CN103013949B

CN103013949B - 一种乙酰化羟基酸水解酶及其基因和应用

Info

Publication number: CN103013949B
Application number: CN201310011788.1A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 马宝娣; 郁惠蕾; 潘江
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2013-01-11
Filing date: 2013-01-11
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2033-01-11
Also published as: CN103013949A

Abstract

本发明公开了一种乙酰化羟基酸水解酶及其基因和应用。本发明公开了一种新的乙酰化羟基酸水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达体制备该水解酶的方法，以及所述水解酶或重组表达转化体在制备手性羟基酸中的应用。本发明所述乙酰化羟基酸水解酶rPPE01的基因来源于假单胞菌（Pseudomonas sp.）ECU1011，该乙酰化羟基酸水解酶具有很好的热稳定性和有机溶剂耐受性，在羟基酸选择性拆分反应中具有催化效率高，对映选择性强，反应条件温和和环境友好等优点，具有很好的工业应用前景。

Description

一种乙酰化羟基酸水解酶及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种乙酰化羟基酸水解酶及其基因和应用，以及该乙酰化羟基酸水解酶或表达该乙酰化羟基酸水解酶的重组转化体在制备手性羟基酸中的应用。

背景技术

光学纯的手性羟基酸在化工、制药和农药领域中都有重要价值。α-羟基苯乙酸(扁桃酸)及其衍生物，除了在手性中间体的构型鉴定和拆分中有广泛应用，更是化学合成的重要中间体，(R)-扁桃酸可以用于合成半合成抗生素，例如重要抗生素青霉素，头孢拉定的侧链基团；(S)-扁桃酸可以用来合成环戊酮类药物，例如非甾体类消炎药塞来昔布（Celebrex）、德拉昔布（Deracoxib）和重要的药物化工中间体三氟苯丙二醇，而(R)-邻氯扁桃酸是治疗心血管疾病畅销药物氯吡格雷(Clopidogrel)的重要手性前体。其他一些手性羟基酸也都是医药合成中非常重要的手性砌块，比如(R)-2-羟基4-苯基丁酸是合成利斯普利（Lisinopril），雷米普利（Ramipril）等多种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)的重要中间体。

光学活性手性羟基酸可以通过物理方法、化学方法或生物方法得到。物理方法主要是利用色谱法结合光学衍生物拆分，处理量小，成本高，限制了其工业应用。化学方法主要是利用手性拆分试剂进行拆分或利用化学催化剂催化不对称合成，但是存在手性拆分试剂成本高、产品光学纯度较低等问题。目前较具有工业应用价值的是生物催化法制备法，在生物催化法中最具竞争力的是酮还原酶不对称还原相应的酮酸和腈水解酶选择性水解扁桃腈及其衍生物，但是腈水解酶的产物局限于扁桃酸及其衍生物，且其生产过程中涉及到氰化物，为剧毒物质；而还原酶需要添加昂贵的辅因子。因此，在工业应用中相对比较成熟的是基于酯酶催化的乙酰化羟基酸或羟基酸酯的对映选择性水解反应，是一种具有应用潜力的拆分方法。目前已有文献报道(Tetrahedron Lett.2003,44:5477-5481；Tetrahedron1995,51:2403-2416；Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic2007,47(3-4):99-104)证实该途径可行，但是仅仅限于实验室规模，还不适用于工业化生产。本实验室在前期工作中采用传统筛选方法得到一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECU1011(该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.2872)，它能够高活性、高选择性地催化水解(S)-乙酰基扁桃酸及其衍生物，最终得到两种单一构型的扁桃酸及其衍生物，已经申请专利，公开号为CN101538542A。但是野生菌株中酶产量低，且不能对其根据结构信息进行改造，提高其催化性能，至今尚没有一个利用重组酯酶高选择性催化高底物浓度酰基化羟基酸水解转化的方法，也没有一个高效、通用的生产手性羟基酸的方法。

