ES2527536T7 - Compuestos de ciclooctina fusionada y su uso en reacciones clic sin metales - Google Patents

Compuestos de ciclooctina fusionada y su uso en reacciones clic sin metales Download PDF

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Description

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Compuestos de ciclooctina fusionada y su uso en reacciones clic sin metales Campo de la invencion
[0001] La invencion se refiere a compuestos de ciclooctina fusionada y a un metodo para su preparacion. Los compuestos de ciclooctina fusionada segun la invencion se pueden utilizar en las reacciones clic sin metales. Por lo tanto, la invencion se refiere ademas a un metodo para la modificacion de una molecula diana mediante la reaccion de un conjugado de ciclooctina fusionada con una molecula diana que comprende un 1,3-dipolo o un 1,3- (hetero)dieno. La invencion tambien se refiere al uso de conjugados de ciclooctina en el etiquetado bioortogonal, la formacion de imagenes o la modificacion de una molecula diana.
Antecedentes de la invencion
[0002] Un desarrollo revolucionario en el campo en rapida expansion de la "biologfa qufmica" esta relacionado con la qufmica en sistemas vivos. La qufmica en sistemas vivos comprende las reacciones qufmicas que son progresivas en la naturaleza, pero tan rapidas y eficientes que se producen a pH aproximadamente fisiologico, en el agua, y en la proximidad de funcionalidades biomoleculares. Tales reacciones se pueden agrupar bajo el termino "qufmica bioortogonal". En el campo de la qufmica bioortogonal hay dos desaffos principales: primero, el desarrollo de la qufmica adecuada, y segundo, su aplicacion en organismos vivos (in vivo).
[0003] En el campo de la qufmica, una caja de herramientas enorme de reacciones qufmicas esta disponible y se pueden aplicar a la construccion de moleculas organicas complejas. No obstante, la gran mayorfa de tales reacciones pueden solo llevarse a cabo bajo condiciones estrictamente anhidras, en otras palabras, en ausencia completa de agua. Aunque todavfa una buena minorfa de reacciones qufmicas se pueden realizar en agua, o en presencia de agua, la mayor parte de estas reacciones pueden solo aplicarse aun in vitro debido a que la interferencia de otros compuestos presentes en el organismo vivo con los productos qufmicos implicados pueden no ser excluidos. Actualmente, solo unas pocas reacciones qufmicas son completamente compatibles con otros grupos funcionales presentes en el organismo vivo.
[0004] Un ejemplo de tal reaccion es la cicloadicion de alquinas y azidas cfclicas, una de las reacciones es conocida como "reacciones clic". Esta reaccion se ha convertido en una herramienta versatil para el etiquetado bioortogonal y la formacion de imagenes de biomoleculas (como por ejemplo protefnas, lfpidos, glicanos y similares), proteomicos y ciencia de los materiales. En esencia, dos entidades moleculares separadas, una cargada con una azida, y una cargada con un cicloalquino forzado, se unen espontaneamente y forman una unica molecula mediante una reaccion llamada cicloadicion de alquinos y azidas promovida por tension (SPAAC). La potencia de la SPAAC para el etiquetado bioortogonal radica en el hecho de que una alquina o azida cfclica aislada es completamente inerte a las funcionalidades biologicas, como por ejemplo aminas, tioles, acidos o carbonilos, pero en combinacion sufren una cicloadicion rapida e irreversible que lleva a un conjugado de triazol estable. Por ejemplo, las protefnas azidomodificadas, obtenidas por expresion en bacterias auxotroficas, ingenierfa genetica o conversion qufmica, pueden ser limpiamente etiquetadas con biotina, fluoroforos, cadenas de PEG u otras funcionalidades agitando simplemente la azido-protefna con un conjugado de ciclooctina. Ademas, el tamano pequeno de la azida ha demostrado ser altamente util para la aplicacion de SPAAC en la formacion de imagenes de biomoleculas especfficas mediante la estrategia de indicador qufmico.
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imagen1
etiqueta
etiqueta
etiqueta
etiqueta
^ ftjsNf diana J
SPAAC
X \ _ ivriri Siani
SPANC
0 _|_ x1diana
Esquema 1
[0005] Ademas de las azidas, las ciclooctinas tambien muestran una alta reactividad con otros dipolos, tales como las nitronas y los oxidos de nitrilo. Por ejemplo, la cicloadicion de alquinos y nitronas promovida por tension (SPANC) se aplico para la modificacion de los W-terminales de las protefnas.
[0006] Las reacciones de cicloadicion SPAAC y SPANC (esquema 1) ocurren espontaneamente, por lo tanto en ausencia de un catalizador (metal), y estas y un selecto numero de cicloadiciones adicionales son tambien llamadas "reacciones clic sin metales".
[0007] Varias alquinas cfclicas y su aplicacion en el etiquetado bioortogonal estan descritas en la tecnica previa. La US 2009/0068738 se refiere a compuestos de cicloalquino modificado y su uso en biomoleculas de modificacion a traves de una reaccion de cicloadicion que se puede llevar a cabo bajo condiciones fisiologicas. La cicloadicion implica reaccionar un cicloalquino modificado, como por ejemplo compuestos de ciclooctina difluorinada DIFO, DIF02 y DlF03, con una fraccion de azida en una biomolecula diana, generando una biomolecula covalente modificada. Se observo que la sustitucion del fluoruro tiene un efecto acelerador en la cicloadicion con azida. Por ejemplo DIF03 muestra una velocidad de reaccion constante significativamente mejorada de hasta k = 76*10-3 M-1 s-1, frente a un maximo de 2.4*10-3 M-1 s-1 en sistemas no fluorinados.
imagen2
[0008] WO 2009/064366 divulga composiciones y metodos de uso de los mismos para etiquetar peptidos y protefnas in vitro o in vivo. Se describen los conjugados donde una ciclooctina fluorinada se conjuga a traves de un enlazador de polietilenglicol con un fluoroforo (Cy3 o Alexa Fluor 568) o con biotina.
[0009] Las ciclooctinas donde la ciclooctina se fusiona con grupos arilo (sistemas benzanulados) se describen en WO 2009/067663, y la cinetica reactiva de estos compuestos de dibenzociclooctina DIBO en la cicloadicion con azidas estan mas mejorados (k = 0.12 M"1 s-1).
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[0010] La azadibenzociclooctina DIBAC fue desarrollada por van Delft et al. (Chem. Commun. 2010, 46, 97 - 99), y muestra ademas la cinetica reactiva mejorada en la cicloadicion con azidas (k = 0.31 M-1 s-1).
[0011] Recientemente fue proporcionado otro sistema benzanulado, la biarilazaciclooctinona BARAC, por Bertozzi et al. (J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 3688 - 3690). Colocando la funcionalidad de la amida en el anillo, la cinetica reactiva de la cicloadicion de BARAC con azidas mejoro significativamente (k = 0.96 M"1 s-1).
imagen3
[0012] Se descubrio tambien que DIBO y DIBAC sufren cicloadicion rapida con nitronas como describen Pezacki (Chem. Commun. 2010, 46,931 - 933) y van Delft (Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 3065 - 3068), con constantes de velocidad de reaccion hasta 300 veces superiores a con azidas.
[0013] No obstante, las sondas de ciclooctina para el etiquetado bioortogonal conocidas en la tecnica anterior conllevan diferentes desventajas. Ante todo, la aplicacion difundida se dificulta por el hecho de que solo DIBAC esta comercialmente disponible. La preparacion sintetica requiere experiencia qufmica avanzada. Ademas, la sfntesis de las sondas actualmente disponibles es larga (ocho pasos qufmicos para DIF02, diez pasos para DIF03, nueve pasos para DIBAC), y/o de produccion baja (10% total para DIBO). En tercer lugar, la presencia de las dos fracciones de arilo benzanulado en DIBO y DIBAC infligen ambas repulsion esterica seria al igual que caracter lipofflico. El caracter lipofflico de DIBO y DIBAC puede llevar a la union de protefnas inespecfficas por interacciones de van der Waals, lo cual es indeseable.
[0014] Por lo tanto, existe una demanda clara de sondas bioortogonales nuevas facilmente accesibles y reactivas para su uso en reacciones clic sin metales, tal como la cicloadicion 1,3-dipolar con azidas, nitronas y otros 1,3- dipolos.
