CN102260657B

CN102260657B - 一种脂肪酶基因及其重组酶和在制备光学活性扁桃酸中的应用

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Publication number: CN102260657B
Application number: CN2011101992994A
Authority: CN
Inventors: 赵健; 上官娇娇; 许建和; 范立强
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2031-07-15
Also published as: CN102260657A

Abstract

本发明公开了一种脂肪酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体，重组表达转化体，重组酶和该重组酶的制备方法。此外叙述了含有该重组脂肪酶的菌体作为催化剂以2-乙酰氧基苯乙酸(α-acetoxyphenylacetic acid)和邻氯乙酰氧基苯乙酸(2-Cl-α-acetoxyphenylacetic acid)为底物不对称去酰基化以制备光学活性物质的应用。本发明的重组脂肪酶基因来源于烟曲霉Aspergillus fumigates Af293，该重组酶可作为催化剂应用于不对称去酰基化以制备光学活性扁桃酸，其催化效率高、立体选择性强，且适用的反应条件温和、对环境友好。本发明中的重组酶，催化活性高，具有很好的工业应用开发前景。

Description

一种脂肪酶基因及其重组酶和在制备光学活性扁桃酸中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，还包括该重组酶的制备方法和其重组脂肪酶转化体作为催化剂以2-乙酰氧基苯乙酸(α-acetoxyphenylaceticacid)及邻氯乙酰氧基苯乙酸(2-Cl-α-acetoxyphenylacetic acid)为底物不对称去酰基化以制备光学活性物质中的应用。

背景技术

扁桃酸(Mandelic Acid，MA)即2-羟基苯乙酸，是一种重要的医药和化工合成中间体，在生物和化学合成中有着广泛的应用。光学纯扁桃酸因其具有良好的生物活性和独特的生理功能，成为备受青睐的药物中间体和酸性手性拆分剂。(S)-扁桃酸是合成用于治疗尿急、尿频和尿失禁药物的前体原料。(R)-扁桃酸用于合成头孢菌素系列抗生素，青霉素和β-内酰胺阻断剂。因其重要的应用前景和潜在的商业价值，光学纯扁桃酸的制备获得了越来越多的关注和研究。邻氯扁桃酸是制备氯吡格雷的重要手性中间体，而氯吡格雷是一种血小板聚集抑制剂，广泛用于治疗动脉粥样硬化患者因心脏病或中风发作引起的血液凝块。

制备光学纯扁桃酸主要有物理法、化学法和生物法三种方法。物理方法主要由色谱法利用环糊精类衍生物作为基质拆分扁桃酸，成本高，样品处理量小，在工业应用中价值小。化学法使用其它手性试剂对扁桃酸消旋体进行拆分，但拆分试剂价格高，工艺繁琐，产品光学纯度取决于拆分次数。生物法与其它方法相比，效率高，产品光学纯度好，且反应条件温和，环境友好，已经有广泛应用。常见的生物法有利用腈水解酶催化扁桃腈水解反应，酯水解酶催化扁桃酸的酯化产物水解反应和氧化还原酶催化不对称合成反应等。目前生物催化方法主要是催化生成(R)-扁桃酸及其衍生物，生成(S)-扁桃酸的反应实例较少。而利用酯水解酶催化扁桃酸的2-羟基乙酰化产物水解反应的报道更属少数，目前仅有西班牙的Guisan课题组和本课题组有少量研究。我们首次报道了利用假单胞菌酯酶选择性催化扁桃酸的2-羟基乙酰化产物水解制备(S)-扁桃酸和(R)-乙酰氧基苯乙酸。但该细胞催化活性较低，反应时间长。目前尚没有烟曲霉脂肪酶作为催化剂不对称催化制备扁桃酸光学纯物质的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种能够手性水解拆分乙酰氧基苯乙酸生成扁桃酸的烟曲霉脂肪酶基因及其重组脂肪酶；提供利用上述重组脂肪酶生产(S)-扁桃酸和(R)-扁桃酸的用途。针对报道的假单胞菌(Pseudomonas sp.ECU1011)整细胞作为不对称催化剂选择性催化2-乙酰氧基苯乙酸总体催化活性相对不高的缺陷，而提供一种具有优异的不对称催化活性、高反应活性和对环境友好的脂肪酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体，重组表达转化体，该重组酶的制备方法和该脂肪酶或其重组酶的应用。

本发明通过下述技术方案解决了上述问题：

本发明的第一方面提供一种脂肪酶，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。

本发明的该脂肪酶来源于烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293，其较佳的是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.2873。

本发明的第二方面提供一种脂肪酶基因，其(1)碱基序列如序列表中SEQID No.1所示；或(2)编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质。

