CN102947710A - 悬滴装置、***和/或方法 - Google Patents

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Abstract

本公开一般涉及用于产生和处理流体悬滴的装置、***以及使用此类装置来产生和处理流体悬滴的方法。本公开还涉及细胞培养装置、方法和/或使用此类装置的***以及细胞培养装置例如用于研发和高通量筛选的用途。

Description

悬滴装置、***和/或方法
本申请要求2010年1月28日提交的美国临时申请61/299,011的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。另外，以下由纽约冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)在1989年出版，由Sambrook，J.等编写的标题为Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第二版)的16.9至16.15页中的指南以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开一般涉及用于产生和处理流体悬滴的装置、***以及使用此类装置来产生和处理流体悬滴的方法。本公开一般还涉及细胞培养装置、***以及使用此类装置的方法。本公开一般还涉及细胞培养装置用于研发和高通量筛选的用途。
发明背景
用于各种药物测试和筛选实验的体外细胞和组织模型常常是制药行业中新型治疗剂研发的核心。然而，现在大多数体外研究仍在常规二维(2D)细胞培养***下进行，所述细胞培养***经常不是用于功能组织和肿瘤的生理模型。因此，涉及此类模型的药物研究可能不会得到精确的示值读数。为了获得更有意义的结果，常常使用涉及动物的体内研究。然而，体内研究一个明显的缺点是这些实验耗时和昂贵的特性。为了弥合非生理性常规2D模型与体内实验之间的这一差距，需要用于医药行业中药物测试和筛选的提供更具治疗预测性和生理相关性结果的三维(3D)体外模型。一种建立3D细胞培养模型的方法是通过类球体或3D细胞簇或细胞团的形成。
以适合如高通量筛选和测试的某些应用的方式按比例扩大类球体培养物会具有一些缺点。传统的类球体形成包括混悬细胞在培养皿盖底面上的悬滴中的培养。这个过程需要在放置液滴后将罩盖倒置。因此，液滴容易受到微扰的影响而下降、摊开，并且与邻近的液滴融合。这种方法虽然廉价，但却是费力(labor-intensive)的方法，它不允许高效的可扩大的生产，并且与用于高通量筛选的自动化仪器不相容。因为很难在不危害类球体的情况下进行培养基交换，这个方法通常需要另一个人工逐个将类球体转移到多孔培养板上进行更长期的培养、处理、分析以及收获的劳动密集型步骤。
替代方法是在生物反应器如转瓶和旋转培养容器中连续搅动细胞混悬液以促进类球体的形成。这个方法需要消耗大量的培养基。该方法还需要专用器材并且类球体的大小和均匀性难以控制。类球体的高可变性阻止其在许多应用中的使用。
方法同样可用于使用3D微孔结构和平面微模型来生产类球体。然而，这些方法需要专用且昂贵的器材来生成微孔结构和微模型。此外，因为多个类球体被培养在一个流体空间内，所以不能用测试化合物对类球体进行单独监测、控制，以及处理。对单个类球体在处理前后进行分析时的困难也使这些方法不适合某些应用，例如药物测试和筛选应用。
其它近期的进展包括被设计用于生成和控制类球体的微流体装置。然而，设计和生产这些装置很昂贵。另外，这些装置不适合类球体的长期培养，在化学上与某些药物不相容，以及与用于进行高通量筛选的自动化仪器不相容。
为了解决本领域中的问题，需要本文所公开的装置、方法和/或***。
发明内容
本公开一般涉及用于产生和处理流体悬滴的装置、***以及使用此类装置来产生和处理流体悬滴的方法。本公开一般还涉及细胞培养装置、***以及使用此类装置的方法。本公开一般还涉及细胞培养装置用于研发和高通量筛选的用途。
例如，在一些实施方案中，本公开提供一种***，其包括：a)至少一个阵列板，所述至少一个阵列板包括顶面和底面以及其中的多个孔洞，其中所述多个孔洞中的每个孔洞包括顶部和底部并且其中所述阵列板的所述底面包括至少一个基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的底部相邻的高台(plateau)；以及，b)其中所述至少一个阵列板被构造用于容纳多个悬滴，其中每一个液滴悬挂于多个所述孔洞中的一个相应的孔洞并且伸到孔洞的下方，其中所述至少一个阵列板所能容纳的悬滴数等于或少于所述至少一个阵列板中孔洞数。在某些实施方案中，所述***进一步包括至少一个放置在所述至少一个阵列板下方的第二板。在某些实施方案中，所述至少一个阵列板进一步包括至少一个储器。在某些实施方案中，所述多个悬滴中的一个或多个悬滴含有以下中的一种或多种：多个细胞；至少一个复合组织或生物体；含有生物和/或化学实体的水性流体；一种或多种蛋白质；一个或多个纳米粒子，一种或多种测试化合物；一种或多种药物；由水性液体形成的固体或凝胶；或其组合。在某些实施方案中，所述至少一个阵列板、所述至少一个第二板和/或所述至少一个罩盖被处理以改良相应经处理表面的性质。