CN104560800A - 一种苯丙酮酸还原酶及其在不对称合成(r)-苯乳酸中的应用 - Google Patents

一种苯丙酮酸还原酶及其在不对称合成(r)-苯乳酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苯丙酮酸还原酶及其在不对称合成(R)-苯乳酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种新的苯丙酮酸还原酶及其编码基因，所述苯丙酮酸还原酶作为生物催化剂用于不对称还原苯丙酮酸制备(R)-苯乳酸时，所制备的(R)-苯乳酸不仅产物浓度高，而且光学纯度好，不需要额外添加昂贵辅酶，反应条件温和，操作简便，易于放大，因此在生物防腐剂的生产中具有很好的工业应用前景。

Description

一种苯丙酮酸还原酶及其在不对称合成(R)-苯乳酸中的应用
技术领域
本发明涉及一种苯丙酮酸还原酶及其在不对称合成(R)-苯乳酸中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
苯乳酸(Phenyllactic acid，PLA)，又名2-羟基-3苯基丙酸，是丹参素(β-3,4一二羟基苯基乳酸钠)的衍生物，与丹参素有相同的药理功能，可以调节人体内的类固醇的水平和抗血小板聚集的活性。苯乳酸也是合成许多药物的重要中间物，比如：降血糖药恩格列酮(Englitazone)、非蛋白氨基酸施德丁(Statine)、抗艾滋病毒制剂、新型驱肠虫药PFl022A、苯丙氨酸、治疗干燥皮肤的乳膏或制剂等。除此之外，苯乳酸是近年来新发现的新型的生物防腐剂，具有着广泛的抗菌谱，对革兰氏阳性菌(如：金黄色葡萄球菌，单核增生性李斯特菌)，革兰氏阴性菌(如：大肠杆菌，沙门氏菌)和真核微生物(如：曲霉青霉)等均有抑制作用。
苯乳酸的生物合成主要包括发酵法和生物转化法，Kamata M等人利用乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium Lactofermentum)发酵制备(R)-PLA，产物浓度为1.94g/L；2000年，Lavermicoccca P等人发现植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)能用于不对称合成(R)-PLA，产物浓度为0.056g/L；2004年，李德茂等人采用菌株溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)T0l发酵制备(R)-PLA，产物浓度为1.59g/L；2011年，郑兆娟等人采用芽孢乳酸菌(Bacillus coagulans)菌株不对称还原苯丙酮酸制备苯乳酸，产物浓度为37.3g/L；2013年，郁书怀等人将菌株戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)应用于不对称合成苯乳酸，产物浓度为0.9g/L。2013年，郑兆娟等通过定点突变的方法对来源于保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)的羰基还原酶进行了分子改造，在1.5小时内可将50mM苯丙酮酸还原为苯乳酸，且ee>99％。
由以上数据可以看出采用发酵法制备苯乳酸的产率较低，提取困难，而生物转化法制备苯乳酸的底物上载量和产率均有所提高，但是仍不能达到工业化生产的要求，需要进一步开发高效苯丙酮酸还原酶。本发明提供了一种苯丙酮酸还原酶，可以高效不对称还原苯丙酮酸(及其钠盐)生成(R)-2-羟基-3苯基丙酸((R)-PLA)，该反应具有不需外源添加昂贵辅酶，反应条件条件温和，操作简单等优点。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种乳杆菌(Lactobacillus sp.)，该菌于2014年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9967，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述乳杆菌CGMCC No.9967所产的苯丙酮酸还原酶的催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种新的苯丙酮酸还原酶，能以苯丙酮酸或其盐为底物经不对称还原制备(R)-苯乳酸，所述苯丙酮酸还原酶是：(a)由SEQ ID No.2所示氨基酸组成的蛋白质；或(b)由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有苯丙酮酸还原酶活性的衍生蛋白质。
在本发明的一种实施方式中，所述衍生蛋白质具有SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，编码所述苯丙酮酸还原酶的基因具有SEQ ID No.1(LcKAR)所示的碱基序列；或对SEQ ID No.1所示碱基序列的一个或多个碱基进行替换、缺失或增加得到的编码具有苯丙酮酸还原酶活性的蛋白的碱基序列。由于密码子的简并性，编码所述苯丙酮酸还原酶的碱基序列并不局限于SEQ ID No.1，本领域技术人员可以通过适当引入替换、缺失、改变、***或增加来获得该碱基序列的同系物，只要其表达的重组酶保持苯丙酮酸还原活性即可。