发明内容

因此，本发明所要解决的技术问题是，针对现有的生物催化乙酰化羟基酸水解制备光学纯羟基酸反应中酶催化活性偏低、底物耐受性差、产物光学纯度不够高以及野生菌株中乙酰化羟基酸水解酶的产量较低等问题，提供一种乙酰化羟基酸水解酶及其基因，含有该乙酰化羟基酸水解酶基因的重组表达载体和重组表达转化体，所述乙酰化羟基酸水解酶及整细胞催化剂的制备方法以及所述乙酰化羟基酸水解酶及其基因在制备手性羟基酸中的应用。本发明所述乙酰化羟基酸水解酶具有极好的热稳定性和有机溶剂耐受性，对乙酰化α-羟基酸表现出高度的底物选择性，所得产物光学纯度高。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种分离的蛋白质，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有乙酰化羟基酸水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

所述蛋白质的制备方法较佳地为：从假单胞菌（Pseudomonas sp.）ECU1011中分离获得，或者从重组表达该水解酶的表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。该乙酰化羟基酸水解酶更佳地于假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECU1011制备所得，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.2872。该菌株从土壤中筛选得到，筛选方法在专利CN101538542A中有详细说明。

其中所述蛋白质(b)是在蛋白质(a)的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有乙酰基扁桃酸水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质，其中所述的(几个)是指二个至小于100个，更佳的是小于30个。比如添加一个融合标签，只要该融合蛋白仍然具有乙酰基扁桃酸水解酶活性，且融合方式如上所述，则都可以达到本发明目的。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种分离的核酸，其是如下(1)或(2)的核酸：

(1)由序列表中SEQ ID No:1所示核苷酸序列组成的核酸；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

本发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述核酸的制备方法较佳地包括：从生物体中提取天然存在的乙酰化羟基酸水解酶基因的核酸分子，通过基因克隆技术获得乙酰化羟基酸水解酶基因核酸分子，或者通过人工合成序列的方法得到所述乙酰化羟基酸水解酶基因核酸。

本发明所述核酸的制备方法优选地为：首先设计合成上游引物（其序列如序列表中SEQ ID NO:3所示），和下游引物（其序列如序列表中SEQ IDNO:4所示）：

上游引物：5’-CGGGATCCGGCAGCCCTGGTGTCGAACAACACA-3’；

下游引物：5’-CCGCTCGAGCTGCAAATGCACTTTAAGTTC-3’。

其中，上游引物下划线部分为BamHI酶切位点，下游引物下划线部分为XhoI酶切位点。

以假单胞菌（Pseudomonas sp.）ECU1011的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系较佳地为：2×Taq PCR MasterMix10μl，上游引物和下游引物各0.5μl(0.25μmol/L)，DNA模板0.5μl(约0.05μg)和ddH₂O8.5μl。PCR扩增程序较佳地为：(1)95℃预变性10min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1.0min；其中步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃延伸5min，冷却至4℃。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化、回收，该核酸序列全长948bp，命名为rPPE01，其碱基序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

所述核苷酸序列中的编码序列CDS从第一个碱基起至第948个碱基止，不包括起始密码子和终止密码子。该序列的表达起始密码子和终止密码子借助于表达载体pET-21a***序列上下游的起始密码子和终止密码子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列SEQ ID No:2所示。

如本领域技术人员所知，编码SEQ ID No:2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No:1，另外可以适当引入替换、缺失、改变、***或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID No:1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加获得序列如序列表中SEQ ID No:5所示的核酸分子，编码如序列表中SEQ ID No:6所示蛋白序列。

SEQ ID No:1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、***或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。SEQ ID No:1的同系物还包括一类具有在标准条件下能够与SEQ ID No:1所示序列的多聚核酸进行杂交的碱基序列的多聚核酸，所述标准条件下进行的杂交可根据《分子克隆》(Cold Spring Harbor Laboratory Press)记载的分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)所述的方式进行。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：一种包含上述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明的所述的乙酰化羟基酸水解酶基因或其突变体的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选地为质粒pET-21a(+)。

所述重组表达载体的构建方法为本领域常规质粒克隆方法。所述克隆方法较佳地为：将前述通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET21a(+)分别用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明所述的乙酰化羟基酸水解酶基因的重组表达质粒pET-21a-rPPE01。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是：一种包含上述的组表达载体的重组表达转化体。

