普鲁兰酶产生菌最常见的分离培养基配方是：糯米淀粉25g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，琼脂粉20g，加水溶解后定容至1000mL，pH值为6.0。
普鲁兰酶产生菌鉴别培养基配方是：蛋白胨10g，酵母膏2g，红色普鲁兰糖3g，NaCl2g，琼脂20g，加水溶解后定容至1000mL，pH值为7.0。
普鲁兰酶活性的测定最常用的方法是3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)。
普鲁兰酶产生菌***菌鉴定的方法主要包括菌体(菌落)形态、生理生化指标的测定和16S rDNA序列分析。
试验操作的一般技术流程是：采集试验样品——富集培养——初筛分离培养——鉴别分离培养(复筛)——普鲁兰酶活性测定——菌株鉴定——下游研究。
虽然目前有一些产普鲁兰酶野生菌株的文献报道，但真正能够用于工业化生产是菌很少，迄今为止，应用最为成功和广泛的仍然仅有Bacillus acidopullulliticus。所以，普鲁兰酶活性较高野生菌株的匮乏仍然是限制普鲁兰酶广泛开发应用的瓶颈问题之一，直接或间接的影响了普鲁兰酶产生菌的菌诱变育种和工程菌株的构建。就我国关于普鲁兰酶研究情况来说，突破性的研究成果很少，普鲁兰酶专利菌株较少，仍未形成有竞争力的核心菌种资源后备库， 没有改变国外在普鲁兰酶生产领域处于垄断地位的现状。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一是为提供一种蒺藜内生菌中具有普鲁兰酶活性的菌株及其人工培养方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供的一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株，其菌株属肠杆菌(Enterobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国、武汉、武汉大学，保藏号为CCTCC M 2015071，该菌株具有普鲁兰酶活性。
本发明提供的一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株的培养方法，包含以下培养步骤：
富集培养：取蒺藜的健康茎冲洗后剪成小段，两端用融化的石蜡封口，再用无菌水冲洗，放入体积百分比为70％乙醇溶液表面消毒，再用0.1mol/L升汞消毒，无菌操作条件下剪去两端的封口石蜡，将剩余的茎放入研钵充分研磨，收集于装有富集培养基的试管中摇床培养。
分离培养：无菌操作条件下取适量富集培养液涂布于固体分离培养基中培养。用接种环选取单菌落，在固体分离培养基平板上划线纯化。然后通过滴加卢氏碘液的方法初筛产普鲁兰酶菌株，选菌落小而水解圈较大者作为目标菌株。
复筛：将所述目标菌株接种于鉴别培养基中培养，然后滴加卢氏碘液，将具有水解圈者确定为具有普鲁兰酶活性的菌株，同时转接于LB培养基4℃斜面保藏。
所述富集培养步骤中，所述摇床培养条件为30℃、180r/min；所述分离培养步骤中培养条件为30℃恒温培养48h；所述复筛步骤中的培养条件为30℃恒温培养48h。
所述富集培养基各组分浓度为：糯米淀粉25g/L，海藻糖0.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 9g/L，自然pH。
所述固体分离培养基各组分浓度为：支链淀粉3g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 9g/L，琼脂粉18g/L，pH为7.0。
所述鉴别培养基各组分浓度为：普鲁兰糖2g/L，蛋白胨8g/L，酵母提取物2g/L，NaCl 9g/L，琼脂粉18g/L，pH为7.0。
所述LB培养基各组分浓度为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 9g/L，pH为7.0。
本发明的有益效果在于：本发明以蒺藜为材料，对其内生具有普鲁兰酶活性菌株进行了筛选和鉴定，筛选出能够高效降解普鲁兰糖的内生菌株；富集培养基通过合理调整各组分含量，有利于弱势菌株的存活与培养；通过常规形态学、生理生化特征、16S rDNA同源序列和***进化树分析，对筛选出的具有普鲁兰酶活性的菌株进行了多相分类鉴定，获得了菌株的一般特征及16S rDAN基因序列，确定隶属于肠杆菌属Enterobacter sp.，命名为肠杆菌Enterobacter sp.ZXY25；通过DNS法，对该菌株的普鲁兰酶活性测定表明，该菌株具有较高的普鲁兰酶活性，在30℃、180r/min、pH6.0条件下发酵培养56h，产酶量可达4.19U/mL，可作为良好的诱变出发菌株和构建工程菌的普鲁兰酶基因备选菌株。
附图说明
图1所示为本发明菌株ZXY25在普鲁兰糖平板上的水解圈图。
图2所示为本发明菌株ZXY25的普鲁兰酶活性图。
图3所示为本发明菌株ZXY25的一般特征图。
图4所示为本发明菌株ZXY25基于16S rDNA基因序列的***发育树。
具体实施方式
下文将结合具体实施例详细描述本发明的内容。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例1
