CN102618513B - 一种羰基还原酶、基因和突变体及在不对称还原羰基化合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的羰基还原酶、基因及其突变体，含有该基因及突变体的重组表达载体和重组表达转化体，该重组酶制备方法，以及该羰基还原酶和重组酶在不对称还原前手性羰基化合物制备活性手性醇中的应用。本发明的羰基还原酶来源于光滑假丝酵母，应用于(R)-邻氯扁桃酸甲酯、(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯、(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯等多种光学活性手性醇的制备。与其他制备方法相比，本方法催化制备的产物浓度高，不需要额外添加或少量添加昂贵的辅酶，产物光学纯度高，具有反应条件温和，操作简便，易于放大等优势，因此在氯吡格雷、L-肉碱以及普利类降压药物中间体的生产中具有很好的工业应用前景。

Description

一种羰基还原酶、基因和突变体及在不对称还原羰基化合物中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶及其基因和突变体，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羰基还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。

背景技术

手性醇是许多畅销药物及手性化学品的重要中间体。例如，(R)-邻氯扁桃酸甲酯(分子式为o-Cl-C₆H₄CH(OH)COOCH₃，分子量为200.62，CAS号：32345-59-8)是合成血小板聚集抑制剂氯吡格雷的重要手性中间体。氯吡格雷是一种二磷酸腺苷(ADP)受体阻滞剂，可与血小板膜表面ADP受体结合，使纤维蛋白原无法与糖蛋白GP Ⅱb/Ⅲa受体结合，从而抑制血小板相互聚集，主要用于治疗急性心肌梗死，在国内具有广泛的市场。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(分子式为C₆H₅(CH₂)₂CH(OH)COOCH₂CH₃，分子量为208.25，CAS号：90315-82-5)是合成多种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)普利药物，如贝那普利、西拉普利等的重要手性砌块。该类药物主要用于治疗高血压、充血性心力衰竭等疾病。(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(分子式为ClCH₂CH(OH)CH₂COOCH₂CH₃，分子量为166.60，CAS号：90866-33-4)是L-肉碱的重要手性中间体。L-肉碱是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，服用L-肉碱能够在减少身体脂肪、降低体重的同时，不减少水分和肌肉，在2003年被国际肥胖健康组织认定为最安全无副作用的减肥营养补充品。因此，研究上述光学纯手性醇的手性合成制备具有广阔的应用前景。

光学活性手性醇的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、对映体选择性高等多种优点，特别是生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。

(R)-邻氯扁桃酸或其衍生物酯的生物不对称合成方法主要有腈水解酶催化的邻氯扁桃腈的不对称水解以及羰基还原酶催化的邻氯苯甲酰甲酸酯的不对称还原。张志钧等用粪产碱杆菌(Alcaligenes sp.ECU0401)来源的腈水解酶在水-甲苯两相体系中催化消旋邻氯扁桃腈的动态动力学水解拆分制备(R)-邻氯扁桃酸，底物浓度为200mM，产物的对映体过量值(ee)为90.4％，产率为76.5％(J.Biotechnol.2011，152，24-29)。Ema等用面包酵母来源的羰基还原酶Gre2p催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯不对称还原制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯，底物浓度为200g/L，产物的ee值高于99％以上，分离得率为89％(Adv.Synth.Catal.2008，350，2039-2044)。为实现高的产率，该反应额外添加了1g/L的NADP⁺辅酶，由于辅酶价格昂贵，使得该反应不尽如人意。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备通常是采用野生菌或重组工程菌的细胞或游离酶催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯不对称还原的方法。在已报道的应用中，底物浓度的最高水平是400mM(82g/L)，所用催化剂为预处理的面包酵母(Baker’syeast)，但是反应48h后仅有41.9％的底物转化成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，且对映体过量值(ee)只有87.5％(Biocatal.Biotransfor.2009，27，211-218)。其他的一些报道中可以获得高光学纯度的产物，但是产物浓度一般都很低，不具备产业化的可行性。Zhang等用克鲁氏假丝酵母(Candida krusei SW2026)催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，底物浓度为2.5g/L时，ee值达99.7％，分离得率为95.1％。但当底物浓度提高到20g/L后，ee值降低到97.4％(Process Biochemistry 2009，44，1270-1275)。Lavandera等用重组醇脱氢酶催化5g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯还原制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，产物的ee值高于99％，但是反应中需要外源添加1mM NADH，大幅度提高了其成本(ChemSusChem 2008，1，431-436)。林文清等用筛选的博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)等菌株，在水相和水/有机两相两相体系中，催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯不对称还原，产品ee值为84.9％～98.9％，且报道的最高产物浓度仅为50g/L(中国专利，公开号CN 101314784A)。褐色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)来源的醛还原酶SSAR可以催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯不对称还原制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，底物浓度可以达到300g/L，但是ee值为91.7％，并不尽如人意。因此针对以上叙述的三个底物，寻找一种羰基还原酶，能够催化高底物浓度下的高立体选择性不对称还原，反应过程中无需额外加入辅酶或者添加极少量辅酶，无疑具有广泛的应用前景。

