CN103524579A - 一种利用三联柱层析技术从地黄中快速分离梓醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种利用三联柱层析技术从地黄中快速分离梓醇的方法，属于中药技术领域。在分离、纯化过程中，依次使用D101型大孔吸附树脂、H103型大孔吸附树脂和活性炭三种常用色谱填料，即可从中药地黄中获得纯度高于95%的梓醇。与现有技术相比，本发明具有以下优势：所选用的三种填料经常规再生处理后均可以反复利用；资金投入少，运行成本低；在分离与纯化过程中仅使用乙醇和水，更加符合环保要求；在进行三联柱层析前，提取液和大孔树脂洗脱液均无需浓缩和进行除杂处理，极大地简化了操作步骤和缩短了运行时间，并且降低了人力和能源消耗。
Description
技术领域
本发明涉及快速分离梓醇的方法，特别涉及三联柱层析技术从中药地黄中快速分离梓醇的方法，属于中药技术领域。
背景技术
中药地黄（Rehmanniae Radix）为玄参科（Scrophulariaceae）多年生草本植物地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）的干燥块根，性甘、寒，归心、肝、肾经，具有清热凉血、养阴生津的功效，主治热入营血、温毒发斑、吐血衄血等。药理实验证明，环烯醚萜苷类化学成分是地黄的主要药效物质基础，尤其以梓醇具有突出的抗癌、神经保护、降血糖及抗肝炎病毒等作用，为2010版《中国药典》中地黄的质量控制指标成分。
目前，地黄中梓醇的分离方法主要有三种：一、以水或含水醇提取，回收溶剂后，有机溶剂萃取除杂，水溶液载入大孔吸附树脂或活性炭单一填料，以水和不同浓度乙醇洗脱，收集含有梓醇的流分，减压浓缩，干燥，反复重结晶。例如，中国专利200710159335.8中，将地黄80%乙醇提取液回收乙醇，水分散，石油醚、乙酸乙酯依次萃取除杂，萃余水溶液载入H103大孔吸附树脂后以水和含水乙醇梯度洗脱，收集80%乙醇流分，减压浓缩并干燥，干燥物以甲醇-乙醇混合溶液反复重结晶，最终得到梓醇；二、将水提液进行多级膜分离后，载入活性炭和多种树脂组成的串联柱层析***，以水和不同浓度乙醇洗脱，收集含有梓醇的流分，减压浓缩，干燥。例如，中国专利200710026330.8中，将水提取液经过微滤、超滤、纳滤三级膜过滤过程，再以活性炭、大孔吸附树脂、阳离子交换树脂和阴离子交换树脂连续柱层析***进行分离，最终得到纯度约为65%的梓醇产品；三、以水、醇或含水醇提取，初步除杂后，载入大孔吸附树脂柱以水和含水乙醇梯度洗脱，收集含有梓醇的洗脱液，浓缩，再以混合溶剂进行硅胶柱层析分离，收集流份，回收溶剂并浓缩，结晶或重结晶，最终得到梓醇。例如，中国专利201110184807.1，将水提液减压浓缩，浓缩液中加入95%乙醇，静置过夜，上清液浓缩后，载入XAD-16大孔树脂柱，先用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩物再如硅胶柱，以乙酸乙酯-甲醇混合溶剂洗脱，收集目标流份，减压浓缩，干燥，含水乙醇重结晶，得到纯度约为95%的梓醇；中国专利200810016005.8、201010529437.6和201110275524.8中，将由鲜地黄制得的含梓醇水溶液，以活性炭或大孔吸附树脂分离，得到粗品，再载入硅胶柱层析用氯仿-甲醇、乙酸乙酯-乙醇或甲醇-乙酸乙酯等混合溶剂洗脱，浓缩，干燥或再以甲醇、丙酮-水进行结晶等操作，得到梓醇。此外，2008年张秀丽等（中国生物工程杂志，第28卷，第1期，P65~69）将鲜地黄匀浆液以95%乙醇温浸提取，提取液浓缩后以D101大孔吸附树脂分离，收集5%乙醇洗脱液，浓缩干燥后，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，浓缩，干燥，得到纯度为90%的梓醇；2010年刘海洋等（中医药信息，第27卷，第1期，P86~88）以80%乙醇加热回流提取，提取液浓缩干燥后，以水溶解，载入H103大孔吸附树脂分离，用水和含水乙醇洗脱，收集含有梓醇的流份，减压浓缩至干，得到纯度约为40%的梓醇，此后用甲醇-乙醇混合溶剂反复重结晶处理，获得了梓醇。
以上方法存在以下几处不足，难以满足规模化生产梓醇的要求：一、以硅胶柱进行分离，填料不能得以反复利用，而且梓醇的极性大，严重的死吸附导致梓醇大量损失；二、纯化过程中使用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮等有毒、易燃、管制试剂，环境负担重，管理成本高；三、在进行柱层析前，提取液需要经过浓缩、初步除杂等处理，人力、时间和能源消耗大；四、微滤、超滤、纳滤等膜分离技术资金投入大，运行成本高，而且最终产品的质量不佳。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上四点不足，通过联用D101型大孔吸附树脂、H103型大孔吸附树脂和活性炭，提供一种利用三联柱层析技术从地黄中快速分离梓醇的方法。