本发明的脂肪酶基因来源于烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293。具体分离方法可为：根据Genbank中收录的烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293的脂肪酶基因AFUA_3G14960(Gene ID：3511767)的mRNA序列设计并合成扩增引物；抽提烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293的基因组RNA，将基因组RNA反转录为基因组cDNA并以此为模板，利用链式聚合酶反应(PCR)进行基因扩增，获得一条完整的脂肪酶全长cDNA基因序列：核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的基因，命名为afl67，全长1080bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1080个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

如本领域技术人员所知，本发明的脂肪酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他任何核苷酸序列。

本发明的第三方面提供一种包含本发明的脂肪酶基因的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的脂肪酶基因和核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体的方法为：将通过PCR扩增所得的脂肪酶基因产物与载体pMD-18T连接，形成克隆载体，之后分别将该克隆载体和表达载体pET28a用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，形成本发明的脂肪酶基因的重组表达载体(质粒)。

本发明的第四方面提供一种表达重组脂肪酶的基因工程菌，其是包含本发明的脂肪酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的脂肪酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠杆菌(E.coli)DH5α。

本发明的第五方面提供一种重组脂肪酶的制备方法，包括培养本发明的表达重组脂肪酶的基因工程菌，获得重组脂肪酶。

其中，所述的基因工程菌同前所述。所述的培养基因工程菌所用的培养基可是本领域任何使转化体生长并产生本发明的微生物培养基，优选LB培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生脂肪酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。对于菌株，优选下述方法：将表达本发明的脂肪酶基因的重组大肠杆菌(优选本发明的大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)重组表达转化体)接种至含0.5mmol/L卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.6-0.8时，在终浓度为0.1-0.5mmol/L(优选0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的条件下，进行15℃(避免在37℃诱导产生大量的包涵体)诱导表达15小时，即可高效表达本发明的重组脂肪酶。

本发明的第六方面提供一种本发明的基因工程菌在生物催化如式1所示的化合物不对称去酰基化制备光学活性物质中的应用。

式1

其中H或o-Cl(邻位的Cl)。较佳的X为单一基团。

所述的底物较佳的为2-乙酰氧基苯乙酸(α-acetoxyphenylacetic acid)和/或邻氯乙酰氧基苯乙酸(2-Cl-α-acetoxyphenylacetic acid)。

本发明的第七方面提供一种生物催化不对称反应制备(R)-扁桃酸的方法，包括在pH 6-9的磷酸盐缓冲液中，以表达重组脂肪酶的基因工程菌为催化剂，以如式1所示的化合物为底物，进行不对称去酰基化反应。

反应化学式如下：

式1 式2 式3

其中X＝H或o-Cl(邻位的Cl)。较佳的X为单一基团。

所述的重组脂肪酶来源于烟曲霉Aspergillus fumigates Af293。较佳的所述的重组脂肪酶来源于烟曲霉CGMCC No.2873，氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO：2所示。

所述的表达重组脂肪酶的基因工程菌较佳的是本发明所述的基因工程菌。该可以是湿菌体或其冻干细胞。

所述的不对称去酰基化反应的条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：所述的底物在反应液中的浓度较佳为1～10mmol/L。本发明的表达重组脂肪酶的基因工程菌在反应液中的浓度较佳为0.1～1g湿菌体/ml，更佳的是0.2～0.4g湿菌体/ml。所述的磷酸盐缓冲液可为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/L，pH 6.0-8.0，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称去酰基化反应较佳的在振荡条件下进行；反应的温度较佳的为25～35℃；反应时间以反应完全为较佳，即底物转化率达到50％，一般为1～12小时。

将上述基因工程菌加入到含有底物的缓冲溶液中，催化底物进行不对称去酰基化。不对称反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取(S)-扁桃酸。硅胶柱层析分离得到(S)-扁桃酸及剩余的(R)-2-乙酰氧基苯乙酸，其中(R)-2-乙酰氧基苯乙酸经由10％氨水催化水解并且重结晶后，可得到(R)-扁桃酸。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明首次利用新克隆的重组脂肪酶作为生物催化剂应用于催化拆分不对称扁桃酸的2-羟基乙酰化产物：2-乙酰氧基苯乙酸以及其衍生物邻氯乙酰氧基苯乙酸生产光学纯扁桃酸，其催化效率高、立体选择性强，且适用的反应条件温和、对环境友好。与物理法，化学法以及野生型假单胞菌(Pseudomonas sp.ECU1011)的整细胞催化相比，本发明的重组脂肪酶是首次从烟曲霉中克隆表达得到，其重组转化体催化效果佳，活性高反应快，生产方便，具有很好的工业应用开发前景。