Resumen de la invencion
imagen4
(IIa):
p es 0 o 1;
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R3 se selecciona del grupo consistente en [(L)p-Q], hidrogeno, halogeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, los grupos alquilo siendo
interrumpidos opcionalmente por uno de varios heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo son opcionalmente independientemente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo Ci - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos
cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos
cicloalquiloxi C3 - C12, halogenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos sililo se representan con la formula (R4)3Si-, donde R4 se selecciona independientemente del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12 y grupos cicloalquiloxi C3 - C12, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de mas heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S;
L es un grupo de union seleccionado de entre grupos alquileno C1 - C24, grupos alquenileno C2 - C24, grupos alquinileno C2 - C24, grupos cicloalquileno C3 - C24, grupos cicloalquenileno C5 - C24, grupos cicloalquinileno Ca - C24, grupos alquil(hetero)arileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquenileno Ca - C24, grupos (hetero)arilalquinileno Cg - C24 lineales o ramificados, los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos alquil(hetero)arileno, grupos (hetero)arilalquileno, grupos (hetero)arilalquenileno y grupos (hetero)arilalquinileno siendo opcionalmente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos cicloalquenilo C5 - C12, grupos cicloalquinilo Ca - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halogenos, grupos amino, grupos oxo y sililo, donde los grupos sililo se pueden representar con la formula (R4)3Si-, donde R4 se define como anteriormente;
Q es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en halogeno, alquilo C1 - C24, (hetero)arilo C6 - C24,
alquilo(hetero)arilo C7 - C24, (hetero)arilalquilo C7
-N3
XR6,
■ C24, -CH = C (R6)2, -CECR6, - [C (R6)2C(R6)2O]q-R6, donde q esta en el intervalo de 1 a 200, -CN, -N3, -NCX, -XCN, -XR6, - N(R6)2, -+N (R6)3, -C(X)N(R6)2, -C(R6)2XR6, -C(X)R6, -C(X) S(O)R6, -S(O)2R6, -S(O)OR6, -S(O)2OR6, -S(O)N(R6)2, -S(O)2N(R6)2, -OS(O)R6, -OS(O)2R6, -OS(O)OR6, - OS(O)2OR6, -P(O)(R6)(OR6), -P(O)(OR6)2, -OP(O)(OR6)2, -Si(R6)3, -XC(X)R6, -XC(X)XR6, -XC(X)N(R6)2, -
N(R6)C(X)R6, -N(R6)C(X)XR6 y -N(R6)C(X)N(R6)2, donde X es oxfgeno o azufre y donde R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, halogeno, grupos alquileno C1-C24, grupos (hetero)arileno C6-C24, grupos alquil(hetero)arileno C7-C24, y grupos (hetero)arilalquileno C7 - C24; y
R1 es independientemente seleccionado del grupo consistente en hidrogeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24.
[0016] La presente invencion se refiere ademas a un conjugado, tal como un conjugado de ciclooctina, donde un compuesto de la Formula (Ila) se conjuga a una etiqueta a traves de un grupo funcional Q.
[0017] Otro aspecto de la presente invencion es proporcionar un metodo para preparar un compuesto de la Formula (Ila), el metodo incluye las etapas de:
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R1 se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrogeno,
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grupos alquilo Ci - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7
- C24;
para formar un compuesto de cicloocteno bicfclico,
(b) Brominacion del compuesto de cicloocteno bicfclico obtenido para formar un compuesto de ciclooctano bicfclico, y
(c) Deshidrobrominacion del compuesto de ciclooctano bicfclico obtenido para formar un compuesto de la Formula (Ila).
[0018] La presente invencion tambien se refiere a un metodo para la modificacion de una molecula diana, donde un conjugado segun la invencion reacciona con un compuesto que comprende un 1,3-dipolo o un 1,3-(hetero)dieno.
[0019] Otro aspecto de la presente invencion es el uso de un conjugado segun la invencion para el etiquetado bioortogonal, la formacion de imagenes o la modificacion, tal como por ejemplo modificacion de la superficie, de una molecula diana.
[0020] Finalmente, la invencion se refiere a una composicion que comprende un conjugado segun la invencion, que comprende ademas un portador farmaceuticamente aceptable.
Descripcion de las figuras
[0021]
La Figura 1 representa el analisis SDS-PAGE de la reaccion SPAAC de protefna capsida etiquetada con azida con una ciclooctina conjugada con Alexa Fluor 555 (izquierda) y de la reaccion en blanco (derecha).
La Figura 2 representa el espectro de masa ESI-TOF de protefna capsida funcionalizada con una ciclooctina conjugada con Alexa Fluor 555.
La Figura 3 representa el analisis FPLC de protefna de capsida funcional con una ciclooctina conjugada con Alexa Fluor 555.
La Figura 4 representa la fluorescencia de la superficie celular en celulas MV3 intactas tras la incorporacion metabolica de Ac4ManNAz, etiquetando con DIBO-biotina o BCN-biotina, y la deteccion con estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488 como se determina con la citometrfa de flujo.
La Figura 5 representa las intensidades de fluorescencia y la viabilidad celular de celulas MV3 tras la incorporacion metabolica de Ac4ManNAz, etiquetando con DIBO-biotina o BCN-biotina, y la deteccion con estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488.
La Figura 6 representa imagenes confocales representativas de celulas etiquetadas, previamente cultivadas en ausencia o presencia de Ac4ManNAz (50 pM), etiquetando con DIBO-biotina o BCN-biotina, y la deteccion con estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
[0022] El verbo "comprender" y sus conjugaciones como se usan en esta descripcion y en las reivindicaciones, se usan no en su sentido limitante para referirse a que los artfculos que siguen a la palabra estan incluidos, sino a que los artfculos no especfficamente mencionados no estan excluidos.
[0023] Ademas, la referencia a un elemento por el artfculo indefinido "un" no excluye la posibilidad de que mas de un elemento este presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artfculo indefinido "un" normalmente significa "al menos uno".
[0024] Los compuestos descritos en esta descripcion y en las reivindicaciones pueden ser descritos como compuestos de ciclooctina fusionada, es decir, compuestos de ciclooctina donde una segunda estructura anular se fusiona con la fraccion de ciclooctina. El triple enlace de la fraccion de ciclooctina en un compuesto de ciclooctina fusionada se puede localizar en cada una de las tres ubicaciones posibles, es decir en la posicion 2, 3 o 4 de la fraccion de ciclooctina (numeracion segun la "Nomenclatura de Qufmica Organica IUPAC", Regla A31.2). La descripcion de cualquier compuesto de ciclooctina fusionada en esta descripcion y en las reivindicaciones pretende incluir los tres regioisomeros individuales de la fraccion de ciclooctina.
[0025] Los compuestos descritos en esta descripcion y en las reivindicaciones pueden comprender uno o varios centros asimetricos, y pueden existir diferentes diastereomeros y/o enantiomeros de los compuestos. La descripcion de cualquier compuesto en esta descripcion y en las reivindicaciones pretende incluir todos los diastereomeros y sus mezclas derivadas, a menos que se establezca lo contrario. Ademas, la descripcion de cualquier compuesto en esta descripcion y en las reivindicaciones pretende incluir tanto los enantiomeros individuales, como cualquier mezcla, racemica u otra diferente, de los enantiomeros, a menos que se establezca lo contrario. Cuando la estructura de un compuesto se representa como un enantiomero especffico, debe entenderse que la invencion de la presente
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aplicacion no esta limitada a ese enantiomero especffico.
[0026] Los compuestos pueden ocurrir en diferentes formas tautomericas. Los compuestos segun la invencion pretenden incluir todas formas tautomericas, a menos que se establezca lo contrario.
[0027] Los compuestos descritos en esta descripcion y en las reivindicaciones pueden existir ademas como exo y endoregioisomeros. A menos que se establezca lo contrario, la descripcion de cualquier compuesto en la descripcion y en las reivindicaciones pretende incluir tanto el exoregioisomero individual como el endoregioisomero individual de un compuesto, al igual que sus mezclas derivadas.
[0028] Ademas, los compuestos descritos en esta descripcion y en las reivindicaciones pueden existir como isomeros cis y trans. A menos que se establezca lo contrario, la descripcion de cualquier compuesto en la descripcion y en las reivindicaciones pretende incluir el isomero cis individual y el isomero trans individual de un compuesto, al igual que sus mezclas derivadas. Como ejemplo, cuando la estructura de un compuesto se representa como un isomero cis, debe entenderse que el correspondiente isomero trans o mezclas del isomero cis y trans no se excluyen de la invencion de la presente solicitud.
[0029] Los grupos alquilo no sustituidos tienen la formula general CnH2n+i y pueden ser lineales o ramificados. Los grupos alquilo no sustituidos tambien pueden contener una fraccion cfclica, y por tanto tienen la formula general concomitante CnH2n-i. Opcionalmente, los grupos alquilo se sustituyen por uno o varios sustituyentes ademas especfficados en este documento. Los ejemplos de grupos alquilo adecuados incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, 2-propilo, t-butilo, 1-hexilo, 1-dodecilo y similares.
[0030] Los grupos alquenilo no sustituidos tienen la formula general CnH2n-1, y pueden ser lineales o ramificados. Los ejemplos de grupos alquenilo adecuados incluyen, pero se limitan a, etenilo, propenilo, isopropenilo, butenilo, pentenilo, decenilo, octadecenilo, y icosenilo y similares. Los grupos alquenilo no sustituidos tambien pueden contener una fraccion cfclica, por tanto tienen la formula general concomitante CnH2n-3.
[0031] Los alquenos no sustituidos tienen la formula general CnH2n mientras que las alquinas no sustituidas tienen la formula general CnH2n-2.
[0032] Los grupos arilo comprenden al menos seis atomos de carbono y pueden incluir estructuras monocfclicas, bicfclicas y policfclicas. Opcionalmente, los grupos arilo se pueden sustituir por uno o varios sustituyentes especfficados ademas en este documento. Los ejemplos de grupos arilo incluyen grupos como por ejemplo fenilo, naftilo, antracilo y similares.
