CN103153927B - 稠合的环辛炔化合物及其在无金属点击反应中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及稠合的环辛炔化合物及其制备的方法。本发明还涉及缀合物，其中本发明的稠合的环辛炔化合物缀合到标记物，并且本发明涉及这些缀合物在靶分子的生物正交标记、成像和/或修饰（例如表面修饰）中的用途。本发明还涉及用于靶分子的修饰的方法，其中本发明的缀合物与含1,3‑偶极子或1,3‑(杂)二烯的化合物反应。

Description

稠合的环辛炔化合物及其在无金属点击反应中的应用
技术领域
本发明涉及稠合的环辛炔化合物及其制备的方法。本发明所述稠合的环辛炔化合物可用于无金属的点击反应(click reaction)。因此，本发明还涉及通过稠合的环辛炔缀合物与包含1,3-偶极子或1,3-(杂)二烯的靶分子的反应修饰靶分子的方法。本发明还涉及环辛炔缀合物用于靶分子的生物正交（bioorthogonal）标记、成像或修饰中的用途。
背景技术
快速发展的“化学生物学”领域中的一个革命性发展涉及生命***中的化学。生命***中的化学涉及这样的化学反应：其在自然条件下是温和的，并且如此的快速和高产率以至于其可在大约生理pH、在水中和生物分子官能团（biomolecular functionality）附近发挥作用。这种反应可分类于术语“生物正交化学”内。在生物正交化学领域，主要有两个挑战：一、开发适合的化学（chemistry）；以及二、将其应用于活生物体中（体内）。
在化学领域，存在大量的化学反应的工具盒，可用于构建复杂的有机分子。但是，绝大多数这种反应只能在严格的无水条件下（换言之，在完全无水的情况下）实施。虽然还有极少数化学反应可在水中或有水条件下进行，但是大多数这种反应只能在体外应用，因为无法排除存在于活生物体中的其他化合物对所涉及的化学试剂的干扰。目前，只有少数化学反应能够与存在于活生物体中的其他官能团完全相容。
这种反应的一个实例是环炔和叠氮化物的环加成反应，其中一个反应称为“点击反应”。该反应已成为生物分子（例如蛋白质、脂质、聚糖等）的生物正交标记和成像、蛋白质组学和材料科学中的通用手段。本质上，一个带有叠氮化物、另一个带有张力(strained)环炔的两个独立的分子实体会通过称为张力促进的叠氮化物-炔环加成反应（SPAAC）的反应自发地结合成一个分子。用于生物正交标记的SPAAC的动力在于分离的环炔或叠氮化物对生物官能团例如胺、巯基、酸或羰基是完全惰性的，但是其结合会发生快速和不可逆的环加成反应形成稳定的***缀合物。例如，通过简单地搅拌所述叠氮基蛋白质与环辛炔缀合物，可将（通过在营养缺陷型细菌中表达、遗传工程或化学转化得到的）叠氮基修饰的蛋白质用生物素、荧光团、PEG-链或其他官能团容易地标记。另外，已经通过化学指示剂策略证明小尺寸的叠氮化物对于SPAAC在特定生物分子成像中的应用非常有用。
方案1
除叠氮化物外，环辛炔也显示出与其他偶极子（例如硝酮和氧化腈）的高反应性。例如，张力促进的炔-硝酮环加成反应（SPANC）应用于蛋白质的N-末端修饰。
SPAAC和SPANC环加成反应（方案1）自发进行，因此不存在（金属）催化剂，并且它们和选定数量的额外环加成反应也称为“无金属点击反应”。
现有技术中描述了几种环炔及其在生物正交标记中的应用。US2009/0068738（以引用方式纳入本文）涉及经修饰的环炔化合物以及它们用于通过可在生理条件下实施的环加成反应修饰生物分子的应用。所述环加成包括使经修饰的环炔（例如二氟化环辛炔化合物DIFO、DIFO2和DIFO3）与靶生物分子上的叠氮化物部分发生反应，产生经共价修饰的生物分子。已发现氟化物取代对于与叠氮化物的环加成具有加速效应。例如DIFO3显示出显著提高的可高达k=76×10-3M-1s-1的反应速率常数，而与之相比，未氟化体系的最大值为2.4×10-3M-1s-1。
WO2009/067663（其通过引用方式纳入本文）中公开了其中环辛炔稠合到芳基上的环辛炔化合物（苯并（benzannulated）体系），并且这些二苯并环辛炔化合物DIBO在与叠氮化物的环加成中的反应动力学得到进一步改进(k=0.12M-1s-1)。
van Delft等(Chem.Commun.2010,46,97–99)（其通过引用方式纳入本文）开发了氮杂二苯并环辛炔DIBAC，并且DIBAC在与叠氮化物的环加成中显示出进一步改进的反应动力学（k=0.31M-1s-1）。
最近，Bertozzi等(J.Am.Chem.Soc.2010,132,3688–3690)（其通过引用方式纳入本文）报道了另一种苯并体系：二芳基氮杂环辛酮BARAC。通过将酰胺官能团置于环中，显著改进了BARAC与叠氮化物的环加成的反应动力学(k=0.96M-1s-1)。
如Pezacki(Chem.Commun.2010,46,931–933)和van Delft(Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,3065–3068)所述，还发现DIBO和DIBAC与硝酮进行快速环加成，其反应速率常数比与叠氮化物的环加成的反应速率常数高最高达300倍，所述两篇文献均以引用方式纳入本文。
但是，在现有技术中已知的用于生物正交标记的环辛炔探针有几点缺陷。首先，只有DIBAC可商购获得，这阻碍了其广泛应用。其合成制备需要高级的化学专业技术。此外，目前可获得的探针的合成很耗时（对于DIFO2需要8个化学步骤，对于DIFO3需要10个化学步骤，对于DIBAC需要9个化学步骤）和/或产率低（对于DIBO总共10%）。第三，DIBO和DIBAC中存在的两个苯并芳基部分导致严重的空间位阻以及亲脂特性。DIBO和DIBAC的亲脂特性可导致通过范德华相互作用的非特异性蛋白结合，这是不合乎需要的。
因此，非常需要新的、易得的和具有反应活性的生物正交探针用于无金属点击反应，例如与叠氮化物、硝酮和其他1,3-偶极子的1,3-偶极环加成。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及式(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物，
其中：
m为0或1；
n为0或8；
p为0或1；
Z是N或C(R3)，其中R3选自[(L)p-Q]、氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地且任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷基氧基、卤素、氨基、氧基和甲硅烷基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷基氧基任选地被取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述甲硅烷基用式(R4)3Si-表示，其中R4独立地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基和C3-C12环烷基氧基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷基氧基任选地被取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断；
Y是O、C(O)或C(R5)2，其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代；
任选地，当m=1时，Y和Z以及连接Y和Z的键一起形成环烷基或(杂)芳基，其中所述环烷基和(杂)芳基任选地被取代，如果Y和Z形成(杂)芳基，那么–(L)p-Q基团是(杂)芳基上的取代基；
L是连接基团，选自直链或支链C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C2-C24亚炔基、C3-C24环亚烷基、C5-C24环亚烯基、C8-C24环亚炔基、C7-C24烷基(杂)亚芳基、C7-C24(杂)芳基亚烷基、C8-C24(杂)芳基亚烯基、C9-C24(杂)芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、(杂)芳基亚烯基和(杂)芳基亚炔基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基、C8-C12环炔基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷基氧基、卤素、氨基、氧基和甲硅烷基，其中所述甲硅烷基可用式(R4)3Si-表示，其中R4的定义如上所述；
