CN101496845A

CN101496845A - 一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法

Info

Publication number: CN101496845A
Application number: CNA2008100103093A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 李存满; 丰加涛; 薛兴亚; 章飞芳; 徐青
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2008-02-01
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2028-02-01
Also published as: CN101496845B

Abstract

一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法，其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷，所述的四种主要成分总含量在60％－75％。白花蛇舌草药材经提取、醇沉、膜分离、非极性大孔树脂分离和工业色谱分离等步骤，获得提取物。本制备方法可有效的去除糖蛋白、多糖、氨基酸等杂质，提高了主要活性成分的含量。制备过程重复性高和可操作性好，易于实现标准化和产业化，同时对于白花蛇舌草药材的质量控制也有一定的指导意义。

Description

一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法

技术领域

本发明涉及天然药物的分离，具体的说是白花蛇舌草提取物分离制备方法，该组分主要成分是鸡矢藤苷甲酯，去乙酰基车叶草苷酸甲酯，车叶草苷酸和车叶草苷四个化合物。

背景技术

中药白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草Hedyotis diffusaWilld.又名Oldenlandia diffusa Roxb.的全草。始载于《广西中药志》，具有清热解毒、活血化瘀、利水渗湿、消肿止痛、抗肿瘤等作用，广泛用于肿瘤、黄疸性肝炎、肠炎和肺炎等的治疗。主产于广东、广西、福建等地。白花蛇舌草的主要成分是环烯醚萜类、黄酮类和蒽醌类化合物，其次为有机酸类、甾醇类化合物等。白花蛇舌草中常见的环烯醚萜类化合物主要有鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷和鸡矢藤苷等。药理研究表明，白花蛇舌草具有抗氧化，消炎抗菌、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性(Lin C.C.，Ng L.T.and Yang J.J.，Am.J.Chin.Med.，2004，32：339-349；Lin C.C.，Ng L.T.，Yang J.J.and Hsu Y.F，Am.J.Chin.Med.，2002，30：225-234；赵浩如等，中国药科大学学报，2002，33(6)：510-513；Yoshida Y.，Wang M.Q.et al.，Int.J.Immunopharmaclo.1997，19：359-370)。同时白花蛇舌草中环烯醚萜类化合物还具有神经保护作用(KimY.，ParkE.J.，et al.，J.Nat.Prod.，2001，64：75-78)。由于白花蛇舌草在抗肿瘤方面的功效，越来越引起人们的关注。

白花蛇舌草及其制剂主要用于呼吸***感染、肝炎、肺炎、肿瘤等的治疗。环烯醚萜类化合物是白花蛇舌草中主要活性成分之一，而目前报道的分离制备烯醚萜类化合物的方法，基本上都是采取传统的溶剂萃取、硅胶柱层析等方法，这些方法存在重现性差、耗时长、有机残留严重、检测手段落后、自动化程度低、无法大规模生产等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法，其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷四个主要的化合物。

本发明提供一种白花蛇舌草提取物，其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷，所述的四种主要成分总含量在60％—75％。

本发明提供的白花蛇舌草提取物，其中鸡矢藤苷甲酯的含量在10％—15％，去乙酰基车叶草苷酸甲酯含量在10％—20％，车叶草苷酸含量在20％—25％，车叶草苷含量在20％—25％。

本发明提供了一种白花蛇舌草提取物的分离制备方法，分为提取、醇沉、膜分离、非极性大孔树脂分离和工业色谱分离等步骤，具体为：

1)提取：称取白花蛇舌草原药材，加入其重量6-10倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小时，得到提取液，将提取液浓缩至相对密度为0.9-1.10得浸膏；

2)醇沉：将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70％，室温静置12-24小时，过滤，取滤液浓缩至相对密度1.05-1.10；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到75-80％，室温静置12-24小时过滤，取滤液浓缩挥发除去乙醇，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心；

3)膜分离：此醇沉组分再通过3000-6000Da的膜分离，得到膜分离组分；

4)非极性大孔树脂分离：将膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1：100—500，分别采用流动相体积浓度10-30％的乙醇和70-95％乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3-5个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；循环洗脱，洗脱液浓缩，即为白花蛇舌草大孔树脂分离组分；

5)工业色谱分离：以粒径5-20微米的OEG系列硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，甲醇的体积浓度从2-100％变化，收集目标组分，干燥处理即为白花蛇舌草提取物。

本发明提供的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，所述色谱柱效为5000-20000塔板/米。

本发明提供的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，所述色谱柱长为200毫米—600毫米，色谱柱内径为20毫米—300毫米。

本发明的优点：

1.主要成分的含量高。本发明采用了最先进的工业色谱填料和分离制备技术。利用工业色谱的高分离能力，可以保证主要成分的纯度达到70％以上。

2.重现性好。本发明利用工业色谱***和OEG系列硅胶键合固定相分离材料稳定的性能，可以保证分离制备的重现性和稳定性。

3.周期短。本发明从原药材的粉碎提取到制备得到白花蛇舌草提取物的产品，只需要10天的时间。

4.有机残留低。由于本发明摒弃了传统工艺中溶剂萃取、硅胶柱层析等工艺，采用了有机溶剂使用量较少的工业色谱方法，而且最终产品采用真空离心干燥处理，所以最终产品的有机溶剂残留特别小。