[0033] Los grupos arilalquilo y los grupos alquilarilo comprenden al menos siete atomos de carbono y pueden incluir estructuras monocfclicas y bicfclicas. Opcionalmente, los grupos arilo se pueden sustituir por uno o varios sustituyentes especfficados ademas en este documento. Un grupo arilalquilo es por ejemplo el bencilo y similares. Un grupo alquilarilo es por ejemplo 4-t-butilfenilo y similares.
[0034] Donde un grupo arilo se denomina como un grupo (hetero)arilo, la notacion pretende incluir un grupo arilo y un grupo heteroarilo. De forma similar, un grupo alquil(hetero)arilo pretende incluir un grupo alquilarilo y un grupo alquilheteroarilo, y (hetero)arilalquilo pretende incluir un grupo arilalquilo y un grupo heteroarilalquilo.
[0035] Un grupo heteroarilo comprende de uno a cuatro heteroatomos seleccionados del grupo consistente en oxfgeno, nitrogeno y azufre.
Compuestos de ciclooctina fusionada
[0036] Basado en el hecho de que la reactividad de las cicloalquinas aumenta conforme decrece el tamano del anillo, los conjugados de cicloalquinas con menos de ocho atomos de carbono serfan de gran interes para la aplicacion en la qufmica bioortogonal. Desafortunadamente, hasta la fecha el cicloheptino y los anillos menores no pueden ser aislados en la forma pura, debido a la energfa de tension en aumento como resultado de la desviacion del angulo ideal 180° C-CaC.
[0037] Una via alternativa para aumentar la energfa de tension es mediante la benzanulacion de la ciclooctina para los grupos arilo, estrategia seguida en WO 2009/067663 para DIBO. La energfa de tension puede luego ademas mejorarse mediante la introduccion de otro atomo tipo sp2 en el anillo, metodo seguido por van Delft para DIBAC y por Bertozzi para BARAC. No obstante, como fue mencionado anteriormente, la presencia de dos fracciones de arilo en la ciclooctina no solo da lugar a una repulsion esterica seria, sino que tambien aumenta el caracter lipofflico de los compuestos de ciclooctina, lo cual es indeseado.
[0038] Los presentes inventores descubrieron que una via altamente eficaz para inducir la tension del anillo adicional implica la fusion de una ciclooctina con un anillo de 3 o 4 miembros, conduciendo a compuestos de ciclooctina fusionada, mas particularmente a sistemas de biciclo[6.1.0]nonina y biciclo[6.2.0]decina, respectivamente. Estos
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sistemas bicfclicos estan sorprendentemente bien adecuados como sondas bioortogonales, ya que combinan estabilidad relativa con alta reactividad en cicloadiciones (3+2) con 1,3-dipolos y en reacciones (hetero) Diels-Alder con 1,3-(hetero)dienos. Ademas, la estructura anular de 3 o 4 miembros fusionada, ademas de infligir tension al anillo, es tambien perfectamente adecuada para la posicion de un mango para la conjugacion de grupos funcionales y/o etiquetas y pueden ser convenientemente funcionales para aplicaciones tal como el etiquetado bioortogonal, la formacion de imagenes y/o la modificacion, tal como por ejemplo modificacion de la superficie, de moleculas diana.
[0039] Los compuestos de ciclooctina fusionada son los compuestos de la Formula general (la),
donde:
m es 0 o 1; n es de 0 a 8; p es 0 o 1;
Z es N o C(R3), donde R3 se selecciona del grupo consistente en [(L)p-Q], hidrogeno, halogeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, los grupos
alquilo opcionalmente siendo interrumpidos por uno de varios heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo son independientemente opcionalmente sustituidos por uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halogenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos sililo estan representados con la formula (R4)3Si-, donde R4 se selecciona independientemente del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12 y
grupos cicloalquiloxi C3 - C12, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S;
Y es O, C(O) o C(R5)2, donde R5 se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrogeno, halogeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, los grupos alquilo siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo son opcionalmente sustituidos;
opcionalmente, cuando m = 1, Y y Z junto con la union de enlace Y y Z, forman un grupo alquilo cfclico o un grupo (hetero)arilo, donde el grupo alquilo cfclico y el grupo (hetero)arilo son opcionalmente sustituidos, siempre y cuando
Y y Z formen un grupo (hetero)arilo, luego el grupo -(L)p-Q es un sustituyente en el grupo (hetero)arilo;
L es un grupo de conexion seleccionado de grupos alquileno C1 - C24, grupos alquenileno C2 - C24, grupos alquinileno C2 - C24, grupos cicloalquileno C3 - C24, grupos cicloalquenileno C5 - C24, grupos cicloalquinileno C8 - C24, grupos alquil(hetero)arileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquenileno C8 - C24,
grupos (hetero)arilalquinileno Cg - C24 lineales o ramificados, los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos alquil(hetero)arileno, grupos (hetero)arilalquileno, grupos (hetero)arilalquenileno y grupos (hetero)arilalquinileno siendo opcionalmente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos cicloalquenilo
C5 - C12, grupos cicloalquinilo C8 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halogenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos sililo se pueden representar con la formula (R4)3Si-, donde R4 se define como anteriormente;
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Q es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en halogeno, alquilo Ci - C24, (hetero)arilo C6 - C24, alquilo(hetero)arilo C7 - C24, (hetero)arilalquilo C7 - C24, -CH = C (R6)2, -CeCR6, - [C (R6)2C(R6)2O]q-R, donde q esta en el intervalo de 1 a 200, -CN, -N3, -NCX, -XCN, -XR6 - N(R6)2, -+N (R6)3, -C(X)N(R6)2, -C(R6)2XR6, -C(X)R6, -C(X) XR6, -S(O)R6, -S(O)2R6, -S(O)OR6, -S(O)2OR6, -S(O)N(R6k -S(O)2N(R6)2, -OS(O)R6, -OS(O)2R6, -OS(O)OR6, -
OS(O)2OR6, -P(O)(R6)(OR6), -P(O)(OR6)2, -OP(O)(OR6)2, -Si(R6)3, -XC(X)R6, -XC(X)XR6, -XC(X)N(R6)2, -
N(R6)C(X)R6, -N(R6)C(X)XR6 y -N(R6)C(X)N(R6)2, donde X es oxfgeno o azufre y donde R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, halogeno, grupos alquileno C1-C24, grupos (hetero)arileno C6-C24, grupos alquil(hetero)arileno C7-C24, y grupos (hetero)arilalquileno C7 - C24; y
R1 se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrogeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24; y R2 se selecciona independientemente del grupo consistente en halogeno, -OR6, -NO2, -CN, -S(O)2R6, grupos alquilo C1 - C12, grupos arilo C1 - C12, grupos alquilarilo C1 - C12 y grupos arilalquilo C1 - C12, donde R6 es tal como se ha definido anteriormente, y donde los grupos alquilo, grupos arilo, grupos alquilarilo y grupos arilalquilo son opcionalmente sustituidos.
[0040] Una ventaja de los compuestos de ciclooctina fusionada es que se sintetizan facilmente. Otra ventaja es que son susceptibles de que se modifiquen simplemente y directamente varias partes de la molecula.
[0041] En el compuesto de ciclooctina fusionada de la Formula (la), el enlace triple se localiza en la posicion 4 de la fraccion de ciclooctina, es decir, opuesto al anillo fusionado de 3 o 4 miembros. Esto puede resultar en un numero disminuido de regioisomeros potenciales posible para (la), dependiendo de la naturaleza de los sustituyentes en el compuesto de ciclooctina.
[0042] En los compuestos de la Formula (la), el sustituyente - [(L)p-Q] en Z se puede situar en la posicion exo o endo respectivamente al anillo de ciclooctina. Los dos sustituyentes R1 pueden estar en una posicion cis o trans uno con respecto al otro.
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-C(X)N(R6)2, -C(R6)2XR6, -C(X)R6, -C(X)XR6, -XC(X)R6, -XC(X)XR6 y -N(R6)C(X)N(R6)2, donde X y R6 son tal como se ha definido anteriormente
N(R6)2, -+N(R6)3, N(R6)C(X)R6, -N(R6)C(X)XR6
[0043] Preferiblemente, Q se selecciona del grupo consistente en -CN, -N3, -NCX, -XCN, -XR
XC(X)N(R6)2
De forma mas preferible, X es del grupo consistente en -OR6, -N(R6)2, -+N(R6)3, OC(O)N(R6)2, -N(R6)C(O)R6, -N(R6)C(O)OR6 y
mas
C(O)OR6, -OC(O)R6
preferible, Q se selecciona OC(O)OR6, -
oxfgeno. De la forma
-C(O)N(R6)2,
-N(R6)C(O)N(R6)2. Ademas, el grupo funcional Q puede opcionalmente ser enmascarado o protegido. Los grupos R6 se pueden seleccionar independientemente entre si, lo que significa que los dos grupos R6 presentes en, por ejemplo, un -N(R6)2 sustituyente puede ser diferente entre si.
[0044] En una forma de realizacion, p es 0, es decir Q esta unido directamente a Z. En otra forma de realizacion, p es 1.
