CN102533705B - 一种腈水解酶及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的腈水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备该重组腈水解酶或含该重组腈水解酶的微生物细胞的方法，以及该微生物细胞在水解邻氯扁桃腈或其结构类似物，生产手性邻氯扁桃酸或其结构类似物的用途。本发明所述的重组腈水解酶来源于Labrenzia aggregate，可作为催化剂用于水解拆分邻氯扁桃腈或其结构类似物，具有催化效率高，对映选择性强，反应条件温和对环境友好等优点。

Description

一种腈水解酶及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种新的腈水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备重组酶的方法，以及该重组腈水解酶在水解邻氯扁桃腈或其结构类似物，制备(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物方面的应用。

背景技术

(R)-邻氯扁桃酸是抗凝血类药物氯吡格雷的重要手性中间体。而其类似物是一类重要的手性合成砌块，被广泛应用于多种药物的合成。如头孢类半合成抗生素、抗肿瘤及抗衰老药物的重要中间体；也可以作为手性拆分试剂，用于拆分其他的手性药物或医药中间体。

目前研究人员已经开发出多种制备(R)-邻氯扁桃酸的方法，主要有化学法和生物法。传统的化学拆分法，主要是利用手性胺类化合物，如α-甲基苄胺、(-)-麻黄碱和辛可宁等，通过与外消旋的邻氯扁桃酸形成非对映异构体盐的方法，得到单一对映体的邻氯扁桃酸。

生物法制备(R)-邻氯扁桃酸已经成为研究的热点。例如，酯酶途径主要有两种：第一种，是在邻氯扁桃酸的羟基上酰化，然后由酯酶催化拆分，从而得到光学纯的产物和剩余底物(Appl Microbiol Biotechnol，2010，86：83-91)。第二种，则是在邻氯扁桃酸的羧基上甲酯化，然后酶促拆分(Biotechnol Bioeng，2008，101：460-469)。

除了酯酶催化拆分之外，还有文献报道了氧化还原酶不对称还原邻氯苯甲酰甲酸，生成(R)-邻氯扁桃酸(J Chem Technol Biot，2009，84：1787-1792)。

腈水解酶能够催化有机腈化合物一步水解为羧酸并产生等摩尔量的氨，该过程反应条件温和，不需要任何辅因子的参与，反应效率高，反应过程具有较好的区域和立体选择性。由于邻氯扁桃腈易于大规模生产且成本低廉；更为重要的是，当(R)-邻氯扁桃腈被对映选择性地酶促水解为(R)-邻氯扁桃酸后，剩余的(S)-邻氯扁桃腈在弱碱性条件下可以自发地消旋转化为外消旋的邻氯扁桃腈，这样理论上可以得到100％的产率。因此，获得对邻氯扁桃腈具有高水解活性和对映选择性的腈水解酶，有利于实现(R)-邻氯扁桃酸的大规模工业化生产。而目前，已知的腈水解酶对于邻氯扁桃腈的底物耐受性普遍较差，多数在50mmol/L以下(J Am Chem Soc，2002，124：9024-9025；J IndMicrobiol Biotechnol，2010，37：741-750；Enzyme Microb Technol，2010，47：140-146)。虽然已有文献报道腈水解酶能够在水-甲苯两相体系中水解200mM邻氯扁桃腈，但其产率和ee较低，产物浓度157mmol/L，ee＝90.4％(JBiotechnol，2011，152：24-29)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种新的水解邻氯扁桃腈获得手性(R)-邻氯扁桃酸的腈水解酶，该腈水解酶在所述催化反应中底物耐受性好，产率和ee值较高，具有催化活性高、对映选择性强、对环境友好的优点。本发明还提供该腈水解酶基因以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，重组酶的制备方法，以及该重组腈水解酶的应用。