在某些实施方案中，所述***可遵守美国国家标准学会(American National Standards Institute)和/或生物分子科学协会(Society of Biomolecular Sciences)的标准。在某些实施方案中，所述***与高通量筛选相容。在某些实施方案中，在所述至少一个阵列板的底面上的所述至少一个高台被构造用于稳定所述多个悬滴的几何结构。在某些实施方案中，在所述至少一个阵列板的底面上的所述至少一个高台被构造用于稳定所述多个悬滴的位置。在某些实施方案中，所述至少一个阵列板被构造用于稳定和保持所述多个悬滴的可测量性质。在某些实施方案中，所述至少一个阵列板进一步包括至少一个在顶面上基本上与多个孔洞中的至少一个孔洞的顶部相邻的高台，其中在所述至少一个阵列板的顶面上的所述至少一个高台被构造用于增进孔洞内和/或外的液体的转移。在某些实施方案中，所述***被构造成保持基本上稳定的湿度。在某些实施方案中，所述***被构造成保持多个悬滴的环境的可测量性质。在某些实施方案中，所述***被构造成处理少量的流体。在某些实施方案中，所述***被构造成允许在所述一个或多个悬滴内的多个细胞的长期培养。在某些实施方案中，所述***被构造成允许以下中的一种或多种：多个细胞的长期培养、保持、分析和/或测试；至少一个复合组织或生物体的长期培养、保持、分析和/或测试；含有生物和/或化学实体的水性流体的长期培养、保持、分析和/或测试；一种或多种蛋白质的长期培养、保持、分析和/或测试；一个或多个纳米粒子的长期培养、保持、测试和或分析；一种或多种测试化合物的长期培养、保持、分析和/或测试；一种或多种药物的长期培养、保持、分析和或测试；或其组合。
例如，某些实施方案涉及方法，其包括：将多个悬滴******，所述***包括：a)至少一个阵列板，所述至少一个阵列板包括顶面和底面，以及其中的多个孔洞，其中所述多个孔洞中的每个孔洞包括顶部和底部并且其中所述阵列板的所述底面包括至少一个基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的底部相邻的高台；并且b)其中所述至少一个阵列板被构造用于容纳多个悬滴，其中每一滴悬挂于多个所述孔洞中相应的一个孔洞并且伸到孔洞的下方，其中所述至少一个阵列板所能容纳的悬滴数等于或少于所述至少一个阵列板中孔洞数；以及在一个或多个悬滴上进行培养、保持、分析、测试或其组合。
例如，某些实施方案涉及装置，其包括：阵列板，其包括顶面和底面，其中所述阵列板包括其中的多个孔洞，其中每个孔洞包括顶面和底面并且其中所述阵列板的所述底面包括至少一个与一个或多个所述孔洞的底面相邻或基本上相邻的高台。
例如，某些实施方案提供一种装置，其包括：a)一个或多个阵列板，所述阵列板包括顶面和底面，其中所述阵列板中的每个阵列板包括其中的多排或多列孔洞，其中每个孔洞包括顶面和底面并且其中所述阵列板的底面包括与每个孔洞的底面相邻的高台；并且b)位于所述阵列板下方的储器板(例如，96孔板)，其中所述储器板接触所述阵列板的边缘(例如，仅边缘)，并且其中所述储器板与孔洞不接触。在一些实施方案中，所述装置进一步包括所述装置的覆盖件，其中所述覆盖件放置在所述阵列板的顶部上并且其中所述覆盖件与孔洞不接触。在一些实施方案中，所述储器包括水性液体。在一些实施方案中，所述装置由聚合塑料(例如，聚苯乙烯)制成。在一些实施方案中，所述阵列板包括384个孔洞。在一些实施方案中，所述孔洞的直径约1.6mm。在一些实施方案中，所述孔洞之间相距约4.5mm。在一些实施方案中，所述装置进一步包括与孔洞的至少一侧(例如，两侧)的顶部和/或底部相邻或基本上相邻的另外的高台或环状结构。在一些实施方案中，所述高台的所述边缘包括环状结构(例如，来稳定液滴)。在一些实施方案中，在所述装置的一个或多个元件上进行表面处理(例如，涂布、等离子体处理等)。
某些实施方案提供一种***，其包括：a)一个或多个阵列板，所述阵列板包括顶面和底面，其中所述阵列板中的每个阵列板包括其中的多排或多列孔洞，其中每个孔洞包括顶面和底面并且其中所述阵列板的底面包括与每个孔洞的底面基本上相邻的高台；b)位于所述阵列板下方的储器板，其中所述储器板接触所述阵列板的边缘(例如，仅边缘)，并且其中所述储器板与孔洞不接触；以及c)多个流体悬滴，其中所述液滴悬挂于一个或多个孔洞上并且伸到孔洞的下方。在一些实施方案中，所述悬滴含有多个细胞。在一些实施方案中，所述细胞保持混悬状态。在其它实施方案中，所述细胞形成团或簇或类球体。在一些实施方案中，所述细胞是复合组织或生物体，例如胚胎、组织、小生物体和蠕虫等。在其它实施方案中，所述悬滴是含有生物和/或化学实体或其组合的水性流体。所述实体的例子包括蛋白质、纳米粒子以及水凝胶。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞(例如，生长在类球体中)。在一些实施方案中，所述***进一步包括测试化合物(例如，抗癌药物)。在一些实施方案中，所述***进一步包括罩盖，其中所述罩盖盖住所述阵列板但不与细胞接触。在一些实施方案中，所述阵列板、储器和覆盖件用防止或抑制水分流失的薄膜包裹。在一些实施方案中，所述***进一步包括一个或多个高通量样本处理装置(例如，机器人样本处理装置或读板仪)。