发明内容

因此，本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的生物催化不对称还原制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯、(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯和(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的反应中需要不同来源的酶、酶催化活性偏低、产物浓度低、光学纯度不高，而且需要额外添加昂贵辅酶等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的羰基还原酶，该羰基还原酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该羰基还原酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明采取的技术方案之一是：一种分离的蛋白质，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少62％相同的蛋白质。

SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质来源于光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234，具有羰基还原酶的功能，是一种新的羰基还原酶。

所述的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质可以从光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。

SEQ ID No.2所示的羰基还原酶和其他已知羰基还原酶的同源性(即氨基酸序列相似性)见表1。本发明中氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的羰基还原酶与已知羰基还原酶的氨基酸序列的同源性低于62％，具有显著差异性。

表1.本发明的新羰基还原酶和其他已知羰基还原酶的同源性

蛋白质(b)是在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少62％相同的蛋白质。其中所述的“几个”是指二个至小于100个，更佳的小于30个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有羰基还原酶活性。再如，根据本发明，在SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1～5个氨基酸残基的突变，也可获得上述蛋白质(b)，并且仍然保持羰基还原酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有羰基还原酶活性，且衍生方式如上所述，并且与蛋白质(a)的同源性在62％以上，都可以达到本发明的发明目的。其中所述蛋白质与蛋白质(a)的同源性在62％以上，更佳的是90％以上，最佳的是98.6％以上。

在筛选获得高活性和立体选择性酶的基础上，我们对野生型的酶进行了蛋白质改造，将活性中心以及导向活性中心的疏水通道中的一些位点的氨基酸残基突变为其他的氨基酸残基，以进一步强化该酶的催化性能，改善酶的表达。所述的活性中心定义为底物结合位点附近大约

的球形空间。

优选的，(b)蛋白质是在(a)的氨基酸序列的第85位、第92位、第94位、第99位和第174位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

其中优选的，(a)所述的氨基酸序列的第85位的缬氨酸取代为异亮氨酸，得突变蛋白质CgKR1V85I，或第174位甘氨酸取代为丙氨酸，得突变蛋白质CgKR1G174A，它们的热稳定性得到了一定的提高。

其中优选的，(a)所述的氨基酸序列的第92位的苯丙氨酸取代为选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸等非极性氨基酸，更佳地取代为亮氨酸，得突变蛋白质CgKR1F92L，其仍然具有一定的羰基还原酶活性。

其中优选的，(a)所述的氨基酸序列的第94位的苯丙氨酸取代为选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸等非极性氨基酸，较佳地取代为缬氨酸，得突变蛋白质CgKR1F94V，其羰基还原酶活性提高到原来的7倍。

其中优选的，(a)所述的氨基酸序列的第99位的异亮氨酸取代为选自丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或酪氨酸等极性氨基酸，更佳地为取代为酪氨酸，得到衍生蛋白质CgKR1I99Y，其可溶性表达与热稳定性都得到了较显著的提高。

