CN102146109A

CN102146109A - 高纯度栀子苷的制备方法

Info

Publication number: CN102146109A
Application number: CN2010101055408A
Authority: CN
Inventors: 张彤; 丁越; 李婷; 尹胜利; 黄孝春
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2010-02-04
Filing date: 2010-02-04
Publication date: 2011-08-10

Abstract

本发明公开了一种从栀子果实中提取纯化制备高纯度栀子苷的方法，该方法采用水提醇沉法制备栀子提取物，采用大孔树脂吸附洗脱技术纯化制备栀子苷粗提物，再采用氧化铝柱层析技术或正丁醇萃取技术精制栀子苷得高纯度栀子苷。本发明制备方法操作简单，成本低廉，产品纯度高、得率高，不污染环境，适合工业生产。

Description

高纯度栀子苷的制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从栀子果实中提取纯化制备高纯度栀子苷的方法。

背景技术

栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis.的干燥成熟果实。9-11月果实成熟呈红黄色时采收。除去果梗及杂质，蒸至上汽或置沸水中略烫，取出，干燥[国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005年版一部)[S].北京：化学工业出版社，2005：173]。性味苦寒，入心、肝、肺、胃、三焦，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒、消肿止痛之功效。

栀子中含有大量的环烯醚萜甙类化合物[王钢力，陈德昌，赵淑杰.栀子属植物化学成分研究进展[J].中国中药杂志，1996，21(2)：67-72]，包括京尼平苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆二糖苷、山栀子苷、栀子酮苷、鸡屎藤次苷甲酯、车叶草苷、脱乙酰基车叶草苷酸、脱乙酰基车叶草苷酸甲酯、栀子酸(京尼平苷酸)、香豆酰京尼平龙胆双糖苷；有机酸类成分，包括绿原酸、熊果酸、苦臧红花酸；黄酮类成分：栀子素A、栀子素B、栀子素C、栀子素D、栀子素E、3，4，5-三甲氧基汉黄芩素、3，4-二甲氧基汉黄芩素、4-二羟基汉黄芩素、3，4-二羟基汉黄芩素、3，4，5-三羟基汉黄芩素、5，7，3，4-四羟基-6，8-二甲氧基黄酮等黄酮类化合物。栀子苷(geniposide)是主要的环烯醚萜苷化合物，是栀子中的主要化学成分，药理学研究显示栀子苷及其代谢物具有：对肝脏、胰腺细胞的保护作用，可以促进胆汁分泌、调节胃机能、增加内脏血流量，以及降压、解热、抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用。其结构式如下：

目前，国内外用栀子果实制备栀子苷时多用传统方法分离纯化栀子苷，如硅胶柱层析、氧化铝柱层析和重结晶等方法。传统的分离方法在制备过程中需要使用大量的有毒有机试剂，容易造成环境污染。而王兰采用现代分离技术制备型RP-HPLC从栀子药材中提取、分离栀子苷单体的完整方法。制备的栀子苷经四谱(核磁共振、红外光谱、紫外光谱、质谱，图略)共同检测，并同文献数据对照，确定纯度最高可达到99.9％，符合标准物质的质量要求[王兰，张鉴.RP-HPLC制备色谱法分离栀子苷单体.中成药.2003，25(9)：764-765]。但其前处理时，需要最大限度除去其它成分，提高样品溶液中栀子苷的含量，从而增加了单元制备时间的制备量。使得制备样品方法复杂，得率低，不适合大规模生产。

