CN101603044A

CN101603044A - 一种乙醇脱氢酶及其基因和重组酶

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Publication number: CN101603044A
Application number: CNA2009101458745A
Authority: CN
Inventors: 胡又佳; 陈祈磊; 尚珂; 谢丽萍; 朱春宝
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2029-06-10
Also published as: CN101603044B

Abstract

本发明公开了一种乙醇脱氢酶及其基因。该基因是下列核苷酸序列之一：1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列；2)编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还公开了含有该基因的重组表达载体和表达转化体，以及重组乙醇脱氢酶及其制备方法和应用。本发明从高加索乳杆菌(Lactobacillus kefir)DSM 20587基因组中分离出了新的乙醇脱氢酶基因，扩大了乙醇脱氢酶基因的资源，同时为Lactobacilluskefir DSM 20587的代谢工程研究和构建基因工程菌提供了科学依据，也为生物有机合成生产中立体选择性的将带有庞大侧链的酮基化合物转化为相应的醇提供了优良的乙醇脱氢酶。

Description

一种乙醇脱氢酶及其基因和重组酶

技术领域

本发明属于属于生物工程技术领域，特别涉及一种乙醇脱氢酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体，以及一种重组乙醇脱氢酶及其制备方法及应用。

背景技术

乙醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1.)，国外称为alcohol dehydrogenase或keto-reductase，即乙醇脱氢酶(醇脱氢酶，ADH)或酮基还原酶，国内也叫乙醛乙醇脱氢酶。乙醇脱氢酶具有立体专一性地还原前手性羰基化合物的能力，是氧化还原酶类中很重要的一个类别。乙醇脱氢酶可用于高效合成具有光学活性的醇，后者往往是精细化工业生产用关键结构单元。从实际应用的角度看，利用NADH作为辅因子的乙醇脱氢酶尤其具有重要应用价值，原因是在NADH再生方面已经建立起了一种有效的甲酸盐/甲酸脱氢酶***；而相比之下对于NADPH依赖的乙醇脱氢酶，其现有的辅因子再生循环体系的有效性就低很多。

现已有报道发现多种可用于有机合成的乙醇脱氢酶，其中使用最多的是可从商业途径购买得到的来自酵母、马肝和Thermoanaerobium brockii的三种乙醇脱氢酶。这三种酶的底物专一性和立体选择性都有显著区别，但它们都能够还原广泛的酮基化合物。这三种酶也均有着一些局限，例如长期使用的稳定性不足或者接受的底物有限，这些限制了它们在技术上的应用。

到目前为止，已报道的乙醇脱氢酶中能够还原例如苯乙酮及其衍生物这类带有庞大侧链的酮类化合物不多。Hummel等在筛选新的生物催化剂时从高加索乳杆菌Lacobacillus kefir DSM 20587中分离到一种NADPH依赖的乙醇脱氢酶，能够将苯乙酮及其衍生物转化成(R)-醇(Hummel W.New alcoholdehydrogenases for the synthesis of chiral compounds.Adv Biochem EngBiotechnol，.1997；58：145-84)；除此之外，在红串红球菌Rhodococcuserythropolis中发现一种新的NADH依赖的乙醇脱氢酶(RE-ADH)。与L.kefir的NADPH依赖的乙醇脱氢酶相比，该乙醇脱氢酶能够催化还原相似的酮为相应的(S)-醇。Hummel等研究了该NADH依赖的醇脱氢酶的纯化及生化性质，并将其成功应用于生物有机合成。

综上所述，寻找并克隆具有潜在应用价值的乙醇脱氢酶基因，尤其是以NADH作为辅因子的乙醇脱氢酶无论是从扩大基因资源还是实际生产应用的角度都具有重要意义。

高加索乳杆菌Lactobacillus kefir DSM 20587是目前报道的唯一一株能通过自身所携带的S)-ADH和(R)-ADH偶联的两步还原反应，高效、高对映选择性地催化生成6-氯-(3R，5S)-二羟基己酸叔丁酯的菌株(Amidjojo M，Franco-Lara E，Nowak A，Link H，Weuster-Botz D.Asymmetric synthesis oftert-butyl(3R，5S)6-chloro-dihydroxyhexanoate with Lactobacillus kefir.ApplMicrobiol Biotechnol.，2005，69(1)：9-15)，后者是医药工业生产抗胆固醇药物HMG-CoA还原酶抑制剂的重要手性结构单元。目前只有其(R)-ADH基因得到了克隆，尚无关于(S)-ADH基因和酶的相关研究报道(Pfruender H，Amidjojo M，Hang F，Weuster-Botz D.Production of Lactobacillus kefir cells forasymmetric synthesis of a 3，5-dihydroxycarboxylate.Appl Microbiol Biotechnol.，2005，67(5)：619-22.)。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的乙醇脱氢酶在生物有机合成手性化合物中均存在的底物及辅酶依赖类型的局限，提供一种新的优良的乙醇脱氢酶及其基因，含有该基因的重组表达载体、转化体，以及该乙醇脱氢酶的重组酶及其制备方法和应用，该新的乙醇脱氢酶能够依赖NADH，催化还原带有庞大侧链的酮类化合物为相应的醇。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种乙醇脱氢酶基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一：1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列；2)编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明的技术方案之二是提供一种乙醇脱氢酶，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。较佳的该乙醇脱氢酶为来源于Lactobacillus kefir DSM20587菌株的NADH依赖的乙醇脱氢酶。

根据本发明，所述的乙醇脱氢酶基因adh是以能够生物催化产生6-氯-(3R，5S)-二羟基己酸叔丁酯的高加索乳杆菌Lactobacillus kefir DSM 20587菌株总DNA为模板，通过PCR扩增获得的。具体可包括如下步骤：

(1)比对分析现有的已知的细菌乙醇脱氢酶氨基酸序列，找出2块高度保守的氨基酸序列区(BlockS)，两块保守区域分别对应乙醇脱氢酶高度保守的锌离子结合域和辅因子结合域。把这两个保守区域的蛋白质序列转换为简并核苷酸序列，并计算简并度，根据该简并核苷酸序列设计一对简并引物。以Lactobacillus kefir DSM 20587菌株总DNA为模板，用该简并引物进行PCR扩增得到一段DNA序列。测定该PCR产物的DNA序列。

(2)在步骤(1)中测得的DNA序列的5’端和3’端各自设计3个嵌套的特异引物SP1，SP2，SP3和SP1’，SP2’，SP3’，分别与13种简并引物(AP1-AP13)配对，以Lactobacillus kefir DSM 20587菌株总DNA为模板，进行TAIL-PCR扩增，并对产物进行DNA测序，得到步骤(1)中测得的DNA序列两端的侧翼序列。

(3)将步骤(1)中测得的DNA序列与步骤(2)中测得的各TAIL-PCR扩增而得的两端侧翼序列拼接，得到如序列表中SEQ ID No.1所示的带有起始密码子ATG和终止密码子TAG的基因全长序列。