其中优选的，(a)所述的氨基酸序列的第92位的苯丙氨酸取代为亮氨酸，同时将第94位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，得突变蛋白质CgKR1F92L/F94V，其羰基还原酶活性提高到原来的12倍，并且其热稳定性得到了较大的提高。

其中优选的，(a)所述的氨基酸序列的第92位的苯丙氨酸取代为亮氨酸，同时第94位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，同时第99位的异亮氨酸取代为酪氨酸，同时第174位的甘氨酸取代为丙氨酸，得突变蛋白质CgKR1F92L/F94V/I99Y/G174A，其羰基还原酶活性提高到原来的12倍，并且其热稳定性得到了很大的提高。

本发明采取的技术方案之二是：一种分离的核酸，其是如下(1)或(2)的核酸：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成的核酸；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的核酸：

(a)由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少62％相同的蛋白质。

本发明所述SEQ ID No.1所示的核酸来源于光滑假丝酵母(Candidaglabrata)CGMCC 2.234。本发明所述SEQ ID No.1所示的核酸可以从光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234基因组中分离获得，也可以从含有该SEQ ID No.1所示核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。

本发明中，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的基因，命名为CgKR1，全长1059bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1056个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No.2的氨基酸序列的核酸序列不仅仅局限于SEQ ID No.1。本发明的羰基还原酶基因的核酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或***来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核酸序列SEQID No.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

SEQ ID No.1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、***或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。

SEQ ID No.1的同系物还指一种具有在标准条件下能够与SEQ ID No.1所示序列的多聚核酸进行杂交的碱基序列的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50～70℃。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明采取的技术方案之三是：一种包含本发明所述的核酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的所述的羰基还原酶基因或其突变体的核酸连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET28a分别用限制性内切酶Nde Ⅰ和BamHⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的羰基还原酶基因的重组表达质粒pET28a-CgKR1或其突变体表达质粒。

本发明采取的技术方案之四是：一种包含本发明所述的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠杆菌(E.coli)DH5α。将前述重组表达质粒pET28a-CgKR1或其突变体转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-CgKR1或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等，较佳地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是：45℃，热击90秒。

本发明采取的技术方案之五是：一种重组羰基还原酶的制备方法，其中包括如下步骤：培养本发明所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组羰基还原酶。

其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的羰基还原酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并产生本发明的羰基还原酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵产酶较佳地选用下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3)/pET28a-CgKR1或其突变体)接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～0.7(更佳地为0.6)时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L(更佳地是0.1mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～30℃(更佳地是16℃)，即可高效表达本发明所述重组羰基还原酶。

本发明中催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性手性醇的催化剂，可以是上述产生的重组羰基还原酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的羰基还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。

本发明采取的技术方案之六是：一种本发明所述的蛋白质在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性醇中的应用。