大孔吸附树脂是近十年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，属多孔***联聚合物。它具有良好的网状结构和较高的比表面积，通过物理特性从水溶液中有选择地吸附有机物质，从而达到分离提纯的目的。另外它具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、节省费用等诸多优点，广泛用于中药中化合物的分离纯化。沈荣光[沈荣光，陈正行.栀子药材中栀子苷的分离纯化.食品工业科技，2006，4(27)：123-127]用大孔吸附树脂X-5柱色谱初步分离、富集栀子提取液中的栀子苷，再经过冷冻干燥得到纯度为65.8％、得率91％的栀子苷。姚干通过研究[姚干，何宗玉，方积年.大孔吸附树脂纯化栀子中总环烯醚萜苷和栀子苷的研究.中草药，2006，37(1)：57-61]认为HPD450大孔吸附树脂能有效富集并纯化栀子总环烯醚萜苷、栀子苷。吕茂平[吕茂平，乔庆彬，庞春燕，等.大孔树脂对栀子苷分离效果的研究.中草药，2002，33：794-796]等通过比较D301R、D396、D296和AB-8四种型号大孔树脂对栀子苷的吸附效果，发现D301R树脂可用来分离栀子苷，但并未对栀子苷的制备工艺和栀子苷的纯度做进一步报道研究。任治军、何开泽等人比较了H103、NKA-II、HPD100A、HPD400A及D141等5种大孔吸附树脂对栀子提取液中栀子黄色素和栀子苷的吸附性能。确定了用H103和HPD100A两种非极性大孔树脂进行栀子苷的分离纯化，并确定了工艺参数，得到的栀子苷纯度达到81.3％，回收率为88.5％[任治军，何开泽，谭健，等.两种大孔吸附树脂结合分离纯化京尼平甙.离子交换与吸附，2006，22(2)：105-111]。由此可见，目前研究中均是采用大孔树脂吸附技术纯化制备栀子苷，但是单独采用大孔树脂吸附技术制备栀子苷，栀子苷的纯度均较低，需结合其他精制工艺作进一步研究。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种制备工艺简单、低成本且对环境无污染的从栀子果实中制备高纯度栀子苷的方法。

本发明提供的高纯度栀子苷的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备栀子提取液：取干燥栀子果实适量，浸泡后用水煎煮2-3次，每次加水5-15倍量，每次1-1.5h，滤过，合并滤液；将滤液浓缩至每ml含1g生药，加入95％乙醇至浓缩液含醇量为70％，离心，收集上清液，减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至每1ml含有0.5g生药，该浓缩液即为栀子提取液；

(2)纯化：将上述栀子提取液经大孔吸附树脂，大孔树脂柱体积为1BV，先用1BV水洗脱，弃去洗脱液；再用0％-30％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压干燥，得到纯度为60-80％的栀子苷粗提物；

(3)精制：上述栀子苷粗提物通过下述正丁醇萃取工艺或氧化铝柱层析工艺精制得到高纯度栀子苷：

正丁醇萃取工艺：取栀子苷粗提物适量，加入10-20倍量的水使之溶解，分别加入正丁醇，萃取两次，每次正丁醇用量为栀子苷粗提物的量的10-20倍，收集正丁醇萃取液，回收正丁醇，干燥，得到纯度高于90％的高纯度栀子苷；

氧化铝柱层析工艺：取适量粒径为100-200目层析用中性氧化铝，装入玻璃柱中，径高比7∶1-5∶1，栀子苷粗提物的上样量为氧化铝用量的1/30，将其溶于少量的蒸馏水中作为上样液，将上样液慢慢加入到氧化铝层析柱中，上样后用浓度为95％以上的乙醇冲洗氧化铝柱，洗脱液用量为6-15倍柱体积；收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得到纯度高于90％的高纯度栀子苷。

优选地，本发明上述高纯度栀子苷的制备方法之步骤(2)中，大孔树脂采用D301R弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，且大孔树脂柱体积为1BV，栀子上样液上样量为1/3BV，水冲洗量为1BV，0％-30％的乙醇冲洗量为2-4BV。

本发明根据栀子苷在环烯醚苷类成分中极性相对较弱的特点，采用大孔树脂纯化栀子苷提取物时，先用大量的水洗去一些水溶性杂质(色素、糖等)和极性大的环烯醚苷类成分，再用0％-30％的乙醇选择性洗脱栀子苷，可与弱极性的杂质和成分分离。采用大孔树脂纯化栀子苷工艺制备的栀子苷纯度在60％-80％之间，要得到高纯度的栀子苷，需结合其他分离纯化方法精制得高纯度的栀子苷。