En otra forma de realizacion, p es 1 y L es CH2.
[0045] En una forma de realizacion preferida, R1 es hidrogeno.
[0046] En otra forma de realizacion preferida, n es 0. En otra forma de realizacion preferida, R2 es un grupo de retirada de electrones, es decir un grupo con un valor positivo para la constante sustituyente Hammett o Los grupos de retirada de electrones adecuados son conocidos por los expertos en la tecnica, e incluyen por ejemplo halogeno (en particular F), -OR6, -NO2, -CN, -S(O)2R6, grupos alquilo sustituidos C1 - C12, grupos arilo sustituidos C1 - C12 o grupos alquilarilo sustituidos C1 - C12, donde los sustituyentes son grupos de retirada de electrones. Preferiblemente, los grupos alquilo, grupos arilo y grupos alquilarilo sustituidos son grupos alquilo fluorinados C1 - C12 (tal como por ejemplo -CF3), grupos arilo fluorinados C1 - C12 (tal como por ejemplo -C6F5) o grupos alquilarilo fluorinados C1 - C12 (tal como por ejemplo -[3,5-(CF3)2(C6H3)]).
Compuestos con m = 0 y Z = CR3
[0047] Una clase especffica de compuestos es la clase de compuestos segun la Formula (la), donde la fraccion de ciclooctina se fusiona con una estructura anular de tres miembros. En esta clase de compuestos, m, tal como se ha definido anteriormente, es 0.
[0048] Preferiblemente, Z es C(R3), donde R3 es tal como se ha definido anteriormente. La presente invencion por lo tanto se refiere a un compuesto segun la Formula (lla):
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donde n, p, R1, R2, R3, L y Q son tal como se ha definido anteriormente para los compuestos de la Formula (la).
[0049] Como ya se ha mencionado anteriormente, el sustituyente -[(L)p-Q] en los compuestos de la Formula (IIa), se puede situar exo o endo con respecto al anillo de ciclooctina, y los dos sustituyentes R1 se pueden situar en una posicion cis o trans una con respecto a la otra. En una forma de realizacion preferida, los sustituyentes R1 estan en una posicion cis.
[0050] En una forma de realizacion, p es 0, es decir Q se une directamente al anillo de ciclopropilo. En otra forma de realizacion, p es 1. En otra forma de realizacion, p es 1 y L es CH2.
[0051] Tambien en compuestos de la Formula (lla), tanto cuando p es 0 como cuando p es 1, Q se selecciona
en -CN, —N3
-XCN, —XR
NCX,
XC(X)XR6, —XC(X)N(R6)2,
6
—N(R6)2
N(R6)C(X)R6, —N(R6)C(X)XR6
+ N(R6)3,
C(X)N(R6)2
y
preferiblemente del grupo consistente
—C(R6)2XR6, —C(X)R6, —C(X)XR6, —XC(X)R6
—N(R6)C(X)N(R6)2, donde X y R6 son tal como se ha definido anteriormente. De forma mas preferible, X es oxfgeno. De la forma mas preferible, Q se selecciona del grupo consistente en —OR6, —N(R6)2, —+N(R6)3, —C(O)N(R6)2, —C(O)OR6, —OC(O)R6, —OC(O)OR6, —OC(O)N(R6)2, —N(R6)C(O)R6, —N(R6)C(O)OR6 y —N(R6)C(O)N(R6)2. Ademas, el grupo funcional Q puede opcionalmente ser enmascarado o protegido. Los grupos R6 se pueden seleccionar
independientemente entre si, lo que significa que los dos grupos R presentes en, por ejemplo, un sustituyente
preferiblemente —OH. En
-N(R6)2 pueden ser diferentes entre si. En una forma de realizacion preferida, Q es —OR6
otra forma de realizacion preferida, Q es —C(O)OR
[0052] En otra forma de realizacion preferida, R3 es hidrogeno o [(L)p—Q].
[0053] En una forma de realizacion preferida, R1 es hidrogeno.
[0054] En otra forma de realizacion preferida, n es 0. En otra forma de realizacion preferida, R2 es un grupo de retirada de electrones, es decir un grupo con un valor positivo para la constante del sustituyente de Hammett o Los grupos de retirada de electrones adecuados son conocidos por un experto en la tecnica, e incluyen por ejemplo halogeno (en particular F), —OR6, —NO2, —CN, —S(O)2R6, grupos alquilo sustituidos C1 - C12, grupos arilo sustituidos C1 - C12 o grupos alquilarilo sustituidos C1 - C12, donde los sustituyentes son grupos de retirada de electrones. Preferiblemente, los grupos alquilo, grupos arilo y grupos alquilarilo sustituidos son grupos alquilo fluorinados C1 - C12 (como por ejemplo —CF3), grupos arilo fluorinados C1 - C12 (como por ejemplo —C6F5) o grupos alquilarilo fluorinados C1 - C12 (como por ejemplo —[3,5-(CF3)2(C6H3)]).
[0055] Los compuestos de la Formula (lla) son preferidos debido a que pueden poseer un eje o un plano de simetrfa, reduciendo asf el numero de regioisomeros potenciales que se pueden formar.
[0056] Una forma de realizacion donde p es 1, L es CH2, Q es —OH, R1 es hidrogeno, R3 es hidrogeno o [(L)p—Q] y n es 0, es particularmente preferida.
Conjugados
[0057] Los compuestos de ciclooctina fusionada segun la presente invencion son muy adecuados para su uso en las reacciones clic sin metales, y en consecuencia estos compuestos son herramientas versatiles en aplicaciones tal como por ejemplo el etiquetado bioortogonal, la formacion de imagenes y/o la modificacion, incluyendo la modificacion de la superficie, de un rango grande de moleculas diana. Se proporciona un conjugado donde un compuesto de la Formula (la) se conjuga a una etiqueta a traves de un grupo funcional Q.
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[0058] El termino "etiqueta" se refiere a cualquier marca identificativa que se puede conjugar con un compuesto de la Formula (Ia). Se conoce una amplia variedad de etiquetas en la tecnica, para una amplia variedad de aplicaciones diferentes. Dependiendo de la aplicacion especffica, se puede seleccionar una etiqueta adecuada para esta aplicacion especffica. Se conocen etiquetas adecuadas para aplicaciones especfficas por los expertos en la tecnica, e incluyen, pero de forma no limitante, todos los tipos de fluoroforos, biotina, cadenas de polietilenglicol (PEG), cadenas de polipropilenglicol (PPG), cadenas mixtas de polietilenglicol/polipropilenglicol, isotopos radiactivos, esteroides, compuestos farmaceuticos, lfpidos, peptidos, glicanos (incluyendo oligosacaridos y polisacaridos), nucleotidos (incluyendo oligonucleotidos y polinucleotidos) y etiquetas peptfdicas. Ejemplos de fluoroforos adecuados son por ejemplo todos los tipos de Alexa Fluor (por ejemplo Alexa Fluor 555), tintes de cianina (por ejemplo Cy3 o Cy5), derivados de cumarina, fluorescefna, rodamina, aloficocianina, cromomicina, etcetera. Ejemplos de etiquetas peptfdicas adecuadas incluyen etiquetas FLAG o HIS. Un ejemplo de un glicano adecuado es la concanavalina. Preferiblemente, la etiqueta se selecciona del grupo que comprende fluoroforos, biotina, cadenas de polietilenglicol, cadenas de polipropilenglicol, cadenas mixtas de polietilenglicol/polipropilenglicol, isotopos radiactivos, esteroides, compuestos farmaceuticos, lfpidos, peptidos, glicanos, nucleotidos y etiquetas peptfdicas.
[0059] El grupo funcional Q se puede conectar a la etiqueta directamente, o indirectamente a traves de un enlazador
0 unidad de conexion. Las unidades de conexion son bien conocidas en la tecnica, y tienen la estructura general Q- S-Q, donde Q es tal como se ha definido anteriormente, y S se selecciona del grupo consistente en grupos alquileno Ci -C200, grupos alquenileno C2 -C200, grupos alquinileno C2 -C200, grupos cicloalquileno C3 -C200, grupos cicloalquenileno C5 -C200, grupos cicloalquinileno C8 -C200, grupos alquilarileno C7 - C200, grupos arilalquileno C7 - C200, grupos arilalquenileno C8 -C200, grupos arilalquinileno C9 -C200 lineales o ramificados. Opcionalmente los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos alquilarileno, grupos arilalquileno, grupos arilalquenileno y grupos arilalquinileno pueden ser sustituidos, y opcionalmente dichos grupos se pueden interrumpir por uno o varios heteroatomos, preferiblemente de
1 a 100 heteroatomos, dichos heteroatomos siendo preferiblemente seleccionados del grupo consistente en O, S y NR6, donde R6 se define como anteriormente. De la forma mas preferible, el heteroatomo es O.
[0060] Ejemplos de unidades de conexion adecuados incluyen, pero no de forma limitante, diaminas de (poli)etilenglicol (como por ejemplo 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano o equivalentes que comprendan cadenas mas largas de etilenglicol), cadenas de polietilenglicol o de oxido de polietileno, polipropilenglicol o cadenas de oxido de polipropileno, 1,x-diaminoalcanos donde x es el numero de atomos de carbono en el alcano, y similares. Otra clase de enlaces adecuados comprende enlaces divisibles. Los enlaces divisibles son bien conocidos en la tecnica.