本发明通过下述技术方案解决上述技术问题：

本发明的技术方案之一是：一种腈水解酶，该腈水解酶是如下(a)或(b)的蛋白质；

(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

(b)在蛋白质(a)的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

蛋白质(b)是在蛋白质(a)的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。其中，所述的“几个”是指二个至小于100个，更佳的小于30个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，只要该融合蛋白还是具有腈水解酶活性，本发明发现这样的融合蛋白同样可以水解邻氯扁桃腈获得手性(R)-邻氯扁桃酸的腈水解酶，并达到底物耐受性好，产率和ee值较高的效果。也就是说本发明发现只要由(a)衍生的蛋白质具有腈水解酶活性，且衍生方式如上所述，则都可以达到本发明的发明目的。本发明所述的腈水解酶来源于Labrenzia aggregate，更佳的来源于Labrenzia aggregate DSM 13394。所述的腈水解酶可以从Labrenzia aggregate中分离获得，也可以从重组表达该腈水解酶的表达子中分离获得，也可以人工合成获得。

根据本发明，在如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1-3个氨基酸残基的突变，也可获得上述蛋白质(b)，但仍然保持腈水解酶活性，并催化邻氯扁桃腈水解获得手性(R)-邻氯扁桃酸，例如将SEQ ID No.2第14位的Ile突变为Val，第31位的Glu突变成Gln，第39位的Ile突变为Leu所得的突变蛋白质，其序列如SEQ ID No.4，在所述的催化反应中仍然具有底物耐受性好，产率和ee值较高的特点。本发明中氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的腈水解酶，与已知腈水解酶的氨基酸序列的同源性低于60％，具有显著性差异。

本发明所述的腈水解酶可以作为催化剂催化邻氯扁桃腈或其结构类似物水解得到光学纯(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物。

本发明的技术方案之二是：一种腈水解酶基因，所述的腈水解酶基因是如下(1)或(2)的基因：

(1)其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

(b)在(a)的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有腈水解酶活性的蛋白质。

本发明的腈水解酶基因来源于Labrenzia aggregate，更佳的来源于Labrenzia aggregate DSM 13394。

所述的腈水解酶基因可以从Labrenzia aggregate基因组中分离获得，也可以从该腈水解酶基因的重组载体中或者重组表达子中分离获得，也可以全人工合成获得。

本发明所述的腈水解酶基因之一碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示，命名为LaN，全长1008bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1008个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

更佳地，本发明将所述的Labrenzia aggregate DSM 13394的腈水解酶全长基因序列(SEQ ID No.1)进行1-3个碱基突变，例如将Labrenzia aggregateDSM 13394的腈水解酶基因编码序列的第91位的G突变为C，第501位的C突变T，第636位的A突变成G，从而得到突变的基因，其序列如SEQ IDNo.3所示。该突变基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，仍然具有腈水解酶活性，可以催化邻氯扁桃腈水解获得手性(R)-邻氯扁桃酸。

如本领域技术人员所知，本发明的腈水解酶基因的碱基序列也可以是编码序列表中SEQ ID No.2(或No.4)所示氨基酸序列的其他任何碱基序列。例如，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No.2(或4)的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No.1(或3)。另外，还可以通过适当引入替换、缺失、改变、***或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID No.1(或3)的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

SEQ ID No.1(或3)的同系物也指启动子突变体。在所述的碱基序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、***或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平，例如对本发明有利的调节序列可来自于革兰氏阴性菌的启动子中，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6等；或存在于革兰氏阳性启动子amy和SPO2中；或来自于真菌或酵母启动子ADC1、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH等；或者来自Hansenula的丙酮酸脱羧酶启动子或人工启动子等。

SEQ ID No.1(或No.3)的同系物还指一种具有在标准条件下能够与SEQID No.1(或No.3)所示序列的多聚核苷酸进行杂交的碱基序列的多聚核苷酸。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行：Cold SpringHarbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(Current Protocols inMolecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50～70℃。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明的技术方案之三是：一种包含本发明所述的腈水解酶基因的重组表达载体。

本发明所述的重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明的腈水解酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒(大肠杆菌中合适载体有pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pMBL等)、粘粒(pHZ132)、噬菌体或病毒载体(反转录病毒载体，腺病毒载体)等所述质粒代表一小部分的可能质粒，其他质粒为技术人员公知。本发明所述重组载体较佳地采用pET28a质粒。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过上游引物：5’-CCGGAATTCATGAAAGCTATCAAGGTTGCCG-3’，下游引物：5’-CCGCTCGAGCTACTCCTCGACCTCAAAAGGC-3’。PCR扩增所得的腈水解酶基因产物和表达载体pET28a用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，生成含有本发明的腈水解酶基因片段的重组表达载体pET-LaN。