本发明中栀子苷提取过程栀子苷提取率为70％-80％；大孔树脂吸附洗脱过程栀子苷的转移率为80％-85％；氧化铝柱层析工艺中栀子苷的转移率为60-70％；正丁醇萃取工艺中栀子苷的转移率为55％-75％。采用大孔树脂吸附技术结合氧化铝柱层析工艺制备高纯度栀子苷过程中，栀子苷的转移率约为40-50％，采用大孔树脂吸附技术结合正丁醇萃取工艺制备高纯度栀子苷过程中，栀子苷的转移率为35％-45％。采用高效液相色谱(HPLC)法测定该粉末中栀子苷的含量，纯度按干燥品计高于92％。并进行UV、MS、IR分析，与栀子苷标准品图谱比对，进行结构分析，证明为栀子苷。

采用本发明方法制备纯度高于90％的栀子苷，制备工艺简单，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明中栀子苷精制品与栀子苷对照品紫外吸收光谱叠加图。

图2为本发明中栀子苷精制品红外光谱图。

图3为本发明中栀子苷对照品红外光谱图。

图4为本发明中栀子苷对照品一级全扫描质谱图。

图5为本发明中栀子苷精制品一级全扫描质谱图。

图6为本发明中栀子苷对照品高效液相色谱图。

图7为本发明中栀子苷精制品高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

实施例1

1.制备栀子提取液：取干燥栀子药材1Kg(栀子苷的含量为4.23％)，用水浸泡0.5h，煎煮3次，每次加水10倍量，每次1.5h，滤过，合并滤液，滤液浓缩至1∶1(每ml含1g生药)，加入95％乙醇至浓缩液含醇量为70％，冷藏放置48h，离心，收集上清液，滤液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至每1ml提取液中含有0.5g生药的浓缩液，提取液体积为2L，即栀子提取液。

2.大孔树脂纯化栀子苷：取预处理好的大孔树脂4.4Kg装入到垫有少许脱脂棉的玻璃柱中，待树脂沉淀完全，使得树脂柱的径高比为1∶7.5，覆以脱脂棉少许于树脂柱上，大孔树脂柱体积为6.0L。取上述栀子提取液于玻璃柱顶端加入，以6.0L/h的流速上样。上样完毕后，静置吸附2h，用6L的水冲洗大孔树脂柱至流出液为无色，再以20％的乙醇洗脱吸附于大孔树脂上的栀子苷，洗脱溶剂用量为12L，收集20％乙醇冲洗液，减压回收乙醇，干燥，得浅黄色浸膏，即为栀子苷粗提物。栀子苷粗提物质量为36.5g，栀子苷的纯度为71％，栀子苷转移率为61.3％。

3.栀子苷精制工艺

正丁醇萃取：取上述栀子苷粗提物适量，加730ml的水使之溶解，分别加入正丁醇萃取两次，每次正丁醇用量为730ml，收集正丁醇萃取液，干燥，得白色或浅黄色粉末状栀子苷。栀子苷成品为18.8g。栀子苷精制品得率18.8％。

采用高效液相色谱法测定栀子苷成品中栀子苷的含量，按照峰面积归一化法计栀子苷纯度为98.0％；按干燥品计，高效液相色谱法测定栀子苷的含量为92.0％。栀子苷得率为40.9％。HPLC分析条件为：Kromasil 100-5C₁₈ ODS色谱柱(5μm，4.6mm*250mm)；乙腈-0.05％磷酸水溶液(15∶85)为流动相；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；检测波长为238nm；理论板数按栀子苷峰计暂定为不得低于1500。栀子苷对照品和栀子苷精制品高效液相色谱图如图1、2所示。对栀子苷精制品进行UV、MS、IR分析(如图2、5、7所示)，与栀子苷标准品图谱(如图3、4、6所示)比对，进行结构分析，确定为栀子苷。

实施例2

2.大孔树脂纯化栀子苷：取预处理好的大孔树脂4.4Kg装入到垫有少许脱脂棉的玻璃柱中，待树脂沉淀完全，使得树脂柱的径高比为1∶7.5，覆以脱脂棉少许于树脂柱上，大孔树脂柱体积为6.0L。取上述栀子提取液于玻璃柱顶端加入，以6.0L/h的流速上样。上样完毕后，静置吸附2h，用6L的水冲洗大孔树脂柱至流出液为无色，再以水洗脱吸附于大孔树脂上的栀子苷，洗脱溶剂用量为18L，收集20％乙醇冲洗液，减压回收乙醇，干燥，得浅黄色浸膏，即为栀子苷粗提物。栀子苷粗提物质量为34.3g，栀子苷的纯度为73.1％，栀子苷转移率为57.6％。