上述应用中，所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：

所述的蛋白质优选本发明所述的羰基还原酶或者重组羰基还原酶。所述的前手性羰基化合物较佳的为α-酮酯、β-酮酯或者芳基酮类化合物，分别是式1、2或3所示的化合物：

其中，

R₁为烷基、苯基或带有取代基的苯基，苯基的取代基为卤素或烷基；

R₂为烷基；

R₃为烷基或卤代烷基；

R₄为卤代烷基。

较佳地，

R₁为碳链长度为1～8的烷基、苯基或者带有取代基的苯基，苯基的取代基为卤素或碳链长度为1～2的烷基；

R₂为碳链长度为1～2的烷基；

R₃为碳链长度为1～2的烷基或卤代烷基，更佳地，所述卤代烷基的卤素是Cl、Br或F；最佳的，R₃为一至三个Cl、Br或F原子取代的甲基。

R₄为卤代烷基。较佳地，所述的卤代烷基的卤素是Cl或F。

更佳地是，

R₁为-CH₃、-C₆H₅、-C₆H₄-o-Cl或-(CH₂)₂C₆H₅；

R₂为-CH₃或-CH₂CH₃；

R₃为-CH₂CH₃、-CH₂Cl、-CH₂Br或-CF₃；

R₄为-CH₂Cl或-CF₃。

最佳的，R₁为-C₆H₄-o-Cl，R₂为-CH₃，即式1是邻氯苯甲酰甲酸甲酯。

最佳的，R₁为-(CH₂)₂C₆H₅，R₂为-CH₂CH₃，即式1是2-羰基-4-苯基丁酸乙酯。

最佳的，R₃为-CH₂Cl，即式2是4-氯-3-羰基丁酸乙酯。

本发明所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳的，所述的应用包括下述步骤：在pH 5.5～7.0的水溶液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下，在本发明所述的羰基还原酶或重组羰基还原酶的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性醇。

较佳的，所述蛋白质用量为5～60kU/L，葡萄糖脱氢酶的用量为5～60kU/L，葡萄糖的用量为5～600g/L，NADP⁺的用量为0～0.5mmol/L，所述前手性羰基化合物的浓度为10mmol/L～2.0mol/L，所述pH 5.5～7.0的水溶液为磷酸盐缓冲液，反应温度为20～35℃。

其中所述的前手性羰基化合物(除邻氯苯甲酰甲酸甲酯、2-羰基-4-苯基丁酸乙酯和4-氯-3-羰基丁酸乙酯外)在反应液中的较佳浓度为10～100mmol/L。本发明的羰基还原酶用量为催化有效量，较佳的为5～60kU/L。葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为5～60kU/L。葡萄糖的用量较佳的为5～600g/L。额外加入的NADP⁺的用量较佳的为0～1.0mmol/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液，只要其pH范围在5.5～7.0即可，优选磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳的为20～35℃。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应过程中，产物浓度不再持续提高的时间为准。

不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。对于邻氯苯甲酰甲酸甲酯、2-羰基-4-苯基丁酸乙酯以及4-氯-3-羰基丁酸乙酯，其底物浓度最高分别可达到1.5mol/L、2.0mol/L和2.0mol/L。本发明的还原酶用量为催化有效量，羰基还原酶与邻氯苯甲酰甲酸甲酯、2-羰基-4-苯基丁酸乙酯或4-氯-3-羰基丁酸乙酯的用量比较佳的为10～100kU羰基还原酶/mol底物。葡萄糖与邻氯苯甲酰甲酸甲酯、2-羰基-4-苯基丁酸乙酯或4-氯-3-羰基丁酸乙酯的用量比较佳的为200～300g葡萄糖/mol底物。葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为10～100kU葡萄糖脱氢酶/mol底物，额外加入的NADP⁺的用量较佳的为0～1.0mmol/L。所述的缓冲液可为本领域常规缓冲液，只要其pH范围在5.5～7.0即可，较佳地选择pH为6.0的磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳的为20～35℃，更佳地为25℃。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应过程中，产物浓度不再提高的时间为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。

本发明中，在所述的羰基还原酶催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性醇的反应中，若使用纯的羰基还原酶，则需要添加辅酶NADP⁺，若使用的是从微生物细胞中提取的羰基还原酶粗酶液或者是表达羰基还原酶的静息细胞，则不需要加辅酶，只需利用细胞内所含有的辅酶即可。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明针对已经报道的生物催化不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的研究中存在产物浓度不高，需要额外添加昂贵辅酶等问题，提供了一种新的羰基还原酶及利用重组还原酶结合辅酶再生不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法。在催化浓度高达2mol/L(412g/L)的底物时，产物的光学纯度仍高达99％以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，不必额外添加昂贵的辅酶NADP⁺，并且具有产物光学纯度高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大的优点，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是基因CgKR1的PCR扩增电泳图谱，其中，1.DNA Marker(MarkerII，北京天根生化科技有限公司)；2～3.基因CgKR1的PCR扩增产物。

图2是大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α/pET28a-CgKR1的菌液PCR扩增电泳图，其中，1.DNA Marker(Marker II，北京天根生化科技有限公司)；2～3.大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α/pET-CgKR1的菌液PCR扩增电泳图。