本发明的技术方案之四是：一种重组表达转化体，该重组转化体包含本发明所述的腈水解酶基因的重组表达载体。

其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α。将本发明前述重组表达质粒pET-LaN通过常规转化方法，转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET-LaN。

本发明的技术方案之五是：一种重组腈水解酶或含重组腈水解酶的微生物细胞的制备方法，包括如下步骤：培养所述的重组表达转化体，获得重组表达的腈水解酶或含重组腈水解酶的微生物细胞。

其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达子转化至宿主微生物得到。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的腈水解酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和培养条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生本发明所述的腈水解酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3)重组表达转化体接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.7(优选0.6)时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组腈水解酶。

本发明中催化邻氯扁桃腈或其结构类似物水解得到光学纯(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物的催化剂，可以是上述产生重组腈水解酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物的腈水解酶进行分离和/或纯化得到的分离产品、或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。

本发明的技术方案之六是：一种所述的腈水解酶或含重组腈水解酶的微生物细胞作为催化剂以邻氯扁桃腈或其结构类似物为底物进行水解反应，得到光学纯(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物的应用。

本发明中，所述的邻氯扁桃腈或其结构类似物是如式(I)所示的化合物，所述的(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物是如式(II)所示的化合物；

其中，R代表H，Cl。

当R为Cl，并在邻位取代时，其为邻氯扁桃腈。

在本发明的一较佳实例中，所述的水解反应在单水相反应体系中进行，包括以下步骤：将含重组腈水解酶的微生物细胞悬浮于pH为6.0～9.0的缓冲水溶液中，加入式(I)所示的邻氯扁桃腈或其结构类似物作为底物进行反应，从反应液中分离提取式(II)所示的光学纯(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物。

在本发明的另一较佳实例中，所述的水解反应在两相反应体系中进行，包括以下步骤：将含重组腈水解酶的微生物细胞悬浮于pH为5.0～10.0的缓冲水溶液中，加入疏水性有机溶剂，加入式(I)所示的邻氯扁桃腈或其结构类似物作为底物进行反应，从反应液中分离提取式(II)所示的光学纯(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物。

在所述的单水相或两相反应体系中，在本发明的重组腈水解酶的作用下，对邻氯扁桃腈或其结构类似物进行对映选择性水解反应，制得(R)-邻氯扁桃酸或其类似物。

本发明的方法中，所述的底物浓度通常为1～500mmol/L。考虑到反应的效率，底物浓度优选为大于等于50mmol/L。较佳的，在单水相反应体系中，式(I)所示的邻氯扁桃腈或其结构类似物在反应液中的浓度为1～200mmol/L，优选50～200mmol/L；在两相反应体系中，式(I)所示的邻氯扁桃腈或其结构类似物在反应液中的浓度为1～500mmol/L，优选50～300mmol/L(以两相总体积计算)。在反应时分批添加底物，可以提高生产效率。反应所生成的产物可以在反应结束后分离，也可以通过原位分离的方法不断地将产物移走。

本发明的方法中，所使用的催化剂较佳的是含所述重组腈水解酶的微生物细胞的整细胞，其用量较佳的为1～300g/L。

本发明的方法中，所述的缓冲水溶液是常规的腈水解酶可以发挥酶活性的缓冲水溶液，较佳的如磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液等。

本发明的方法中，所述水解反应的反应温度是常规的腈水解酶可以发挥酶活性的温度，可以是15-50℃，优选20-40℃，最优选30℃。

本发明的方法中，所述水解反应的反应时间是常规，一般到反应至反应完全为止。

在本发明所述的在两相反应体系中的水解反应方法中，所述的疏水性有机溶剂是本领域常规的疏水性有机溶剂，较佳的是疏水性极性有机溶剂，如选自碳链长5～9的烷烃类(直链、支链或环化)、乙酸乙酯，乙酸丁酯，氯仿、正辛醇、苯和甲苯中的一种或多种，均可取得较佳的反应结果，其中以甲苯最佳。两相的体积比例是有机相∶水相＝0∶10～4∶1。