本发明的技术构思如下：
梓醇为环烯醚萜苷类化合物，极性大，D101型和H103型大孔吸附树脂均为非极性树脂，两者常被用于从地黄中分离梓醇，但是单独使用时效果不佳，需结合硅胶柱层析、重结晶等方法提高产品纯度，原因在于前者的比表面约为400m2/g，孔径约为100nm，对梓醇的吸附作用很弱，在上样和以水进行洗脱时，梓醇与糖类、氨基酸等成分一同流出；后者的比表面为1000~1100m2/g，孔径约为8.5~9.5nm，对梓醇的吸附作用较前者明显增强，而对糖类、氨基酸等强极性成分几乎没用吸附，但是在以含水醇洗脱时，梓醇易与提取液中的水溶性色素、毛蕊花糖苷一同流出；活性炭是另一种常用于分离梓醇的填料，但是由于地黄中的毛蕊花糖苷与梓醇同为单糖苷，在洗脱过程中，两者难以分离。
本发明的技术构思是创新性地按照特定顺序联合使用D101型大孔吸附树脂、H103型大孔吸附树脂和活性炭三种可反复使用的色谱填料，首先由D101型大孔吸附树脂除去地黄提取液中的水溶性色素和毛蕊花糖苷，再由H103型大孔吸附树脂除去一部分糖类和氨基酸等成分，最后由活性炭除去剩余的杂质，即可得到纯度达95%以上的梓醇产品；在整个分离过程中，唯一使用的有机溶剂为安全无毒的乙醇；此外，除最后一步减压浓缩至干外，无需除去乙醇等溶剂，也无需特殊设备，并且避免了导致大量损失的硅胶柱层析，操作简便，可以快速地用于从地黄中制备高纯度的梓醇。
本发明一种利用三联柱层析技术从地黄中快速分离梓醇的方法，按照下述步骤进行：
1）取市售地黄，于60℃以下烘干，粉碎，过20目筛，收集细粉，按每千克地黄加入8~12 L水，加热至微沸，煎煮2~3次，每次1~2 h，滤过，收集滤液，得到水煎液；
2）以步骤（1）中地黄质量﹕大孔吸附树脂质量为1﹕5~10（kg/kg）称取D101型大孔吸附树脂，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将1）中水煎液载入D101型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速﹕树脂质量为0.5~1﹕1（L·h-1/kg，每小时流出体积/质量），洗脱体积﹕树脂质量为4~6﹕1（L/kg），收集水洗脱液；
3）以步骤（1）中地黄质量﹕大孔吸附树脂质量为1﹕5~10（kg/kg）称取H103型大孔吸附树脂，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将2）中水洗脱液载入H103型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速﹕树脂质量为0.5~1﹕1（L·h-1/kg），洗脱体积﹕树脂质量为4~6﹕1（L/kg），弃去水洗脱液；换用10%~30%乙醇（v/v）进行洗脱，流速﹕树脂质量为0.5~2﹕1（L·h-1/kg），洗脱体积﹕树脂质量为4~6﹕1（L/kg），收集10%~30%乙醇（v/v）洗脱液；
4）以步骤（1）中地黄质量﹕颗粒状活性炭质量为1﹕6~10（kg/kg）称取颗粒状或粉末状商品活性炭，进行常规预处理后用水湿法装柱，将3）中10%~30%（v/v）乙醇洗脱液载入活性炭柱，以10%~30%乙醇（v/v）进行洗脱，流速﹕活性炭质量为0.5~1﹕1（L·h-1/kg），洗脱体积﹕活性炭质量为3~6﹕1（L/kg），弃去洗脱液，换用50%~60%乙醇（v/v）进行洗脱，流速﹕活性炭质量为0.5~1﹕1（L·h-1/kg），洗脱体积﹕活性炭质量为3~6﹕1（L/kg），收集50%~60%乙醇（v/v）洗脱液，60℃以下减压浓缩至干，即得白色固体，经过核磁共振氢谱和碳谱分析，并与文献数据进行对照，确认白色固体为梓醇，再以高效液相色谱分析其纯度为95%以上。
所述的梓醇的化学结构和分子量如下所示：
其中市售地黄为市售地黄药材、生地黄饮片或熟地黄饮片；
其中常规预处理是指将D101型或H103型大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h以上，湿法装柱，然后以乙醇洗至流出液加等量蒸馏水不产生混浊，再用蒸馏水洗至流出液无醇味。
本发明的有益效果如下：
（1）不使用一次性的正相硅胶，所选用的三种填料经常规再生处理后均可以反复利用，亦有效避免了由于硅胶的使用而引起梓醇严重损失。
（2）不使用膜分离等设备，资金投入少，运行成本低，而且梓醇纯度可达到95%以上，能满足药理活性测试以及对该中药进行常规质量控制的需要。
（3）在分离与纯化过程中仅使用乙醇和水，避免使用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮等多种有毒、易燃、管制试剂，更加符合环保要求。