图1所示为本发明菌株ZXY25在普鲁兰糖平板上的水解圈图；图2所示为本发明菌株ZXY25的普鲁兰酶活性图；图3所示为本发明菌株ZXY25的一般特征图；图4所示为本发明菌株ZXY25基于16S rDNA基因序列的***发育树。
1、试验材料
蒺藜的来源：采自洛阳市区洛河堤岸。
富集培养基：糯米淀粉25g，海藻糖0.5g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 9g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH。
固体分离培养基：支链淀粉3g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 9g，琼脂粉18g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。
鉴别培养基：普鲁兰糖2g，蛋白胨8g，酵母提取物2g，NaCl 9g，琼脂粉18g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 9g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。
发酵培养基：玉米淀粉25g，酵母粉10g，K2HPO40.5g，KH2PO40.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH6.0。
2、培养方法
富集培养：取蒺藜的健康茎，先用自来水冲洗，剪成5cm小段，两端用融化的石蜡封口，之后用无菌水冲洗三次，放入70％乙醇溶液表面消毒5min，再用0.1mol/L升汞消毒3min，无菌操作条件下将两端的封口石蜡剪去，将剩余的茎放入研钵充分研磨，并收集于装有15mL富集培养基的试管中，于30℃、180r/min条件下摇床培养12h。
分离培养：无菌操作条件下取适量富集培养液涂布于固体分离培养基，于30℃恒温培养48h。用接种环从平板中挑取生长良好、特征典型的单菌落，仍然在固体分离培养基平板上划线纯化，连续进行3次。编号备份后，通过滴加卢氏碘液的方法初筛产普鲁兰酶菌株，将菌落小而水解圈较大者作为目标菌株。
复筛：将分离培养的目标纯化菌株接种于鉴别培养基，30℃恒温培养48h后，滴加卢氏碘液，仍然具有水解圈者，初步确定为具有普鲁兰酶活性的菌株。同时转接于LB培养基4℃斜面保藏。
3、产普鲁兰酶菌株的酶活性测定方法
粗酶液的制备：将纯化好的菌株接种于装有25mL LB培养基的三角瓶中，30℃、180r/min 摇床培养16h，取出4mL菌液转接于装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，相同条件下震荡培养，每隔8h取样一次。将发酵液4000r/min室温离心20min，上清液即为粗酶液。
采用DNS法对复筛菌株进行酶活性测定。具体如下：在1mL 0.5％的普鲁兰糖溶液中加入1mL磷酸缓冲液(pH6.0)，再加入1mL粗酶液，60℃水浴30min后，加入DNS 1.5mL，沸水浴5min，取出用流水迅速冷却，最后在520nm波长测量吸光值。一个酶活单位界定为：在相应反应条件下，每分钟降解普鲁兰糖后释放出1μmol葡萄糖所需的酶量，以1U/mL表示。
4、菌株的鉴定方法
4.1菌株的生化指标测定方法
测定方法参考刘国生主编的《微生物学实验技术》和潘春梅、张晓静主编的《微生物技术》，鉴定参考《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》。
4.2菌株的16S rDNA分析方法
将具有普鲁兰酶活性的菌株接种于LB液体培养基，30℃，180r/min摇床培养12h，获取菌液。采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit Ver.2.0试剂盒提取基因组DNA。
16S rDNA PCR扩增引物：正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物1492R：5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′
引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
PCR扩增体系(20μL)：10×Ex Taq PCR buffer 2μL，dNTP(10mmol/mL)1.6μL，正向和反向引物(20μm/mL)各1μL，DNA模板1μL，Ex Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O 13.2μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸1min 30s，循环30次；72℃最终延伸7min。扩增片段长度为1.5kb左右，PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后切胶，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver.3.0试剂盒进行胶回收，回收产物与TaKaRa pMDTM18-T Vecter载体连接，将重组质粒转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞，37℃过夜培养，经蓝白斑筛选，对阳性克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。