Q是选自氢、卤素、R6、-CH=C(R6)2、-C≡CR6、-[C(R6)2C(R6)2O]q-R6（其中q为1到200）、-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(X)N(R6)2、-C(R6)2XR6、-C(X)R6、-C(X)XR6、-S(O)R6、-S(O)2R6、-S(O)OR6、-S(O)2OR6、-S(O)N(R6)2、-S(O)2N(R6)2、-OS(O)R6、-OS(O)2R6、-OS(O)OR6、-OS(O)2OR6、-P(O)(R6)(OR6)、-P(O)(OR6)2、-OP(O)(OR6)2、-Si(R6)3、-XC(X)R6、-XC(X)XR6、-XC(X)N(R6)2、-N(R6)C(X)R6、-N(R6)C(X)XR6和-N(R6)C(X)N(R6)2的官能团，其中X是氧或硫并且其中R6独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
R1独立地选自氢、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；并且
R2独立地选自卤素、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、C1-C12烷基、C1-C12芳基、C1-C12烷基芳基和C1-C12芳基烷基，其中R6的定义如上所述，并且其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任选地被取代。
本发明还涉及缀合物，例如环辛炔缀合物，其中式(Ia)、(Ib)和/或(Ic)的化合物通过官能团Q缀合到标记物。
本发明的另一方面是提供用于制备通式(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物的方法，该方法包含以下步骤：
（a）将稠合的3元环或者4元环引入式(VIIa)、(VIIb)或(VIIc)的环辛二烯以形成双环环辛烯化合物：
其中：
n=0到8;
R1独立地选自氢、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；并且
R2独立地选自卤素、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、C1-C12烷基、C1-C12芳基、C1-C12烷基芳基和C1-C12芳基烷基，其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任选地被取代，并且其中R6独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，
（b）溴化所得的双环环辛烯化合物以形成双环环辛烷化合物，并且
（c）使所得的双环环辛烷化合物脱溴化氢。
本发明还涉及修饰靶分子的方法，其中本发明的缀合物与包含1,3-偶极子或1,3-(杂)二烯的化合物发生反应。
本发明的另一方面是本发明的缀合物用于靶分子的生物正交标记、成像或修饰（例如表面修饰）的用途。
最后，本发明涉及包含本发明的缀合物并且还包含可药用载体的组合物。
附图说明
图1示出了对叠氮化物标记的衣壳蛋白和缀合至Alexa Fluor555的环辛烷的SPAAC反应（左）和空白反应（右）的SDS-PAGE分析。
图2示出了用缀合至Alexa Fluor555的环辛烷官能化的衣壳蛋白的ESI-TOF质谱图。
图3示出了对用缀合至Alexa Fluor555的环辛烷官能化的衣壳蛋白的FPLC分析。
图4示出了代谢整合Ac4ManNAz、用DIBO-或BCN-生物素标记并用AlexaFluor488-缀合的抗生蛋白链菌素检测后用流式细胞仪测定的完整MV3细胞的细胞表面荧光。
图5示出了代谢整合Ac4ManNAz、用DIBO-或BCN-生物素标记并用AlexaFluor488-缀合的抗生蛋白链菌素检测后的MV3细胞的荧光强度和细胞活力。
图6示出了预先在不存在或存在Ac4ManNAz(50μM)的条件下培养、用DIBO-或BCN-生物素标记并用AlexaFluor488-缀合的抗生蛋白链菌素检测的经标记细胞的代表性共聚焦图像。
具体实施方式
定义
本说明书和权利要求书中所用的动词“包含”及其变形以非限制性含义使用，意指包括该词后面的条目，但不排除未具体提及的条目。
此外，除非上下文中明确表示有且只有一个要素，否则当以不定冠词“一”或“一个”涉及一种元素时不排除存在多于一个所述要素的可能性。因此，所述不定冠词“一”或“一个”通常表示“至少一个”。
本说明书和权利要求书中公开的化合物可被描述为稠合的环辛炔化合物，即其中第二个环结构稠合到所述环辛炔部分的环辛炔化合物。在稠合的环辛炔化合物中所述环辛炔部分的三键可位于三个可能的位置（即所述环辛炔部分的2、3或4位（依据―IUPACNomenclature ofOrganic Chemistry‖,Rule A31.2编号））中的任何一个。本说明书和权利要求书中对于任何稠合的环辛炔化合物的描述均意在包括所述环辛炔部分的所有三种单独的区域异构体(regioisomer)。
本说明书和权利要求书中公开的化合物可包含一种或多种不对称中心，并且所述化合物可能存在不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中对任何化合物的描述均意在包括所有非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中对任何化合物的描述均意在包括所述单独的对映异构体以及所述对映异构体的任意混合物(外消旋的或相反)。可以理解的是，当将化合物的结构描述为具体的对应异构体时，本申请的发明不限于所述具体的对映异构体。
所述化合物可以不同的互变异构形式存在。除非另有说明，本发明的化合物意在包括所有的互变异构形式。
本说明书和权利要求书中公开的化合物还可存在外型（exo）和内型（endo）区域异构体。除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中对任何化合物的描述意在包括化合物的单独的外型区域异构体和单独的内型区域异构体，及其混合物。
此外，本说明书和权利要求书中公开的化合物还可存在顺式和反式异构体。除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中对任何化合物的描述意在包括化合物的单独的顺式异构体和单独的反式异构体，及其混合物。作为实例，可以理解的是，当将化合物的结构描述为顺式异构体时，本申请的发明不排除其相应的反式异构体或所述顺式异构体和反式异构体的混合物。
未被取代的烷基具有通式CnH2n+1，并且可为直链或支链。未被取代的烷基还可包含环状部分并因此具有随之而来的通式CnH2n-1。任选地，所述烷基可被本文中进一步具体提及的一种或多种取代基取代。合适的烷基的实例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。
未被取代的烯基具有通式CnH2n-1，并且可以是直链或者支链。合适的烯基的实例包括但不限于，乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、戊烯基、癸烯基、十八烯基和二十碳烯基等。未被取代的烯基还可包含环状部分并因此具有随之而来的通式CnH2n-3。
未被取代的烯具有通式CnH2n，而未被取代的炔具有通式CnH2n-2。
芳基包含至少6个碳原子，并可包括单环、双环和多环的结构。可任选地，所述芳基可被本文中进一步具体提及的一种或多种取代基取代。芳基的实例包括例如苯基、萘基、蒽基等的基团。
芳基烷基和烷基芳基包含至少7个碳原子，并可包括单环和双环的结构。任选地，所述芳基可被本文中进一步具体提及的一种或多种取代基取代。芳基烷基为例如苯甲基等。烷基芳基为例如4-叔丁基苯基等。
将芳基表示为(杂)芳基时，该符号意在包括芳基和杂芳基。同样地，烷基(杂)芳基意在包括烷基芳基和烷基杂芳基，并且(杂)芳基烷基意在包括芳基烷基和杂芳基烷基。
杂芳基包含1到4个选自氧、氮和硫的杂原子。
稠合的环辛炔化合物
基于环炔的反应性随着环尺寸的减小而增加这一事实，具有小于8个碳原子的环炔缀合物在生物正交化学中具有很高的应用价值。不幸的是，由于偏离理想的180°C–C·C角度导致的张力能增加，到目前为止尚不能以纯的形式分离环庚炔及更小的环。
增加张力能的另一种方式是通过将环辛炔苯并至芳基（该策略在WO2009/067663中用于DIBO）。随后可通过在所述环中引入另一个sp2-型原子进一步提高张力能(该方法由van Delft用于DIBAC并由Bertozzi用于BARAC)。但是，如上所述，环辛炔中存在两个芳基部分不仅产生了严重的空间位阻，而且增加了所述环辛炔化合物亲脂特性，这是不想要的。
本发明人发现了一种非常有效的诱导额外的环张力的方法，其包括将环辛炔稠合到3元环或者4元环上，得到稠合的环辛炔化合物，更具体地分别得到双环[6.1.0]壬炔和双环[6.2.0]癸炔体系。这些双环体系出乎意料地非常适合作为生物正交探针，因为它们在与1,3-偶极子的(3+2)环加成中和与1,3-(杂)二烯的(杂)Diels-Alder反应中兼具相对的稳定性与高反应性。此外，除产生环张力之外，所述稠合的3元环或者4元环结构也极其适合用于放置缀合官能团和/或标记物上的柄（handle），并且可被便利地官能化用于例如靶分子的生物正交标记、成像和/或修饰（例如表面修饰）的应用。