根据本发明，所述的乙醇脱氢酶基因adh全长1044bp，其中A、C、G、T四种核苷酸数目及百分比分别为273(26.1％)、254(24.3％)、260(24.9％)、257(24.6％)。起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。该序列无内含子，具有完整的开放读码框，编码347个氨基酸。编码产物，即本发明乙醇脱氢酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，分子量为37.07kD，等电点pI为5.70。通过美国国立生物技术信息中心序列相似性搜索程序(NCBIBlast)的蛋白质序列比对分析，表明与已登记的乙醇脱氢酶同源性最高为72％，其中与卢特氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri 100-23和Lactobacillusreuteri F275的乙醇脱氢酶氨基酸序列同源性最高，为72％。由此也证明了本发明的乙醇脱氢酶基因是一个新的乙醇脱氢酶基因。

当然，如本领域技术人员所知，本发明乙醇脱氢酶基因也可以是编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。而本发明乙醇脱氢酶不仅限于序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；还可以是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有相同的乙醇脱氢酶活性的由序列2衍生的蛋白质的核苷酸序列，这些氨基酸残基的取代、缺失或添加的情况包括：在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列修饰形式上的差异等情况。相应地，本发明乙醇脱氢酶基因也可以是编码这些本发明乙醇脱氢酶衍生物或类似物的核苷酸序列。

本发明的技术方案之三是提供一种重组表达载体，包含上述的本发明的乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列。该重组表达载体的载体骨架优选原核表达载体，更优选pET-28a(+)。

本发明的技术方案之四是提供一种重组表达转化体，包含上述的任何一种本发明的核苷酸序列或重组表达载体。该重组表达转化体优选细菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21.DE3。

本发明的技术方案之五是提供一种重组乙醇脱氢酶的制备方法，培养上述本发明的重组表达转化体，获取重组的乙醇脱氢酶。本发明的大肠杆菌E.coli BL21.DE3重组表达转化体经IPTG诱导后表达出约44kD的目的蛋白，证实了本发明的乙醇脱氢酶基因是一个具有表达功能的基因。

本发明的技术方案之六是提供所述方法所制备而得的重组乙醇脱氢酶。

本发明的技术方案之七是提供所述的乙醇脱氢酶或重组乙醇脱氢酶在生物有机合成中将羰基化合物转化为相应的醇的应用。较佳的，该酶在生物有机合成中将醛类化合物或带有较大的侧链基团的酮类化合物如苯乙酮及其衍生物如对氯苯乙酮转化还原为相应的(S)-醇。所述的醛类化合物较佳的选自正丙醛、正丁醛、异丁醛、正戊醛、正己醛、正庚醛、苯甲醛、苯乙醛、水杨醛、邻氯苯甲醛、柠檬醛和肉桂醛。所述的酮类化合物较佳的选自环戊酮、3-戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮、苯乙酮和对氯苯乙酮。该酶在生物有机合成中还可以将酯类化合物转化还原为相应的(S)-醇。所述的酯类化合物较佳的是乙酰乙酸乙酯。

本发明提供的乙醇脱氢酶基因还可用于研究的生物代谢途径或构建基因工程菌。所述的生物优选为Lactobacillus kefir DSM 20587菌株。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明从Lactobacillus kefirDSM 20587基因组中分离出了新的乙醇脱氢酶基因，扩大了乙醇脱氢酶基因的资源，同时为高加索乳杆菌Lactobacillus kefir DSM 20587的代谢工程研究和构建基因工程菌提供了科学依据。本发明的分离自Lactobacillus kefir DSM20587的醇脱氢酶(LK-ADH)能够高对映选择性地转化苯乙酮为(S)-苯乙醇，对映体过量值达到99.4％，同时辅酶依赖类型为NADH型，表明该酶是一种NADH依赖的(S)-醇脱氢酶。因此本发明为生物有机合成生产中立体选择性的将羰基化合物、特别是带有庞大侧链的酮基化合物转化为光学纯的醇，如(S)-苯乙醇提供了优良的醇脱氢酶。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和优点。

图1为本发明扩增乙醇脱氢酶基因部分片段的两端侧翼序列的TAIL-PCR反应流程图。

图2为本发明乙醇脱氢酶基因adh全长序列的拼接及TAIL-PCR设计图。

图3为本发明乙醇脱氢酶包涵体透析复性纯化电泳分析图，其中1、2泳道是包涵体洗涤液I和II的洗脱馏分，3泳道显示的是包涵体溶解液蛋白组分，4泳道即是经过透析复性的重组酶液，第5泳道显示的是破壁后得到的上清液中的蛋白。

图4为本发明pET-28a(+)-adh质粒构建图。

图5为LK-ADH不对称还原苯乙酮产物的GC分析。a：(S)-苯乙醇和(R)-苯乙醇标准品(Sigma-Aldrich)；b：反应液样品.苯乙酮，(R)-苯乙醇and(S)-苯乙醇保留时间分别为5.623，7.634，and 7.884min。

图6-1为pH对氧化反应酶活力的影响。

图6-2为pH对还原反应酶活力的影响。

图7-1为温度对氧化反应酶活力的影响。

图7-2为温度对还原反应酶活力的影响。

图8-1为苯乙酮浓度和反应速度的双倒数曲线。

图8-2为异丙醇浓度和反应速度的双倒数曲线。

图9-1为重组酶在-20℃下的稳定性。

图9-2为重组酶25℃下的稳定性。

图9-3为重组酶的热稳定性。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1PCR简并引物的设计

根据GenBank中收录的细菌乙醇脱氢酶蛋白质序列，具体菌种见表1，经Vector NTI Advance 10软件包的AlignX多序列比对程序分析，找出2块高度保守的氨基酸序列区(BlockS)，这两块保守区域分别对应乙醇脱氢酶高度保守的锌离子结合域和辅因子结合域。把这两个保守区域的蛋白质序列转换为简并核苷酸序列，并计算简并度，根据该简并核苷酸序列设计一对简并引物，该引物的序列参见表2及序列表中SEQ ID No.3和4。

表1.设计乙醇脱氢酶基因简并引物所参考的乙醇脱氢酶蛋白的菌种

表2.扩增乙醇脱氢酶的简并引物

注：Y＝C或T；W＝A或T；S＝C或G；K＝G或T；R＝A或G；M＝A或C；B＝G或C或T；H＝A或C或T；D＝A或G或T；V＝A或G或C。

实施例2Lactobacillus kefir DSM 20587菌株基因组总DNA的提取

1)培养Lactobacillus kefir DSM 20587细胞300ml(购自美国国家标准菌种保藏中心，

Number：35411)。

2)3,000g离心10min，重悬于5ml SET溶液。加入溶菌酶(终浓度1mg/ml)，37℃培养1小时。

3)加入1/10体积10％(w/v)SDS及蛋白酶K(终浓度0.5mg/ml)，55℃培养2小时(间或颠倒混匀)。加入1/3体积5M NaCl，1倍体积氯仿，室温培养0.5小时，经常颠倒混匀。