在本发明的一种实施方式中，编码所述苯丙酮酸还原酶的基因的碱基序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。
本发明还提供一种包含本发明苯丙酮酸还原酶基因的重组表达载体。可通过本领域常规方法将本发明的苯丙酮酸还原酶基因的核苷酸序列连接于各种合适载体上构建而成，苯丙酮酸还原酶基因可以通过合适的调控序列实现组成型或诱导型表达。所述载体可以是本领域的各种常规载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
在本发明的一种实施方式中，表达载体是质粒，如pET28和pET24，连接苯丙酮酸还原酶基因LcKAR后得到重组表达载体pET28a-LcKAR、pET24a-LcKAR。
本发明还提供了一种包含本发明苯丙酮酸还原酶基因或重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞来制得所述重组表达转化体。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达载体稳定地自行复制，且其所携带的还原酶基因可被有效表达。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主是大肠杆菌如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5a。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主在重组表达苯丙酮酸还原酶基因的同时，还可以同时过表达葡萄糖脱氢酶，构建双酶偶联型辅酶循环***，以实现还原型辅酶的循环供应，降低催化反应的成本。
本发明还提供一种重组苯丙酮酸还原酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，分离纯化获得重组苯丙酮酸还原酶。其中，培养所述重组表达转化体所述的培养基，可选自本领域的常规培养基，前提是使转化体生长并产生本发明的苯丙酮酸还原酶。
在本发明的一种实施方式中，将通过PCR扩增所得的包含苯丙酮酸还原酶基因的PCR产物用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，形成互补的黏性末端，同时将克隆载体片段和表达载体pET28a用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，经T4DNA连接酶连接经过酶切的基因片段和表达载体，形成含有本发明的苯丙酮酸还原酶基因的重组表达质粒pET28-LcKAR。将所述重组表达质粒pET28-LcKAR转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中，即可获得基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-LcKAR，培养该菌可使其发酵生产苯丙酮酸还原酶。
在本发明的一种实施方式中，生产苯丙酮酸还原酶的重组菌是重组大肠杆菌时，优选LB培养基，将重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组苯丙酮酸还原酶。
本发明还提供一种应用所述苯丙酮酸还原酶制备(R)-苯乳酸的方法，是以源于乳杆菌CGMCC No.9967的苯丙酮酸还原酶或其活性突变体，或携带源于乳杆菌CGMCC No.9967的苯丙酮酸还原酶或其活性突变体的菌株为催化剂，催化苯丙酮酸(或钠盐)不对称还原反应制备(R)-苯乳酸，具体的反应条件如底物浓度、pH、缓冲液组成、酶用量等可按本领域此类反应的常规条件进行。所述方法可在振荡或搅拌条件下进行。所述方法的时间优化以转化率>99％为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法，从反应混合液中提取手性醇产物。
在本发明的一种实施方式中，在底物浓度为10mM时，以所述乳杆菌CGMCC 9967的1g湿细胞为生物催化剂，能在12小时内实现苯丙酮酸的转化率达90％，产物的光学纯度为99％ee(R)。
在本发明的一种实施方式中，在pH 5.0～9.0的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD+的存在条件下，以苯丙酮酸还原酶或重组苯丙酮酸还原酶为催化剂，对苯丙酮酸进行不对称还原，制得光学活性(R)-苯乳酸。所述磷酸盐缓冲液可以是本领域常规的任何磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液；磷酸盐缓冲液的浓度可以为50～200mM。不对称还原反应温度可以为20～40℃，优选30℃。底物苯丙酮酸(或钠盐)在反应液中的浓度可以为10～500mM。葡萄糖的用量为15～750mM，NAD+的用量为0～1mM。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种乳杆菌菌株，以及由该菌株表达的苯丙酮酸还原酶，所述菌株或其苯丙酮酸还原酶可以高效催化苯丙酮酸(或钠盐)的不对称还原以制备光学纯(R)-苯乳酸。在底物浓度高达500mM(或92g/L苯丙酮酸钠及81g/L苯丙酮酸)时产物的光学纯度仍达99％ee以上。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，光学纯度好，反应条件温和，环境友好，操作简便，易于放大，在合成新型天然防腐剂和丹参素、恩格列酮等重要药物具有很好的应用前景。