本公开还提供方法，其包括：a)将多个流体悬滴***装置，所述装置包括i)一个或多个包括顶面和底面的阵列板，其中所述阵列板中的每个阵列板包括其中的多排或多列孔洞，其中每个孔洞包括顶面和底面并且其中所述阵列板的底面包括与每个孔洞的底面基本上相邻的高台；和ii)位于所述阵列板下方的储器板，其中所述储器板接触所述阵列板的边缘(例如，仅边缘)，并且其中所述储器板与孔洞不接触，其中所述液滴悬挂于一个或多个孔洞上并且伸到所述阵列板的孔洞的下方；以及b)在使细胞生长和/或保持活力的条件下在悬滴中培养细胞。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞、胚胎干细胞和肝细胞等(例如，生长在类球体中)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使细胞与测试化合物(例如，药物、化学药品、蒸汽、生物分子或纳米粒子)接触并且测定所述测试化合物对细胞生长或其它性质的影响的步骤。在一些实施方案中，悬滴被放置在从所述阵列板的顶部或底部到孔洞或孔洞的一个开口处。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过将液体分配至孔洞或孔洞的一个开口处来添加另外的液体和/或细胞至悬滴的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过孔洞去除液体和/或细胞的步骤。在一些实施方案中，所述阵列板的不同部分(例如，不同的悬滴或细胞群)暴露在不同的测试化合物和/或生长条件中。
某些实施方案涉及一种***，其包括阵列板、罩盖和托架，其中所述阵列板包括顶面和底面、储器以及其中的多个孔洞或进入孔洞(access hole)，其中每个进入孔洞包括顶面和底面，其中所述阵列板的底面包括一个或多个与多个进入孔洞的底面相邻或基本上相邻的高台结构，并且其中所述阵列板的所述顶面包括与所述多个进入孔洞的顶面相邻或基本上相邻的第二高台结构。在某些实施方案中，所述罩盖和所述托架围住或基本上围住所述阵列板以将细胞培养物与外界环境和物质隔离开。在某些实施方案中，所述阵列板、罩盖以及所述托架由相同材料制成。在其它实施方案中，一个或多个所述阵列板、罩盖以及所述托架由不同材料制成。在一些实施方案中，所述***是基本上气密的。在其它实施方案中，所述***充分气密以允许***内外之间的气体交换和/或保持***内的湿度。在一些实施方案中，所述阵列板和托架其中之一或两者含有包括水性液体的储器。在一些实施方案中，所述水性液体提供蒸汽以保持所述***内的湿度。在其它实施方案中，所述储器包括其它物质。在一些实施方案中，所述托架的底面基本上是光学透明的。在一些实施方案中，所述基本上光学透明的表面基本上是平坦的并且提供用于光学成像和分析的无遮挡的细胞培养物视野，所述光学成像和分析如微观的、比色的、荧光和发光成像和测量。在一些实施方案中，所述***(或多个***)有合乎标准的几何结构和测量值，例如ANSI/SBS(美国国家标准学会/生物分子科学协会)所规定的现有标准，因此使所述***与主流成像***和用于研究和研发(如高通量筛选)的自动化器材相容。
本文对另外的实施方案进行描述。
附图说明
附图促进对这一技术的各种非限制性实施方案的理解。
图1示出根据本公开的某些实施方案的示例性装置。(a)示出一种用于本发明实施方案的384孔的格式化细胞类球体培养阵列板，以及其剖视图。(b)所述阵列板的照片和尺寸。(c)用能够同时吸移96个细胞培养位点的液体处理机器人来操作的阵列板的照片。(d)加湿室的示意图。
图2示出(a)根据某些实施方案的经7至12天培养的具有各种细胞群的COS7，mES以及A431.H9细胞类球体的渗透度。(b)经过12天培养的存活/死亡受染色COS7和mES细胞类球体的荧光图像。(c)A431.H9类球体的大小(直径)比初始细胞数量。(d)根据某些实施方案的A431.H9类球体的大小(体积)比各种初始数量的细胞/类球体的时间。
图3示出根据某些实施方案的TPZ结果，不同浓度下的A431.H9类球体的延时图像，柱状图概述所有尺寸的类球体在各种浓度和常规2D培养条件下经过96小时的药物处理后对照细胞活力的百分比。
图4示出根据某些实施方案的5-FU结果，不同浓度下的A431.H9类球体的延时图像，柱状图概述所有大小的类球体在各种浓度和常规2D培养条件下经过96小时的药物处理后对照细胞活力的百分比。
图5示出用于某些实施方案的示例性装置的示意图。
图6示出用于某些实施方案的示例性装置的示意图。
图7示出用于某些实施方案的示例性装置的详细视图。
图8示出用于某些实施方案的示例性装置的详细视图。
图9示出根据某些实施方案的高台区域的视图。
图10示出用于向某些实施方案的装置中添加和去除细胞和液体的示例性方法的示意图。
图11示出用某些实施方案的方法培养的mES类球体。
图12示出用某些实施方案的方法培养的mES类球体。
图13示出用某些实施方案的方法培养的肝细胞类球体。
图14示出用于某些实施方案的示例性装置的示意图。A是概观图。B是环状结构的特写图。
图15示出根据某些实施方案的在各种不同浓度下计算出来的荧光和吸光测定的Z因子。
图16A至图16F示出根据某些实施方案的示例性阵列板。图16A示出俯视图；图16B示出俯视图的异构图；图16C示出侧视图；图16D示出端视图；图16E示出沿图16A所示的剖面线M-M的剖视图；以及图16F示出沿图16C所示的剖面线L-L的所述阵列板的剖视图。
图17A至图17D示出根据某些实施方案的示例性高台结构。图17A示出俯视图；图17B示出俯视图的异构图；图17C示出仰视图；图17D示出底部的异构图。