[0061] En una forma de realizacion preferida, la invencion se refiere a un conjugado, donde un compuesto de la Formula (IIa) se conjuga con una etiqueta a traves de un grupo funcional Q. En otra forma de realizacion preferida, el compuesto conjugado de la Formula (IIa) es un compuesto donde p es 1 y L es CH2. R1 y/o R3 son preferiblemente H. En otra forma de realizacion, n es 0 (Q, n, p, L, R1 y R3, tal y como se definen anteriormente). De la forma mas preferible, p es 1, L es CH2, R1 es H, R3 es H y n es 0.
[0062] La presente invencion tambien se refiere al uso de un conjugado segun la invencion para el etiquetado bioortogonal, la formacion de imagenes o la modificacion, tal como por ejemplo la modificacion de la superficie, de una molecula diana.
Metodo de sfntesis
[0063] Otro aspecto de la presente invencion es proporcionar un metodo de sfntesis para los compuestos de la Formula (IIa).
[0064] Un metodo para preparar un compuesto de la Formula (Ia) general comprende los pasos de:
(a) Introduccion de un anillo fusionado de 3 o 4 miembros a un ciclooctadieno de la Formula (VIIa):
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n = de 0 a 8;
R1 se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrogeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24; y R2 se selecciona independientemente del grupo consistente en halogeno, -OR6, -NO2, -CN, -S(O)2R6, grupos alquilo Ci - C12, grupos arilo C1 - C12, grupos alquilarilo C1 - C12 y grupos arilalquilo C1 - C12, donde los grupos alquilo, grupos arilo, grupos alquilarilo y grupos arilalquilo son opcionalmente sustituidos, y donde R6 se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrogeno, halogeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24.
para formar un compuesto de cicloocteno bicfclico,
(b) Brominacion del compuesto obtenido de cicloocteno bicfclico para formar un compuesto de ciclooctano bicfclico, y
(c) Deshidrobrominacion del compuesto obtenido de ciclooctano bicfclico para formar un compuesto de la Formula (la) general.
[0065] El ciclooctadieno de la Formula (Vila) en el paso (a) puede ser un cis,cis- o un cis,frans-ciclooctadieno. En una forma de realizacion, el ciclooctadieno es un cis,cis-ciclooctadieno. En una segunda forma de realizacion, el ciclooctadieno es un cis,frans-ciclooctadieno. En otras palabras, el enlace doble que comprende el sustituyente R1 puede tener la configuracion E o Z.
[0066] En una forma de realizacion preferida R1 es H. En otra forma de realizacion preferida, n es 0. En otra forma de realizacion preferida, R1 es H y n es 0.
[0067] El grupo funcional Q se puede introducir en cualquier punto en el metodo de sfntesis. Por ejemplo, el grupo funcional se puede introducir durante el paso (a), la formacion del compuesto de cicloocteno bicfclico. El grupo funcional tambien se puede introducir en un paso adicional, por ejemplo antes o despues del paso de brominacion (b) o despues del paso de deshidrobrominacion (c). Como quedara claro para un experto en la tecnica, la estrategia empleada para la introduccion del grupo funcional depende en su totalidad de la naturaleza del grupo funcional especffico que necesita ser introducido.
[0068] Obviamente, el metodo de eleccion del paso (a), la introduccion de un anillo fusionado de 3 o 4 miembros en un ciclooctadieno de la Formula (Vila), depende del tipo de anillo de 3 o 4 miembros que se introduce.
[0069] El paso (b), brominacion de un compuesto de cicloocteno, y el paso (c), deshidrobrominacion de un compuesto de ciclooctano, son considerados transformaciones organicas estandar conocidas por un experto en la tecnica.
[0070] Los presentes inventores descubrieron que por ejemplo los compuestos de la Formula (lla) pueden ser facilmente y rapidamente preparados a buen rendimiento a partir de materias primas facilmente disponibles. La presente invencion por lo tanto tambien se refiere a un metodo para preparar un compuesto de la Formula (lla), el metodo que comprende las etapas de:
(a) Ciclopropanacion de un ciclooctadieno de la Formula (Vlla):
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donde n, R1 y R2 son tal como se ha definido anteriormente para formar un compuesto de cicloocteno bicfclico,
(b) Brominacion del compuesto obtenido de cicloocteno bicfclico para formar un compuesto de ciclooctano bicfclico, y
(c) Deshidrobrominacion del compuesto obtenido de ciclooctano bicfclico para formar un compuesto de la Formula (Ila).
[0071] El ciclooctadieno de la Formula (Vila) en el paso (a) puede ser un cis,cis- o un c/'s,frans-ciclooctadieno. En una forma de realizacion, el ciclooctadieno es un cis,cis-ciclooctadieno. En otra forma de realizacion, el ciclooctadieno es un c/'s,frans-ciclooctadieno. En otras palabras, el enlace doble que comprende los sustituyentes R1 puede tener la configuracion E o Z.
[0072] En una forma de realizacion preferida R1 es H. En otra forma de realizacion preferida, n es 0. En otra forma de realizacion preferida R1 es H y n es 0.
[0073] Tambien en este caso, el grupo funcional Q se puede introducir en un paso adicional, por ejemplo antes o despues del paso de brominacion (b), o a continuacion del paso de deshidrobrominacion (c). El paso (a), la ciclopropanacion de un ciclooctadieno, puede por ejemplo conseguirse mediante la reaccion de un carbeno, un carbenoide o un precursor de carbeno con el ciclooctadieno, opcionalmente en presencia de un catalizador. El paso (b) y (c) son transformaciones organicas estandar conocidas por el experto en la tecnica.
[0074] Como ejemplo, un compuesto de la Formula endo-(lla), donde p es 1, L es CH2, Q es OH, n es 0, y R1 y R3 son H (endo-9-(hidroximetil)biciclo[6.1.0]non-4-ina), se puede sintetizar con buen rendimiento en solo 4 pasos en un periodo de tiempo muy corto (solo 1 - 2 dfas). Otra ventaja del metodo de sfntesis segun la presente invencion es que solo hay una necesidad limitada de la purificacion cromatografica, reduciendo asf el tiempo total necesario para la sfntesis total.
Modificacion de moleculas diana
[0075] Los conjugados segun la presente invencion se aplican exitosamente en el etiquetado bioortogonal, la formacion de imagenes o la modificacion, incluyendo la modificacion de la superficie, de moleculas diana tales como por ejemplo protefnas, lfpidos y glicanos. La presente invencion por lo tanto tambien se refiere a un metodo para la modificacion de una molecula diana, donde un conjugado segun la presente invencion reacciona con un compuesto que comprende un 1,3-dipolo o un 1,3-(hetero)dieno. Como ejemplo, la cicloadicion promovida por tension de un cicloalquino con una azida (SPAAC) o con una nitrona (SPANC) fue representada en el Esquema 1. La reaccion de una ciclooctina con un 1,3-(hetero)dieno se conoce como reaccion (hetero) Diels-Alder. Estas reacciones se nombran tambien reacciones clic sin metales.
[0076] Los compuestos 1,3-dipolo son bien conocidos en la tecnica (cf. por ejemplo F.A. Carey y R.J. Sundberg, Advanced Organic Chemistry, Part A: Structure and Mechanisms, 3a Ed., 1990, p. 635 - 637), e incluyen oxidos de nitrilo, azidas, diazometano, nitronas, nitrilaminas, etc. Preferiblemente, el compuesto que comprende un 1,3-dipolo es un compuesto que comprende azida, un compuesto que comprende nitrona o un compuesto que comprende oxido de nitrilo.
[0077] Las reacciones (hetero) Diels-Alder y los 1,3-(hetero)dienos son tambien bien conocidos en el estado de la tecnica. Ejemplos de 1,3-dienos incluyen, entre otros, 1,3-butadieno, 1,3-ciclopentadieno, 1,3-ciclohexadieno, furano, pirrol, y sus variedades sustituidas. Ejemplos de 1,3-heterodienos incluyen entre otros 1-oxa-1,3-butadieno, 1-aza- 1,3-butadieno, 2-aza-1,3-butadieno, 3-aza-1,3-butadieno, y sus variedades sustituidas.
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[0078] Una gran variedad de moleculas diana, es decir compuestos que comprenden un 1,3-dipolo o un 1,3- (hetero)dieno, se pueden modificar mediante el metodo segun la invencion. Las moleculas diana adecuadas son bien conocidas en la tecnica e incluyen, pero no de forma limitante, biomoleculas tal como por ejemplo protefnas, peptidos, glicanos, lfpidos, acidos nucleicos, enzimas, hormonas, y similares. En principio, cualquier compuesto que comprende un 1,3-dipolo o un 1,3-(hetero)dieno se puede adecuar como molecula diana.