图3是大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-CgKR1的菌液PCR扩增电泳图，其中，1.DNA Marker(Marker II，北京天根生化科技有限公司)；2～3.大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-CgKR1的菌液PCR扩增电泳图。

图4是大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-CgKR1F92L/F94V/I99Y/G174A的菌液PCR扩增电泳图，其中，1.DNA Marker(Marker II，北京天根生化科技有限公司)；2～3.大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-CgKR1 F92L/F94V/I99Y/G174A的菌液PCR扩增电泳图。

图5是重组表达质粒pET28a-CgKR1的构建示意图。

图6是重组羰基还原酶CgKR1的聚丙烯凝胶电泳图。

图7是重组羰基还原酶CgKR1F92L/F94V/I99Y/G174A的聚丙烯凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明人通过基因组数据库挖掘的方法分析了一些基因组序列，候选了一批在一些生物信息学上被预测为羰基还原酶基因的序列。所述的挖掘方法具体为，以具有良好生物催化性能的、来自Saccharomyces cerevisiae的羰基还原酶Gre2p(或称为YOL151w)的氨基酸序列做探针，在NCBI数据库中进行pBLAST搜索，选定一批预测的羰基还原酶基因序列。然后对这些候选基因分别进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。通过测定这些羰基还原酶对底物邻氯苯甲酰甲酸甲酯、2-羰基-4-苯基丁酸乙酯或4-氯-3-羰基丁酸乙酯的活性和立体选择性等，对所克隆表达的酶进行反复比较和筛选，最终获得催化性能最佳的羰基还原酶CgKR1，从而完成了本发明。

本发明在筛选获得高活性和立体选择性酶的基础上，对野生型的酶进行了蛋白质改造，将活性中心以及导向活性中心的疏水通道中的一些位点的氨基酸残基突变为其他的氨基酸残基，以进一步强化该酶的催化性能，改善酶的表达。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中的材料来源为：

光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234。

表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

实施例1 羰基还原酶基因的克隆

根据Genbank收录的预测为光滑假丝酵母(Candida glabrata)羰基还原酶的基因序列(NCBI登录号：CAG58832)为依据，设计PCR引物如下：

CgKR1f：5’-CATATGGCTTCTGATAACAGCAAC-3’；

CgKR1r：5’-GGATCCTTAATTAGAGTTCTTCTCGGC-3’。

其中，上游引物下划线部分为Nde Ⅰ酶切位点，下游引物下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点。

以光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/L)，DNA模板1μl(0.1μg)和ddH₂O 7μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性1min；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收900～1200bp区间的目标条带(图1)。获得一条完整的光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234的羰基还原酶全长基因序列，经DNA测序，全长1059bp，命名为CgKR1，其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1。

实施例2 CgKR1基因的定点突变

将实施例1所得的光滑假丝酵母CGMCC 2.234的羰基还原酶全长基因序列(SEQ ID No.1)进行碱基突变。

设计PCR引物如下：

突变V85I：

上游引物：5’-CAAGGTTATCTTACACACCGCCTCTCC-3’

下游引物：5’-CGGTGTGTAAGATAACCTTGATATCCTTGCCATG-3’

突变F92L：

上游引物：5’-CCGCCTCTCCACTGCACTTCAACACCACTGACATT-3’

下游引物：5’-GTGCAGTGGAGAGGCGGTGTGTAAG-3’

突变F94V：

上游引物：5’-CACACCGCCTCTCCATTCCACGTTAACACCACTGA

CATTGAA-3’

下游引物：5’-TGGAGAGGCGGTGTG-3’

突变I99Y：

上游引物：5’-CCACTGACTATGAAAAGGATCTATTGATCCC-3’

下游引物：5’-GATCCTTTTCATAGTCAGTGGTGTTGAAGTGG-3’

突变G174A：

上游引物：5’-CCAATCAGAGCTTACTGTGGTTCAAAGAAGTTTG-3’