图18示出根据某些实施方案的示例性进入孔洞结构的俯视图、剖视图，以及仰视图。
图19是示出根据某些实施方案的进入孔洞的示例性阵列的顶部和底部的剖视图和异构3D示意图。
图20A至图20F示出根据某些实施方案的图16所示的所述阵列板可能会使用的示例性托架。图20A示出俯视图；图20B示出俯视图的异构图；图20C示出侧视图；图20D示出端视图；图20E示出沿图20A所示的剖面线P-P的剖视图；以及图20F示出沿图20C所示的剖面线N-N的所述托架的剖视图。
图21A至图21F示出根据某些实施方案的图16所示的所述阵列板可能会使用的示例性罩盖。图21A示出俯视图；图21B示出俯视图的异构图；图21C示出侧视图；图21D示出端视图；图21E示出沿图21A所示的剖面线R-R的剖视图；以及图21F示出沿图21C所示的剖面线T-T的所述罩盖的剖视图。
图22A至图22F示出根据某些实施方案的阵列板、托架和罩盖的示例性组合件。图22A示出俯视图；图22B示出俯视图的异构图；图22C示出侧视图；图22D示出端视图；图22E示出沿图22A所示的剖面线V-V的剖视图；以及图22F示出沿图22C所示的剖面线U-U的所述组件的剖视图。
图23A和图23B示出根据某些实施方案的图22A-F所示的所述组合件的示例性堆叠。图23A示出侧视图并且图23B示出端视图。
图24A至图24D示出根据某些实施方案的进入孔洞结构的示例性变型。图24A示出在所述顶面上具有长且细的高台结构的示例性进入孔洞结构。图24B示出在所述顶面上具有短且细的高台结构的示例性进入孔洞结构。图24C示出在所述顶面上具有长且粗的高台结构的示例性进入孔洞结构。图24D示出在所述顶面上具有长且细的高台结构的示例性进入孔洞结构，其通过一个不同的分模线进行注塑。
定义
为促进对本公开的理解，许多术语和词语被定义如下，或可能在本公开的其它位置对术语进行定义。
术语“样本”使用的是其最广泛的意义。一方面它意味着包括试样或培养物。另一方面，它意味着包括生物样本和环境样本两者。
生物样本可能是动物(包括人)、流体、固体(如粪便)或组织，还有液体和固体食物以及饲料产品和成分如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品，以及废物。生物样本可从家畜的各种家系，还有野性或野生动物，包括但不局限于如像有蹄动物、熊、鱼、兔类、啮齿类等或其组合的动物中获得。
环境样本包括环境材料如地表物质、土壤、水以及工业样本，还有由食物和乳品加工仪器、设备、器材、器具、一次性和非一次性用品或其组合获得的样本。这些实施例不能理解为限制适用于本公开的所述样本类型。
本文所用的，术语“细胞”指不论是体外还是体内的任何真核或原核细胞(如像大肠杆菌的细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖类动物细胞、植物细胞、鱼类细胞，以及昆虫细胞)，或其组合。术语“细胞”还指含有一个或多个呈混悬状或呈簇状或团状的细胞的水性流体或溶液。
本文所用的，术语“细胞培养物”指细胞的任何体外培养物。这个术语内包括传代细胞系(如有长久的表型)、原代细胞培养物、转化细胞系、有限细胞系(如非转化细胞)，其它保持在体外的细胞群，或其组合。
本文所用的术语“转染”指将外来核酸导入真核细胞。转染可能通过本技术领域已知的各种手段来完成，所述手段包括磷酸钙-DNA-共沉淀法、DEAE葡聚糖介导转染法、凝聚胺介导转染法、电穿孔法、显微注射法、脂质体融合法、脂质体转染法、原生质体融合法、逆转录病毒感染法，以及基因枪法。
本文所用的，术语“可选择标记”指赋予在缺少应有必需营养素(例如，酵母细胞中的HIS3基因)的培养基中生长能力的编码酶活性的基因的用途；另外，可选择标记可能赋予在表达可选择标记的细胞上的抗生素或药物以抵抗力。可选择标记可能是“显性”；显性可选择标记编码能在任何真核细胞系中被检测到的酶活性。显性可选择标记的实施例包括赋予在哺乳动物细胞中的药物G418以抵抗力的细菌氨基糖苷类3′磷酸转移酶基因(也称为新基因)，赋予抗菌潮霉素以抵抗力的细菌潮霉素G磷酸转移酶(hyg)基因以及赋予在酚酸存在的条件下以生长的能力的细菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(也称为gpt基因)。其它可选择标记可能不是显性，因为它们必须与缺少相关酶活性的细胞系结合使用。非显性可选择标记包括与tk-细胞系结合使用的胸苷激酶(tk)基因、与CAD缺陷细胞结合使用的CAD基因，以及与hprt-细胞系结合使用的哺乳动物次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因。由纽约冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)在1989年出版，由Sambrook，J.等编写的标题为Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版)的16.9至16.15页中提供了对在哺乳动物细胞系中使用可选择标记的评论。