4)4,500g离心15min，将上层水相移入新管。

5)加入1倍体积异丙醇，轻轻颠倒管子混匀，离心后DNA沉淀用70％乙醇洗涤，真空干燥，溶于TE溶液。

实施例3乙醇脱氢酶基因部分片段的PCR扩增

以实施例2所得的Lactobacillus kefir DSM 20587菌株基因组总DNA为模板，用实施例1所设计的引物(由Invitrogen上海英骏生物技术有限公司合成)，进行PCR扩增(扩增反应使用购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司的DR001A PCR试剂盒)反应体系见表3，反应程序如下：

表3.PCR反应体系组成

PCR反应程序：

Step 195℃预变性3min，

Step 295℃变性30sec，

Step 360℃退火30sec，

Step 472℃延伸30sec，

Step 5重复Step2至Step4，总共循环运行30次，

Step 672℃延伸10min，

Step 74℃保持。

实施例4PCR产物的测序

回收实施例3所得的PCR产物，按下列步骤操作：

(1)取实施例3所得的PCR反应液5μl，加入μll 6×loading buffer，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。

(2)将DNA电泳凝胶置于长波紫外灯下，切出含扩增出的DNA片段的凝胶，装入一个预先称重的塑料离心管(购自Eppendorf公司)，称出凝胶的重量。

(3)加入三倍凝胶重量的6mol/L NaI(0.1g凝胶加300μl)，于45℃水浴保温至凝胶完全融化。

(4)加入5μl玻璃奶，旋涡混和器混匀(该玻璃奶由如下步骤制备：10g硅胶(Sigma S5631)悬浮于100ml PBS缓冲液中，静置2h后倾去悬浮物，离心(Beckman Avanti J-25，转子JA17，2000g，2min)弃去上清液，沉淀重新悬浮于3mol/L NaI溶液中，将该溶液分装后在4℃保存)。

(5)置于冰浴中保持10min，并每隔1～2min振荡一次离心管。

(6)离心(台式离心机，13,000r/min，30sec)沉淀玻璃奶，弃去上清液。

(7)加入200μl冷冻保存(-20℃)的New Wash洗脱缓冲液(NaCl50mmol/L；EDTA(pH7.5)2.5mmol/L；Tris(pH7.5)10mmol/L；乙醇50％)，于旋涡混和器悬浮玻璃奶，离心(台式离心机，13,000r/min，30sec)洗涤。此过程需重复三次，最后一次洗涤应尽可能吸干残余在管底的洗脱缓冲液。

(8)加入5μl无菌蒸馏水，振荡使玻璃奶悬浮，放置45℃水浴保温10min，使吸附的DNA被解吸，离心(台式离心机，13,000r/min，30sec)，将上清移入一个新离心管。此过程需重复三次，合并上清。

(9)离心去除可能带入的玻璃奶(台式离心机，13,000r/min，30sec)，将上清移入一个新离心管，即为回收产物。

回收产物与pMD19-T克隆载体连接，连接按照说明书进行。采用的pMD19-T是一种常用的克隆载体，大小为2692bp，具有Amp抗性基因购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司。

连接产物转化E coli DH5α感受态细胞。在含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB筛选平板上进行蓝白斑筛选，并提取白斑菌落质粒进行菌落PCR以鉴定阳性重组子。其中E coli DH5α感受态细胞的制备步骤如下：

(1)用甘油冷冻保存菌液E coli DH5α(购自上海生工生物技术公司)接种2ml LB液体培养基(胰蛋白胨1％；NaCl 0.5％；酵母抽提物1％；pH7.4)，于37℃振荡培养过夜。

(2)以1％的接种量接种装有20ml LB液体培养基的250ml三角瓶，于37℃振荡培养2h左右，控制OD₆₀₀在0.3～0.5。

(3)将菌液移入50ml的无菌塑料离心管(购自Beckman公司)，在冰浴中放置10min。

(4)离心6,000r/min，4℃，10min，回收菌体。

(5)倾去培养液，并将离心管倒置以使最后残留的痕量培养液流尽。

(6)将菌体沉淀悬浮于10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液中，菌体经洗涤后离心回收。

(7)将菌体重新悬浮于10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液中，在冰浴中保持30min。

(8)离心回收菌体细胞，倾去上层溶液并将离心管倒置以使最后残留的溶液流尽。

(9)将菌体悬浮于800μl用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液中，置于4℃或-70℃冰箱保存，即为感受态细胞。

用CaCl₂法转化E coli DH5α感受态细胞，步骤如下：

(1)将上述连接到pMD19-T克隆载体的DNA连接产物用冷却的无菌吸头加入含有上述制备的100μl感受态细胞、置于预先冰浴的塑料离心管(购自Eppendorf公司)中，用手指轻叩离心管底部，小心混匀，在冰浴中保持30min。

(2)将含有DNA连接产物和感受态细胞的离心管在42℃恒温水浴中热激90sec，其间不要摇动离心管。

(3)快速将离心管置于冰浴中保持2min。

(4)加入800μl LB液体培养基，颠倒混匀，37℃，120r/min振荡温育1h使细胞繁殖。

(5)将转化的细胞涂布于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的琼脂平板表面。

(6)将平板置于室温直至液体被吸收。

(7)倒置平板，于37℃培养16h。

阳性重组子的筛选及鉴定：

(1)蓝白斑反应筛选阳性重组子：根据α-互补反应的原理，在附加氨苄青霉素、X-gal和IPTG的琼脂平板上产生的白色菌落为带有重组质粒的菌落，蓝色菌落为带有重新环化载体的菌落，因此白色菌落可初步鉴定为阳性重组子。

(2)阳性重组子的菌落PCR鉴定：挑取白斑菌落，利用通用引物进行PCR。PCR反应程序同上不变，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，电泳显示出与目的DNA大小一致的条带，证明质粒重组正确，是阳性重组子。

DNA序列测定与分析：

阳性重组子由上海英俊生物技术有限公司进行序列测定，即得Lactobacillus kefir DSM 20587菌株的乙醇脱氢酶基因部分片段的DNA序列，即乙醇脱氢酶基因的两块保守区域之间的DNA序列，这两块保守区域分别对应乙醇脱氢酶高度保守的锌离子结合域和辅因子结合域。

实施例5采用TAIL-PCR扩增上述乙醇脱氢酶基因部分片段的两端侧翼序列

根据TAIL-PCR原理，以实施例4最后测定的DNA序列为基础，在其5’端和3’端各自设计3个嵌套的特异引物SP1、SP2、SP3和SP1’、SP2’、SP3’，分别与13种简并引物(AP1-AP13)配对，经过PCR扩增得到其两端的侧翼序列。具体引物序列见表4及序列表中SEQ ID No.5～23。