因此在第一方面，本发明涉及通式(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物，
其中：
m为0或1；
n为0到8；
p为0或1；
Z是N或C(R3)，其中R3选自[(L)p-Q]、氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地且任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷基氧基、卤素、氨基、氧基和甲硅烷基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷基氧基任选地被取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述甲硅烷基用式(R4)3Si-表示，其中R4独立地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基和C3-C12环烷基氧基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷基氧基任选地被取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断；
Y是O、C(O)或C(R5)2，其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代；
任选地，当m=1时，Y和Z以及连接Y和Z的键一起形成环烷基或(杂)芳基，其中所述环烷基和(杂)芳基任选地被取代，如果Y和Z形成(杂)芳基，那么–(L)p-Q基团是(杂)芳基上的取代基；
L是连接基团，其选自直链或支链的C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C2-C24亚炔基、C3-C24环亚烷基、C5-C24环亚烯基、C8-C24环亚炔基、C7-C24烷基(杂)亚芳基、C7-C24(杂)芳基亚烷基、C8-C24(杂)芳基亚烯基、C9-C24(杂)芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、(杂)芳基亚烯基和(杂)芳基亚炔基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基、C8-C12环炔基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷基氧基、卤素、氨基、氧基和甲硅烷基，其中所述甲硅烷基可用式(R4)3Si-表示，其中R4的定义如上所述；
Q是选自氢、卤素、R6、-CH=C(R6)2、-C≡CR6、-[C(R6)2C(R6)2O]q-R6（其中q为1到200）、-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(X)N(R6)2、-C(R6)2XR6、-C(X)R6、-C(X)XR6、-S(O)R6、-S(O)2R6、-S(O)OR6、-S(O)2OR6、-S(O)N(R6)2、-S(O)2N(R6)2、-OS(O)R6、-OS(O)2R6、-OS(O)OR6、-OS(O)2OR6、-P(O)(R6)(OR6)、-P(O)(OR6)2、-OP(O)(OR6)2、-Si(R6)3、-XC(X)R6、-XC(X)XR6、-XC(X)N(R6)2、-N(R6)C(X)R6、-N(R6)C(X)XR6和-N(R6)C(X)N(R6)2的官能团，其中X是氧或硫并且其中R6独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
R1独立地选自氢、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；并且
R2独立地选自卤素、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、C1-C12烷基、C1-C12芳基、C1-C12烷基芳基和C1-C12芳基烷基，其中R6的定义如上所述并且其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任选地被取代。
本发明所述稠合的环辛炔的一个优点是它们易于合成。另一个优点是这些分子的多个部分可以进行简单、直接的修饰。
优选式(Ia)的所述稠合环辛炔化合物。该化合物中，三键位于所述环辛炔部分的4-位，即与所述稠合的3元环或4元环相对的位置。根据所述环辛炔化合物上取代基的性质，这可能导致(Ia)的可能的区域异构体的数目减少。
在式(Ia)、(Ib)和(Ic)的化合物中，Z上的取代基–[(L)p-Q]可位于相对于所述环辛炔环的外(exo)位或内(endo)位。两个R1-取代基相对于彼此可为顺式或反式的位置。
优选地，Q选自-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(X)N(R6)2、-C(R6)2XR6、-C(X)R6、-C(X)XR6、-XC(X)R6、-XC(X)XR6、-XC(X)N(R6)2、-N(R6)C(X)R6、-N(R6)C(X)XR6和-N(R6)C(X)N(R6)2，其中X和R6的定义如上所述。更优选地，X是氧。最优选地，Q选自-OR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(O)N(R6)2、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-OC(O)OR6、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR6和-N(R6)C(O)N(R6)2。此外，官能团Q可任选地被掩蔽或保护。所述R6可相互独立地进行选择，也就是说例如-N(R6)2取代基中的2个R6基团可彼此不同。
在一个实施方案中，p为0，即Q直接键合到Z。在另一个实施方案中，p为1。在另一个实施方案中，p为1并且L是CH2。
在一个优选的实施方案中，R1是氢。
在另一个优选的实施方案中，n为0。在另一个优选实施方案中，R2是吸电子基团，即Hammett取代常数σ为正值的基团。合适的吸电子基团是本领域技术人员已知的，并且包括例如卤素（特别为氟）、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、取代的C1-C12烷基、取代的C1-C12芳基或取代的C1-C12烷基芳基，其中所述取代基是吸电子基团。优选地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代C1-C12烷基（例如-CF3）、氟代C1-C12芳基（例如-C6F5）、或氟代C1-C12烷基芳基（例如-[3,5-(CF3)2(C6H3)]）。
m=0且Z=CR3的化合物
本发明涉及的一类具体的化合物是式(Ia)、(Ib)或(Ic)类的化合物，其中所述环辛炔部分稠合到3元环结构。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，如上所定义，m为0。
在另一个优选的实施方案中，Z是C(R3)，其中R3如上所定义。因此，本发明还涉及式(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物，其中所述化合物具有式(IIa)、(IIb)或(IIc):
其中n、p、R1、R2、R3、L和Q如上述式(Ia)、(Ib)和(Ic)的化合物中所定义。
如上所述，式(IIa)、(IIb)和(IIc)的化合物中的取代基–[(L)p-Q]可位于相对于所述环辛炔环的外或内位，并且两个R1取代基相对于彼此可位于顺式或反式位置。在一个优选实施方案中，R1取代基为顺式位置。
在一个实施方案中，p为0，即Q直接键合到环丙基环。在另一个实施方案中，p为1。在另一个实施方案中，p为1并且L是CH2。
同样在式(IIa)、(IIb)或(IIc)的化合物中，当p为0和p为1时，Q优选地选自-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(X)N(R6)2、-C(R6)2XR6、-C(X)R6、-C(X)XR6、-XC(X)R6、-XC(X)XR6、-XC(X)N(R6)2、-N(R6)C(X)R6、-N(R6)C(X)XR6和-N(R6)C(X)N(R6)2,其中X和R6的定义如上所述。更优选地，X是氧。最优选地，Q选自-OR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(O)N(R6)2、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-OC(O)OR6、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR6和-N(R6)C(O)N(R6)2。此外，官能团Q可任选地被掩蔽或保护。R6基团可相互独立地进行选择，也就是说例如-N(R6)2取代基中的2个R6基团可彼此不同。在一个优选的实施方案中，Q是–OR6，优选为–OH。在另一个优选的实施方案中，Q是-C(O)OR6。