生物材料保藏
乳杆菌(Lactobacillus sp.)，于2014年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9967，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1苯丙酮酸还原酶催化苯丙酮酸(钠)生成(R)-苯乳酸示意图
图2基因LcKAR的PCR扩增电泳图谱。M，Marker；1，LcKAR基因
图3重组表达质粒pET28-LcKAR的构建示意图
图4重组苯丙酮酸还原酶LcKAR的蛋白电泳图。M，Marker；泳道1、2和3分别为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-LcKAR诱导后全细胞、破碎上清和沉淀部分。
图5重组共表达质粒pET24a-gdh-T7-LcKAR的构建示意图
具体实施方式
除非另有注明具体条件，各实施例中的试验方法均按照常规方法和条件或按照试剂说明书进行。除非另有明确标注，各组分的含量均以质量/体积(w/v)含量表示。表达质粒pET28a和pET24a购于上海Novagen公司。E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCRMaster Mix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
苯丙酮酸还原酶的酶活单位1U定义为每分钟转化1μmol底物生成产物所需要的酶量。苯丙酮酸还原酶活力测定方法如下：反应介质：100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0，加入2mM苯丙酮酸，0.1mM NADH，30℃保温2min后加入适量的粗酶液，迅速混匀，实时检测340nm处的吸光值变化。
实施例1乳杆菌CGMCC No.9967的筛选
(1)以苯丙酮酸为底物，从无锡马山分离得到一株能够高效催化苯丙酮酸还原生成(R)-苯乳酸的乳杆菌JNU-KR1002，保藏号为：CGMCC 9967。
(2)乳杆菌CGMCC No.9967催化苯丙酮酸的不对称还原
乳杆菌CGMCC No.9967在MRS培养基(牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖20g/L，醋酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.28g/L，吐温800.1g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH 6.2-6.4)中于37℃培养24小时。所得培养液经离心获得菌体沉淀，以10g/L所述乳杆菌的湿细胞为生物催化剂，在底物浓度为10mM时，能在12小时内使苯丙酮酸的转化率达90％，产物产量1.5g/L，产物的光学纯度为99％ee(R)。该乳杆菌具有>99％的对映选择性，并且保持了>90％的转化率，是一个优良的苯丙酮酸还原酶产生菌。
表1乳杆菌CGMCC 9967对苯丙酮酸的转化
实施例2酮酸还原酶基因的克隆
采用鸟枪法克隆上述乳杆菌CGMCC No.9967中的苯丙酮酸还原酶基因。
(1)首先将上述乳杆菌CGMCC No.9967在含牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L、醋酸钠5g/L、柠檬酸二铵2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.28g/L、吐温800.1g/L、磷酸氢二钾2g/L，pH 6.2-6.4的培养基中于37℃培养24小时。所得培养液经离心获得菌体沉淀，并以本领域常规技术提取获得总DNA。
(2)所得总DNA可采用限制性内切酶进行酶切以形成特定的黏性末端，例如，可通过Sau3AI酶切形成GATC黏性末端。通过控制酶用量和反应时间，把总DNA酶切成2～6kb的片段并进行酶切回收。将这些片段与BamHI(识别序列GGATCC，黏性末端GATC)酶切的pET28a载体以相同的粘性末端高效连接。将酶连产物转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)后，涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，倒置平皿，于37℃培养12～16h后，挑取单菌落进行活性筛选。