（4）在进行三联柱层析前，提取液和大孔树脂洗脱液均无需浓缩和进行除杂处理，可直接载入分离，极大地简化了操作步骤和缩短了运行时间，并且降低了人力和能源消耗。
附图说明
图1是梓醇的核磁共振氢谱。
图2是梓醇的核磁共振碳谱。
图3是梓醇的高效液相色谱图；图中4.398min色谱峰为梓醇。
具体实施方式
实施例1
取市售地黄药材0.1kg，于60℃以下烘干，粉碎，过20目筛，收集细粉，加入1.2L水，加热至微沸，煎煮2次，每次2h，滤过，收集滤液，得到水煎液；称取D101型大孔吸附树脂1kg，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将水煎液载入D101型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速为1L·h-1，洗脱体积为6L，收集水洗脱液；称取H103型大孔吸附树脂1kg，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将水洗脱液载入H103型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速为1L·h-1，洗脱体积为6L，弃去水洗脱液，换用30%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为2L·h-1，洗脱体积为6L，收集30%乙醇（v/v）洗脱液；称取颗粒状商品活性炭1kg，进行常规预处理后用水湿法装柱，将30%乙醇洗脱液载入活性炭柱，以30%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为0.5L·h-1，洗脱体积为3L，弃去洗脱液，换用60%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为1L·h-1，洗脱体积为3L，收集60%乙醇（v/v）洗脱液，60℃以下减压浓缩至干，即得梓醇，该化合物的核磁共振氢谱和碳谱如图1和图2所示；再以高效液相色谱分析其纯度为96.8%，典型的高效液相色谱图如图3所示。
实施例2
取市售生地黄饮片0.1kg，于60℃以下烘干，粉碎，过20目筛，收集细粉，加入1L水，加热至微沸，煎煮2次，每次2h，滤过，收集滤液，得到水煎液；称取D101型大孔吸附树脂0.5kg，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将水煎液载入D101型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速为0.25L·h-1，洗脱体积为2L，收集水洗脱液；称取H103型大孔吸附树脂0.5kg，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将水洗脱液载入H103型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速为0.25L·h-1，洗脱体积为2L，弃去水洗脱液，换用10%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为0.5L·h-1，洗脱体积为2L，收集10%乙醇（v/v）洗脱液；称取粉末状商品活性炭1kg，进行常规预处理后用水湿法装柱，将10%乙醇洗脱液载入活性炭柱，以10%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为1L·h-1，洗脱体积为6L，弃去洗脱液，换用60%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为1L·h-1，洗脱体积为6L，收集60%乙醇（v/v）洗脱液，60℃以下减压浓缩至干，即得梓醇，以高效液相色谱分析其纯度为97.5%。
实施例3
取市售地黄药材0.5kg，于60℃以下烘干，粉碎，过20目筛，收集细粉，加入4L水，加热至微沸，煎煮3次，每次1h，滤过，收集滤液，得到水煎液；称取D101型大孔吸附树脂5kg，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将水煎液载入D101型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速为4L·h-1，洗脱体积为30L，收集水洗脱液；称取H103型大孔吸附树脂4kg，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将水洗脱液载入H103型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速为2L·h-1，洗脱体积为20L，弃去水洗脱液，换用10%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为2L·h-1，洗脱体积为20L，收集10%乙醇（v/v）洗脱液；称取粉末状商品活性炭4kg，进行常规预处理后用水湿法装柱，将10%乙醇（v/v）洗脱液载入活性炭柱，以10%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为2L·h-1，洗脱体积为20L，弃去洗脱液，换用60%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为2L·h-1，洗脱体积为20L，收集60%乙醇（v/v）洗脱液，60℃以下减压浓缩至干，即得梓醇，以高效液相色谱分析其纯度为95.7%。