在另一个优选的实施方案中，R3是氢或[(L)p-Q]。
在一个优选的实施方案中，R1是氢。
在另一个优选的实施方案中，n为0。在另一个优选实施方案中，R2是吸电子基团，即Hammett取代常数σ为正值的基团。合适的吸电子基团为本领域技术人员已知的，并且包括例如卤素（特别为氟）、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、取代的C1-C12烷基、取代的C1-C12芳基或取代的C1-C12烷基芳基，其中所述取代基是吸电子基团。优选地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代C1-C12烷基（例如-CF3）、氟代C1-C12芳基（例如-C6F5）、或氟代C1-C12烷基芳基（例如-[3,5-(CF3)2(C6H3)]）。
在式(IIa)、(IIb)和(IIc)的化合物中，优选式(IIa)的化合物，因为它们可具有对称的轴或平面，因而减少可能形成的潜在区域异构体的数目。
特别优选其中p为1、L是CH2、Q是–OH、R1是氢、R3是氢或[(L)p-Q]并且n为0的实施方案。
m=0且Z=N的化合物
本发明还涉及通式为(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物，其中m为0且Z是N。这些化合物具有通式(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)：
其中n、p、R1、R2、L和Q如上式(Ia)、(Ib)和(Ic)的化合物中所定义。
两个R1取代基相对于彼此可位于顺式或反式的位置。在一个优选的实施方案中，所述R1取代基位于顺式位置。
在一个实施方案中，p为0，即Q直接键合到N。在另一个实施方案中，p为1。在另一个实施方案中，p为1并且L是CH2。
同样在式(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)的化合物中，当p为0和p为1时，Q优选地选自-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(X)N(R6)2、-C(R6)2XR6、-C(X)R6、-C(X)XR6、-XC(X)R6、-XC(X)XR6、-XC(X)N(R6)2、-N(R6)C(X)R6、-N(R6)C(X)XR6和-N(R6)C(X)N(R6)2,其中X和R6的定义如上所述。更优选地，X是氧。最优选地，Q选自-OR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(O)N(R6)2、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-OC(O)OR6、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR6和-N(R6)C(O)N(R6)2。此外，官能团Q可任选地被掩蔽或保护。所述R6可相互独立地进行选择，也就是说例如-N(R6)2取代基中的2个R6基团可彼此不同。
在一个优选的实施方案中，R1是氢。
在另一个优选的实施方案中，n为0。在另一个优选实施方案中，R2是吸电子基团，即Hammett取代常数σ为正值的基团。合适的吸电子基团为本领域技术人员已知的，并且包括例如卤素（特别为氟）、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、取代的C1-C12烷基、取代的C1-C12芳基或取代的C1-C12烷基芳基，其中所述取代基是吸电子基团。优选地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代C1-C12烷基（例如-CF3）、氟代C1-C12芳基（例如-C6F5）、或氟代C1-C12烷基芳基（例如-[3,5-(CF3)2(C6H3)]）。
在式(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)的化合物中，优选式(IIIa)的化合物，因为它们具有对称元素，因而减少可能形成的潜在区域异构体的数目。
m=1且Z=C(R3)的化合物
本发明还涉及通式为(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物，其中m为1且Z是C(R3)，且这些化合物具有通式(IVa)、(IVb)或(IVc)：
其中Y是O、C(O)或C(R5)2，并且n、p、L、Q、R1、R2、R3和R5如上所定义。
同样在式(IVa)、(IVb)和(IVc)的化合物中，取代基–[(L)p-Q]可位于相对于所述环辛炔环的外或内位，并且两个R1取代基相对于彼此可位于顺式或反式的位置。
在如上所示的式(IVa)、(IVb)和(IVc)的化合物中，所述Z-基团（即键合到R3和-[(L)p-Q]取代基的C-原子）位于所述稠合的环辛炔化合物的9-位。但是，也包括(IVb)和(IVc)的区域异构体，其中Z-基团位于所述稠合的双环癸炔的10-位，由此所述-[(L)p-Q]取代基可位于外或内位置。
在一个实施方案中，p为0，即Q直接键合到环丁基环。在另一个实施方案中，p为1。在另一个实施方案中，p为1并且L是CH2。
同样在式(IVa)、(IVb)或(IVc)的化合物中，当p为0和p为1时，Q优选地选自-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(X)N(R6)2、-C(R6)2XR6、-C(X)R6、-C(X)XR6、-XC(X)R6、-XC(X)XR6、-XC(X)N(R6)2、-N(R6)C(X)R6、-N(R6)C(X)XR6和-N(R6)C(X)N(R6)2，其中X和R6的定义如上所述。更优选地，X是氧。最优选地，Q选自-OR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(O)N(R6)2、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-OC(O)OR6、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR6和-N(R6)C(O)N(R6)2。此外，官能团Q可任选地被掩蔽或保护。所述R6可相互独立地进行选择，也就是说例如-N(R6)2取代基中的2个R6基团可彼此不同。
在一个优选的实施方案中，Y是O。在另一个优选的实施方案中，Y是C(O)。当Y是O和Y是C(O)时，优选R1为氢。
在另一个优选的实施方案中，n为0。在另一个优选实施方案中，R2是吸电子基团，即Hammett取代常数σ为正值的基团。合适的吸电子基团为本领域技术人员已知的，并且包括例如卤素（特别为氟）、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、取代的C1-C12烷基、取代的C1-C12芳基或取代的C1-C12烷基芳基，其中所述取代基是吸电子基团。优选地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代C1-C12烷基（例如-CF3）、氟代C1-C12芳基（例如-C6F5）、或氟代C1-C12烷基芳基（例如-[3,5-(CF3)2(C6H3)]）。
优选式(IVa)的化合物。在该化合物中，三键位于所述环辛炔部分的4-位，即与稠合的环丁基环相对。
m=1且Z=N的化合物
本发明还涉及通式为(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物，其中m为1且Z是N。这些化合物具有通式(Va)、(Vb)或(Vc)：
其中Y是C(O)或C(R5)2，并且n、p、L、Q、R1、R2和R5如上所定义。
在此处所示的式(Va)、(Vb)和(Vc)的化合物中，所述4元环的N-原子位于所述双环体系的9-位。但是，本发明还涉及式(Vb)或(Vc)的区域异构体，其中所述4元环的N-原子位于所述双环体系的10-位。此外，两个R1取代基相对于彼此可位于顺式或反式的位置。
在一个实施方案中，p为0，即Q直接键合到所述4元环。在另一个实施方案中，p为1。在另一个实施方案中，p为1并且L是CH2。
同样在式(Va)、(Vb)或(Vc)的化合物中，当p为0和p为1时，Q优选地选自-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(X)N(R6)2、-C(R6)2XR6、-C(X)R6、-C(X)XR6、-XC(X)R6、-XC(X)XR6、-XC(X)N(R6)2、-N(R6)C(X)R6、-N(R6)C(X)XR6和-N(R6)C(X)N(R6)2，其中X和R6的定义如上所述。更优选地，X是氧。最优选地，Q选自-OR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(O)N(R6)2、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-OC(O)OR6、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR6和-N(R6)C(O)N(R6)2。此外，官能团Q可任选地被掩蔽或保护。所述R6可相互独立地进行选择，也就是说例如-N(R6)2取代基中的2个R6基团可彼此不同。