(3)用无菌牙签将单菌落接种至LB固体培养基平板进行保存，随后接种至96孔深孔板培养，待OD600达到0.6～0.8时，加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，30℃诱导12小时后，离心培养液收集细胞，用pH 7.0的缓冲液悬浮所得细胞，利用溶菌酶进行细胞破碎后离心，收取上清液，加入甘油至终浓度为10％即为粗酶液，于-80℃保存备用。通过检测340nm处吸光值的变化的方式，利用分光光度计对细胞破碎液进行苯丙酮酸还原酶活力的检测，发现有一个重组菌株的破碎上清液具有显著的苯丙酮酸还原活性。
(4)由上海赛音生物技术有限公司对所得的具有显著苯丙酮酸还原活性的阳性克隆中所***的外源片段进行测序。测序结果表明，外源片段长度为1897bp，利用ORF Finder在线预测开放阅读框，发现其中600～1200bp的开放阅读框只有一个。
(5)根据鸟枪法克隆所得到的开放阅读框为依据，设计引物如下：
上游引物：GGAATTCCATATGATGAAGATTCTAAACAG；
下游引物：CCGCTCGAGTCAGTATCCG CGCGTGAGATC。
其中上游引物划线部分为Nde I酶切位点，下游引物划线部分为Xho I酶切位点。以乳杆菌Lactobacillus sp.CGMCC No.9967的基因组为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系为10×TaqPCR MasterMix 2μl，上下游引物各0.2μl(20μmol/L)，TaKaRa Ex Taq 0.2μl(5U/μl)，DNA模板0.2μl和ddH2O 17.2μl。PCR扩增步骤：(1)95℃，预变性5min(2)94℃，变性30s；(3)52℃退火30s；(4)72℃延伸1min 20s；步骤2-4重复29次；(5)72℃延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖胶回收试剂盒回收700-1000bp区间的条带(图2)，即苯丙酮酸还原酶基因。所得苯丙酮酸还原酶全长基因命名为LcKAR，其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示，全长939bp，其起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，序列中无内含子，编码序列从第1个碱基起至936个碱基止，所编码的蛋白质具有如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
实施例3重组质粒pET28a-LcKAR的构建和重组表达
将实施例2回收的苯丙酮酸还原酶基因LcKAR目标条带在37℃用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切9h，经琼脂糖电泳纯化后，利用琼脂糖胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切的质粒pET28a，在4℃下连接过夜即得到重组质粒pET28a-LcKAR(图3)。将该重组质粒pET28a-LcKAR转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，转化液涂布到含有50mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落进行PCR和酶活验证，获得阳性重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-LcKAR。将所得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LcKAR接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，按3％(v/v)的接种量接入装有80ml LB培养基的500ml三角瓶中，置于37℃、120rpm的摇床培养，当培养液OD660达到0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃诱导5h后收集菌体。将菌体超声破碎后，SDS-PAGE检测其全细胞，上清液和沉淀中的蛋白组成如图4所示，可知来源于乳杆菌CGMCC No.9967的苯丙酮酸还原酶在大肠杆菌中成功得到了异源表达，且绝大部分以可溶蛋白的形式表达，仅有少量的包涵体蛋白，蛋白分子量大小约为38kD。由于该重组酶在N端含有His标签，可以通过常规亲和层析得到相应的纯酶。
实施例4重组质粒pET24a-gdh-LcKAR的质粒的构建
为了实现还原型辅酶的循环供应，降低催化反应的成本，将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH，Genbank accession No.CP010053.1)引入，构建双酶偶联型辅酶循环***。设计引物如下：
上游引物：GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGC；