表4.TAIL-PCR扩增乙醇脱氢酶基因部分片段两端的侧翼序列所用引物

注：N＝A或G或C或T；W＝A或T；S＝C或G。

其中TAIL-PCR原理；本发明表4中所用的引物的设计原则及TAIL-PCR具体实验操作步骤如下：

①TAIL-PCR原理：TAIL-PCR全称为热不对称交错PCR(ThermalAsymmetric Interlaced PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。TAIL-PCR基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(special prime，简称SP1，SP2，SP3，约20bp)，用它们分别和多个具有低Tm值的短的(14bp左右)随机简并引物(Arbitrarydegenerate prime简称AP)相组合，以基因组DNA作为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来进行特异性扩增。通常情况下至少有一种简并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获得已知序列的侧翼序列。TAIL-PCR具体反应流程如图1所示。

②本发明TAIL-PCR特异性引物及随机简并引物设计原则：特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧。每两个引物之间的距离一般以60-100bp为宜。引物设计原则：引物的长度为22-26nt，GC含量45-55％，Tm值60-70℃。随机简并引物按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计，长度为14bp左右，Tm值为30～48℃。为了增加简并引物与目标序列间退火的可能性，除了3′端的3个碱基以外，其它位置的碱基包含简并核苷酸。

③本发明TAIL-PCR具体实验操作步骤如下：

1)基因组DNA的获取。

Lactobacillus kefir DSM 20587菌株基因组总DNA的提取同实施例2。

2)已知序列的确认。

在进行PCR实验之前对实施例4测得的DNA序列进行3次测序，以确保测序结果的可靠性。

3)1st PCR反应。

基因组DNA经OD测定准确定量后，取适量作为模板，以AP引物(13种中的任意一种，以下以AP1引物为例)作为上游引物，SP1或SP1’引物为下游引物，进行1st PCR反应。扩增反应使用购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司的DRR002A PCR试剂盒。

●按下列组份配制1st PCR反应液。

●1st PCR反应条件如下：

94℃ 1min

98℃ 1min

94℃ 30sec；25℃ 3min；72℃ 2～4min

72℃ 10min

4)2nd PCR反应。

将1st PCR反应液稀释50倍后，取1μl作为2nd PCR反应的模板，以AP1引物为上游引物，SP2或SP2’引物为下游引物，进行2nd PCR反应。

●按下列组份配制2nd PCR反应液。

●2nd PCR反应条件如下：

72℃ 10min

5)3rd PCR反应。

将2nd PCR反应液稀释50倍后，取1μl作为3rd PCR反应的模板，以AP1引物为上游引物，SP3或SP3’引物为下游引物，进行3rd PCR反应。

●按下列组份配制3rd PCR反应液。

●3rd PCR反应条件如下：

72℃ 10min

6)取1st，2nd，3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。

7)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3和SP3’为引物对PCR产物进行DNA测序。

实施例6乙醇脱氢酶基因全长序列的拼接、PCR扩增、克隆和测序

在实施例4中测得的DNA序列和实施例5中测得的各TAIL-PCR扩增而得的两端侧翼序列的基础上，结合Blastn、Primer Premier5.0软件及VectorNTI ORF分析，拼接出带有起始密码子ATG和终止密码子TAG的基因全长序列(见图2)。根据拼接而得的序列设计全长验证引物ADH-正向和ADH-反向(见表5及序列表中SEQ ID No.24和25)，以Lactobacillus kefir DSM 20587菌株基因组总DNA为模板扩增全长乙醇脱氢酶基因。PCR反应条件为95℃3min，95℃30sec，56℃1min，72℃1min30sec，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物克隆到pMD19-T载体进行序列验证。通过测定该PCR产物的序列，与拼接所得的序列进行比对后表明两者的核苷酸序列完全一致。

表5.扩增乙醇脱氢酶基因全长序列所用引物

上述所得的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。基因全长1044bp，其中A、C、G、T四种核苷酸数目及百分比分别为273(26.1％)、254(24.3％)、260(24.9％)、257(24.6％)。该序列无内含子，具有完整的开放读码框，编码347个氨基酸。编码产物的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，分子量为37.07kD，等电点pI为5.70。

将所得的基因的序列上传到http://www.ncbi.nlm.gov网站上用BLAST程序进行序列同源性比较和打分。通过NCBI Blastn和Blastp核酸及蛋白质序列比对分析，在GenBank数据库里找不到完全相同的序列。在已登记的蛋白质数据库中，LK-ADH与所有序列的同源性均不超过78％，其中与短乳杆菌L.brevis ATCC 367编码的锌依赖醇脱氢酶(LB-ADH)同源性为78％(GenBank登录号YP_795041)；与卢特氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri 100-23编码的含锌醇脱氢酶(LR-ADH)的同源性为72％(GenBank登录号ZP_01273263)。LK-ADH与上述同源性最高的两种蛋白的序列，在保守域位置(锌离子结合位点和辅因子的结合区域)呈现出高度的同源性，仅在一个残基位置有差别。由此也证明了本发明的乙醇脱氢酶基因是一个新的乙醇脱氢酶基因。

实施例7表达载体和转化体的构建

根据pET-28a(+)表达载体的多克隆位点序列，在乙醇脱氢酶基因adh的起始密码子ATG处引入BamHI酶切位点，在终止密码子TAG处引入HindIII酶切位点，设计并合成引物(见表6及序列表中SEQ ID No.26和27)。以Lactobacillus kefir DSM 20587菌株基因组总DNA为模板，PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min 10sec，总共循环运行30次，最后72℃延伸10min。回收PCR产物，经BamHI和HindIII双酶切，再经过胶回收，与同样用BamHI和HindIII双酶切且胶回收的pET-28a(+)质粒(购于Novagen公司)于16℃连接16h，制得重组质粒pET-28a(+)-adh，质粒构建图见图4。将该连接产物转化E coli DH5α感受态细胞。连接产物用CaCl₂法转化E.coli DH5α感受态细胞后涂布到含50μg/mL的卡那霉素抗性平板上。提取抗性平板上长出的转化子的质粒(具体步骤见下文)，用BamHI与HindIII进行酶切验证。

表6.乙醇脱氢酶基因表达用引物

下划线处为酶切位点BamHI(正向)和HindIII(反向)。

重组转化子质粒的提取步骤：

1)从生长过夜的转化平板上挑单菌落接种含5ml LB和50μg/ml的卡那霉素的试管，37℃振荡培养过夜；

2)吸取1ml菌液于eppendorf离心管，离心(Eppendorf 5415R型，13000r/min，1min，下同)，弃上清液，真空吸干残余液体；

3)将沉淀重新悬浮于100μl Solution I溶液，于旋涡混和器上振荡使菌体分散，置于冰浴；

4)加入200μl新鲜配制的Solution II溶液，盖紧盖子后，颠倒管子数次使Solution II溶液与菌体充分接触，以便细胞裂解，冰浴3-5min；

5)加入150μl预先冰浴的Solution III溶液，剧烈振动管子使之充分混和，置于冰浴3～5min；

6)离心10min，将上清液移至另一离心管，加入2倍体积乙醇，-20℃放置30min；

7)离心10min，弃上清液。沉淀用70％乙醇洗涤一次，于真空干燥器中干燥，加入25μl TE缓冲液溶解沉淀得到重组转化子质粒。

Solution I溶液(mmol/L)：葡萄糖50，EDTA 10，Tris-Cl 25，pH 8.0。

Solution II溶液：NaOH 0.2mol/L，SDS 1(w/v)％。

Solution III溶液：5mol/L醋酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，TE缓冲液(mmol/L)：Tris-HCl 10，EDTA 1，pH 8.0。