如果Y是C(R5)2，R5优选地为氢。当Y是C(R5)2和Y是C(O)时，优选R1为氢。
在另一个优选的实施方案中，n为0。在另一个优选实施方案中，R2是吸电子基团，即Hammett取代常数σ为正值的基团。合适的吸电子基团为本领域技术人员已知的，并且包括例如卤素（特别为氟）、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、取代的C1-C12烷基、取代的C1-C12芳基或取代的C1-C12烷基芳基，其中所述取代基是吸电子基团。优选地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代C1-C12烷基（例如-CF3）、氟代C1-C12芳基（例如-C6F5）、或氟代C1-C12烷基芳基（例如-[3,5-(CF3)2(C6H3)]）。
如上所述，优选式(Va)的化合物，其中三键位于所述环辛炔部分的4-位，即与所述稠合的环丁基环相对。
m=1且Y和Z形成环状烷基或(杂)芳基的化合物
本发明还涉及通式为(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物，其中m为1时，Y和Z以及连接Y和Z的键一起形成环状烷基或(杂)芳基，其中所述环烷基和(杂)芳基任选地被取代，如果Y和Z形成(杂)芳基，那么–(L)p-Q基团为(杂)芳基上的取代基。
所述环状基团优选为芳基，特别为苯并芳基，如在式(VIa)、(VIb)和(VIc)中：
其中p、n、R1、R2、L和Q如上所定义。
-(L)p-Q取代基可位于所述苯并芳基的邻位或间位，并且在式(VIa)、(VIb)和(VIc)的化合物中，R1-取代基相对于彼此可位于顺式或反式的位置。
在一个实施方案中，p为0，即Q直接键合到所述芳基。在另一个实施方案中，p为1。在另一个实施方案中，p为1并且L是CH2。
当p为0和p为1时，Q优选地选自-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(X)N(R6)2、-C(R6)2XR6、-C(X)R6、-C(X)XR6、-XC(X)R6、-XC(X)XR6、-XC(X)N(R6)2、-N(R6)C(X)R6、-N(R6)C(X)XR6和-N(R6)C(X)N(R6)2，其中X和R6的定义如上所述。更优选地，X是氧。最优选地，Q选自-OR6、-N(R6)2、-+N(R6)3、-C(O)N(R6)2、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-OC(O)OR6、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR6和-N(R6)C(O)N(R6)2。此外，官能团Q可任选地被掩蔽或保护。所述R6可相互独立地进行选择，这是指例如-N(R6)2取代基中的2个R6基团可彼此不同。
在一个优选的实施方案中，R1是氢。在另一个优选的实施方案中，n为0。在另一个优选实施方案中，R2是吸电子基团，即Hammett取代常数σ为正值的基团。合适的吸电子基团为本领域技术人员已知的，并且包括例如卤素（特别为氟）、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、取代的C1-C12烷基、取代的C1-C12芳基或取代的C1-C12烷基芳基，其中所述取代基是吸电子基团。优选地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代C1-C12烷基（例如-CF3）、氟代C1-C12芳基（例如-C6F5）、或氟代C1-C12烷基芳基（例如-[3,5-(CF3)2(C6H3)]）。
如上所述，优选式(VIa)的化合物，其中三键位于所述环辛炔部分的4-位。
缀合物
本发明所述稠合的环辛炔化合物非常适合用于无金属点击反应中，因此这些化合物在例如多种靶分子的生物正交标记、成像和/或修饰（包括表面修饰）的应用中是通用手段。本发明的一个方面提供缀合物，其中本发明的式(Ia)、(Ib)和/或(Ic)的化合物通过官能团Q缀合到标记物。
术语“标记物”是指可缀合到本发明的式(Ia)、(Ib)和(Ic)的化合物的任何识别标签。本领域已知有大量标记物，可用于多种不同的用途。根据具体的用途，可选择适合该具体用途的标记物。适用于具体用途的适合标记物为本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，所有种类的荧光团、生物素、聚乙二醇（PEG）链、聚丙二醇（PPG）链、混合的聚乙二醇/聚丙二醇链、放射性同位素、类固醇、药用化合物、脂质、肽、聚糖（包括低聚糖和多糖）、核苷酸（包括寡核苷酸和多核苷酸）以及肽标签。适合的荧光团的实例为例如所有种类的AlexaFluor(例如Alexa Fluor555)、花青染料(例如Cy3或Cy5)、香豆素衍生物、荧光素、罗丹明、别藻蓝蛋白、色霉素等。适合的肽标签的实例包括FLAG或HIS标签。适合的聚糖的一个实例是刀豆素。优选地，所述标记物选自荧光团、生物素、聚乙二醇链、聚丙二醇链、混合的聚乙二醇/聚丙二醇链、放射性同位素、类固醇、药用化合物、脂质、肽、聚糖、核苷酸和肽标签。
官能团Q可直接连接到所述标记物或者通过连接体（linker）或连接单元（linkingunit）间接连接到所述标记物。连接单元是本领域中公知的，其具有的一般结构为Q-S-Q，其中Q如上所定义，并且S选自直链或支链C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200环亚烷基、C5-C200环亚烯基、C8-C200环亚炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基、C9-C200芳基亚炔基。任选地，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基、芳基亚炔基可被取代，并且任选地所述基团可被一个或多个杂原子（优选为1到100个杂原子）间断，所述杂原子优选地选自O、S和NR6，其中R6如上所定义。最优选地，所述杂原子是O。
合适的连接单元的实例包括但不限于，(聚)乙二醇二胺（例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或含较长的乙二醇链的等价物）、聚乙二醇或聚环氧乙烷链、聚丙二醇或聚环氧丙烷链、1,x-二氨基烷（其中x是所述烷中的碳原子数）等。另一类合适的连接体包含可切割连接体。可切割连接体是本领域中公知的。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及缀合物，其中式(IIa)、(IIb)和/或(IIc)的化合物通过官能团Q缀合到标记物。在另一个优选的实施方案中，所述式(IIa)、(IIb)和/或(IIc)的缀合化合物是p为1并且L是CH2。R1和/或R3优选地为H。在另一个实施方案中，n为0(Q、n、p、L、R1和R3如上所定义)。最优选地，p为1、L是CH2、R1是H、R3是H并且n为0。
在另一个实施方案中，本发明涉及缀合物，其中式(IIIa)、(IIIb)和/或(IIIc)的化合物通过官能团Q缀合到标记物。在另一个实施方案中，所述式(IIIa)、(IIIb)和/或(IIIc)的缀合化合物中p为1并且L是CH2。在另一个实施方案中，p为0，因此官能团Q直接键合到N-原子。R1优选地为H。在另一个实施方案中，n为0(Q、n、p、L、R1和R3如上所定义)。在最优选的实施方案中，p为1、L是CH2、R1是H并且n为0。在另一个最优选的实施方案中，p为0、R1是H并且n为0。
在另一个实施方案中，本发明涉及缀合物，其中式(IVa)、(IVb)和/或(IVc)的化合物通过官能团Q缀合到标记物。在一个优选的实施方案中，所述式(IVa)、(IVb)和/或(IVc)的缀合化合物中p为1并且L是CH2。R1和/或R3优选地为H，并且Y优选地为C(O)或O。在另一个实施方案中，n为0(Q、n、p、L、R1和R3如上所定义)。在一个最优选的实施方案中，Y是O或C(O)、p为1、L是CH2、R1是H、R3是H并且n为0。在另一个最优选的实施方案中，Y是O或C(O)、p为0、R1是H、R3是H并且n为0。
此外，本发明涉及缀合物，其中式(Va)、(Vb)和/或(Vc)的化合物通过官能团Q缀合到标记物。在一个优选的实施方案中，所述式(Va)、(Vb)和/或(Vc)的缀合化合物中p为1并且L是CH2。R1优选地为H。Y优选地为C(O)。在另一个实施方案中，n为0(Q、n、p、L、Y、R1和R3如上所定义)。在一个最优选的实施方案中，Y是C(O)、p为1、L是CH2、R1是H并且n为0。在另一个最优选的实施方案中，Y是C(O)、p为0、R1是H并且n为0。