所使用的术语“真核细胞”指区别于“原核细胞”的生物体。所述术语旨在包含具有显现出真核细胞一般特征的细胞的生物体，如受核膜束缚的其中有染色体的真核的存在，膜结合细胞器的存在，以及其它通常在真核细胞中观察到的特征。因此，所述术语包括但不局限于此类生物体如真菌、原生生物，以及动物(例如，人类)。
本文所用的，术语“体外”指人工环境和在人工环境内出现的过程或反应。体外环境可能由试管和/或细胞培养组成，但不局限于试管和/或细胞培养。术语“体外”指自然环境(例如，动物或细胞)和在自然环境内出现的过程或反应。
术语“测试化合物”和“候选化合物”指任何化学实体、药品、药物等，也就是用于治疗或防止不适、疾病、病症，或身体机能失调的候选者。测试化合物包括已知的和潜在的治疗化合物。测试化合物可能通过筛选被确定为具有疗效，所述筛选采用本公开中的筛选方法、装置和/或***。在本公开的某些实施方案中，测试化合物可包括反义、siRNA和/或shRNA化合物。
术语“类球体”指细胞簇或细胞团和/或细胞集落。类球体可能由各种细胞类型形成，例如原代细胞、细胞系、肿瘤细胞和干细胞等。类球体的形状可能是球形或不规则形状。类球体可能含有细胞，细胞类型，以及如增生细胞、静止细胞和坏死细胞的不同状态的细胞的异质种群。
详细描述
以下描述是根据可能共有共同特点和特征的数个实施方案提供的。应理解一个实施方案的一个或多个特征可能可与其它实施方案的一个或多个特征组合。另外，所述实施方案中任一个实施方案的单个特征或特征组合可以构成额外实施方案。
在本说明书中，措辞“包含”应理解为其“开放”的含义，即包括的含义，因此不局限于其“封闭”的含义，即“仅由......组成”的含义。相应的含义适于所有出现的相应措辞“包含”、“被包含”。
在详细描述中使用的主题标题仅为了方便读者参考，不应用来限制可在本公开或权利要求书全文中找到的主题。主题标题不应用来解释权利要求书的范围或权利要求的限制。
在一些实施方案中，所述装置可以组合2D和3D细胞培养物。例如，在一些实施方案中，一些细胞可培养在进入孔洞的内壁上(2D细胞培养物)，而其它细胞作为类球体培养在进入孔洞底面上的悬滴中(3D细胞培养物)。例如，在一些实施方案中，所述装置可以包括进入孔洞和可在常规多孔板上发现的孔结构，使得细胞的2D和3D培养能够在同一装置上进行。在其它实施方案中，进入孔洞中的流体和孔可以连接，从而允许通过细胞产物(例如化学和生物分子)的分泌和/或检测来分析进入孔洞和孔中的细胞之间的相互作用。
类球体可以用作优异的肿瘤和/或其它功能组织的3D模型。类球体是可在细胞-细胞相互作用超过细胞-基底相互作用时通过自组装形成的细胞集落的球状簇。类球体一般可以定义为可在细胞-细胞相互作用超过细胞-基底相互作用时通过自组装形成的细胞和/或细胞集落的簇或团。类球体可以由例如原代细胞、细胞系、肿瘤细胞、干细胞等各种细胞类型形成。类球体可以具有球形或不规则形状。类球体可以含有细胞，细胞类型，以及诸如增殖细胞、休眠细胞和坏死细胞的不同状态的细胞的异质性群体。类球体可以模拟肿瘤并且可以用作已知提供更可靠且有意义的治疗示值读数的优异的生理肿瘤模型。类球体可以产生一致和/或可再现的结果和/或测量值。例如，经受同一实验或重复的相同实验中的相同处理的样本产生一致的或在标准偏差可接受范围内，例如在10％至30％内的测量值。也考虑了其它可接受范围。这意味着所获得的结果和/或测量值与被调查的受试者有关并且对被调查受试者有价值。例如，样本可以产生密切模拟由动物和/或人体内研究产生的研究结果的结果和/或测量值。这可以包括遵循相似趋势或在可接受的数值范围内，例如在从动物和/或人体内研究获得的测量值的10％至30％范围内的定量和/或定性结果。也考虑了其它可接受范围。虽然已认识到类球体的这些优势，但是形成、保持、溶液更换以及微量细胞和流体操控所需的让人厌烦且充满挑战的程序仍然阻碍了工业更广泛地使用经充分验证的类球体组织模型。此外，由于3D模型的复杂性，很难以高通量方式按比例扩大3D培养物以用于筛选和测试目的。
典型的类球体形成方法包括悬滴、在非粘附性表面上培养细胞、旋转瓶培养和NASA旋转细胞培养***。然而，这些传统类球体形成和培养***经常非常让人厌烦、没有高通量并且难以处理。还开发了各种微流体(芯片上的类球体)装置以增加类球体形成效率。然而，这些技术中的许多仍然具有诸如长期培养和装置与药物的相容性的问题。另外，这些微流体装置中的许多与各种现存高通量筛选(HTS)***不相容，并因而不能被商业化以使制药工业受益。
在本公开某些实施方案的开发过程中进行的实验导致开发了高通量悬滴阵列***，该***允许具有均匀尺寸的类球体的高效形成和/或在标准化的板格式下的长期类球体培养，并且与各种可商购获得的HTS***相容，这使得这些高通量悬滴阵列***非常适合于商业化以便被更广泛地使用。
本文描述的装置、方法和/或***的某些实施方案克服了，例如稳健的液滴处理的障碍，如在不发生下列情况的前提下将流体引导至流体将行进至的板区域中所存在的困难：不发生由例如移液管定位不准确造成的流体散布到所述板的其它部分，不发生由于例如振动、运动引起的流体散布至超过所述板的所需区域，不发生由于润湿引起的液体散布，以及其组合。例如，某些实施方案产生更稳健的液滴处理，这部分由于所述板底部的高台结构所引起，所述高台结构允许具有可高度再现的几何结构和尺寸的悬滴形成在限定位置，而不存在散布或存在最低程度的散布。其它实施方案导致可再现体积的流体容易转移到进入孔洞中和从进入孔洞中转移出。其它实施方案导致诸如移液管尖端和转移针(pin)的液体处理设备能够与进入孔洞较容易地、较快速地且较准确地对齐。