3.栀子苷精制工艺

氧化铝柱层析：取层析用中性氧化铝(100-200目)347g，装入玻璃柱中，径高比5∶1，取上述栀子苷粗提物，将其溶于少量的蒸馏水中作为上样液，将上样液慢慢加入到氧化铝层析柱中，上样后用95％乙醇冲洗氧化铝柱，洗脱液用量为2.2L。收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得浅黄色或黄色栀子苷粉末。栀子苷成品为17.1g。

采用高效液相色谱法测定栀子苷成品中栀子苷的含量，按照峰面积归一化法计栀子苷纯度为98.0％；按干燥品计，高效液相色谱法测定栀子苷的纯度为92.3％。栀子苷转移率为37.3％。HPLC分析条件为：Kromasil 100-5C₁₈ODS色谱柱(5μm，4.6mm*250mm)；乙腈-0.05％磷酸水溶液(15∶85)为流动相；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；检测波长为238nm；理论板数按栀子苷峰计暂定为不得低于1500。对栀子苷精制品进行UV、MS、IR分析(如图2、5、7所示)，与栀子苷标准品图谱(如图3、4、6所示)比对，进行结构分析，确定为栀子苷。

Claims

1.一种高纯度栀子苷的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)制备栀子提取液：取干燥栀子果实适量，按常规浸泡后水煎提取，水煎液滤过，合并滤液；将滤液浓缩，浓缩液中加入乙醇醇沉，静置，收集上清液，减压回收乙醇至无醇味，浓缩，该浓缩液即为栀子提取液；

(2)纯化：将上述栀子提取液过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，弃去水洗脱液；再用低浓度的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥，得到纯度为60-80％的栀子苷粗提物；

正丁醇萃取工艺：取栀子苷粗提物适量，加-水使之溶解，分别加入正丁醇，萃取两次，-收集正丁醇萃取液，回收正丁醇，干燥，得到纯度高于90％的高纯度栀子苷；

氧化铝柱层析工艺：取适量层析用中性氧化铝，装入玻璃柱中，栀子苷粗提物溶于少量的蒸馏水中作为上样液，将上样液慢慢加入到氧化铝层析柱中，上样后用浓度为95％以上的乙醇冲洗氧化铝柱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得到纯度高于90％的高纯度栀子苷。

2.按权利要求1所述的高纯度栀子苷的制备方法，其特征在于，提取时，步骤(1)中，水煎提取时水用量为5-15倍量，煎煮时间为1-1.5h，煎煮次数为2-3次。醇沉过程中水提液浓缩至每ml含1-1.5g生药的浓缩液，乙醇醇沉浓度为60-70％乙醇，静置24-48小时，收集上清液，减压回收乙醇至无醇味，最后浓缩至每1ml含有0.5-1g生药的浓缩液。

3.按权利要求1所述的高纯度栀子苷的制备方法，其特征在于，大孔树脂纯化时，步骤(2)中，大孔树脂采用D301R弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔树脂纯化过程中，设大孔树脂柱体积为1BV，栀子上样液上样量范围为1/3-1/2BV，水冲洗量为0.8-1BV，低浓度乙醇的冲洗量为2-4BV，浓度为0％-30％。

4.按权利要求1所述的高纯度栀子苷的制备方法，其特征在于，精制时，步骤(3)之正丁醇萃取工艺中，正丁醇用量为栀子苷粗提物的量的10-20倍。

5.按权利要求1所述的高纯度栀子苷的制备方法，其特征在于，精制时，步骤(3)之氧化铝柱层析工艺中，氧化铝采用100-200目层析用中性氧化铝，氧化铝柱径高比范围为7∶1-5∶1，栀子苷粗提物的上样量范围为氧化铝用量的1/10-1/15，上样后冲洗液乙醇浓度为90-95％，洗脱液用量范围为6-15倍柱体积。