下游引物：CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGC。
上/下游引物中划线部分分别为限制性内切酶NdeI和HindIII的识别为点。经PCR获得gdh基因的全长序列，将PCR产物和pET24a质粒同时经限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切后得到含有粘性末端的片段和线性化载体，4℃连接过夜，得到重组质粒pET24a-gdh。
根据质粒pET28a-LcKAR的T7启动子及苯丙酮酸还原酶的序列设计引物如下：
上游引物：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAG；
下游引物：CCGCTCGAGTCAGTATCCG CGCGTGAGATC。
其中上游引物划线部分为Not I酶切位点，下游引物划线部分为Xho I酶切位点。以质粒pET28a-LcKAR为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系为10×Taq PCRMasterMix 2μl，上下游引物各0.2μl(20μmol/L)，TaKaRaEx Taq 0.2μl(5U/μl)，DNA模板0.2μl和ddH2O 17.2μl。PCR扩增步骤：(1)95℃，预变性5min(2)94℃，变性30s；(3)52℃退火30s；(4)72℃延伸1min 20s；步骤2-4重复29次；(5)72℃延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖胶回收试剂盒回收1000-1500bp区间的条带，即含有T7启动子的苯丙酮酸还原酶基因。
将回收的含有T7启动子的苯丙酮酸还原酶基因目标条带在37℃用限制性内切酶Not I和Xho I双酶切9h，经琼脂糖电泳纯化后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经限制性内切酶NotI和XhoI双酶切的质粒pET24a-gdh，在4℃下连接过夜即得到重组质粒pET24a-gdh-LcKAR(图5)。
实施例5重组菌E.coli BL21(DE3)/pET24a-gdh-LcKAR的制备及培养
将实施例4所制备的重组质粒pET24a-gdh-LcKAR重新转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组菌E.coli BL21(DE3)/pET24a-gdh-LcKAR。
将上述所得的重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，按3％(v/v)的接种量接入装有80ml LB培养基的500ml三角瓶中，置于37℃、120rpm的摇床培养，当培养液OD660达到0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃诱导5h后收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，将所得的静息细胞冷冻干燥得冻干细胞。
实施例6重组菌催化不对称还原苯丙酮酸生产(R)-苯乳酸
于10ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.0)中加入实施例5所得的菌体1g/L，100μmol苯丙酮酸，150μmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。
底物及产物的检测：反应结束后取一定量的转化液，添加9％HCl调pH至小于2，8000r/min高速离心10min，除去菌体等不溶杂质，进行HPLC分析：日立chromaster(日本)，Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(150mm×4.6mm)；流动相成为甲醇：水：三氟乙酸＝40：60：0.05；流速1ml/min；柱温30℃。苯丙酮酸的检测波长UV 290nm，保留时间为17.5min；苯乳酸的检测波长：UV 210nm，保留时间为9.5min。另一部分转化液8000r/min高速离心10min，充分去除杂质，上清用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，加入过量的无水硫酸镁过夜干燥，将处理后的样品高速离心后进行立体选择性的HPLC分析：Daicel Chiralcel OD-H(250mm×4.6mm)液相色谱柱；流动相为正己烷：异丙醇：三氟乙酸(95:5:0.05，v/v/v)；流速1mL/min，柱温30℃；紫外检测波长210nm；进样量5μL，(R)-苯乳酸的保留时间34.3min。测定结果见表2。
实施例7重组菌催化不对称还原苯丙酮酸生产(R)-苯乳酸
于10ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.0)中加入实施例5所得的菌体10g/L，1mmol苯丙酮酸，1.5mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。