经验证正确的转化子质粒再采用CaCl₂法转化E.coli BL21.DE3(美国Novagen公司)感受态细胞，经抗性培养基筛选得阳性克隆并进行酶切分析鉴定，证明含有正确的***片段，得到用于基因表达的转化菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-adh(上述大肠杆菌感受态细胞的制备及CaCl₂法转化的具体的步骤参见实施例4)。

实施例8重组乙醇脱氢酶的表达(重组乙醇脱氢酶粗酶液的提取)

(1)接种实施例7制得的基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-adh于含有卡那霉素(50μg/mL)抗生素的LB液体培养基中，37℃培养16h。将培养液以1％的接种量转接新鲜的LB液体培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.6后，加入IPTG至终浓度为1mM进行诱导表达4h。

(2)吸取1ml诱导后的菌液于eppendorf离心管4℃，13,200rpm离心10min弃上清液；

(3)加入0.5ml pH6.0磷酸钠缓冲液(含MgCl₂1mM)重悬，重复步骤(2)对菌体洗涤一次后再次加入0.5ml pH6.0磷酸钠缓冲液(含MgCl₂ 1mM)重悬；

(4)置于冰浴中超声波破壁3min(250W，工作5s，间歇5s)。细胞破碎液4℃，13,200rpm离心20min。

(5)超声波破壁后得到的沉淀加入1ml包涵体洗涤液I，反复吹吸后于16,100g 4℃离心20min(Eppendorf5415R小型冷冻高速离心机)，去上清后加入1ml包涵体洗涤液II同法进行第二次洗涤。

(6)洗涤后的包涵体沉淀加入5ml包涵体溶解液，室温放置约2h并不时搅动帮助溶解直至全溶。4℃16,100g离心20min，吸出上清得到较纯的包涵体蛋白液。

(7)包涵体蛋白液装入处理过的透析袋于4℃进行逐级透析，透析液分别含尿素4M，2M，1M和0M。各级透析分别持续8～16h。最后一轮为不含尿素的透析，透析液根据需要选择不同pH值的缓冲液。

包涵体洗涤液：

洗涤液I：

Tris pH8.0 50mmol/L EDTA 1mmol/L

Triton X-100 0.5％尿素 2mol/L

洗涤液II：

Tris pH8.0 50mmol/L EDTA 0.5mmol/L

尿素 1mol/L

包涵体溶解液：

磷酶钾缓冲液

pH6.0 0.1mol/L 尿素 8mol/L

MgCl₂ 1mmol/L

通过SDS-PAGE分析发现只需经过透析复性，目的蛋白就已经达到足够的纯度。将分离纯化各步骤的蛋白样品进行SDS-PAGE分析结果如图4-4所示。第5泳道显示的是破壁得到的上清蛋白，1、2泳道是包涵体洗涤液I和II的洗脱馏分，3泳道显示的是包涵体溶解液蛋白组分，4泳道即是经过透析复性的重组酶液。纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE电泳胶上呈一条带，灰度扫描显示纯度在95％以上，用Bradford法测得浓度0.84mg/ml。本发明以下的实施例中所用的酶液都是该酶液。

实施例9辅酶依赖类型的测定

方法：以苯乙酮为底物，分光光度计340nm(ε340＝6.22mmol/L-1cm-1)下检测醇脱氢酶催化还原反应活性。活性检测条件为：30℃，反应体系总体积1ml，含有：10mmol/L苯乙酮；100mmol/L pH6.0的磷酸钾缓冲液；0.25mmol/L NADH(或NADPH)；以及0.2ml的酶液。加入酶液后反应开始计时，测定340nm吸光值在1min内的变化。

酶活力定义：在30℃下，每分钟催化转化1μmol的NADH(或NADPH)的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

酶活的计算公式为：酶活(U)＝EW×V/6.22

(EW为1min内340nm吸光度的变化；V为反应液的体积，ml；6.22，摩尔消光系数)

结果：为了确定醇脱氢酶LK-ADH的辅酶依赖类型，分别以NADH和NADPH为辅酶按照上述方法分别测得LK-ADH对于苯乙酮的活性为7.23×10^-2U/ml酶液和0.90×10^-2U/ml酶液，前者是后者的8倍。该结果表明：克隆到的高加索乳杆菌L.kefir DSM 20587的LK-ADH是一种NADH依赖型醇脱氢酶。

本发明以下的实施例中测定酶活采用的都是实施例9中的方法。

实施例10对映选择性的测定

方法：以苯乙酮为底物测定醇脱氢酶LK-ADH在不对称还原反应中的对映选择性。

反应体系总体积1ml，含有：0.20mmol/L NADH；7.7μl异丙醇(0.1mol/L)；1.2μl苯乙酮(10mmol/L)176μl 100mmol/L pH6.0的磷酸钾缓冲液(含1mmol/L MgCl₂)；800μl纯化的醇脱氢酶LK-ADH(5.6U/ml)。混匀后于30℃振荡反应4h，4,000rpm离心20min，取上清液用1倍体积氯仿抽提。得到的氯仿层萃取液用于气相色谱分析，根据峰面积计算产物光学纯度(对映体过量值，e.e值)，并由此确定醇脱氢酶LK-ADH的对映选择性。

气相色谱分析方法：

气相色谱仪： Agilent 6890色谱工作站

手性色谱柱： CP-Chirasil-DEX CB column(25m；diameter：25μm)

柱温程序： 5min at 60℃，5℃/min to 195℃

载气流速： 1.3ml/min

载气：氦气

进样量： 1μl

检测器 FID

按照上述方法，醇脱氢酶LK-ADH气相色谱分析结果见图5。

反应4h后，苯乙酮(保留时间：5.623min)峰面积＝23.88；(R)-苯乙醇(Sigma-Aldrich)(保留时间：7.634min)峰面积＝1.42；(S)-苯乙醇(Sigma-Aldrich)(保留时间：7.884min)：峰面积＝462.28。重组醇脱氢酶LK-ADH在不对称还原苯乙酮的反应中光学对映选择性为S-构型。其中：

对映体过量值(e.e值)＝(462.28-1.42)/(462.28+1.42)×100％＝99.4％。

实施例11底物特异性试验

方法：按照下述方法，分别测试纯化后的醇脱氢酶LK-ADH与一系列醇类化合物的氧化反应活性以及与一系列酮、醛类化合物的还原反应活性。

氧化反应以对异丙醇的酶活为100％计算相对活性；还原反应以对苯乙酮的酶活为100％计算相对活性。所有底物终浓度均为10mmol/L。

1.氧化反应

以异丙醇为底物，分光光度计340nm(ε340＝6.22mmol/L-1cm-1)下检测醇脱氢酶氧化反应活性。活性检测条件为：30℃，反应体系总体积1ml，含有：10mmol/L异丙醇；100mmol/L pH6.0的磷酸钾缓冲液；0.25mmol/L NAD+；以及0.2ml的酶液。加入酶液后反应开始计时，测定340nm吸光值在1min内的变化