在本发明方法中制备的邻氯扁桃酸可简单地通过萃取来从水相中分离。为此，先用碱(如氢氧化钠和氨水)来碱化反应液，优选将pH调至8.0～9.0，然后用有机溶剂萃取以除去反应液中的杂质，可以重复几次以彻底去除杂质及未反应完的底物。然后，再加入酸(如盐酸或硫酸)来酸化反应液，优选pH值在1.0～2.0之间，再用有机溶剂萃取，可以重复几次以提高产率。有机溶剂包括乙酸乙酯、***、甲苯或正己烷等，本发明中较佳地采用甲苯为有机相。通过将有机溶剂浓缩或去除后，即可得到较高化学纯度的产物，还可以通过重结晶来进一步提高产物的化学纯度和光学纯度。

通过以上优选的方法，本发明方法的产物可以以60％-98％的产率分离。分离的产物具有很高的化学纯度和光学纯度，经过重结晶之后其对映体过量值高于99％。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的LaN与已知的腈水解酶相似性低(＜60％)，该酶对于邻氯扁桃腈具有较高的比活力以及很好的选择性。本发明的腈水解酶或其重组酶可作为催化剂应用于制备(R)-邻氯扁桃酸及其类似物，具有催化效率高，对映选择性强，且产物光学纯度高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1为基因LaN的PCR扩增电泳图谱。其中，1、基因LaN的PCR扩增产物；2、DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。

图2为重组表达质粒pET-LaN的构建示意图。

图3为重组腈水解酶LaN的聚丙烯凝胶电泳图(泳道1为破碎上清，泳道2为纯酶)。

具体实施方式

本发明人通过基因组数据库挖掘的方法分析了一些基因组序列，候选了一批在一些生物信息学上被预测为腈水解酶基因序列。所述的挖掘方法具体为，以来自Alcaligenes sp.ECU0401的腈水解酶Alcaligenes sp.nitrilase的氨基酸序列为模板探针，在NCBI数据库中进行pBLAST搜索，选出一批预测的腈水解酶序列。然后将这些候选基因分离出来，进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞，验证其功能。通过测定对邻氯扁桃腈的活力以及立体选择性，对克隆的腈水解酶进行比较，获得催化性能最佳的腈水解酶。实验证明这些候选基因(7个)均能够选择性水解邻氯扁桃腈，生成光学纯的(R)-邻氯扁桃酸。它们针对邻氯扁桃腈的活力普通集中在0.10～0.80U/mg protein，产物(R)-邻氯扁桃酸的ee值均＞70％，为此，我们从这7个腈水解酶中选择了活力和选择性最佳的腈水解酶LaN作为后续实验所用的酶，从而完成了本发明。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照生产厂商所建议的条件。

下列实施例中的材料来源为：

菌株Labrenzia aggregate DSM 13394，从DSMZ购买所得。

表达载体质粒pET28a购自上海Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

实施例1过程如图2所示。

实施例1腈水解酶基因的克隆

根据Genbank中收录的Labrenzia aggregate的基因序列GenbankAccession NZ_AAUW01000019.1设计PCR引物如下：

引物(扩增LaN基因)：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGAAAGCTATCAAGGTTGCCG-3’，

下游引物：5’-CCGCTCGAGCTACTCCTCGACCTCAAAAGGC-3’。

其中，上游引物下划线部分为EcoRI酶切位点，下游引物下划线部分为XhoI酶切位点，CCG为保护碱基。

以Labrenzia aggregate DSM 13394，(购自DSMZ)的基因组DNA为模板，加入引物进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR体系为：2×Taq PCRMasterMix 15μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/L)，DNA模板1μl(0.1μg)和ddH₂O 12μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性5min；(2)94℃，变性60s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸60s；步骤(2)～(4)重复35次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1000bp左右的目标条带(见图1)。送上海生工公司测序，确认是目的条带，如此获得一条完整的腈水解酶全长基因序列，命名为LaN，全长1008bp，碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

实施例2重组表达质粒和重组表达转化体的制备

将实施例1所得的PCR产物在37℃用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切6h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段，其中含有正确的***片段。将目标片段与同样经EcoR1和XhoI酶切后的质粒pET28a混合，在T4 DNA连接酶的作用下，4℃连接过夜得到重组表达质粒pET-LaN。

将上述重组表达质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中。在含有卡那霉素的抗性平板(培养基成分LB培养基，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量50mg/L)上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌株，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中。转化液涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/PET-LaN。