底物及产物含量测定同实施例6。测定结果见表2。
实施例8重组菌催化不对称还原苯丙酮酸生产(R)-苯乳酸
于10ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.0)中加入实施例5所得的菌体20g/L，5mmol苯丙酮酸，7.5mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。
底物及产物含量测定同实施例6。测定结果见表2。
实施例9重组菌催化不对称还原苯丙酮酸生酸产(R)-苯乳酸
于10ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.0)中加入实施例5所得的菌体20g/L，6mmol苯丙酮酸，9.0mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应24h。
底物及产物含量测定同实施例6。测定结果见表2。
实施例10重组菌催化不对称还原苯丙酮酸生产(R)-苯乳酸
于10ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.5)中加入实施例5所得的菌体20g/L，5mmol苯丙酮酸，7.5mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。
底物及产物含量测定同实施例6。测定结果见表2。
实施例11重组菌催化不对称还原苯丙酮酸生产(R)-苯乳酸
于10ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)中加入实施例5所得的菌体20g/L，5mmol苯丙酮酸，7.5mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。
底物及产物含量测定同实施例6。测定结果见表2。
实施例12重组菌催化不对称还原苯丙酮酸钠生产(R)-苯乳酸
于10ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.0)中加入实施例5所得的菌体20g/L，5mmol苯丙酮酸钠，7.5mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。
底物及产物含量测定同实施例6。测定结果见表2。该苯丙酮酸还原酶既可以以苯丙酮酸为底物，又可以以苯丙酮酸钠为底物，不对称还原制备光学纯(R)-苯乳酸。
实施例13重组菌催化不对称还原苯丙酮酸钠生产(R)-苯乳酸
对该重组苯丙酮酸还原酶生产(R)-苯乳酸的效果在100mL体系进行放大。取2g实施例5所得的重组大肠杆菌冻干细胞悬浮于100ml磷酸-磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中，加入9.31g底物苯丙酮酸钠，15g葡萄糖。在30℃，200r/min反应9h。反应结束后用乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，获得8.51g(R)-苯乳酸，ee>99.9％。
表2重组菌催化苯丙酮酸(钠)的不对称还原
实施例14苯丙酮酸还原酶突变酶的构建和重组表达
对于实施案例2所得到的苯丙酮酸还原酶LcKAR全长基因序列(SEQ ID No.1)进行碱基突变，分别将还原酶基因编码序列的第180位的G突变为C，第515位的T突变为C，第543位的C突变为A，第773位的A突变为T，第894位的C突变为T(除515和第773位外，其余均为沉默突变)，从而得到如SEQ ID No.3和SEQ ID No.5所示的突变基因的碱基序列。其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.6，即将乳杆菌的苯丙酮酸还原酶(SEIID No.2)第172为的Phe突变为Ser，以及第258位的Asp突变为Val，因此分别将突变基因所编码的苯丙酮酸还原酶命名为LcKAR/F172S和LcKAR/D258V。如实施例3所述的方法制备重组转化体，并按照实施例4的方法构建与葡萄糖脱氢酶共表达的重组转化体，并按照实例5的方法制备静息细胞，并冷冻干燥得冻干细胞。
实施例15携带突变酶LcKAR/F172S的重组菌催化苯丙酮酸钠的不对称还原
于10ml磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入实施例14所得的含有突变酶(LcKAR/F172S)的菌体0.2g，1mmol苯丙酮酸钠，1.5mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。反应结束后取一定量的转化液，加入9％的HCl调pH至小于2，8000r/min高速离心5min，除去菌体等不溶杂质，采用与实施例6相同的方法进行HPLC分析。结果见表3。含有突变酶(LcKAR/F172S)的重组转化体仅需要3h即可转化100mM 2-氧代-3-苯基丙酸钠，且ee值仍保持>99％(R)。