其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的乙酰化羟基酸水解酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠埃希氏菌(E.coli)，更佳地为大肠埃希氏菌BL21(DE3)或大肠埃希氏菌DH5α。将前述重组表达质粒pET-21a-rPPE01转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET-21a-rPPE01。所述转化方法为本领域常规转化方法，其较佳地包括化学转化法，热激法或电转法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五是：一种乙酰化羟基酸水解酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：培养如上所述的重组表达转化体，从培养物中获得乙酰化羟基酸水解酶。

其中所述制备方法较佳地为：将上述重组大肠埃希氏菌接种至含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，30～40℃，150～200rpm培养，培养液的吸光密度OD₆₀₀达到0.5~1.0(优选0.8)，加入0.05~1.0mmol/L(优选地为0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16～30℃(优选25℃)，诱导12~16小时即可得到高效表达的上述重组乙酰化羟基酸水解酶。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之六是：上述蛋白质或重组表达转化体作为催化剂，在催化乙酰化羟基酸进行选择性水解反应，制备(R)-乙酰基羟基酸和(S)-羟基酸中的应用。

其中所述的应用较佳地为：在pH为5.0～7.0的缓冲液中，加入本发明所述蛋白质或重组表达转化体以及乙酰化羟基酸，进行选择性水解反应，形成(R)-乙酰基羟基酸和(S)-羟基酸。

其中所述选择性水解反应的通式较佳地如下所示：

其中所述乙酰化羟基酸较佳地为如式1或式2所示的乙酰化α-羟基酸：

其中式1中R较佳地为氢、o-卤素、m-卤素或p-卤素，所述卤素较佳地为Cl，其中n较佳地为0、1或2。

其中所述乙酰化羟基酸优选地为化学式3～9所示的乙酰化α-羟基酸：

其中所述的缓冲液为本领域常规的反应缓冲液。所述缓冲液较佳地为：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。

其中所述缓冲液的pH值较佳地为5.0～7.0，更佳地为6.2；所述反应的温度较佳地为20～60℃，更佳地为50℃，所述乙酰化羟基酸的浓度较佳地为50～300mmol/L，更佳地为50～100mmol/L，优选地为50mmol/L或100mmol/L，所加酶量较佳的为2~10g/L，更佳地为5g/L。所述反应的时间较佳地为1～9小时，更佳地为1～4小时。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的乙酰化羟基酸水解酶表现出较好的热稳定性和有机溶剂耐受性，能够满足工业应用的要求，并且能够高选择性地水解乙酰化α-羟基酸底物。本发明还建立了一种手性拆分乙酰化α-羟基酸制备高光学纯度(R)-乙酰基羟基酸和(S)-羟基酸的方法。该制备方法反应工艺简单，条件温和，催化效率高，产物光学纯度好，对映体过量值(ee)>99%，具有较好的工业应用前景。

附图说明

图1为重组表达质粒pET-21a-rPPE01的构建示意图。

图2为rPPE01基因的PCR扩增DNA片段电泳图谱。其中：1.DNAMarker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)；2.rPPE01基因的PCR扩增产物。

图3为rPPE01的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中：1.重组rPPE01在E.coli BL21(DE3)中表达的破碎上清；2.rPPE01在E.coli BL21(DE3)中表达的破碎沉淀；3.蛋白电泳Marker。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术内容做进一步描述，其目的在于更好的理解本发明的内容，而非限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件，或按照商品说明书选择。

下列实施例中的材料来源为：

假单胞菌（Pseudomonas sp.）ECU1011，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.2872。

表达质粒pET-21a(+)购自于上海Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoRI和XhoI购自大连宝生物有限公司。

实施例1乙酰基扁桃酸水解酶基因的克隆

乙酰基扁桃酸水解酶基因的克隆策略如图1所示。发明人设计并合成了上游引物（其序列如序列表中SEQ ID NO:3所示）和下游引物（其序列如序列表中SEQ ID NO:4所示）：

上游引物：5’-CGGGATCCGGCAGCCCTGGTGTCGAACAACACA-3’；

下游引物：5’-CCGCTCGAGCTGCAAATGCACTTTAAGTTC-3’。

以假单胞菌（Pseudomonas sp.）ECU1011（保藏号为CGMCC No.2872）的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix10μl，上游引物和下游引物各0.5μl(0.25μmol/L)，DNA模板0.5μl(约0.05μg)和ddH₂O8.5μl。