下游引物：5’-CCACAGTAAGCTCTGATTGGATCGGATTGAC-3’

组合突变F92L/F94V：

上游引物：5’-CTCCACTGCACGTGAACACCACTGACATTGAAAAG-3’

下游引物：5’-GTGTTCACGTGCAGTGGAGAGGCGGTGTGTAAG-3’

以实施例1所得的光滑假丝酵母CGMCC 2.234的羰基还原酶全长基因序列(SEQ ID No.1)为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：10×KOD-Plus PCRbuffer 2μl，25mM MgSO₄ 1.2μl，2mM dNTP 2μl，KOD-Plus PCR高保真酶0.3μl，DNA模板0.5μl(0.1μg)，ddH₂O 13μl，以CgKR1f(见实施例1)分别和下游引物各0.5μl(10mmol/L)通过PCR扩增第一DNA片段，以CgKR1r和上游引物各0.5μl(10mmol/L)通过PCR扩增第二DNA片段。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)98℃，变性15s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标条带。

而后以上述所得第一DNA片段与第二DNA片段为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：10×KOD-Plus PCR buffer 5μl，25mM MgSO₄ 3μl，2mMdNTP 5μl，KOD-Plus PCR高保真酶1μl，作为DNA模板的第一DNA片段与第二DNA片段各1μl(0.1μg)，ddH₂O 31μl，CgKR1f和CgKR1r各1.5μl(10mmol/L)。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)98℃，变性15s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1.0～1.2kbp左右的目标条带。

其中所述F92L/F94V/I99Y/G174A突变构建过程为：先以SEQ ID No.1为模板，用组合突变F92L/F94V的PCR引物构建F92L/F94V，而后以此突变为模板，用突变I99Y的PCR引物构建F92L/F94V/I99Y，最后以此突变为模板，用突变G174A的PCR引物构建成F92L/F94V/I99Y/G174A。

经DNA测序正确，所得目标条带即为本发明所述的突变体蛋白的基因，其名称分别为：

CgKR1 V85I，氨基酸序列SEQ ID No.2第85位的缬氨酸取代为异亮氨酸；

CgKR1 F92L，氨基酸序列SEQ ID No.2第92位的苯丙氨酸取代为亮氨酸；

CgKR1 F94V，氨基酸序列SEQ ID No.2第94位的苯丙氨酸取代为缬氨酸；

CgKR1 F92L/F94V，氨基酸序列SEQ ID No.2第92位的苯丙氨酸取代为亮氨酸，同时第94位苯丙氨酸取代为缬氨酸；

CgKR1 I99Y，氨基酸序列SEQ ID No.2第99位的异亮氨酸取代为酪氨酸；

CgKR1 G174A，氨基酸序列SEQ ID No.2第174位的甘氨酸取代为丙氨酸；

CgKR1 F92L/F94V/I99Y/G174A，氨基酸序列SEQ ID No.2第92位的苯丙氨酸取代为亮氨酸，第94位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，第99为异亮氨酸取代为酪氨酸，第174位甘氨酸取代为丙氨酸。

实施例3 重组表达载体(质粒)的构建和重组表达转化体的制备

将实施例1或2中所得的羰基还原酶基因DNA片段在37℃用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经NdeI和BamHI酶切后的质粒pET28a，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a-CgKR1及其突变体，质粒构建图谱如图5所示。

将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，转化条件45℃，热击90秒，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆(图2)。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-CgKR1及其突变体，菌落PCR验证阳性克隆(图3)，BL21(DE3)/pET28a-CgKR1F92L/F94V/I99Y/G174A的菌液PCR扩增电泳图(图4)。

实施例4 重组羰基还原酶的表达和酶活性与稳定性测定

将实施例3所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组羰基还原酶的粗酶液。粗酶液与沉淀一起经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析，其中CgKR1的聚丙烯凝胶电泳图为图6所示，重组羰基还原酶CgKR1 F92L/F94V/I99Y/G174A的聚丙烯凝胶电泳图如图7所示。