本发明还涉及缀合物，其中式(VIa)、(VIb)和/或(VIc)的化合物通过官能团Q缀合到标记物。在一个优选的实施方案中，R1是H。在另一个优选的实施方案中，p为0，即Q直接键合到芳基。
本发明还涉及本发明的缀合物用于靶分子的生物正交标记、成像或修饰（例如表面修饰）的用途。
合成方法
本发明的另一个方面是提供式(Ia)、(Ib)和(Ic)的化合物的合成方法。本发明因此涉及制备通式(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
（a）将稠合的3元环或4元环引入式(VIIa)、(VIIb)或(VIIc)的环辛二烯以形成双环环辛烯化合物：
其中：
n=0到8;
R1独立地选自氢、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；并且
R2独立地选自卤素、-OR6、-NO2、-CN、-S(O)2R6、C1-C12烷基、C1-C12芳基、C1-C12烷基芳基和C1-C12芳基烷基，其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任选地被取代，并且其中R6独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，
（b）溴化所得的双环环辛烯化合物以形成双环环辛烷化合物，并且
（c）使所得的双环环辛烷化合物脱溴化氢以形成通式(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物。
步骤（a）中所述式(VIIa)、(VIIb)或(VIIc)的环辛二烯可以是顺,顺-环辛二烯或顺,反-环辛二烯。在一个实施方案中，所述环辛二烯是顺,顺-环辛二烯。在第二个实施方案中，所述环辛二烯是顺,反-环辛二烯。也就是说，含R1-取代基的双键可具有E-或Z-构象。
在一个优选的实施方案中，R1是H。在另一个优选的实施方案中，n为0。在另一个优选的实施方案中，R1是H且n为0。
官能团Q可在所述合成方法中的任意点引入。例如，可在步骤（a）（形成所述双环环辛烯化合物）过程中引入所述官能团。还可以在一个额外的步骤中引入所述官能团，例如在所述溴化步骤（b）之前或之后，或者所述脱溴化氢步骤（c）之后。本领域技术人员能够知晓，引入所述官能团的策略完全取决于所需要引入的具体官能团的性质。
很显然，用于步骤（a）——将稠合的3元环或4元环引入式(VIIa)、(VIIb)或(VIIc)的环辛二烯中——的方法的选择取决于所引入的3元环或4元环的类型。例如，含N-原子的3元环可通过与含氮烯的化合物反应稠合到所述环辛二烯而形成式(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)的化合物。例如，可通过使环辛二烯与含烯酮的化合物反应将4元环引入所述环辛二烯而形成式(IVa)、(IVb)或(IVc)的化合物（其中，Y是C(O)）。可通过环辛二烯与（活化的）异氰酸酯反应而将含N-原子的4元环引入所述环辛二烯形成式(Va)、(Vb)或(Vc)的化合物（其中Y是C(O)），即含β-内酰胺的化合物。随后的氢化形成式(Va)、(Vb)或(Vc)的化合物，其中Y是CH2。例如，可通过所述环辛二烯与（取代的）苯炔化合物反应制备式(VIa)、(VIb)或(VIc)的化合物。
步骤（b）——环辛烯化合物的溴化——和步骤（c）——环辛烷化合物的脱溴化氢——被认为是本领域技术人员公知的标准的有机转化。
本发明人发现，可从容易获得的起始材料容易地且快速地以高产率制备例如式(IIa)、(IIb)或(IIc)的化合物。因此，本发明还涉及制备式(IIa)、(IIb)或(IIc)的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
（a）环丙烷化式(VIIa)、(VIIb)或(VIIc)的环辛二烯以形成双环环辛烯化合物:
其中，n、R1和R2如上所定义，
（b）溴化所得的双环环辛烯化合物以形成双环环辛烷化合物，并且
（c）使所得的双环环辛烷化合物脱溴化氢以形成式(IIa)、(IIb)或(IIc)的化合物。
步骤（a）中所述式(VIIa)、(VIIb)或(VIIc)的环辛二烯可以是顺,顺-环辛二烯或顺,反-环辛二烯。在一个实施方案中，所述环辛二烯是顺,顺-环辛二烯。在另一个实施方案中，所述环辛二烯是顺,反-环辛二烯。也就是说，含R1-取代基的双键可具有E-或Z-构象。
在一个优选的实施方案中，R1是H。在另一个优选的实施方案中，n为0。在另一个优选的实施方案中，R1是H且n为0。
同样在该情况中，所述官能团Q可以在一个额外的步骤中引入，例如所述溴化步骤（b）之前或之后，或者所述脱溴化氢步骤（c）之后。例如，步骤（a）——所述环辛二烯的环丙烷化——可通过使卡宾、类卡宾（carbenoid）或卡宾前体与环辛二烯反应实现，任选地存在催化剂。步骤（b）和步骤（c）是本领域技术人员公知的标准的有机转化。
作为实例，只需4步即可在很短的时间内（仅1-2天）以高产率合成式内型-(IIa)的化合物，其中p为1、L是CH2、Q是OH、n为0、并且R1和R3是H(内型-9-(羟甲基)双环[6.1.0]壬-4-炔)。本发明所述合成方法的另一个优点是只需要有限的色谱纯化，因此减少了整个合成所需的总时间。
靶分子的修饰
本发明的缀合物可成功地用于靶分子（例如蛋白质、脂质和聚糖）的生物正交标记、成像或修饰（包括表面修饰）。因此，本发明还涉及修饰靶分子的方法，其中本发明的缀合物与含1,3-偶极子或1,3-(杂)二烯的化合物反应。作为实例，方案1中示出了环炔与叠氮化物的张力促进环加成（SPAAC）或环炔与硝酮的张力促进环加成（SPANC）。环辛炔与1,3-(杂)二烯的反应称作(杂)Diels-Alder反应。这些反应也称作无金属点击反应。
1,3-偶极化合物是本领域中公知的（参见，例如F.A.Carey and R.J.Sundberg,Advanced Organic Chemistry,Part A:Structure andMechanisms,第3rd版,1990,第635–637页），并且其包括氧化腈、叠氮化物、重氮甲烷、硝酮、腈胺等。优选地，所述含1,3-偶极子的化合物是含叠氮化物的化合物、含硝酮的化合物或含氧化腈的化合物。
(杂)Diels-Alder反应和1,3-(杂)二烯也是本领域中公知的。除其他的实例外，1,3-二烯的实例还包括1,3-丁二烯、1,3-环戊二烯、1,3-环己二烯、呋喃、吡咯及其经取代的变体。除其他的实例外，1,3-杂二烯的实例还包括1-氧杂-1,3-丁二烯、1-氮杂-1,3-丁二烯、2-氮杂-1,3-丁二烯、3-氮杂-1,3-丁二烯及其经取代的变体。
通过本发明的方法可修饰很多种靶分子，即含1,3-偶极子或1,3-(杂)二烯的化合物。合适的靶分子是本领域中公知的，并且包括但不限于，生物分子例如蛋白质、肽、聚糖、脂质、核酸、酶、激素等。原则上，任何含1,3-偶极子或1,3-(杂)二烯的化合物都适合作为靶分子。
本发明所述修饰靶分子的方法的应用包括但不限于，诊断和治疗应用、活细胞（例如MV3细胞、成纤维细胞、Jurkat细胞、CHO细胞或HEK细胞）的细胞标记、生物聚合物（蛋白质、脂质、核酸、聚糖）修饰、用于质谱分析的蛋白质和聚糖的富集、聚合物性质调节、表面修饰等。
在一个实施方案中，所述缀合物的反应在体外实施。在一个优选的实施方案中，所述反应在体内即在生理条件下实施。
以上对可用于修饰靶分子的本发明的缀合物进行了详细描述。这些缀合物的很大的优点之一是它们可在体内和在体外使用。此外，本发明所述的缀合物只遭受较少的不想要的非特异性亲脂相互作用，并且在无金属点击反应中显示出很好的反应动力学。另一个优点是本发明所述的缀合物容易合成，并且所述缀合物的多个部分可进行简单且直接的修饰。这使得可以为具体应用而“精确调节”所述缀合物，并且可优化该应用的反应动力学。
在一个优选的实施方案中，上述式(IIa)、(IIb)和/或(IIc)的化合物或其缀合物与含1,3-偶极子或1,3-(杂)二烯的化合物反应。例如，(IIa)与苄基叠氮的环加成在水性条件下以优良的反应动力学（k=0.09–0.28M-1s-1，取决于溶剂）快速且干净地进行，形成相应的***加合物。(IIa)与C-苯甲酰胺-N-甲基硝酮的环加成的反应动力学甚至更高（k=1.25M-1s-1）。令人意外地，外型-(IIa)和内型-(IIa)的反应动力学相似，这表明(IIa)化合物在C-9位置的立体化学对反应性影响很小。因此，本发明的外型-和内型-化合物的混合物可以用于某些应用中，而不需要分离外型-和内型-化合物，并且甚至进一步简化了本发明化合物的合成。
本发明所述方法的另外的应用包括，例如连接荧光团缀合物——其中(IIa)和Alexa Fluor555缀合到含单一叠氮化物的病毒质粒蛋白，以及通过化学指示剂策略检测细胞表面聚糖。
药物组合物