[0079] Las aplicaciones del metodo para la modificacion de moleculas diana segun la presente invencion incluyen, pero de ninguna manera de forma limitante, diagnostico y usos terapeuticos, etiquetado celular de celulas vivas, por ejemplo celulas MV3, fibroblastos, celulas Jurkat, celulas CHO o celulas HEK, modificacion de biopolfmeros (protefnas, lfpidos, acidos nucleicos, glicanos), enriquecimiento de protefnas y glicanos para el analisis espectrometrico de masas, sintonizacion de propiedades polimericas, modificacion superficial, etc.
[0080] En una forma de realizacion, la reaccion del conjugado se realiza in vitro. En una forma de realizacion preferida, la reaccion se realiza in vivo, es decir, bajo condiciones fisiologicas.
[0081] Los conjugados segun la presente invencion que se aplican en la modificacion de una molecula diana son anteriormente descritos con gran detalle. Una de las grandes ventajas de estos conjugados es que se pueden aplicar tanto in vivo como in vitro. Ademas, los conjugados aquf descritos son menos susceptibles de sufrir interacciones lipofflicas inespecfficas no deseadas, y muestran una buena cinetica reactiva en las reacciones clic sin metales. Otra ventaja es que los conjugados aquf descritos son facilmente sintetizados y susceptibles de que se modifiquen simplemente y directamente varias partes del conjugado. Esto hace posible "sintonizar con precision" un conjugado para una aplicacion especffica, y optimizar la cinetica reactiva para esta aplicacion.
[0082] En una forma de realizacion preferida, un compuesto de la Formula (Ila), o un conjugado de la misma como se ha descrito anteriormente, reacciona con un compuesto que comprende un 1,3-dipolo o un 1,3-(hetero)dieno. Por ejemplo la cicloadicion de (Ila) con azida de bencilo en condiciones acuosas procede rapidamente y limpiamente a los aductos de triazol correspondientes con una cinetica reactiva excelente (k = 0.09 - 0.28 M-1 s-1, dependiendo del disolvente). La cinetica reactiva para la cicloadicion de (Ila) con C-benzilamida-W-metilnitrona es incluso mas alta (k = 1.25 M-1 s-1). Sorprendentemente, la cinetica reactiva es similar tanto para exo-(lla) como para endo-(lla), lo que indica que la estereoqufmica en la posicion C-9 del compuesto (lla) tiene poca influencia en la reactividad. Consecuentemente, se puede aplicar una mezcla de exo y endocompuestos segun la invencion en algunas aplicaciones, evitando la necesidad de la separacion de los exo y endocompuestos e incluso ademas simplificando la sfntesis de los compuestos segun la invencion.
[0083] Aplicaciones adicionales del metodo segun la presente invencion incluyen por ejemplo el ligamiento de un conjugado de fluoroforo donde (lla) se conjuga con Alexa Fluor 555 hasta dar una protefna de plasmido vfrico con una unica azida, y la deteccion de glicanos de la superficie celular mediante la estrategia de indicador qufmico.
Composicion farmaceutica
[0084] Finalmente, la invencion se refiere a una composicion que comprende un conjugado segun la invencion, que comprende ademas un portador farmaceuticamente aceptable. Se conocen en la tecnica una amplia variedad de portadores farmaceuticamente aceptables adecuados (cf. por ejemplo R.C. Rowe, P.J. Sheskey y P.J. Weller (Eds.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a Ed. 2003).
Ejemplos
Ejemplo 1: Sfntesis de exo- y endo-lla.2
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[0086] En el primer paso, el diazoacetato de etilo se anade lentamente a una solucion en diclorometano de gran exceso (8 equiv.) de 1,5-ciclooctadieno en presencia de acetato de rodio, conduciendo a los compuestos diastereomericos exo-iia.1 y endo-IIa.1 en una proporcion de 2:1 (rendimiento combinado del 82%). Directamente despues de la separacion mediante gel de sflice, primero el endoisomero de IIa.1 fue convertido en alcohol IIa.2 siguiendo un procedimiento directo de tres pasos de reduccion, brominacion y eliminacion. Asf, la reduccion esterica de endo-IIa.1 con LiAlH4 (30 min) produjo un alcohol intermedio crudo (30 min) suficientemente puro para la brominacion sin purificacion intermedia (30 min). Debe senalarse que no es necesaria la proteccion temporal del alcohol, como en la sfntesis de DIBO. Finalmente, el dibromuro resultante fue sometido a exceso de KOfBu en THF (0 °C ^ reflujo, 2 h), proveyendo el deseado 9-(hidroximetil)-biciclo[6.1.0]non-4-ina endo-IIa.2 en rendimiento aislado del 61% para los tres pasos de endo-IIa.1. Una secuencia similar de eventos, que se puede ejecutar en un solo dfa con solo una purificacion cromatografica, proveyo el exoisomero diastereomerico de IIa.2 en un 53%.
Ejemplo 2: Cinetica reactiva
[0087] Se investigo la cinetica reactiva para la cicloadicion con la azida prototfpica azida de bencilo. Asf, el compuesto endo-IIa.2 fue disuelto en una mezcla 3:1 de CD3CN y D2O y mezclado con azida de bencilo a una concentracion final de 18 mM. La conversion qufmica fue seguida con RMN de proton mediante la integracion de picos de diagnostico y fue indicado que el endo-IIa.2 reacciono rapidamente y limpiamente a los aductos de triazol previstos. El calculo de la cinetica reactiva de segundo orden mostro una constante de fndice de 0.12 M-1 s-1. Un valor similar de 0.10 M-1 s-1 fue determinado para exo-IIa.2, indicando que la estereoqufmica en la posicion C-9 tiene poca influencia en la reactividad, con solo un fndice ligeramente superior para los compuestos configurados con endo. Se observo un efecto significativo del disolvente debido a que la misma reaccion de cicloadicion en una mezcla 1:2 de CD3CN y D2O produjo constantes de fndice de 0.28 y 0.25 M-1 s-1 para endo-IIa.2 y exo-IIa.2, respectivamente.
Ejemplo 3: Conjugados biciclo[6.1.0]non-4-ina (BCN)
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BCN conjugado con brotina {tia,4l
[0089] La fraccion alcoholica de endo-\\a.1 fue convertida en un carbonato de p-nitrofenilo (pNP) como en IIa.3. La reaccion posterior con biotina-(POE)3-NH2 llevo a un conjugado de BCN-biotina \\a.4 (rendimiento 69%).
BCN conjugado con Alexa Fluor 555 (\\a.6)
[0090] Alternativamente, el compuesto \\a.3 fue reaccionado con 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano para dar sonda BCN amino-terminal \\a.5, que fue convertida en el conjugado de fluoroforo \\a.6 con la reaccion esterica de hidroxisuccinimida Alexa Fluor 555 comercial.
[0091] Alternativamente, el compuesto \\a.3 fue reaccionado con 1,5-diaminopentano para dar como resultado una sonda BCN amino-terminal mas lipofflica.
Ejemplo 4: Reaccion de \\a.6 con protefna capsida etiquetada con azida (etiquetado SPAAC)
[0092] La protefna capsida se preparo para contener solo una unica funcionalidad de azida por molecula, la cual - tras el ensamblaje de la capsida- se localiza en la superficie interna de la capsida. La protefna es disuelta en el tampon (50 mM de tampon fosfato a pH 7.5; 1M NaCl) a una concentracion de 1 mg/mL. El conjugado Alexa Fluor 555-BCN \\a.6 fue disuelto en agua y se anadieron 4 equivalentes del conjugado a la solucion de protefna. La mezcla reactiva fue incubada durante 3 horas a temperatura ambiente antes del analisis.
[0093] El producto de la reaccion fue analizado en un gel SDS-PAGE al 12%, del cual se registro una imagen de fluorescencia antes de la coloracion con Coomassie-blue. En la Figura 1 se muestran los analisis del SDS-Page del producto de la reaccion (izquierda) y de la reaccion en blanco (derecha). La parte superior de la Figura 1 muestra la coloracion Coomassie-blue, la parte inferior muestra la imagen de fluorescencia antes de la coloracion con Coomassie-blue. Estos resultados indican claramente que el conjugado Alexa Fluor 555-BCN fue incorporado en la protefna capsida.
[0094] Para el analisis de masa, la mezcla reactiva cruda fue dializada al 0.1% TFA en milliQ antes de analizarla con ionizacion por electrospray a tiempo de vuelo (ES\-TOF) en un JEOL AccuTOF. La Figura 2 muestra el espectro de masa ES\-TOF de la protefna capsida reaccionada con \\a.6. El pico B corresponde a la masa de la protefna capsida no-reaccionada, mientras que el pico A corresponde al producto de la reaccion. La diferencia de masa entre los picos es 1135.1 (previsto 1135), lo que indica que la unica azida en la protefna capsida ha reaccionado eficazmente con el conjugado BCN-Alexa Fluor555 que tiene una masa de 1135.