某些实施方案旨在处理流体和/或产生含有下列的一种或多种的流体悬滴：细胞混悬液和/或细胞团；复杂的生物结构，例如，一种或多种胚胎、组织样本、小生物体、蠕虫等或其组合；流体含有物理、化学和/或生物实体；或其组合。某些实施方案旨在处理流体和/或产生流体悬滴，其中所述悬滴含有细胞混悬液和/或细胞团。某些实施方案旨在处理流体和/或产生流体悬滴，其中所述悬滴含有复杂的生物结构，例如，一种或多种胚胎、组织样本、小生物体、蠕虫等或其组合。某些实施方案旨在处理流体和/或产生流体悬滴，其中所述悬滴含有物理、化学、生物实体，或其组合。
某些实施方案旨在处理流体和/或产生流体悬滴，其中：可以使细胞混悬液和/或细胞团生长，可以保持、测试、分析细胞混悬液和/或细胞团，或其组合；可以通过在悬滴中蒸发而使一种或多种蛋白质结晶和/或可以分析一种或多种蛋白质；可以在悬滴中观察和/分析纳米粒子；悬滴用作使化学、物理和/或生物变化发生的反应器；或其组合。某些实施方案旨在处理流体和/或产生流体悬滴，其中可以使细胞混悬液和/或细胞团生长，可以保持、测试、分析细胞混悬液和/或细胞团，或其组合。某些实施方案旨在处理流体和/或产生流体悬滴，其中可以通过在悬滴中蒸发而使一种或多种蛋白质结晶，可以分析一种或多种蛋白质，或其组合。某些实施方案旨在处理流体和/或产生流体悬滴，其中可以在悬滴中观察和/分析纳米粒子。某些实施方案旨在处理流体和/或产生流体悬滴，其中悬滴用作使化学、物理、生物变化发生的反应器，或其组合。
某些公开的实施方案改进液体转移的简易性。例如，在某些实施方案中，进入孔洞顶面上的高台结构使得不论液体处理是手动进行还是使用自动化***进行，在液体转移期间移液管尖端或转移针都容易与进入孔洞对齐。该顶面上的高台结构还可以阻止液体从一个进入孔洞溢出或从一个进入孔洞散布至另一个进入孔洞。
细胞在3D条件下正常生长，因此为了获得准确而有意义的治疗示值读数，以高通量方式模拟生理微环境的新3D筛选和测试高台如3D类球体培养***在制药工业和其它工业中有用。由于准确而有意义，预期例如所获得的结果和/或测量值与被调查主题相关并且对被调查主题有价值。例如，样本可以产生密切模拟由动物和/或人体内研究产生的研究结果的结果和/或测量值。这可以包括遵循相似趋势或在可接受的数值范围内，例如在从动物和/或人体内研究获得的测量值的10％至30％范围内的定量和定性结果。也考虑了其它可接受范围，其取决于所寻求的测量值。
已开发出提供细胞在生理微环境中的高效和/或高通量培养的复杂装置。然而，在学术实验室中创建的这些智能装置中的大多数缺乏以更广泛地用于工业的商业化的能力。在本公开某些实施方案的开发过程中进行的实验导致开发了各种类球体形成和培养悬滴阵列板，所述板与各种可商购获得的用于高通量类球体形成和长期培养的HTS仪器和工具相容。这些***高效地形成类球体作为用于药物筛选和测试以及其它基于细胞的应用或其组合的优异的生理3D组织和肿瘤模型。在某些实施方案中，长期培养一般意指可以将细胞和/或细胞团保持在可存活状态下，持续比常规类球体培养方法长的时间，例如，1周至6周或更长时间。但是考虑了如本文所公开的其它时间范围。这是可能的，因为培养基可以容易地使用手动移液管和/或自动化液体处理***通过进入孔洞更换，从而保持类球体生长和生存的充足条件(例如营养物水平)。这使得类球体能够在阵列板上连续培养，而不会出现在类球体已超出特定尺寸或培养时间之后因为培养基中的可用营养物有限而需要将类球体转移至单独的容器。
高通量筛选(HTS)一般意指实施方案与在药物发现和化学及生物学相关领域中使用的显微镜检查、分析和/或自动化***相容。一个***(或这些***的组合)允许研究者在一天中执行大量的测试，例如100个至100,000个测试。在某些实施方案中，可执行的测试数量可以为100个至10,000个、500个至10,000个、100个至20,000个、1000个至30,000个、1000个至50,000个、10,000个至80,000个等。HTS允许研究者鉴定相关的化学和生物实体并且了解生物过程。主流HTS仪器设计用于对包含在符合ANSI/SBS标准的微量滴定板上的样本执行操作或任务，如液体处理、成像、显微镜检查，或光学检测。在一些实施方案中，所述装置(阵列板或者阵列板与罩盖和底板的组合)符合标准，例如当前ANSI/SBS标准，从而允许所述装置与HTS仪器一起使用，这意味着悬滴或类球体的产生和评估可以容易地按比例扩大。
某些实施方案提供了多重(例如，1536、384、96等)悬滴阵列板，所述板提供了易于处理的培养基更换程序。在其它实施方案中，进入孔洞布置在行和列的其它合适的多重构造中，例如18(3×6)、25(5×5)、72(6×12)、100(10×10)，或625(25×26)孔洞。符合标准，例如ANSI/SBS(美国国家标准学会/生物分子科学协会)设定的当前标准的标准化(例如，16×24384-孔、8×1296-孔)格式的使用提供了与大多数可商购获得的HTS仪器的相容性。使用液体处理机器人的悬滴形成和随后的培养基更换程序展示在图1c中。本文描述的悬滴阵列板用作例如用于多种应用的高通量3D筛选/测试平台。