重组蛋白以部分可溶的形式存在。可溶性蛋白含量计算方法：对聚丙烯酰胺凝胶电泳图中上清与沉淀中的重组羰基还原酶进行积分，上清中的重组羰基还原酶所占两者总和的百分比即为可溶性蛋白含量。重组羰基还原酶CgKR1以及CgKR1 F92L/F94V/I99Y/G174A的可溶性见表2。将粗酶液用冷冻冻干机冻干，即为冻干粗酶粉。

羰基还原酶的活力测定：通过检测340nm处吸光值变化的方式测定。具体方法如下：于1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 6.0)中，加入终浓度为2mmol/L底物邻氯苯甲酰甲酸甲酯，终浓度为0.1mmol/L的NADPH，30℃保温2分钟后加入适量细胞破碎后的粗酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×l)；式中，EW为1min内340nm处吸光度的变化值；V为反应液的体积，单位mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。每单位(U)羰基还原酶的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADPH氧化所需的酶量。重组羰基还原酶CgKR1及其突变株的酶活力如表2所示。

羰基还原酶稳定性测定方法：根据文献Angew.Chem.Int.Ed.，2006，27，7745-7751测定羰基还原酶酶的T₅₀值。重组羰基还原酶CgKR1及其突变株的T₅₀值如表2所示。

葡萄糖脱氢酶活力测定方法如下：于1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中，加入10mmol/L葡萄糖，1mmol/L NADP⁺，30℃保温2分钟后加入适量酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。每单位(U)葡萄糖脱氢酶的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADP⁺还原所需的酶量。

表2.CgKR1及其突变株性质

实施例5～17 重组还原酶CgKR1催化羰基化合物的不对称还原

在0.4ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加入2U实施例4制备的粗酶液CgKR1和2U的葡萄糖脱氢酶粗酶液(制备方法参见：Journal ofIndustrial Microbiology and Biotechnology 2011，38，633-641)，分别加入终浓度为10mmol/L的酮酯或芳基酮(实施例5～17)，以及终浓度为0.5mmol/L的NADP⁺和5g/L的葡萄糖。在30℃，1100rpm振荡反应，反应时间为24小时，此时反应产物的浓度都不再继续增长。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和还原产物的ee值。结果见表3。

产物转化率与ee值的具体分析条件如下：

实施例5及10～17使用气相色谱仪进行分析转化率与ee值，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，其他条件如下：

实施例5：柱温80℃；

实施例10：初始柱温90℃维持2min后，以1℃/min的速率升温至120℃，维持5min；

实施例11和12：反应产物乙酰化后进行分析，初始柱温110℃，维持2min后，以2℃/min的速率升至126℃，维持2min；

实施例13：柱温120℃；

实施例14：柱温130℃；

实施例15和16：柱温140℃；

实施例17：柱温160℃；

实施例6～9使用气相色谱仪进行分析转化率，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温180℃；

实施例6和7使用液相色谱分析ee值，手性OD-H柱，流动相：正己烷/异丙醇/三氟乙酸＝94/6/0.2，流速1ml/min，检测器波长228nm。

实施例8和9使用液相色谱分析ee值，手性OD-H柱，流动相：正己烷/异丙醇＝97/3，流速1ml/min，检测器波长254nm。

表3.CgKR1催化羰基化合物不对称还原反应的结果

实施例18 CgKR1催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的不对称还原

在100ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 5.5)中加入4000U的实施例4制备的CgKR1粗酶液和4000U的葡萄糖脱氢酶粗酶液，加入终浓度为0.75mol/L的邻氯苯甲酰甲酸甲酯和220g/L的葡萄糖。反应在20℃下进行，反应液pH控制为5.5，反应至反应完全为止，即反应产物的浓度不再继续增长，此时反应时间为12小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，减压蒸馏获得1.16g(R)-邻氯扁桃酸甲酯，收率76％，产物的ee值为98.0％。