附图说明

图1为烟曲霉RNA抽提产物的电泳图谱。

图2为AFL67基因的PCR扩增产物的电泳图谱。泳道1：AFL67基因的PCR扩增后条带；泳道2：DNAmarker 3。

图3为表达质粒PET-afl67的构建图。

图4为AFL67重组转化体菌落PCR鉴定图。泳道1，2：AFL67重组转化体菌落PCR条带；泳道3：DNAmarker 3。

图5为AFL67重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。泳道1：低分子量蛋白Maker；泳道2：诱导前全菌体裂解物；泳道3：诱导后全菌体裂解物；泳道4：破碎后上清酶液；泳道5：破碎后包涵体。

图6为AFL67重组脂肪酶对不同碳链长度对硝基苯酚酯的底物特异性。

图7为AFL67重组转化体手性催化2-乙酰氧基苯乙酸后反应混合物的HPLC分析图。(R)-2-乙酰氧基苯乙酸和(S)-扁桃酸如箭头所示。

图8为AFL67重组转化体手性催化邻氯乙酰氧基苯乙酸后反应混合物的HPLC分析图。(R)-邻氯乙酰氧基苯乙酸和(S)-邻氯扁桃酸如箭头所示。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下列实施例中的材料来源为：本发明所使用烟曲霉Aspergillusfumigatus Af293保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.2873。质粒pMD18-T购自大连TaKaRa公司。表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×TaqPCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒抽提试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。反转录使用的是Fermentas(K1621)反转录试剂盒。

实施例1RNA抽提和反转录获取cDNA

1.菌体总RNA的抽提(Trizol法)：

将烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293CGMCC No.2873接种于马丁培养基(蛋白胨5g/L，酵母提取物2g/L，葡萄糖20g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄0.5g/L，pH 6.8)中30℃培养48小时左右。

(1)将摇瓶培养的烟曲霉菌体(小球状)吸入离心管中，10000g离心10min(4℃)弃废液，并用去离子水清洗2次，沥干水分，将菌体转入液氮中，充分研磨，移入含1mL Trizol的1.5mL离心管中，混匀后利用液氮的余温反复冻融几次，再在冰盒中平放静置5min，使核蛋白复合物完全解离(样品体积不超过所用Trizol体积的10％)；

(2)加入200μL氯仿，剧烈摇动或用旋涡震荡器混匀。于4℃下10000g离心10min；

(3)吸取上清液，缓慢加入200μL 5M NaAc，形成沉淀，4℃下10000g离心10min；

(4)吸取上清液，再加入200μL氯仿柔和混匀，放置2min后于4℃下10000g离心10min；

(5)吸取上清液，每1mL Trizol 500μL的异丙醇，充分混匀后，于冰盒放置10min。于4℃下10000g离心10min。

(6)收集RNA沉淀，加入75％的DEPC水配制的乙醇清洗2次，重复上述离心。

(7)吸尽残存的乙醇。将打开管盖的离心管放置几分钟，使残余的乙醇挥发掉，不要让RNA干透。

(8)加50～100μL DEPC处理过的水，将RNA溶液贮存于-70℃。

经电泳检测，结果如图1。

2.RT-PCR：

抽提出mRNA后，将其反转录为cDNA，用Fermentas(K1621)反转录试剂盒进行反转录。

(1)在PCR管中配制下列混合液

混匀

(2)在PCR仪中进行变性退火反应，65℃5min，暂停，立刻置于冰水浴中。

(3)在PCR管中加入混合液

快速离心混匀。

4.在PCR仪上按下列条件进行反应

42℃保持60min，

70℃保持10min，

4℃保存。

产物cDNA放-20℃保存，可直接作为PCR的模版。

实施例2脂肪酶基因的克隆

根据Genbank中已收录的烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293的脂肪酶AFUA_3G14960(Gene ID：3511767)的基因序列为依据，设计PCR引物如下：

上游引物：CGCATATGGCAGACTACTCGGAAT；

下游引物：CGCAAGCTTCTACTTTGTTTTGATC。

其中，上游引物下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物下划线部分为HindIII酶切位点。

以实施例1所得的烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293CGMCC No.2873的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix：10μL，上游引物和下游引物各：1μL，cDNA模板：1μL，ddH₂O：7μL。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性5min；(2)94℃，变性30s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸70s；步骤(2)～(4)循环30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1080bp左右的目标条带。获得一条烟曲霉脂肪酶AFL67的全长cDNA基因(图2)，经测序序列如序列表SEQ ID NO：1所示。经DNAMAN软件比对分析后，和NCBI上序列有99.91％的相似性，证明是一条新的烟曲霉脂肪酶afl67基因。该新脂肪酶afl67基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，和现有的已知脂肪酶的氨基酸序列的同源性最大是99.72％，证明是一种新的烟曲霉脂肪酶。