PCR扩增程序为：(1)95℃预变性10min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1.0min；其中步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃延伸5min，冷却至4℃。PCR所得产物凝胶电泳图如图2所示。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化、回收并连接至PMD-18T载体，转化至E.coli DH5α，扩增后挑阳性克隆，经过DNA测序，该序列全长948bp，命名为rPPE01，经测序后表明，其碱基序列如序列表SEQ ID No:1所示，编码蛋白为rPPE01。

实施例2制备乙酰化羟基酸水解酶重组表达载体和重组表达转化体，重组乙酰化羟基酸水解酶粗酶粉以及重组菌冻干细胞

将***rPPE01基因的PMD-18T质粒用BamHI和XhoI双酶切8h，连接至同样经过BamHI和XhoI的pET-21a(+)质粒，转化至E.coli DH5α，挑阳性克隆，得到表达质粒pET-21a-rPPE01，提取扩增后的质粒转化至E.coliBL21(DE3)，挑阳性克隆，得到重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET-21a-rPPE01，用于后续诱导表达。

将上述所得的重组大肠杆菌，接种至含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，去离子水1000ml，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1%(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml摇瓶中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，细胞沉淀用生理盐水洗涤两次，得到湿细胞；将细胞重悬于缓冲液中，在冰浴状态下超声破碎，离心收集上清液，即得重组酶的粗酶液。所得粗酶液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析，其结果如图3所示。将所得湿细胞或粗酶液放入-80℃冰箱预冻过夜，真空条件下冷冻干燥，即得重组水解酶冻干细胞或水解酶的粗酶粉。

实施例3温度对重组rPPE01蛋白对映选择性水解乙酰基扁桃酸的影响

在0.5ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(200mmol/L，pH7.0)中加入5mmol/L乙酰化的扁桃酸，控制不同的反应温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、65℃)，加入1.0g/L如实施例2制备的粗酶粉，启动反应，30min后取样，测定反应初速率和ee值，待反应转化率约为50%时，终止反应，测定最终的ee值。结果如表1所示，最适反应温度为50℃，所得产物ee值为30℃反应的两倍，在该体系中自发水解的速率不到催化反应的0.5%，对最终反应的ee_p影响很小，转化率接近50%时，所有温度下反应的ee_p>99%。

表1温度对rPPE01活性的影响

反应温度(℃)	相对活性(%)
		20	57.7±5.1
30	74.7±3.3
		40	91.4±1.1
50	100.0±3.6
		60	53.2±4.6
65	6.6±3.1

实施例4pH对重组rPPE01对映选择性水解乙酰基扁桃酸的影响

在0.5ml不同pH的缓冲液(200mmol/L，pH5.0~6.4为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH6.0~7.0为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液)中加入5mmol/L乙酰化的扁桃酸，温度控制在50℃，加入1.0g/L如实施例2制备的粗酶粉，启动反应，30min后取样，测定反应初速率和ee值，待反应转化率约为50%时，终止反应，测定最终的ee值，测定结果如表2所示。结果表明，最适pH在5.8~6.2之间，在最适反应pH范围内自发水解的速率也小于催化反应的0.5%，对最终反应的ee_p影响很小，转化率接近50%时，ee_p均大于99%。

表2pH对rPPE01活力影响

实施例5底物浓度对重组rPPE01对映选择性水解乙酰基扁桃酸的影响

向10ml pH为6.2的柠檬酸-柠檬酸钠(50mmol/L)缓冲液中，加入不同浓度的乙酰基扁桃酸钠(50mmol/L、100mmol/L、300mmol/L和500mmol/L)和5mg/ml rPPE01冻干细胞（实施例2制备所得），水浴控制在50℃，磁力搅拌反应，反应过程用1M碳酸钠滴定生成的乙酸，控制反应pH在6.2，反应不同时间取样，测定转化率和ee值，待反应转化率约为50%时，终止反应，测定结果如表3所示。结果表明，在低底物浓度(100mmol/L)下，4小时以内拆分完全，ee_p与ee_s都达到99%以上，提高底物浓度至300mmol/L，与100mmol/L相比，反应时间延长至8.5小时，最终的ee_p为96.5%，ee_s为94.2%，但是当底物浓度提高至500mmol/L，反应到3小时以后，转化率达到14%以后，反应基本停止，不能持续，且最终ee_p仅为92%。主要原因在于底物或产物引起酶活性的丧失。