本公开某些实施方案的装置、方法和/或***提供了优于目前可用装置的一个或多个优势。一些优势包括，但不限于：使具有均匀且可调节的细胞团尺寸(例如，可以通过板结构的几何结构、细胞接种数量或培养时间来控制细胞团的尺寸/体积)的细胞生长的能力；与现存高通量筛选仪器如液体处理***和读板仪的相容性；适合于形成生理相关模型(例如，通过模拟氧梯度、扩散传输，和在实体肿瘤和组织中发现的细胞分布)；适合于高通量筛选；适合于细胞团的大量生产；适合于细胞团的长期培养；提供了由于培养的液滴与气体的最大表面接触所引起的高效的气体交换；在细胞接种、培养基更换和试剂添加与除去期间内容物进出板的高效转移(移液)；在实验的不同时间点期间细胞、培养基、试剂和其它内容物的添加和除去的简易性；对来自板的顶部和底部的细胞团的收获；劳动力、时间和成本或其组合的减少。例如通过使细胞团的生长和测试，以及形成、保持流线型化和简化而降低成本，因为细胞团的测定在同一板上进行并且容易进行，细胞团高效形成(例如，标准384-孔格式减少测试化合物和试剂的消耗，多孔格式意味着分配液体消耗的时间减少并且针对固定数量的终点的板操控的次数也减少)或其组合。
某些实施方案的其它优势是培养基的消耗最少，和/或在细胞处理中需要的药物或其它测试化合物的量最少。因为类球体生长在小体积，例如少于100微升至20微升的培养基的单个液滴中，所以类球体培养需要明显较少的培养基。因此，在细胞处理中需要明显较少的药物和测试化合物以获得在液滴中的期望药物浓度。在某些实施方案中，液滴的体积可以小于200微升、125微升、100微升、80微升、60微升、40微升、20微升，或10微升。在某些实施方案中，液滴的体积可以在10微升至250微升、10微升至200微升、20微升至200微升、20微升至100微升，或100微升至250微升的范围内。
例如，某些实施方案提供了使具有均匀且可调节的细胞团尺寸的细胞生长的能力。在一些实施方案中，均匀尺寸意指在整个培养期中类球体的尺寸或体积的变化可以保持在小范围内，例如3％至5％的范围内。在一些实施方案中，可调节的尺寸意指类球体的最终尺寸或体积可以通过接种的细胞数量、培养期的时间长度，和/或其它参数控制。在某些实施方案中，均匀的尺寸可能意味着在整个培养期或在培养期的足够长的一部分时间内类球体的尺寸或体积变化可以保持在诸如1％至10％、2％至8％、2％至5％、3％至8％、4％至10％，或5％至10％至5％的范围内。在某些实施方案中，可调节尺寸意指类球体的最终尺寸或体积可以通过接种的细胞数量、培养期的时间长度，和/或其它参数控制。
某些实施方案与现存高通量筛选仪器如液体处理***和读板仪具有相容性。与在高通量和高内涵筛选中使用的显微***、自动化器材如液体处理、检测和/或成像***的相容性是本公开获得的必要优势。某些***实施方案设计成多孔板格式，所述多孔板格式符合主流仪器可接受的标准，例如当前ANSI/SBS标准。使用自动化仪器，类球体的产生和/或评估可以使用本文公开的多个阵列板按比例扩大。进入孔洞使得液体能够容易地转移到用于类球体的保持和处理的液滴中和从所述液滴中转移出。使用高通量仪器，类球体的产生和评估可以容易地使用多个阵列板按比例扩大。
某些实施方案适合于形成生理相关模型(例如，通过模拟氧梯度、扩散传输和在实体肿瘤和组织中发现的细胞分布)。例如，某些测试化合物对于定居在类似于实体肿瘤的类球体的低氧核中的细胞更有效，在低氧核中细胞对氧的消耗是活跃的和/或扩散氧运输受到限制。例如，某些测试化合物对于抑制休眠细胞的生长不太有效，休眠细胞通常定居在类球体内部并且难以在2D细胞培养物中复制。因此，对2D培养物中的较多增殖细胞进行的测试所产生的结果在生理学上不太准确。
某些实施方案可以适合于细胞团的大量生产。在一些实施方案中，每个装置均允许在悬滴中形成384个类球体。通过使用自动化***和多个装置，可以在合理的时间段内，例如在5分钟、15分钟、1小时、2小时、5小时、10小时，或24小时内形成例如1,000至100,000个悬滴，每个悬滴均含有将形成类球体的细胞。
某些实施方案适合于细胞团的长期培养。例如，在某些实施方案中，可以培养细胞团至少1周、2周、3周、4周、5周或6周。例如，在某些实施方案中，可以培养细胞团1周至6周、1周至2周、1周至4周，或2周至5周。
某些实施方案也适合于培养细胞团较短的时间。例如，在某些实施方案中，可以培养细胞团至少30分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、8小时、12小时、24小时、2天、3天，或6天。例如，在某些实施方案中，可以培养细胞团多达30分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、8小时、12小时、24小时、2天、3天、6天或7天。例如，在某些实施方案中，可以培养细胞团30分钟至7天、2小时至24小时、30分钟至48小时、1小时至5天，或1小时至7天。
某些实施方案提供了部分由于所培养液滴与气体的最大表面接触所引起的高效气体交换。例如，与流体体积的顶面暴露于空气用于气体交换的常规多孔板中的流体相比较，在某些实施方案中形成的悬滴的显著较高比例的表面区域暴露于空气用于交换(在进入孔洞和进入孔洞顶部开口下面的整个液滴表面)。高效的气体交换经常用于某种气体组分(例如氧气)的浓度与细胞行为有关的研究中。