2.还原反应

以苯乙酮为底物，分光光度计340nm(ε340＝6.22mmol/L-1cm-1)下检测醇脱氢酶还原反应活性。活性检测条件为：30℃，反应体系总体积1ml，含有：10mmol/L苯乙酮；100mmol/L pH6.0的磷酸钾缓冲液；0.25mmol/L NADH；以及0.2ml的酶液。加入酶液后反应开始计时，测定340nm吸光值在1min内的变化

结果：按照上述方法，以一系列醇类化合物以及酮、醛类化合物分别测定了醇脱氢酶LK-ADH在氧化反应及还原反应中的底物特异性，结果见表7。

表7.醇脱氢酶LK-ADH的底物特异性

通过底物特异性的测定发现醇脱氢酶LK-ADH普遍对所测醛类化合物表现出相对较高的活性，另外带有较大的侧链基团的酮类化合物如苯乙酮及其衍生物如对氯苯乙酮也能够被该酶有效的转化还原为相应的醇。

实施例12酶的最适反应pH值

方法：

(1)将酶液配制成不同的pH体系，分别为：3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6和8.0。其中pH值为3.6到5.6的酶液用100mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制，pH值为6.0到8.0的酶液用100mmol/L的磷酸钾缓冲液配制。

(2)分别测定氧化反应和还原反应中纯化的重组酶于不同pH条件下对应的剩余酶活力。

(3)以最高酶活为100％，计算并绘制酶在不同pH值下的活力变化曲线，研究酶促反应的最适pH。

结果：按照上述方法进行氧化反应和还原反应时酶的最适反应pH值的实验，结果如图6-1和6-2所示。从实验数据可以看出氧化反应时该酶的最适反应pH值在5.6左右，当反应pH降低到4.0以下或调节到6.6以上，酶活力迅速下降。还原反应时酶的最适反应pH值为5.0左右，同样当反应pH降低到4.0以下或调节到中性7.0以上，酶活力迅速下降。

实施例13酶的最适反应温度

方法：

(1)使用4℃冰浴及不同的水浴温度：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃、70℃。

(2)将酶液在100mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)中置于上述不同温度保温10min，取样测定还原反应中其对应的剩余酶活力。

(3)将酶液在100mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.6)中置于上述不同温度保温10min，取样测定氧化反应中其对应的剩余酶活力。

(4)以最高酶活值为100％，计算并绘制酶在不同温度下的活力变化曲线，考察酶的最适反应温度。

结果：按照上述方法进行酶的最适反应温度的实验，结果如图7-1、7-2所示。实验数据显示氧化反应和还原反应时该酶均在35℃左右表现的活力最高。在30℃～50℃范围内，LK-ADH的活性无论是在氧化反应还是还原反应中都较稳定，温度超过50℃酶活性显著降低。

实施例14不同类型添加剂对酶活力的影响

方法：分别测定了几种常用金属离子、金属离子螯合剂、表面活性剂、蛋白质变性剂、巯基还原剂对酶活性的影响。测试条件：按照实施例9的方法，在pH5.0的100mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液反应体系中加入终浓度为10mmol/L的添加剂与酶液在35℃保温10min后加入底物苯乙酮，考察不同添加物质对酶活力的影响。以不含添加物的反应体系为100％酶活对照计算相对活性。所测试物质为：

(1)金属离子对酶活的影响

K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺(1mmol/L)、Fe³⁺、Zn²⁺，Cu²⁺(10μmol/L)。

(2)其他添加剂对酶活力的影响

尿素、吐温-80(Tween-80)、二甲亚砜(DMSO)、乙二胺四乙酸(EDTA)、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、十二烷基磺酸钠(SDS)。

结果：按照上述方法测定了几种金属离子、金属离子螯合剂、表面活性剂、蛋白质变性剂、巯基还原剂对酶活性的影响，结果见表8。

表8.不同类型添加剂对酶活力的影响

实施例15动力学常数K_m的测定

方法：在pH5.0的100mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系中，将酶液与不同浓度的底物苯乙酮(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mmol/L)作用，测定酶还原反应的初速度；在pH5.6的100mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系中，将酶液与不同浓度的底物异丙醇(0.2、0.5、1、2、5、10mmol/L)作用，测定酶氧化反应的初速度，分别用Lineweaver-Burk双倒数作图法作图。

得方程式：Y＝BX+C 其中B＝K_m/V_max；C＝1/V_max

以此求出以苯乙酮为底物的还原反应K_m值和以异丙醇为底物的氧化反应K_m值。

结果：

(1)还原反应K_m

以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mmol/L苯乙酮作为底物，测定底物反应速率(表9-1)，用Lineweaver-Burk双倒数作图法以最大反应速率的倒数和底物浓度的倒数作图(见图8-1)，得方程式：y＝80.49x+1.4537；计算得到还原反应：K_m＝55.37mmol/L。

表9-1.测定还原反应K_m值的最大反应速度

底物浓度(mmol/L)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
底物浓度(mmol/L)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	V_max(×10^-2U/mg.min)	1.210	2.493	3.720	4.255	5.780	6.406	7.194	9.191	9.708	10.905

(2)氧化反应Km

以0.2、0.5、1、2、5、10mmol/L异丙醇作为底物，测定底物反应速率(表9-2)，用Lineweaver-Burk双倒数作图法以最大反应速率的倒数和底物浓度的倒数作图(见图8-2)，得方程式：y＝103.18x+1.1646；计算得到氧化反应：Km＝88.60mmol/L

表9-2.测定氧化反应K_m值的最大反应速度

底物浓度(mmol/L)	0.2	0.5	1	2	5	10
底物浓度(mmol/L)	0.2	0.5	1	2	5	10	V_max(×10^-3U/mg.min)	1.923	5.319	7.353	25.641	50.012	83.333

实施例16酶的稳定性

方法：

(1)-20℃冷冻保藏酶活力的变化

将酶液置于-20℃冰箱冷冻保藏，每周取样一次，于35℃，100mmol/LpH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系中测定酶活力。以酶活最高者为100％，考察酶在-20℃下的稳定性。

(2)25℃常温保温对酶活力的影响

将酶液置于25℃水浴中保温，每隔一段时间取样测量酶活力。以酶活最高者为100％，考察酶在25℃时的稳定性。

(3)酶在不同温度下的热稳定性

将酶液在100mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)中分别在25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃保温1h，取样测量酶的剩余活力。以酶活最高者为100％，考察酶的热稳定性。

结果：

(1)-20℃冷冻保藏酶活力的变化

按照上述方法-20℃冷冻保藏下酶活随时间的变化，结果如图9-1所示。在冷冻的情况下该酶在保藏2周时间内活性能保持90％以上，保藏4周后剩余约70％活力，保藏5周后仍剩余50％活力，说明该酶可以在冷冻情况下短期存储。