5.能够实现大规模工业生产。本发明所采用工艺非常容易实现标准化，自动化，适于进行产业化大规模生产。

附图说明

图1本发明实施例1工业色谱制备白花蛇舌草提取物的制备色谱图。

图2本发明中白花蛇舌草提取物的HPLC色谱图(λ＝254nm)

具体实施方式

白花蛇舌草提取物的制备方法

实施例1：

将白花蛇舌草原药材粉碎，定量称取2千克，置于20升提取罐中，加入20升水煎煮1小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入20升水煎煮1小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至500毫升，得到白花蛇舌草水提取组分。在浓缩液中加入710毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至300毫升，在浓缩液中加入1600毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到白花蛇舌草醇沉组分300毫升。此醇沉组分再过6000Da膜，得到膜分离组分。

取白花蛇舌草膜分离组分，进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析***(20L)中，。首先用5倍柱体积100L30％乙醇洗脱柱体，洗脱液浓缩备其它用，再用5倍柱体积100L95％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩，得到白花蛇舌草大孔树脂组分。

工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的OEG-4键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm(可为230-260nm)，流速200分钟/毫升，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(5％甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取白花蛇舌草大孔树脂组分样品5ml，进样，按设定梯度洗脱，收集2分钟至8分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分(见图1)。将收集得到的切割组分，合并，浓缩，再通过真空离心干燥得到白花蛇舌草提取物产品2.3克，经高效液相色谱分析(图2)，其提取物的总含量>71％。

表1 实施例1白花蛇舌草提取物的工业色谱制备梯度设置表

序号	时间(min)	流量(ml/min)	A：甲醇(％)	B：水(％)
序号	时间(min)	流量(ml/min)	A：甲醇(％)	B：水(％)	1	0	200	5	95
2	5	200	5	95	1	0	200	5	95
2	5	200	5	95	3	10	200	10	90
4	30	200	30	70	3	10	200	10	90
4	30	200	30	70	5	31	200	100	0
6	35	200	100	0	5	31	200	100	0

实施例2

将白花蛇舌草原药材粉碎，定量称取5千克，置于100升提取罐中，加入40升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入40升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至1000毫升，得到白花蛇舌草水提取组分。在浓缩液中加入1710毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至500毫升，在浓缩液中加入2670毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(10000转/分钟)离心，得到白花蛇舌草醇沉组分500毫升。此醇沉组分再过6000Da膜，得到膜分离组分。

取白花蛇舌草膜分离组分，进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析***(60L)中，。首先用3倍柱体积30％乙醇洗脱柱体，洗脱液浓缩备其它用，再用3柱体积的95％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩，得到白花蛇舌草大孔树脂组分。

工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的OEG-4键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm，流速200分钟/毫升，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(5％甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取白花蛇舌草大孔树脂组分样品5ml，进样，按设定梯度洗脱，收集2分钟至8分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。将收集得到的切割组分，合并，浓缩，再通过真空离心干燥得到白花蛇舌草提取物产品5.8克，经高效液相色谱分析，其提取物的总含量>71％。

实施例3

将白花蛇舌草原药材粉碎，定量称取10千克，置于100升提取罐中，加入60升水煎煮3小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入60升水煎煮3小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至2000毫升，得到白花蛇舌草水提取组分。在浓缩液中加入3420毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至1500毫升，在浓缩液中加入8000毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(25000转/分钟)离心，得到白花蛇舌草醇沉组分1800毫升。此醇沉组分再过3000Da膜，得到膜分离组分。

取白花蛇舌草膜分离组分，进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析***中，。首先用3倍柱体积30％乙醇洗脱柱体，洗脱液浓缩备其它用，再用3倍柱体积95％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩，得到白花蛇舌草大孔树脂组分。

工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的OEG-4键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm(可为230-260nm)，流速200分钟/毫升，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(5％甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取白花蛇舌草大孔树脂组分样品3ml，进样，按设定梯度洗脱，收集2分钟至8分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。将收集得到的切割组分，合并，浓缩，再通过真空离心干燥得到白花蛇舌草提取物产品10.8克，经高效液相色谱分析，其提取物的总含量>70％。

Claims

1、一种白花蛇舌草提取物，其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷，其特征在于：所述的四种主要成分总含量在60％—75％。

2、按照权利要求1所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于：鸡矢藤苷甲酯的含量在10％—15％。

3、按照权利要求1所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于：去乙酰基车叶草苷酸甲酯含量在10％—20％。

4、按照权利要求1所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于：车叶草苷酸含量在20％—25％。

5、按照权利要求1所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于：车叶草苷含量在15％—25％。

6、一种如权利要求1所述的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，其特征在于：分为提取、醇沉、膜分离、非极性大孔树脂分离和工业色谱分离等步骤，具体为：

1)提取：称取白花蛇舌草原药材，加入其重量6-10倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小时，得到提取液，将提取液浓缩至相对密度为0.9-1.10浸膏；

7、一种如权利要求6所述的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，其特征在于：所述色谱柱效为5000-20000塔板/米。

8、一种如权利要求6所述的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，其特征在于：所述色谱柱长为200毫米—600毫米，色谱柱内径为20毫米—300毫米。