[0095] Para probar las propiedades de autoensamblaje de la protefna capsida funcional, la mezcla reactiva cruda fue dializada a un tampon a pH 5.0 (50 mM NaOAc; 1 M NaCl; 10 mM CaCh), que deberfa inducir la formacion de partfculas esfericas de dimension 28 nm (B.J.M. Verduin, FEBS Lett. 1974, 45, 50 - 54). Despues del ensamblaje de las capsidas por dialisis, la mezcla reactiva fue analizada con FPLC. El analisis de exclusion de tamano en una columna Superpose 6 se muestra en la Figura 3. El pico de absorcion a 280 nm a un volumen de elucion de 1.2 ml senala la formacion de capsidas de 28 nm, y la absorbancia de superposicion a 555 nm muestra que el tinte Alexa, y por eso \\a.6, esta presente en las capsidas.
Ejemplo 5: Reaccion de \\a.2 con protefna etiquetada con nitrona FRATtide (etiquetado SPANC)
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[0096] Se disolvio FRATtide (15.6 |jg, 3.4 nmol, 34 jM) en 0.1 M de tampon NH4OAC a pH 6.9 (100 pL) y se anadio NaIO4 (1.1 jg, 5.5 nmol, 48 jM). Se dejo que la reaccion se produjera a temperature ambiente durante 40 min y se anadio p-metoxibenzenetiol (9.2 jg, 66.0 nmol, 565 jM). Se agito la mezcla durante 2 horas a 25 °C y se anadio p- anisidina (13.5 jg, 109.3 jmol, 845 jM), hidrocloruro de W-metilhidroxilamina (18.2 jg, 218.6 nmol, 1.5 mM), y BcN- OH II.a2 (41.1 jg, 273.3 nmol, 1.8 mM). Finalmente, se agito la mezcla reactiva a 25 °C durante 24 horas para dar el conjugado deseado.
[0097] El progreso de la reaccion fue monitoreado por espectrometrfa de masas (Accu-TOF). El pico de ion molecular a 4533.8 Da, que corresponde con la protefna FRATtide, desaparecio tras el tratamiento con peryodato de sodio, mientras que aparecio un pico de ion molecular a 4534.8, correspondiente con el hemiacetal metflico. Tras el tratamiento con W-metilhidroxilamina y BCN-OH, aparecio un pico de ion molecular a 4681.4 Da, que corresponde con el derivado de nitrona de protefna FRATtide que ha reaccionado con BCN-OH IIa.2, como el pico principal (tras la deconvolucion).
Ejemplo 6: Etiquetado de la superficie celular
[0098] La utilidad del conjugado de biotina IIa.4 con fines de etiquetado bioortogonal fue investigada mediante la deteccion de glicanos de la superficie celular mediante la estrategia de indicador qufmico. La N- azidoacetilmanosamina (ManNAz) fue metabolicamente incorporada en celulas MV3, y detectada por FACS y microscopfa confocal.
Procedimiento de cultivo celular
[0099] Las celulas de melanoma humano invasivo y metastasico (MV3) se mantuvieron en el medio de cultivo RPMI 1640, que contiene 10% de suero de feto de ternera, penicilina/estreptomicina (cada 50U/ml) en una atmosfera saturada de agua a 5% CO2.
Etiquetado de azida de superficie celular
[0100] Las celulas MV3 fueron cultivadas durante 6 dfas en ausencia o presencia de Ac4ManNAz (50jM). El cambio de medio y compuesto fue realizado 3 dfas despues. La adhesion y morfologfa celulares fueron analizadas con un microscopio de campo claro antes de los estudios avanzados. Para el etiquetado de celula viva, se separaron celulas con EDTA (1mM), se lavaron y centrifugaron tres veces (PBS, 300 x G rpm, 5 min, 4°C), se resuspendieron en PBS y se incubaron en BCN-biotina (IIa.4) (60jM), DIBO-biotina (60jM) o tampon (1 h, 20°C), se lavaron tres veces (PBS, 300 x G, 2 min, 4°C), se resuspendieron en PBS que contenfa estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488 a temperatura muy frfa (5jg/ml, Invitrogen; volumen final 200jl). Tras la incubacion (30 min, 4°C), las celulas fueron lavadas tres veces, resuspendidas en PBS (200jl, 4°C) para mas analisis biologicos.
Citometrfa de flujo
[0101] La citometrfa de flujo fue realizada en un citometro de flujo BD Biosciences FACS-Calibur que utiliza el laser de argon de 488 nm y se analizaron datos con la edicion de investigacion FCS Express version 3 (De Novo Software, Los Angeles, CA). Por muestra, se analizaron 2x104 celulas morfologicamente intactas en presencia de yoduro de propidio (2.5jg/ml).
[0102] En la Figura 4, se muestra la fluorescencia de la superficie celular en celulas MV3 intactas tras la incorporacion metabolica de Ac4ManNAz, el etiquetado con DIBO-biotina o BCN-biotina y la deteccion con estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488. El analisis por citometrfa de flujo indica un incremento de mas de 100 veces en la intensidad de la fluorescencia para el etiquetado con BCN-biotina o DIBO-biotina, seguidos de la deteccion con estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488, con niveles insignificantes de antecedentes de fluorescencia cuando las celulas no se incuban con Ac4ManNAz.
[0103] La Figura 5 muestra las intensidades de fluorescencia y viabilidad celular de las celulas MV3 despues de la incorporacion metabolica de Ac4ManNAz, el etiquetado con DIBO-biotina o BCN-biotina, y la deteccion con estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488. En la Figura 5A se muestran las intensidades medias para la fluorescencia verde (Alexa Fluor 488) y las desviaciones estandar (SD) de cuatro experimentos independientes, en la Figura 5B la viabilidad celular intacta despues del etiquetado con glicano. Se usaron etiquetas de fluorescencia verde (Alexa Fluor 488) y el yoduro de propidio (PI). Los numeros indican el porcentaje de celulas PI-negativas viables. De la Figura 5A, se puede concluir que tanto BCN como DIBO son efectivamente celulas de etiquetado que fueron previamente expuestas a Ac4ManNAz, con una eficiencia mayor de etiquetado con BCN-biotina. La Figura 5B muestra que las celulas, ya sea sin tratar, tratadas con BCN o tratadas con DIBO, mostraron una viabilidad alta (>98% en todos casos).
Microscopfa confocal
5
10
15
20
25
30
35
[0104] Los glicanos de la superficie celular fueron etiquetados con BCN-biotina o DIBO-biotina y posteriormente con estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488. Despues del etiquetado, las celulas fueron resuspendidas en el medio de cultivo normal, transferidas a una placa de 6 pocillos e incubada durante 30 min a 37°C. La formacion de imagenes de celulas vivas de celulas MV3 fue realizada en un microscopio de escaneo de laser confocal Olimpo FV1000 con un laser de argon 488, excitacion 488 nm, emision 520 nm y una ampliacion 40x a temperatura ambiente.
[0105] La Figura 6 muestra imagenes confocales representativas de celulas etiquetadas, previamente cultivadas en ausencia o presencia de Ac4ManNAz (50pM). Las imagenes confocales muestran claramente que la superficie celular de las celulas MV3 se hace fluorescente tras la incubacion de las celulas con Ac4ManNAz seguida de la deteccion de los glicanos de la superficie celular con BCN-biotina o DIBO-biotina y posteriormente estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488, pero no sin incubacion con Ac4ManNAz.
Ejemplo 7: Sfntesis de IIa.7
[0106]
imagen14
(1R8S,Z)-dietil biciclo[6.1.01non-4-eno-9,9-dicarboxilato (IIa.8)
[0107]
imagen15
[0108] A una solucion de 1,5-ciclooctadieno (5.27 mL, 43.0 mmol) y Rh2(OAc)4 (100 mg, 0.23 mmol) en ChhCh (5 mL) se anadio gota a gota en 3 horas una solucion de diazomalonato de dietilo (1.0 g, 5.37 mmol) en ChhCh (5 mL). Esta solucion fue agitada durante 24 horas a temperatura ambiente. El Ch^Ch fue evaporado y el exceso de ciclooctadieno fue retirado por filtracion con un filtro de vidrio lleno de sflice (elucion: heptano). El filtrado fue concentrado al vacfo y el residuo fue purificado por cromatograffa en columna en gel de sflice (EtOAc:heptano; 1:10) para obtener IIa.8 (1.03 g, 72%).
1H RMN (CDCla, 400 MHz): 8 5.65-5.57 (m, 2H), 4.10 (2 ^ q, J = 7.2 Hz, 4H), 2.41-2.29 (m, 2H), 2.15-2.06 (m, 3H), 1.83- 1.70 (m, 3H), 1.31-1.23 (2 ^ t, J = 7.2 Hz, 6H).
(1 R,8S,Z)-Biciclo[6.1.0]non-4-eno-9.9-diildimetanol (IIa.9)
[0109]
5
10
15
20
25
imagen16
[0110] A una suspension de LiAlH (103 mg, 2.70 mmol) en Et2O (10 mL) se anadio gota a gota a 0 °C una solucion de IIa.8 (400 mg, 1.50 mmol) en Et2O (10 mL). Se anadio agua cuidadosamente hasta que el solido gris se volvio blanco. Despues se anadio Na2SO4 (2 g), se filtro el solido y se lavo fntegramente con Et2O (100 mL). El filtrado fue concentrado al vacfo. El residuo fue purificado por cromatograffa en columna en gel de sflice (EtOAc:heptano; 3:1) para obtener IIa.9 como un solido blanco (190 mg, 69%).