(2)25℃常温保温对酶活力的影响

按照上述方法进行25℃保温对酶活力影响的实验，结果如图9-2所示。该酶在25℃保温的前4h内活性下降较少，4h时剩余96％的活力；在24h后，酶活力仍有90％剩余，保温2d后，酶的剩余活力减少为原来的约50％，之后酶活继续下降。

(3)酶在不同温度下的热稳定性

对重组醇脱氢酶在不同温度下的热稳定性进行了考察，结果如图9-3所示。酶在20、25、30、35℃保温1h后活力均没有明显的降低，35℃保温1h后剩余活力为原来的95％，温度达到45℃后保温1h酶活骤降为原来的11％，表明35～40℃是该酶耐受温度的极限范围。

序列表

<110>上海医药工业研究院

<120>一种乙醇脱氢酶及其基因和重组酶

<130>P4-091325C

<150>CN200810038752.1

<151>2008-06-10

<160>27

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1044

<212>DNA

<213>高加索乳杆菌(Lactobacillus kefir)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1041)

<400>1

atg aaa tca acc att ttt gta aaa cct ggc aaa gtt gaa att caa aac 48

Met Lys Ser Thr Ile Phe Val Lys Pro Gly Lys Val Glu Ile Gln Asn

1 5 10 15

att gac aag cca acc att caa gct gat gat gac gca att tta cac att 96

Ile Asp Lys Pro Thr Ile Gln Ala Asp Asp Asp Ala Ile Leu His Ile

20 25 30

gtt cga gct tgt gtc tgt gga tca gac tta tgg gct tat cgt gat tta 144

Val Arg Ala Cys Val Cys Gly Ser Asp Leu Trp Ala Tyr Arg Asp Leu

35 40 45

gaa gat aag gag ccg aat tct gag aat acc ggc cac gaa gca atc gca 192

Glu Asp Lys Glu Pro Asn Ser Glu Asn Thr Gly His Glu Ala Ile Ala

50 55 60

att gtc gac caa gtc ggt aaa aat att aca act gtc aag ccg gga gac 240

Ile Val Asp Gln Val Gly Lys Asn Ile Thr Thr Val Lys Pro Gly Asp

65 70 75 80

ttt gta atc gca cca ttt acc cac ggc tgc ggt cat tgt gct gcc tgc 288

Phe Val Ile Ala Pro Phe Thr His Gly Cys Gly His Cys Ala Ala Cys

85 90 95

cgt gcc ggt tac gaa gga agc tgt cag agt cat agc gac aac ttt agt 336

Arg Ala Gly Tyr Glu Gly Ser Cys Gln Ser His Ser Asp Asn Phe Ser

100 105 110

gct ggt tat caa gcc gaa tac gtt cgt tac cag cat gcc gag tgg tca 384

Ala Gly Tyr Gln Ala Glu Tyr Val Arg Tyr Gln His Ala Glu Trp Ser

115 120 125

ctg gtt aag att cca ggc aaa cct gaa gac tat agt gac ggc atg tta 432

Leu Val Lys Ile Pro Gly Lys Pro Glu Asp Tyr Ser Asp Gly Met Leu

130 135 140

aat tcg tta ctg act ctc gca gac gtc atg gca acc ggc tat cat gct 480

Asn Ser Leu Leu Thr Leu Ala Asp Val Met Ala Thr Gly Tyr His Ala

145 150 155 160

gcc cgt gtc gcc aac gtt aag ccc ggt gat aca gtc gtc gtt gtc ggt 528

Ala Arg Val Ala Asn Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Val Val Val Gly

165 170 175

gac ggt gct gtc ggc ctt tgc ggt gta atc gcc tca cag atg cgt ggc 576

Asp Gly Ala Val Gly Leu Cys Gly Val Ile Ala Ser Gln Met Arg Gly

180 185 190

gca agc cga atc att gca atg agc cgc cat gag gac cgt caa aag ctg 624

Ala Ser Arg Ile Ile Ala Met Ser Arg His Glu Asp Arg Gln Lys Leu

195 200 205

gca acc gaa ttt ggg gca acc gat att gtc cct gaa cgt ggt gac gaa 672

Ala Thr Glu Phe Gly Ala Thr Asp Ile Val Pro Glu Arg Gly Asp Glu

210 215 220

gcc gtc gct aag gtt atg gct tta acc aac ggc gcc ggc gcc gat gct 720

Ala Val Ala Lys Val Met Ala Leu Thr Asn Gly Ala Gly Ala Asp Ala

225 230 235 240

gtt ctt gag tgt gtt ggc tct gaa tta tca acc gat acc gca atg aaa 768

Val Leu Glu Cys Val Gly Ser Glu Leu Ser Thr Asp Thr Ala Met Lys

245 250 255

gtt gcc cgt cca ggt gca acc gtc ggc cga gtt ggc ctg cct cat aca 816

Val Ala Arg Pro Gly Ala Thr Val Gly Arg Val Gly Leu Pro His Thr

260 265 270

aaa aag acc gat tta acg aac tca ttt tac agt aac ctg gca att gcc 864

Lys Lys Thr Asp Leu Thr Asn Ser Phe Tyr Ser Asn Leu Ala Ile Ala

275 280 285

ggt ggt ccc gct tct gta acc acc tat gac aaa tca gtt ctg cta aag 912

Gly Gly Pro Ala Ser Val Thr Thr Tyr Asp Lys Ser Val Leu Leu Lys

290 295 300

gcg gtc ttg gat ggc gat att cac cca ggc aag gtc ttt acc aag cgc 960

Ala Val Leu Asp Gly Asp Ile His Pro Gly Lys Val Phe Thr Lys Arg

305 310 315 320

ttt acg ctc gat gaa att gat gat gcc tac cag gcc atg gcc aaa cgt 1008

Phe Thr Leu Asp Glu Ile Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Met Ala Lys Arg

325 330 335

gaa gca atc aaa tcg ttg gtt gtc gct caa aaa tag 1044

Glu Ala Ile Lys Ser Leu Val Val Ala Gln Lys

340 345

<210>2

<211>347

<212>PRT

<213>高加索乳杆菌(Lactobacillus kefir)

<400>2

Met Lys Ser Thr Ile Phe Val Lys Pro Gly Lys Val Glu Ile Gln Asn

1 5 10 15

Ile Asp Lys Pro Thr Ile Gln Ala Asp Asp Asp Ala Ile Leu His Ile

20 25 30

Val Arg Ala Cys Val Cys Gly Ser Asp Leu Trp Ala Tyr Arg Asp Leu

35 40 45

Glu Asp Lys Glu Pro Asn Ser Glu Asn Thr Gly His Glu Ala Ile Ala

50 55 60

Ile Val Asp Gln Val Gly Lys Asn Ile Thr Thr Val Lys Pro Gly Asp

65 70 75 80

Phe Val Ile Ala Pro Phe Thr His Gly Cys Gly His Cys Ala Ala Cys

85 90 95

Arg Ala Gly Tyr Glu Gly Ser Cys Gln Ser His Ser Asp Asn Phe Ser

100 105 110

Ala Gly Tyr Gln Ala Glu Tyr Val Arg Tyr Gln His Ala Glu Trp Ser

115 120 125

Leu Val Lys Ile Pro Gly Lys Pro Glu Asp Tyr Ser Asp Gly Met Leu

130 135 140

Asn Ser Leu Leu Thr Leu Ala Asp Val Met Ala Thr Gly Tyr His Ala

145 150 155 160

Ala Arg Val Ala Asn Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Val Val Val Gly