实施例19 CgKR1催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的不对称还原

在100ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入6000U的实施例4制备的CgKR1粗酶液和6000U的葡萄糖脱氢酶粗酶液，加入终浓度为1.5mol/L的邻氯苯甲酰甲酸甲酯和450g/L的葡萄糖。反应在25℃下进行，反应液pH控制为6.0，反应至反应完全为止，即反应产物的浓度不再继续增长，此时反应时间为6小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，减压蒸馏获得2.61g(R)-邻氯扁桃酸甲酯，收率87％，产物的ee值为98.5％。

实施例20 CgKR1催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原

在100ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入6000U的实施例4制备的CgKR1粗酶液和6000U的葡萄糖脱氢酶粗酶液，加入终浓度为2.0mol/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯和600g/L的葡萄糖。反应在25℃下进行，反应液pH控制为6.0，反应至反应完全为止，即反应产物的浓度不再继续增长，此时反应时间为12小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，减压蒸馏获得3.67g(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，收率89％，产物的ee值为98％。

实施例21 CgKR1催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯的不对称还原

在100ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入6000U的实施例4制备的CgKR1粗酶液和6000U的葡萄糖脱氢酶粗酶液，加入终浓度为2.0mol/L的4-氯-3-羰基丁酸乙酯和600g/L的葡萄糖。反应在25℃下进行，反应液pH控制为6.0，反应至反应完全为止，即反应产物的浓度不再继续增长，此时反应时间为4小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，减压蒸馏获得3.0g(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，收率91％，产物的ee值为97％。

实施例22～31 CgKR1及其突变体催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的不对称还原

根据实施例2构建CgKR1的突变株，根据实施例3制备重组表达载体(质粒)和重组表达转化体，根据实施例4制备粗酶粉。

在100ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入4000U的上述实施例4制备所得的CgKR1及其突变株的粗酶粉和4000U葡萄糖脱氢酶粗酶粉，加入终浓度为100g/L的邻氯苯甲酰甲酸甲酯，150g/L的葡萄糖以及0.1mmol/L的NADP⁺。反应在25～35℃下进行，反应液pH控制为6.0，反应至24h，此时实施例21～31反应产物的浓度都不再继续增长。根据实施例8测定反应转化率以及ee值，结果如表4所示。

表4.CgKR1及其突变体催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的不对称还原结果

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种分离的蛋白质，其特征在于：其是如下的蛋白质：

在由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的氨基酸序列中第92位的苯丙氨酸取代为亮氨酸，第94位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，第99位的异亮氨酸取代为酪氨酸，同时第174位甘氨酸取代为丙氨酸。

2.一种分离的核酸，其特征在于：其是编码如下蛋白质的基因：由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质中第92位的苯丙氨酸取代为亮氨酸，第94位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，第99位的异亮氨酸取代为酪氨酸，同时第174位甘氨酸取代为丙氨酸。

3.一种包含如权利要求2所述的核酸的重组表达载体。

4.一种包含如权利要求3所述的重组表达载体的重组表达转化体。

5.一种重组羰基还原酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养如权利要求4所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组羰基还原酶。

6.一种如权利要求1所述的蛋白质在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性醇中的应用，其特征在于，所述的前手性羰基化合物为如式1、2或3所示的化合物：

其中R₁为-CH₃、苯基或者带有取代基的苯基，苯基的取代基为卤素或碳链长度为1～2的烷基；

R₂为碳链长度为1～2的烷基；

R₃为碳链长度为1～2的烷基或卤代烷基，所述卤代烷基的卤素是Cl、Br或F；

R₄为-CH₂Cl或-CF₃。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用包括下述方法：在pH5.5～7.0的水溶液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下，在如权利要求1所述的蛋白质的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性醇。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蛋白质用量为5～60kU/L，葡萄糖脱氢酶的用量为5～60kU/L，葡萄糖的用量为5～600g/L，NADP⁺的用量为0～0.5mmol/L，所述前手性羰基化合物的浓度为10mmol/L～2.0mol/L，所述pH5.5～7.0的水溶液为磷酸盐缓冲液，反应温度为20～35℃。

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