表3不同底物浓度对拆分反应影响

底物浓度(mM)	反应时间(h)	转化率(%)	ee_s(%)	ee_p(%)
					50	4	49.2	>99	>99
100	4	49.9	>99	>99
					300	8.5	49.6	94.2	96.9
500	8.5	14.1	14.9	92.0

实施例6-12重组乙酰化羟基酸水解酶对映选择性水解乙酰化α-羟基酸

在50ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(50mmol/L，pH6.2)中加入100mmol/L乙酰化的羟基酸和5mg/mL rPPE01冻干细胞，水浴控制在50℃，磁力搅拌反应，反应过程用1mol/L碳酸钠滴定生成的乙酸，控制反应pH在6.2，反应不同时间取样，测定转化率和ee值，待反应转化率约为50%时，终止反应。结果如表4所示。

HPLC分析流速为1ml min^-1，柱温为25℃，检测波长为228nm，所用分析柱以及流动相如下：

实施例6-9，HPLC分析用柱是Chiralcel OD-H，流动性是正己烷:异丙醇:三氟乙酸=94:6:0.1(v/v/v)。

实施例10，HPLC分析用柱是Chiralcel OJ-H，流动性是正己烷:异丙醇:三氟乙酸=89:11:0.1(v/v/v)。

实施11和12，HPLC分析用柱是Chiralpak AD-H，流动性是正己烷:异丙醇:三氟乙酸=96:4:0.1(v/v/v)。

表4rPPE01催化乙酰化羟基酸不对称水解反应结果

实施例13

将实施例1中所得到的rPPE01水解酶的全长序列（SEQ ID No:1）进行适当的碱基突变，包括：C端的15个核苷酸(934-948)的缺失以及第193A、194A、673A和674A分别突变为G、C、C、G，得到的突变序列如序列表中SEQ IDNO:5所示。其编码的蛋白质序列出现了2个氨基酸的突变和五个氨基酸的缺失，其序列如序列表中的SEQ ID NO:5所示。该核酸分子编码的rPPE01突变体蛋白序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。将该突变基因进行如实施例2所述的方法制备重组突变酶、静息细胞和粗酶，按照实施例3～12相同的条件进行反应，所得到产物的光学活性均大于97，实验结果说明所得rPPE01突变体蛋白同样具备乙酰化羟基酸水解酶活性，可以应用到催化拆分手性羟基酸拆分反应中。

对比实施例1

将本发明所得rPPE01催化拆分手性羟基酸拆分与文献报道的拆分催化效果比较，本发明所述乙酰化羟基酸水解酶底物耐受浓度远远高于现有的水解酶，其结果如表5所示。

表5rPPE01催化拆分手性羟基酸拆分与文献报道催化效果比较

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离的蛋白质，其特征在于，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有乙酰化羟基酸水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质，所述蛋白质序列如序列表中SEQ ID No:6所示。

2.一种分离的核酸，其特征在于，其是如下(1)或(2)的核酸：

(1)由序列表中SEQ ID No:1所示核苷酸序列组成的核酸；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

3.一种包含如权利要求2所述核酸的重组表达载体。

4.一种包含如权利要求3所述重组表达载体的重组表达转化体。

5.一种乙酰化羟基酸水解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：培养如权利要求4所述的重组表达转化体，从培养物中获得乙酰化羟基酸水解酶。

6.如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求4所述的重组表达转化体作为催化剂在催化乙酰化羟基酸进行选择性水解反应制备(R)-乙酰基羟基酸和(S)-羟基酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤：在pH为5.0～7.0的缓冲液中，在权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述重组表达转化体的催化下，乙酰化羟基酸进行选择性水解反应，形成(R)-乙酰基羟基酸和(S)-羟基酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述乙酰化羟基酸为如式1或式2所示的乙酰化α-羟基酸：

所述式1中R为氢或氯原子，n为0、1或2。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述式1中R为H、o-Cl、m-Cl或p-Cl。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述缓冲液pH为6.2，所述反应的温度为20～60℃，所述乙酰化羟基酸的浓度为50～300mmol/L。