最后，本发明涉及包含本发明的缀合物并且还包含可药用载体的组合物。本领域已知多种适合的可药用载体（参见，例如R.C.Rowe,P.J.Sheskey and P.J.Weller(Eds.),Handbook of PharmaceuticalExcipients,第4th版，2003）。
实施例
实施例1:外型（exo）-和内型（endo）-IIa.2的合成
第一步，在乙酸铑的存在下，将重氮乙酸乙酯缓慢加入到大量过量（8倍当量）的1,5-环辛二烯在二氯甲烷中的溶液中，产生比例为2:1的非对映异构化合物外型-IIa.1和内型-IIa.1(总产率为82%)。通过硅胶直接分离后，按照还原、溴化和消除（elimination）的直接三步过程，首先将所述IIa.1的内型-异构体转化为醇IIa.2。因此，用LiAlH4对内型-IIa.1的酯还原(30分钟)产生粗的中间体醇（30分钟），其纯度足以用于溴化反应而不需中间纯化（30分钟）。需要指出的是，不需要如DIBO的合成中一样对醇进行暂时保护。最后，将所得的二溴化物用溶于THF中的过量的KOtBu处理(0℃→回流，2h),以对于从内型-IIa.1得到所需要的9-(羟甲基)双环[6.1.0]壬-4-炔内型-IIa.2，所述三步的分离收率为61%。可在一天内仅用一次色谱纯化进行的一系列相似事件得到IIa.2的非对映异构外型-异构体，收率为53%。
实施例2：反应动力学
对用典型的叠氮化物苄基叠氮进行的环加成的反应动力学进行了研究。因此，将内型-IIa.2化合物溶于CD3CN和D2O的比例为3:1的混合物中，并与苄基叠氮混合至最终浓度为18mM。化学转化之后通过对鉴定峰的积分进行质子NMR，并显示内型-IIa.2快速且干净地反应得到期望的***加合物。二级反应动力学的计算显示其速率常数为0.12M-1s-1。对于外型-IIa.2测得类似的速率常数值0.10M-1s-1,这表明C-9位置的立体化学对反应性几乎没有影响，内型-构象化合物仅具有略微高的速率。发现存在显著的溶剂效应，因为在CD3CN和D2O的比例为1:2的混合物中相同的环加成反应分别得到0.28M-1s-1（内型-IIa.2）和0.25M-1s-1（外型-IIa.2）的速率常数。
实施例3：双环[6.1.0]壬-4-炔(BCN)缀合物
缀合到生物素的BCN(IIa.4)
将内型-IIa.1的醇部分转化为如IIa.3中的P-硝基苯基（pNP）碳酸盐。然后与生物素-(POE)3-NH2反应产生BCN-生物素缀合物IIa.4（69%产率）。
缀合到Alexa Fluor555的BCN(IIa.6)
或者，化合物IIa.3与1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷反应产生氨基封端的BCN-探针IIa.5，其与市售的Alexa Fluor555羟基琥珀酰亚胺酯反应后转化为荧光团缀合物IIa.6。
或者，化合物IIa.3与1,5-二氨基戊烷反应后产生更加亲脂的氨基封端BCN-探针。
实施例4：IIa.6与叠氮化物标记的衣壳蛋白的反应（SPAAC标记）
将衣壳蛋白制备为每分子中仅含一个叠氮化物官能团，其在所述衣壳组装后位于所述衣壳的内表面上。所述蛋白质溶于缓冲液中（50mM磷酸盐缓冲液pH7.5;1M NaCl），其浓度为1mg/mL。Alexa Fluor555-BCN缀合物IIa.6溶于水中，并将4倍当量的所述缀合物加入所述蛋白质溶液。分析之前，将所述反应混合物在室温下孵育3小时。
所得反应产物在12%SDS-PAGE凝胶上分析，在用考马斯蓝(Coomassie-blue)染色之前记录其荧光图像。图1中示出了所述反应产物（左）和空白反应（右）的SDS-Page分析。图1的上部示出了考马斯蓝染色，下部示出了考马斯蓝染色之前的荧光图像。这些结果清楚地显示Alexa Fluor555-BCN缀合物被纳入所述衣壳蛋白中。
为进行质量分析，将所得粗反应混合物在milliQ中用0.1%TFA透析，随后在JEOLAccuTOF上通过电喷雾离子化飞行时间（ESI-TOF）对其进行分析。图2示出了与IIa.6反应的衣壳蛋白的ESI-TOF质谱。峰B对应于未反应的衣壳蛋白的质量，而峰A对应于反应产物。峰之间的质量差是1135.1(预期是1135)，这表明衣壳蛋白中单个的叠氮化物有效地与BCN-Alexa Fluor555缀合物反应，该缀合物质量为1135。
为测试所述功能化的衣壳蛋白的自组装性能，将所述粗反应混合物用pH5.0的缓冲液（50mM NaOAc;1M NaCl;10mM CaCl2）透析，其应该能够诱导形成28nm尺寸的球形颗粒（B.J.M.Verduin,FEBSLett.1974,45,50–54，其以引用的方式纳入本文）。通过透析组装所述衣壳后，通过FPLC分析所述反应混合物。图3示出了在Superpose6柱上的尺寸排阻分析。在1.2ml洗脱体积处的280nm处的吸收峰表明形成了28nm尺寸的衣壳，并且在555nm处的重叠吸收显示所述衣壳中存在Alexa染料，并因此存在IIa.6。
实施例5：IIa.2与硝酮标记的FRATide蛋白的反应（SPANC标记）
将FRATide(15.6μg,3.4 nmol,34μM)溶解于pH 6.9的0.1 MNH4OAc缓冲液(100μL)中，并加入NaIO4(1.1μg,5.5 nmol,48μM)。允许所述反应在室温下进行40 min，并加入p-甲氧基苯硫酚(9.2 μg,66.0 nmol,565μM)。将所述混合物在25°C下振荡2 h，并加入p-氨基苯甲醚(13.5μg,109.3μmol,845μM)、N-甲基羟胺盐酸盐（18.2μg,218.6 nmol,1.5 mM）以及BCN-OH II.a2（41.1μg,273.3 nmol,1.8mM）。最后，将所述反应混合物在25°C下振荡24 h以产生所需的缀合物。
通过质谱（Accu-TOF）监测所述反应的过程。用高碘酸钠处理后，在4533.8 Da处的分子离子峰——对应于FRATide蛋白——消失，而在4534.8 Da处出现分子离子峰，其对应于甲基半缩醛。用N-甲基羟胺和BCN-OH处理后，分子离子峰出现在4681.4 Da处——对应于与BCN-OH IIa.2反应后的FRATide蛋白硝酮衍生物——作为主峰（去卷积后）。
实施例6：细胞表面标记
通过以化学指示剂策略检测细胞表面聚糖，研究了生物素缀合物IIa.4用于生物正交标记的有效性。通过代谢将N-叠氮基乙酰甘露糖胺（ManNAz）纳入MV3细胞，并通过FACS和共聚焦显微镜进行检测。
细胞培养步骤
侵袭性的和转移性的人黑色素瘤细胞（MV3）保持在培养基RPMI1640中，其在5%CO2水饱和的气氛中含有10%胎牛血清、青霉素/链霉素（各50U/ml）。
细胞表面叠氮化物标记
在存在或不存在Ac4ManNAz（50μM）的条件下，将MV3细胞培养6天。3天后更换培养基和化合物。进行进一步的研究之前，用明视野显微镜进行细胞粘附和形态学分析。对于活细胞标记，通过EDTA(1 mM)将细胞脱附、洗涤和离心3次（PBS,300×G rpm,5 min,4℃），重悬浮于PBS中并在BCN-生物素(IIa.4)(60μM)、DIBO-生物素(60μM)或缓冲液(1 h,20℃)中孵育，洗涤3次（PBS,300×G,2min,4℃），重悬浮于冰预冷的含AlexaFluor488-缀合的抗生蛋白链菌素的PBS（5μg/ml,Invitrogen;终体积200μl）中。孵育（30min,4℃）后将细胞洗涤3次，重悬浮于PBS(200μl,4℃)中用于进一步生物分析。
流式细胞术
在BD Biosciences FACS-Calibur流式细胞仪上用488nm氩激光实施流式细胞术，并将数据用FCS Express版本3研究版本(De NovoSoftware,Los Angeles,CA)分析。在碘化丙啶(2.5μg/ml)存在的条件下，对每个样本中2×104个形态学上完整的细胞进行分析。
图4示出了在代谢纳入Ac4ManNAz、用DIBO-或BCN-生物素标记后，并用AlexaFluor488-缀合的抗生蛋白链菌素检测后，完整MV3细胞上的细胞表面荧光。通过流式细胞术进行的分析表明，用BCN-生物素或DIBO-生物素标记后用AlexaFluor488-缀合的抗生蛋白链菌素检测的荧光强度增加超过100-倍，背景荧光水平为细胞未用Ac4ManNAz孵育时的可忽略背景荧光水平。
图5示出了在代谢纳入Ac4ManNAz、用DIBO-或BCN-生物素标记后，并用AlexaFluor488-缀合的抗生蛋白链菌素检测后，MV3细胞的荧光强度和细胞活力。图5A示出了4个独立的实验中绿色荧光（AlexaFluor488）的平均强度和标准差（SD），图5B示出了聚糖标记后完整细胞的活力。使用绿色荧光（AlexaFluor488）和碘化丙啶（PI）标记物。数字显示PI-阴性的活细胞的百分比。从图5A可得出,BCN和DIBO都能够有效地标记预先暴露于Ac4ManNAz的细胞，而BCN-生物素的标记效率更高。图5B显示细胞——无论是未处理的、BCN处理的或是DIBO处理的——具有高活力（所有情况下都>98%）。
共聚焦显微镜