实施例4
取市售熟地黄饮片1kg，于60℃以下烘干，粉碎，过20目筛，收集细粉，加入8L水，加热至微沸，煎煮3次，每次1h，滤过，收集滤液，得到水煎液；称取D101型大孔吸附树脂6kg，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将水煎液载入D101型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速为3L·h-1，洗脱体积为30L，收集水洗脱液；称取H103型大孔吸附树脂8kg，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将水洗脱液载入H103型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速为4L·h-1，洗脱体积为40L，弃去水洗脱液，换用10%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为4L·h-1，洗脱体积为40L，收集10%乙醇（v/v）洗脱液；称取颗粒状商品活性炭6kg，进行常规预处理后用水湿法装柱，将10%乙醇（v/v）洗脱液载入活性炭柱，以10%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为3L·h-1，洗脱体积为30L，弃去洗脱液，换用50%乙醇（v/v）进行洗脱，流速为3L·h-1，洗脱体积为30L，收集50%乙醇（v/v）洗脱液，60℃以下减压浓缩至干，即得梓醇，以高效液相色谱分析其纯度为95.2%。
Claims (3)
1.一种利用三联柱层析技术从地黄中快速分离梓醇的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
1）取市售地黄，于60℃以下烘干，粉碎，过20目筛，收集细粉，按每千克地黄加入8~12 L水，加热至微沸，煎煮2~3次，每次1~2 h，滤过，收集滤液，得到水煎液；
2）以步骤（1）中地黄质量：大孔吸附树脂质量为1：5~10（kg/kg）称取D101型大孔吸附树脂，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将1）中水煎液载入D101型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速：树脂质量为0.5~1：1（L·h-1/kg，每小时流出体积/质量），洗脱体积：树脂质量为4~6：1（L/kg），收集水洗脱液；
3）以步骤（1）中地黄质量：大孔吸附树脂质量为1：5~10（kg/kg）称取H103型大孔吸附树脂，用乙醇湿法装柱并进行常规预处理，将2）中水洗脱液载入H103型大孔吸附树脂柱，以水进行洗脱，流速：树脂质量为0.5~1：1（L·h-1/kg），洗脱体积：树脂质量为4~6：1（L/kg），弃去水洗脱液；换用10%~30%乙醇（v/v）进行洗脱，流速：树脂质量为0.5~2：1（L·h-1/kg），洗脱体积：树脂质量为4~6：1（L/kg），收集10%~30%乙醇（v/v）洗脱液；
4）以步骤（1）中地黄质量：颗粒状活性炭质量为1：6~10（kg/kg）称取颗粒状或粉末状商品活性炭，进行常规预处理后用水湿法装柱，将3）中10%~30%（v/v）乙醇洗脱液载入活性炭柱，以10%~30%乙醇（v/v）进行洗脱，流速：活性炭质量为0.5~1：1（L·h-1/kg），洗脱体积：活性炭质量为3~6：1（L/kg），弃去洗脱液，换用50%~60%乙醇（v/v）进行洗脱，流速：活性炭质量为0.5~1：1（L·h-1/kg），洗脱体积：活性炭质量为3~6：1（L/kg），收集50%~60%乙醇（v/v）洗脱液，60℃以下减压浓缩至干，即得白色固体为梓醇。
2.根据权利要求1所述的一种利用三联柱层析技术从地黄中快速分离梓醇的方法，其特征在于其中所述的梓醇的化学结构和分子量如下所示：
3.根据权利要求1所述的一种利用三联柱层析技术从地黄中快速分离梓醇的方法，其特征在于其中市售地黄为市售地黄药材、生地黄饮片或熟地黄饮片。
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