165 170 175

Asp Gly Ala Val Gly Leu Cys Gly Val Ile Ala Ser Gln Met Arg Gly

180 185 190

Ala Ser Arg Ile Ile Ala Met Ser Arg His Glu Asp Arg Gln Lys Leu

195 200 205

Ala Thr Glu Phe Gly Ala Thr Asp Ile Val Pro Glu Arg Gly Asp Glu

210 215 220

Ala Val Ala Lys Val Met Ala Leu Thr Asn Gly Ala Gly Ala Asp Ala

225 230 235 240

Val Leu Glu Cys Val Gly Ser Glu Leu Ser Thr Asp Thr Ala Met Lys

245 250 255

Val Ala Arg Pro Gly Ala Thr Val Gly Arg Val Gly Leu Pro His Thr

260 265 270

Lys Lys Thr Asp Leu Thr Asn Ser Phe Tyr Ser Asn Leu Ala Ile Ala

275 280 285

Gly Gly Pro Ala Ser Val Thr Thr Tyr Asp Lys Ser Val Leu Leu Lys

290 295 300

Ala Val Leu Asp Gly Asp Ile His Pro Gly Lys Val Phe Thr Lys Arg

305 310 315 320

Phe Thr Leu Asp Glu Ile Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Met Ala Lys Arg

325 330 335

Glu Ala Ile Lys Ser Leu Val Val Ala Gln Lys

340 345

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>adh-5’端引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(3，6，11，12，13，14，15，18，20，21)

<223>h＝a或c或t；y＝c或t；s＝c或g；m＝a或c；w＝a或t；b＝g或c或t

<400>3

gghcaygaag shdyhggmaw bgt 23

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>adh-3’端引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，4，6，7，8，10，13，14，15，16)

<223>v＝a或g或c；r＝a或g；s＝c或g；k＝g或t；y＝c或t；m＝a或c

<400>4

vccrassscr ccrkymcc 18

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SP1

<400>5

ttcggcttga taaccagcac taa 23

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SP2

<400>6

aaccagcact aaagttgtcg ctatga 26

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SP3

<400>7

tggtgcgatt acaaagtctc ccg 23

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SP1’

<400>8

cgttaccagc atgccgagtg 20

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SP2’

<400>9

catgccgagt ggtcactggt taa 23

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SP3’

<400>10

atgctgcccg tgtcgccaac 20

<210>11

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP1

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，7，8，11，13)

<223>n＝a或g或c或t；s＝c或g；w＝a或t

<400>11

ngtcgaswga nawgaa 16

<210>12

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP2

<220>

<221>misc_feature

<222>(3，5，8，10，13)

<223>w＝a或t；n＝a或g或c或t；s＝c或g

<400>12

tgwgnagwan casaga 16

<210>13

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP3

<220>

<221>misc_feature

<222>(3，5，8，10，13)

<223>w＝a或t；n＝a或g或c或t

<400>13

agwgnagwan cawagg 16

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP4

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，5，8，10，13)

<223>s＝c或g；n＝a或g或c或t

<400>14

sttgntastn ctntgc 16

<210>15

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP5

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，6，8，10，12)

<223>n＝a或g或c或t；s＝c或g；w＝a或t

<400>15

ntcgastwts gwgtt 15

<210>16

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP6

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，5，8，10，13)

<223>w＝a或t；n＝a或g或c或t

<400>16

wgtgnagwan canaga 16

<210>17

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP7

<220>

<221>misc_feature

<222>(3，6，8，11，13)

<223>w＝a或t；n＝a或g或c或t；s＝c或g

<400>17

cawcgncnga nasgaa 16

<210>18

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP8

<220>

<221>misc_feature

<222>(3，5，8，11，13)

<223>n＝a或g或c或t；w＝a或t；s＝c或g

<400>18

tcstncgnac ntwgga 16

<210>19

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP9

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，5，8，10，13)

<223>w＝a或t；n＝a或g或c或t

<400>19

wcagntgwtn gtnctg 16

<210>20

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP10

<220>

<221>misc_feature

<222>(5，8，11，13)

<223>n＝a或g或c或t

<400>20

tcttncgnac ntngga 16

<210>21

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP11

<220>

<221>misc_feature

<222>(4，7，10，12)

<223>n＝a或g或c或t

<400>21

ttgnagnacn anagg 15

<210>22

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP12

<220>

<221>misc_feature

<222>(3，7，8，10，13)

<223>n＝a或g或c或t；s＝c或g；w＝a或t

<400>22

gtncgaswca nawgt t 16

<210>23

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AP13

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，6，8，10，12，14)

<223>n＝a或g或c或t；s＝c或g；w＝a或t

<400>23

ntcagstwts gwgwt 15

<210>24

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ADH-正向引物

<400>24

atgaaatcaa ccatttttgt aaaacc 26

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ADH-反向引物

<400>25

ctatttttga gcgacaacca ac 22

<210>26

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pET-28a-adh-正向引物

<400>26

gcgggatcca tgaaatcaac catttttgt 29

<210>27

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pET-28a-adh-反向引物

<400>27

gcgaagcttc tatttttgag cgacaacc 28

Claims

1、一种乙醇脱氢酶基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一：

1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列；

2)编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2、一种乙醇脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

3、根据权利要求2所述的乙醇脱氢酶，其特征在于，其为来源于高加索乳杆菌Lactobacillus kefir DSM 20587菌株的NADH依赖的乙醇脱氢酶。

4、一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列。

5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，载体骨架为原核表达载体。

6、根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，载体骨架为pET-28a(+)。

7、一种重组表达转化体，其特征在于，包含权利要求1所述的任何一种核苷酸序列或权利要求4～6任一项所述的重组表达载体。

8、根据权利要求7所述的重组表达转化体，其特征在于，其为细菌。

9、根据权利要求8所述的重组表达转化体，其特征在于，其为大肠杆菌E.coli BL21.DE3。

10、一种重组乙醇脱氢酶的制备方法，其特征在于，包括培养权利要求7～9任一项所述的重组表达转化体，获得重组的乙醇脱氢酶。

11、一种由权利要求10的制备方法所制得的重组乙醇脱氢酶。

12、一种如权利要求2或3所述的乙醇脱氢酶或权利要求11所述的重组乙醇脱氢酶在生物有机合成中将羰基化合物转化为相应的醇的应用。