实施例16携带突变酶LcKAR/F172S的重组菌催化苯丙酮酸钠的不对称还原
于10ml磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入实施例14所得的含有突变酶(LcKAR/F172S)的菌体0.2g，5mmol苯丙酮酸钠，7.5mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。反应结束后取一定量的转化液，加入9％的HCl调pH至小于2，8000r/min高速离心5min，除去菌体等不溶杂质，采用与实施例6相同的方法进行HPLC分析。结果见表3。含有突变酶(LcKAR/F172S)的重组转化体仅需要6h即可转化500mM 2-氧代-3-苯基丙酸钠，且ee值仍保持>99％(R)。与母本相比，该突变体仅需要一半的时间就可以达到相同的转化效果。活力分析显示，该位点的突变使的苯丙酮酸还原酶对苯丙酮酸底物的催化活力提高了4倍，因而在相同催化剂量和底物浓度条件下，仅需更少的时间即可达到相同的效果。
实施例17携带突变酶LcKAR/D258V的重组菌催化2-氧代-3苯基丙酸的不对称还原
于10ml磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入实施例12所得的含有突变酶(LcKAR/D258V)的菌体0.2g，1mmol 2-氧代-3-苯基丙酸钠，1.5mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。反应结束后取一定量的转化液，加入9％的HCl调pH至小于2，8000r/min高速离心5min，除去菌体等不溶杂质，采用与实施例6相同的方法进行HPLC分析。结果见表3。含有突变酶(LcKAR/D258V)的重组转化体在24h内不能转化5100mM 2-氧代-3-苯基丙酸钠，ee值仍保持>99％(R)。该位点的突变导致了苯丙酮酸还原酶活力的降低，仅保留母本的20％的活力，尽管将反应时间延长至24h，仍然不能达到>99％的转化。不过该突变位点对于对映选择性没有影响，仍然保持>99％ee(R)。
表3苯丙酮酸还原酶突变酶对苯丙酮酸的不对称还原
实施例18苯丙酮酸还原酶纯酶催化苯丙酮酸钠的不对称还原
于10ml磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入实施例3所得的重组苯丙酮酸还原酶纯酶50mg，1mmol苯丙酮酸钠，1.5mmol葡萄糖，在30℃，200r/min反应12h。反应结束后取一定量的转化液，加入9％的HCl调pH至小于2，8000r/min高速离心5min，采用与实施例6相同的方法进行HPLC分析。在12h，可以实现100mM苯丙酮酸钠的完全转化，且ee值>99％(R)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种乳杆菌(Lactobacillus sp.)，该菌于2014年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9967，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种苯丙酮酸还原酶，其特征在于，所述苯丙酮酸还原酶是：由SEQ ID No.2所示氨基酸组成的蛋白质；或由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有苯丙酮酸还原酶活性的衍生蛋白质。
3.根据权利要求2所述的苯丙酮酸还原酶，其特征在于，所述衍生蛋白质具有SEQ IDNo.4或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。
4.一种编码苯丙酮酸还原酶的基因，其特征在于，所述基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示；或对SEQ ID No.1所示碱基序列的一个或多个碱基进行替换、缺失或增加得到的编码具有苯丙酮酸还原酶活性的蛋白的碱基序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的碱基序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。
6.一种包含权利要求4或5所述基因的重组表达载体。
7.一种包含权利要求4或5所述基因的重组表达转化体。
8.权利要求1所述乳杆菌在苯丙酮酸还原酶或(R)-苯乳酸的生产中的应用。
9.权利要求2所述苯丙酮酸还原酶在(R)-苯乳酸生产中的应用。
10.一种应用苯丙酮酸还原酶制备(R)-苯乳酸的方法，其特征在于，是以源于乳杆菌CGMCC No.9967的苯丙酮酸还原酶或其活性突变体，或携带源于乳杆菌CGMCC No.9967的苯丙酮酸还原酶或其活性突变体的菌株为催化剂，催化苯丙酮酸或其钠盐不对称还原反应制备(R)-苯乳酸。
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