实施例3重组腈水解酶的表达

将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。按1％(v/v)的接种量接入装有50ml LB培养基的250ml三角烧瓶中，置37℃、180rpm摇床震荡培养。当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行诱导。16℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得0.1～0.5g湿细胞，总活力5～40U。

重组腈水解酶的制备：将所得的静息细胞悬浮于磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，在冰水浴中超声破碎(功率400W，工作6s，间隙4s，超声99次)。8800rpm离心20min收集上清液，即为重组腈水解酶的粗酶液。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(见图3)，重组蛋白以可溶的形式存在。

细胞冻干粉的制备：将所得静息细胞均匀涂布在容器内(水果盘)，厚度＜0.5cm。置于-80℃冰箱预冷6h，在迅速置于冷冻干燥机内，冷冻干燥48h。干燥后，收集细胞冻干粉于干燥的小瓶中。

实施例4利用LaN重组腈水解酶催化水解邻氯扁桃腈(式I中，R为Cl，并在邻位取代)

在1ml磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液中(100mM，pH6～9)，加入0.2U重组腈水解酶(实施例3制备的粗酶液)，加入终浓度为10mM的邻氯扁桃腈，在20～40℃反应2h。反应后，取500μl样品，加入100μl2M的盐酸酸化，再加入500μl的乙酸丁酯萃取。有机相加入无水硫酸钠干燥过夜，用高效液相色谱(手性OJ-H柱)分析产物浓度以及ee值。HPLC分析条件如下：流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝92∶8∶0.2。柱温25℃。结果如表1所示。

表1.利用LaN重组腈水解酶催化水解邻氯扁桃腈的结果

实施例5-6利用LaN重组细胞干粉催化水解邻氯扁桃腈

取LaN重组细胞冻干粉(由实施例3制备)130mg(实施例5)，或520mg(实施例6)悬浮于10ml磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，混匀后于30℃保温10min，加入0.5mmol底物邻氯扁桃腈(终浓度50mM)(实施例5)，或加入1mmol底物邻氯扁桃腈(终浓度100mM)(实施例6)，在30℃，磁力搅拌下反应1.5h后，取50μl样品，加入100μl2M的盐酸酸化，再加入500μl的乙酸丁酯萃取。有机相加入无水硫酸钠干燥过夜，用高效液相色谱(手性OJ-H柱)分析产物浓度以及ee值。HPLC分析条件如下：流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝92∶8∶0.2。柱温25℃。结果如表2。

表2.利用LaN重组细胞干粉催化水解邻氯扁桃腈的结果

实施例7利用LaN重组细胞干粉批次补加底物水解邻氯扁桃腈

称取LaN重组细胞冻干粉520mg，悬浮于10ml磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，混匀后于30℃保温10min，加入0.5mmol底物邻氯扁桃腈(终浓度50mM)，在30℃，磁力搅拌下反应，薄层层析(TLC)检测反应进程。当反应完全后，再次向反应体系中加入0.5mmol邻氯扁桃腈，如此连续补加5次后，反应体系中累积的(R)-邻氯扁桃酸的浓度达到252±8mmol/L，ee值为93.8％。

实施例8～17两相反应体系中利用重组细胞干粉水解邻氯扁桃腈

称取LaN重组细胞冻干粉130mg，悬浮于9ml的磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，于30℃保温10min，加入0.5mmol底物邻氯扁桃腈(溶于有机相)，在30℃，180rpm的摇床中下反应12h。反应后，取50μl样品，加入100μl2M的盐酸酸化，再加入500μl的乙酸丁酯萃取。有机相加入无水硫酸钠干燥过夜，用高效液相色谱(手性OJ-H柱)分析产物浓度以及ee值。HPL℃分析条件如下：流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝92∶8∶0.2。柱温25℃。反应结果如表3。

表3.两相体系中利用LaN重组细胞干粉催化水解邻氯扁桃腈的结果

实施例18～23甲苯-水两相反应体系中利用重组细胞干粉水解邻氯扁桃腈

称取LaN重组细胞冻干粉130mg，悬浮于一定量(2～10ml)的磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，加入甲苯补足体积至10ml，混匀后于30℃保温10min，加入0.5mmol底物邻氯扁桃腈(总体积终浓度50mmol/L)，在30℃，180rpm的摇床中下反应4h。反应后，取50μl样品，加入100μl 2M的盐酸酸化，再加入500μl的乙酸丁酯萃取。有机相加入无水硫酸钠干燥过夜，用高效液相色谱(手性OJ-H柱)分析产物浓度以及ee值。HPLC分析条件如下：流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝92∶8∶0.2。柱温25℃。反应结果如表4。