采用MEGA6.06软件进行多序列比对，选择Neighbor-Joining方法构建***发育进化树。
5、试验结果
通过富集培养、分离培养和复筛，获得一株普鲁兰糖降解水解圈大而显著的菌株，如图1所示，初步判断其具有较高的普鲁兰酶活性，确定为目标菌株，菌株编号为ZXY25。
5.1 普鲁兰酶活性菌株ZXY25的酶活性测定
采用DNS法对ZXY25菌株进行普鲁兰酶活性测定，结果表明，ZXY25菌株的普鲁兰酶活性最高达到4.19U/mL，确认具有良好的普鲁兰酶活性，如图2所示，ZXY25菌株的普鲁兰酶活性非常理想，是诱变育种良好的野生出发菌株，具有较大开发应用潜力。
5.2 ZXY25菌株的鉴定
(1)ZXY25菌株的菌落特征
ZXY25菌株为直型杆菌，菌体长1.3-2.9μm、宽0.5-1.2μm，具鞭毛和荚膜，能运动，在普鲁兰糖平板上的菌落边缘整齐，表面湿润，低凸起，菌落血红色，发酵液也呈血红色，如图3所示。
(2)ZXY25菌株的生化指标测定
测定方法参考刘国生主编的《微生物学实验技术》和潘春梅、张晓静主编的《微生物技术》，鉴定参考《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》。
测定结果显示，革兰氏染色阴性，兼性厌氧，无芽孢，甲基红反应、吲哚反应、苯丙氨酸脱氢酶、DNA酶、脲酶和吲哚反应阴性，乳糖、V-P反应、柠檬酸盐反应阳性，明胶液化，不产硫化氢。初步鉴定为肠杆菌属Enterobacter。
(3)ZXY25菌株的16S rDNA鉴定
将ZXY25菌株接种于LB液体培养基，32℃，200r/min摇床培养16h，获取菌液。采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit Ver.2.0试剂盒提取基因组DNA。
采用的16S rDNA PCR扩增引物为：
正向引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物，1492R：5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′
PCR扩增体系(20μL)：10×Ex Taq PCR buffer 2μL，dNTP(10mmol/mL)1.6μL，正向和反向引物(20μm/mL)各1μL，DNA模板1μL，Ex Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O 13.2μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸1min 30s，循环30次；72℃最终延伸7min。扩增片段长度为1.5kb左右，PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后切胶，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver.3.0试剂盒进行胶回收，回收产物与TaKaRa pMDTM18-T Vecter载体连接，将重组质粒转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞，37℃过夜培养，经蓝白斑筛选，阳性克隆测序。
获得的ZXY25菌株16S rDNA序列长度为1503bp，序列如下：
TAGGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATCGCCAAGGTTATTAACCTTAACGCCTTCCTCCTCGCTGAAAGTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCTGATGGCATGAGGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCACCCGAGAGCAAGCTCTCTGTGTTACCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTC
通过NCBI的blast在线分析功能对ZXY25菌株的16S rDNA基因序列进行同源性搜索，并用MEGA6.06软件中的Neighbor-Joining方法构建***发育进化树，如图4所示。结果表明，ZXY25与产气肠杆菌Enterobacter aerogenes聚为一支，说明二者亲缘关系最为接近。综合培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，确定ZXY25隶属于肠杆菌属Enterobacter，命名为肠杆菌Enterobacter sp.ZXY25。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims (1)

1.一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株，其特征在于，该菌株隶属于肠杆菌(Enterobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015071，该菌株具有普鲁兰酶活性。
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