实施例3重组表达载体(质粒)和重组表达转化体的制备

将实施例2所得的afl67基因与pMD-18T载体连接，构建克隆质粒，转化大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α，通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取质粒，在37℃下用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切3h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将酶切后的片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经NdeI和HindIII双酶切后的质粒pET28a，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a-afl67(图3)，转化到大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，在含有0.5mmol/L卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有0.5mmol/L卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性重组转化体E.coli BL21(pET-afl67)，菌落PCR鉴定如图4所示。

实施例4重组脂肪酶的表达

将实施例3所得的重组大肠杆菌转化体，接种至含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入含有0.5mmol/L卡那霉素的100mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)的500mL三角瓶中，置37℃、180rpm摇床培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mmoL/L的IPTG作为诱导剂，15℃诱导15h后，将培养液离心，收集细胞，即为可以用于生物催化反应的湿菌体。用生理盐水洗涤该细胞两次，将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组脂肪酶的粗酶液。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组蛋白大部分以可溶性形式存在(图5)，其分子量约为41kDa。

实施例5重组脂肪酶活力的测定与底物特异性

利用分光光度计检测405nm吸光值的变化计算脂肪酶的活力，方法如下：于3mL反应体系：2.87mL(100mmol/L KPB缓冲液，pH 7.0)，加入30μL p-nitrophenyl hexanoate(C6，100mmol/L，最适底物)，30℃保温2分钟后加入100mL实施例4制备的粗酶液，迅速摇匀，检测405nm处吸光值的变化。酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×10³/(9873.15×1)；式中，EW为1min内405nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL；9873.15为摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。每单位酶活定义为在上述条件下，1min转化生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量为1个活力单位(U)。活性测定均进行三次平行试验，取其平均值为最后结果。

重组脂肪酶底物特异性测定用不同碳链长度的对硝基苯酚酯，分别为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸脂(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚葵酸酯(C10)，对硝基苯酚月桂酸酯(C12)和对硝基苯酚棕榈酸酯(C16)，作为底物进行酶活测定。其中该重组脂肪酶对对硝基苯酚己酸脂(C6)活性最高，可达4.74×10⁴U/L。AFL67对不同底物的底物特异性如图6所示。

实施例6重组脂肪酶AFL67不对称催化2-乙酰氧基苯乙酸

将实施例4所得的湿菌体用浓度为0.85％(w/v)的生理盐水洗涤3次，按照4g湿菌体对10mL反应液的比例，加入到底物2-乙酰氧基苯乙酸浓度为5mmol/L，pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，在30℃，180rpm条件下反应3.5小时后加入0.1％(v/v)的浓硫酸终止反应。加入氯化钠和乙酸乙酯，震荡萃取1min，离心取上清，加入无水硫酸钠静置过夜。过滤后溶液经硅胶柱层析分离得到(S)-扁桃酸及剩余的(R)-2-乙酰氧基苯乙酸，其中(R)-2-乙酰氧基苯乙酸经由10％氨水催化水解并且重结晶后，可得到(R)-扁桃酸。

反应中底物的转化率和产物的对映体过量值(ee_p)采用液相色谱分析，分析条件为：手性柱OD-H柱(OD-H柱，

日本Daicel公司出品)；流动相：正己烷/异丙烷/三氟乙酸(94∶6∶0.2，v/v)，流速为1mL/min；紫外检测器，波长228nm；柱温25℃。出峰时间：(R)-扁桃酸，23.9min；(S)-扁桃酸，20.3min；(R)-2-乙酰氧基苯乙酸，12.3min；(S)-2-乙酰氧基苯乙酸，10.8min。

经检测计算，ee_s为97.2％，ee_p为91.9％，转化率为48％，E＝64。

实施例7重组脂肪酶AFL67不对称催化邻氯乙酰氧基苯乙酸

将实施例4所得的湿菌体用浓度为0.85％w/v的生理盐水洗涤3次，按照0.1g湿菌体对500μL反应液的比例，加入到底物邻氯乙酰氧基苯乙酸浓度为10mmol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，在30℃，900rpm条件下反应12小时后加入0.1％(v/v)的浓硫酸终止反应。加入氯化钠和乙酸乙酯，震荡萃取1min，离心取上清，加入无水硫酸钠静置过夜。过滤后溶液经硅胶柱层析分离得到S-邻氯扁桃酸及剩余的(R)-邻氯乙酰氧基苯乙酸。

反应中底物的转化率和产物的对映体过量值(ee_p)采用液相色谱分析，分析条件同上。出峰时间：(R)-邻氯扁桃酸，20.9min；(S)-邻氯扁桃酸，17.2min；(R)-邻氯酰氧基苯乙酸，11.9min；(S)-邻氯酰氧基苯乙酸，9.19min。

经检测计算，ee_s为93.5％，ee_p为91.3％，转化率为47％。