细胞表面聚糖用BCN-生物素或DIBO-生物素标记，然后用AlexaFluor488-缀合的抗生蛋白链菌素标记。标记后，将细胞重悬浮于正常的培养基中，转移到6-孔板中并在37℃下孵育30min。在室温下用带有氩488激光器的Olympus FV1000共聚焦激光扫描显微镜对MV3细胞进行活细胞成像，所述激光器的激发光为488nm，发射光为520nm并且放大倍数为40×。
图6示出了预先在不存在或存在Ac4ManNAz（50μM）的情况下培养的经标记细胞的代表性共聚焦图像。共聚焦图像清楚地显示，在将MV3细胞用Ac4ManNAz孵育后，接着用BCN-生物素或DIBO-生物素和随后的AlexaFluor488-缀合的抗生蛋白链菌素检测MV3细胞表面聚糖时，MV3细胞的细胞表面出现荧光，但没有用Ac4ManNAz孵育的细胞的细胞表面未出现荧光。
实施例7:IIa.7合成
(1R,8S，Z)-二乙基双环[6.1.0]壬-4-烯-9,9-二甲酸酯(IIa.8)
在3h内向1,5-环辛二烯(5.27mL,43.0mmol)和Rh2(OAc)4(100mg,0.23mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液中滴加重氮丙二酸二乙酯(1.0g,5.37mmol)的CH2Cl2溶液(5mL)。所述溶液在室温下搅拌24h。使CH2Cl2蒸发，并通过用填充二氧化硅的玻璃过滤器过滤而移除过量的环辛二烯（洗脱剂:庚烷）。将滤液在真空中浓缩，并通过在硅胶上进行柱色谱（EtOAc：庚烷为1:10）纯化所得剩余物，得到IIa.8(1.03g,72%)。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ5.65-5.57(m,2H),4.10(2×q,J=7.2Hz,4H),2.41-2.29(m,2H),2.15-2.06(m,3H),1.83-1.70(m,3H),1.31-1.23(2×t,J=7.2Hz,6H)。
(1R,8S,Z)-双环[6.1.0]壬-4-烯-9,9-二基二甲醇(IIa.9)
在0℃下向LiAlH4(103mg,2.70mmol)在Et2O(10mL)中的悬液中滴加IIa.8(400mg,1.50mmol)的Et2O(10mL)溶液。小心地加入水至灰色固体变为白色。然后加入Na2SO4(2g)，过滤出所述固体并用Et2O(100mL)彻底洗涤。在真空中浓缩所得滤液。通过在硅胶上进行柱色谱（EtOAc：庚烷为3:1）纯化所得剩余物，得到白色固体IIa.9(190mg,69%)。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ5.66-5.58(m,2H),3.88(d,J=4.8Hz,2H),3.58(d,J=4.8Hz,2H),2.43-2.35(m,2H),2.20-1.99(m,6H),1.71-1.57(m,2H),0.95-0.88(m,2H).
((1R,8S)-4,5-二溴双环[6.1.0]壬烷-9,9-二基)二甲醇(IIa.10)
将二元醇IIa.9(145mg,0.796mmol)溶于CH2Cl2(5mL)中。在0℃下滴加Br2(45μL,0.875mmol)的CH2Cl2(1mL)溶液，至黄色稳定不变。用10%Na2S2O3溶液(5mL)将所得反应混合物淬灭，并用CH2Cl2(2×20mL)提取。将有机层干燥（Na2SO4）并真空浓缩。通过在硅胶上进行柱色谱（EtOAc：庚烷为5:1）纯化所得剩余物，得到白色固体IIa.10(235mg,86%)。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ4.87-4.78(m,2H),3.96-3.88(m,2H),3.60(d,J=5.2Hz,2H),2.75-2.63(m,2H),2.32-2.22(m,3H),2.20-2.13(m,1H),2.05-1.94(m,2H),1.74-1.57(m,2H),1.13-0.99(m,2H)。
(1R,8S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9,9-二基二甲醇(IIa.7)
在0℃下向所述二溴化物IIa.10(100mg,0.292mmol)的THF(5mL)溶液中滴加KOtBu溶液(1.29mL,在THF中1M,1.29mmol)。然后，使所述溶液回流1.5h。所述混合物冷却至室温后，用饱和NH4Cl溶液（20mL）淬灭所述混合物，并用CH2Cl2(3×20mL)提取。将有机层干燥（Na2SO4）并真空浓缩。通过在硅胶上进行柱色谱（EtOAc）纯化所得剩余物，得到白色固体IIa.7(24mg,46%)。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ3.89(bs,2H),3.63(bs,2H),2.58(bs,2H),2.34-2.20(m,6H),1.68-1.59(m,2H),0.89-0.82(m,2H)。

Claims (14)

1.式(IIa)的化合物:
其中：
p为0或1；
R3选自[(L)p-Q]和氢；
L是连接基团，其选自直链或支链C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C24环亚烷基、C5-C24环亚烯基、C7-C24烷基(杂)亚芳基、C7-C24(杂)芳基亚烷基、C8-C24(杂)芳基亚烯基，所述亚烷基、亚烯基、环亚烷基、环亚烯基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基和(杂)芳基亚烯基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C3-C12环烷基氧基、卤素、氨基、氧基和甲硅烷基，其中所述甲硅烷基可用式(R4)3Si-表示，其中R4独立地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基和C3-C12环烷基氧基，其中所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断；
Q是官能团，其选自-OR6、-N(R6)2、-C(O)N(R6)2、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-OC(O)OR6、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR6和-N(R6)C(O)N(R6)2，其中R6独立地选自氢、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；并且
R1是氢。
2.权利要求1的化合物，其中p为1并且L是CH2。
3.权利要求1的化合物，其中Q是–OH并且R3是氢。
4.权利要求2的化合物，其中Q是–OH并且R3是氢。
5.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有式(exo-IIa.2)或(endo-IIa.2)：
6.缀合物，其中权利要求1–5中任一项的化合物通过官能团Q缀合到标记物，其中所述标记物选自荧光团、生物素、聚乙二醇链、聚丙二醇链、混合的聚乙二醇/聚丙二醇链、放射性同位素、类固醇、药物化合物、脂质、肽、聚糖和核苷酸。
7.权利要求6的缀合物，其中官能团Q是通过结构为Q-S-Q的连接单元连接到所述标记物，并且其中S选自直链或支链C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C3-C200环亚烷基、C5-C200环亚烯基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基，其中任选地所述基团是被一个或多个杂原子所间断的，所述杂原子选自O、S和NR6，其中R6如权利要求1中所定义。
8.权利要求6或7的缀合物，其中在权利要求1-5中任一项的化合物中，p为1、L为CH2并且R3为H。
9.权利要求6的缀合物，其中所述标记物为肽标签。
10.用于制备权利要求1–5中任一项的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(a)环丙烷化式(VIIa)的环辛二烯以形成双环环辛烯化合物:
其中：
R1是氢，
(b)溴化所得的双环环辛烯化合物以形成双环环辛烷化合物，并且
(c)将所得的双环环辛烷化合物脱溴化氢以形成权利要求1–5中任一项的化合物。
11.用于修饰靶分子的方法，其中权利要求6-9中任一项的缀合物与含1,3-偶极子或1,3-(杂)二烯的化合物反应。
12.权利要求11的方法，其中所述含1,3-偶极子的化合物是含叠氮化物的化合物、含硝酮的化合物或含氧化腈的化合物。
13.权利要求6-9中任一项的缀合物用于靶分子的生物正交标记、成像或修饰的用途。
14.包含权利要求6-9中任一项的缀合物的组合物，还包含可药用载体。
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