表4.甲苯-水两相利用LaN重组细胞干粉催化水解邻氯扁桃腈的结果

实施例24甲苯-水两相反应体系中利用重组细胞干粉催化制备(R)-邻氯扁桃酸

称取LaN重组细胞冻干粉5.2g，悬浮于90ml磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，混匀后于30℃保温10min，加入10ml甲苯，以及30mmol的邻氯扁桃腈(终浓度300mM，基于总体积)，在30℃，200rpm机械搅拌下反应，薄层层析(TLC)检测反应进程。当反应完全后，将反应液以12,000×g离心10min，除去细胞。水相用2M的NaOH溶液调节pH至8.0～9.0，加入乙酸乙酯萃取，以除去杂质，然后加入2mol/LHCl酸化至pH为1.0～2.0，加入食盐至饱和，用等体积的乙酸乙酯萃取，重复三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去有机溶剂，得到5.29g(R)-邻氯扁桃酸，产率94.5％，ee值为96％。使用甲苯作为溶剂重结晶后，得到(R)-邻氯扁桃酸的纯品：针状晶体，产率78％，ee＞99％，比旋光度 由此可见，以该转化体细胞作为催化剂能够耐受高浓度的邻氯扁桃腈，并且具有很好的催化效果。

实施例25利用LaN重组细胞干粉催化水解扁桃腈(式I中，R为H，邻位取代)

取LaN重组细胞冻干粉80mg悬浮于10ml磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，混匀后于30℃保温10min，加入0.5mmol底物扁桃腈(终浓度50mmol/L)，在30℃，磁力搅拌下反应1.5h后，取50μl样品，加入100μl2mol/L的盐酸酸化，再加入500μl的乙酸丁酯萃取。有机相加入无水硫酸钠干燥过夜，用高效液相色谱(手性OD-H柱)分析产物浓度以及ee值。结果如下：产物浓度48±1.8mmol/L，ee值为98％。

实施例26

将实施例1中所得的Labrenzia aggregate DSM 13394的腈水解酶全长基因序列(SEQ ID No.1)进行5个碱基突变，分别是将Labrenzia aggregate DSM13394的腈水解酶基因编码序列的第40位的A突变为G，第91位的G突变为C，第115位的A突变为C，第501位的C突变T，第636位的A突变成G，从而得到的突变基因的序列如SEQ ID No.3所示。其编码的氨基酸序列出现了3个氨基酸残基的突变，突变后的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，即在SEQ ID No.4的第14位的Ile突变为Val，第31位的Glu突变成Gln，第39位的Ile突变为Leu。该突变基因进行如实施例2所述的方法制备重组突变酶。该突变酶按照实施例3的方法制备静息细胞和粗酶，按照实施例4-25相同的条件进行反应，可达到类似的效果。

应当理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一种氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的腈水解酶或含氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的重组腈水解酶的微生物细胞作为催化剂以邻氯扁桃腈或其结构类似物为底物进行水解反应得到光学纯(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物的应用，所述的邻氯扁桃腈或其结构类似物是如式（Ⅰ）所示的化合物，所述的(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物是如式（Ⅱ）所示的化合物；

其中，R代表H,Cl。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的水解反应在单水相反应体系中进行，包括以下步骤：将含重组腈水解酶的微生物细胞悬浮于pH为6.0～9.0的缓冲水溶液中，加入式（Ⅰ）所示的邻氯扁桃腈或其结构类似物作为底物进行反应，从反应液中分离提取式（Ⅱ）所示的光学纯(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的水解反应在两相反应体系中进行，包括以下步骤：将含重组腈水解酶的微生物细胞悬浮于pH为5.0～10.0的缓冲水溶液中，加入疏水性有机溶剂，加入式（Ⅰ）所示的邻氯扁桃腈或其结构类似物作为底物进行反应，从反应液中分离提取式（Ⅱ）所示的光学纯(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物。