1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 8 5.66-5.58 (m, 2H), 3.88 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.58 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 2.43-2.35 (m, 2H), 2.20-1.99 (m, 6H), 1.71-1.57 (m, 2H), 0.95-0.88 (m, 2H).
((1R8S)-4,5-Dibromobiclo[6.1.0]nonano-9,9-diil)dimetanol (IIa.10)
[0111]
imagen17
[0112] El diol IIa.9 (145 mg, 0.796 mmol) fue disuelto en CH2Cl2 (5 mL). A 0 °C se anadio una solucion de Br2 (45 pL, 0.875 mmol) en CH2Ch (1 mL) gota a gota hasta que el color amarillo permanecio. La mezcla reactiva fue extinguida con una solucion de Na2S2O3 al 10% (5 mL), y extrafda con CH2Cl2 (2 x 20 mL). El estrato organico fue secado (Na2SO4) y concentrado al vacfo. El residuo fue purificado por cromatograffa en columna en gel de sflice (EtOAc:heptano; 5:1) para obtener IIa.10 (235 mg, 86%) como un solido blanco.
1H RMN (CDCla, 400 MHz): 8 4.87-4.78 (m, 2H), 3.96-3.88 (m, 2H), 3.60 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 2.75-2.63 (m, 2H), 2.322.22 (m, 3H), 2.20-2.13 (m, 1H), 2.05-1.94 (m, 2H), 1.74-1.57 (m, 2H), 1.13-0.99 (m, 2H).
(1R.8S)-Biciclo[6.1.01non-4-in-9.9-diildimetanol (IIa.7)
[0113]
imagen18
[0114] A una solucion del dibromuro IIa.10 (100 mg, 0.292 mmol) en THF (5 mL) se le anadio gota a gota a 0 °C una solucion de KOfBu (1.29 mL, 1 M en THF, 1.29 mmol). Posteriormente la solucion fue refluida durante 1.5 horas. 5 Tras el enfriamiento hasta temperatura ambiente, la mezcla fue extinguida con solucion saturada de NH4Cl (20 mL), y extrafda con CH2Ch (3 x 20 mL). El estrato organico fue secado (Na2SO4) y concentrado al vacfo. El residuo fue purificado por cromatograffa en columna en gel de sflice (EtOAc) para obtener Ila. (24 mg, 46%) como un solido blanco.
1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 8 3.89 (bs, 2H), 3.63 (bs, 2H), 2.58 (bs, 2H), 2.34-2.20 (m, 6H), 1.68-1.59 (m, 2H), 0.8910 0.82 (m, 2H).

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    1. Compuesto de la Formula (I la):
    imagen1
    p es 0 o 1;
    R se selecciona del grupo consistente en [(L)p -Q], hidrogeno, halogeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, los grupos alquilo siendo
    opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo son opcionalmente independientemente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo Ci - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos
    cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos
    cicloalquiloxi C3 - C12, halogenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos sililo se representan con la formula (R4)3Si- donde R4 se selecciona independientemente del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12 y
    grupos cicloalquiloxi C3 - C12, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroatomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S;
    L es un grupo de union seleccionado de grupos alquileno C1 - C24, grupos alquenileno C2 - C24, grupos alquinileno C2 - C24, grupos cicloalquileno C3 - C24, grupos cicloalquenileno C5 - C24, grupos cicloalquinileno Ca - C24, grupos alquil(hetero)arileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquenileno Ca - C24, grupos (hetero)arilalquinileno Cg - C24, los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos alquil(hetero)arileno, grupos (hetero)arilalquileno, grupos (hetero)arilalquenileno y grupos (hetero)arilalquinileno lineales o ramificados siendo opcionalmente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos cicloalquenilo C5 - C12,
    grupos cicloalquinilo Ca - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halogenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos sililo se pueden representar con la formula (R4)3Si- donde R4 se define como anteriormente;
    Q es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en halogeno, alquilo C^ alquilo(hetero)arilo C7 - C24, (hetero)arilalquilo C7 - C24j
    C24, (hetero)arilo C6 - C24, donde q esta
    .4 -CH = C (R6)2, -CECR6, - [C (R6)2C(R6)2O]q-R6
    en el intervalo de 1 a 200, -CN, -N3, -NCX, -XCN, -XR6 - N(R6)2, -+N (R6)3, -C(X)N(R6)2, -C(R6)2XR6, -C(X)R6, -C(X) XR6, -S(O)R6, -S(O)2R6, -S(O)OR6, -S(O)2OR6, -S(O)N(R6k -S(O)2N(R6)2, -OS(O)R6, -OS(O)2R6, -OS(O)OR6, -
    OS(O)2OR6, -P(O)(R6)(OR6), -P(O)(OR6)2, -OP(O)(OR6)2, -Si(R6)3, -XC(X)R6, -XC(X)XR6, -XC(X)N(R6)2, -
    N(R6)C(X)R6, -N(R6)C(X)XR6 y -N(R6)C(X)N(R6)2, donde X es oxfgeno o azufre y donde R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, halogeno, grupos alquileno C1-C24, grupos (hetero)arileno C6-C24, grupos alquil(hetero)arileno C7-C24, y grupos (hetero)arilalquileno C7 - C24; y
    R1 se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrogeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24.
  2. 2. Compuesto segun la reivindicacion 1, donde p es 1 y L es CH2
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
  3. 3. Compuesto segun la reivindicacion 1 o reivindicacion 2, donde Q se selecciona del grupo consistente en -OR6, -N(R6)2, -+N(R6)3, -C(O)N(R6)2, -C(O)OR6, -OC(O)R6, -OC(O)OR6, -OC(O)N(R6)2, -N(R6)C(O)R6, -N(R6)C(O)OR6 y -N(R6)C(O)N(R6)2, donde R6 es tal y como se define en la reivindicacion 1.
  4. 4. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, donde Q es -OH.
  5. 5. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, donde R1 es hidrogeno.
  6. 6. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, donde R3 es hidrogeno o [(L)p-Q].
  7. 7. Compuesto segun la reivindicacion 2, donde Q es -OH, R1 es hidrogeno y R3 es hidrogeno o [(L)p-Q].
    imagen2
  8. 9. Conjugado donde un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 se conjuga con una etiqueta a traves de un grupo funcional Q.
  9. 10. Conjugado segun la reivindicacion 9, donde el grupo funcional Q se conecta a la etiqueta a traves de una unidad
    de conexion de la estructura Q-S-Q, donde Q se define como en la reivindicacion 1, y donde S se selecciona del grupo consistente en grupos alquileno C1 - C200, grupos alquenileno C2 - C200, grupos alquinileno C2 - C200, grupos cicloalquileno C3 - C200, grupos cicloalquenileno C5 - C200, grupos cicloalquinileno C8 - C200, grupos alquilarileno C7 -
    C200, grupos arilalquileno C7 - C200, grupos arilalquenileno C8 - C200, grupos arilalquinileno C9 - C200, donde
    opcionalmente los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos alquilarileno, grupos arilalquileno, grupos arilalquenileno y grupos arilalquinileno son sustituidos, y donde opcionalmente dichos grupos se interrumpen por uno o varios heteroatomos, dichos heteroatomos siendo seleccionados del grupo que consiste en O, S y NR6, donde R6 se define como en la reivindicacion 1.
  10. 11. Conjugado segun la reivindicacion 9 o reivindicacion 10, donde, en el compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, p es 1, L es CH2, R1 es H y R3 es H.
  11. 12. Conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones 9 - 11, donde la etiqueta se selecciona del grupo que comprende fluoroforos, biotina, cadenas de polietilenglicol, cadenas de polipropilenglicol, cadenas mixtas de polietilenglicol/polipropilenglicol, isotopos radiactivos, esteroides, compuestos farmaceuticos, lfpidos, peptidos, glicanos, nucleotidos y etiquetas peptfdicas.
  12. 13. Metodo para preparar un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, el metodo comprende las etapas de:
    (a) Ciclopropanacion de un ciclooctadieno de la Formula (Vila):
    5
    10
    15
    20
    25
    H H
    imagen3
    (Vila)
    donde:
    R1 se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrogeno,
    grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7
    - C24;
    para formar un compuesto de cicloocteno bicfclico,
    (b) Brominacion del compuesto obtenido de cicloocteno bicfclico para formar un compuesto de ciclooctano bicfclico, y
    (c) Deshidrobrominacion del compuesto obtenido de ciclooctano bicfclico para formar un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8.
  13. 14. Metodo para la modificacion de una molecula diana, donde un conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones 9 - 12 reacciona con un compuesto que comprende un 1,3-dipolo o un 1,3-(hetero)dieno.
  14. 15. Metodo segun la reivindicacion 14, donde el compuesto que comprende un 1,3-dipolo es un compuesto que comprende azida, un compuesto que comprende nitrona o un compuesto que comprende oxido de nitrilo.
  15. 16. Uso de un conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones 9 - 12 para el etiquetado bioortogonal, la formacion de imagenes o la modificacion de una molecula diana.
  16. 17. Composicion que comprende un conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones 9 - 12, que comprende ademas un portador farmaceuticamente aceptable.
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