某些实施方案提供了在细胞接种、培养基更换和/或试剂添加与除去期间内容物进出板的高效转移(移液)；在实验的不同时间点期间细胞、培养基、试剂和/或其它内容物的添加和除去的简易性；对来自所述板的顶部和底部的细胞团的收获；劳动力、时间和成本的减少；或其组合。对单个类球体的监测和/或操控是某些公开的实施方案的其它优势。处理前和处理后的单个类球体分析也对于某些公开的实施方案有利。因为每个类球体都被分离并且生长在其自身的液滴中，所以它们可以用化合物单独地处理、使用显微技术和分析方法单独地监测和分析、单独地收获用于进一步处理，或其组合。此外，持续1周至6周的时间的单独类球体的长期培养和评估是可能的。也考虑了其它时间段。因为培养基可以容易地使用手动移液管或自动化液体处理***通过进入孔洞更换，从而保持对于类球体生长和生存的充足的营养物水平。所以，在类球体已超出特定尺寸或时间之后，不会因为培养基中的可用营养物有限而需要将类球体转移至较大的容器。
某些实施方案，例如通过使细胞团的生长和测试，以及形成、保持流线型化和简化而导致成本降低，因为细胞团的测定在同一板上进行并且容易进行，细胞团高效地形成(例如，标准384-孔格式减少测试化合物和试剂的消耗，多孔格式意味着分配液体消耗的时间减少并且针对固定数量的终点的板操控的次数也减少)或其组合。例如，与使用常规96孔板进行的每个样本(每个孔)需要200微升细胞培养基的标准测试相比较，在某些实施方案中每个样本仅需要20微升培养基，从而减少细胞培养基的数量和在细胞培养基上花费的成本。同样地，在一些实施方案中，在每个样本中获得相同的处理浓度需要少10倍的测试化合物，这具有重大意义，因为在临床前和临床实验中使用的许多药物的生产费用昂贵并且是以极低的量生产的。与使用常规方法在培养皿底面上形成的悬滴相比较，在采用自动化***的某些实施方案中的384个类球体的形成仅需要常规方法所需时间(和劳动力)的一小部分，范围为1秒至15秒，与5分钟至15分钟。
在一些实施方案中，所述装置通过下列加以辨别：收获来自板的顶部和/或底部的细胞的能力、在悬滴板和底板之一或两者上包括储器(例如储水器)的能力；允许制造期间的易成型和脱模的简单板设计以及对细胞团和化学实体进行板上分析(on-plate analysis)(例如，不需要为了进行分析而将板的内容物收获到单独的板、容器或装置中；可以通过将含有内容物的板放置在标准高通量筛选仪器如读板仪中来进行分析例如比色分析、荧光分析、发光分析等，并且可以对所培养液滴的光学信号进行直接照明和检测，因为样本下面不存在如常规多孔板中的塑料材料)的能力，或其组合。在其它实施方案中，底板是基本上光学透明的并且提供了液滴的无遮挡的视野，从而允许液滴的光学信号的照明和检测利用位于底板顶部上的阵列板进行。
在某些实施方案中，底板提供了使成像和分析较容易进行的类球体的无遮挡的视野。在某些实施方案中，底板提供了在阵列板上的类球体的无遮挡的视野以便方便类球体成像和类球体的光学分析。
为了在包括长时间段在内的各种时间段内培养类球体，在某些实施方案中优选将悬滴中的细胞培养基的渗透度保持在相对稳定的范围内。在某些实施方案中，相对稳定的范围可以是将悬滴的期望参数保持至期望或所陈述参数的±1％、±3％、±5％、±8％、±10％、±15％、±20％，或±25％。在某些实施方案中，相对稳定的范围可以是将悬滴的期望或所陈述参数保持至足够大的变化范围，使得可以获得或基本上获得培养的最终结果。在某些实施方案中，将悬滴中的细胞培养基的渗透度保持在相对稳定的范围内。例如，在初始渗透度测量值的10％至20％的范围内。在其它实施例中，在初始渗透度测量值的3％至20％、5％至15％、5％至25％、5％至10％，或15％至20％的范围内。在某些实施方案中，类球体培养物可以保持在稳定范围内，持续1周至6周。例如，在某些实施方案中，类球体培养物可以保持在稳定的范围内，持续至少30分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、8小时、12小时、24小时、2天、3天，或6天。例如，在某些实施方案中，类球体培养物可以保持在稳定范围内，持续30分钟至7天、2小时至24小时，30分钟至48小时、1小时至5天，或1小时至7天。也考虑了其它范围。
某些实施方案提供了产生悬滴中类球体形成的高度可再现性的能力。因为类球体可以利用基本上相同的起始数量的细胞形成，并且类球体形成在分离的体积中，所以类球体的生长是可高度再现的并且避免了产生尺寸变化的邻近类球体的融合，因为避免了单个类球体之间的接触。在某些实施方案中，类球体之间的尺寸变化在整个培养期中可以保持在3％至5％的范围内。在某些实施方案中，类球体之间的尺寸变化在整个培养期中可以保持在3％至5％、2％至6％、1％至6％，或3％至6％的范围内。在某些实施方案中，类球体之间的尺寸变化在培养期的大部分时间内可以保持在3％至5％、2％至6％、1％至6％，或3％至6％的范围内。
在某些实施方案中，液滴的稳定性可被改进，部分由于进入孔洞底面处的高台结构。液滴稳定并保持在限定的尺寸和位置，从而基本上限制了液滴的散布。
由于悬滴体积小的性质，蒸发可以导致培养基的渗透度移动。在一些实施方案中，为了在类球体培养期间阻止这种移动或基本上阻止这种移动，将悬滴阵列板夹在孔板罩盖与填充有蒸馏水或其它水溶液的板(例如96孔板)之间，并随后将整体构造(setup)包裹在封口膜或其它密封材料中。直接在悬滴底部上的水填充板(或水性填充板)提供了对悬滴的湿润。在一些实施方案中，在所述板周边的储水器或水溶液储器(例如在图1b和图1d中所示)与封口膜一起阻止悬滴的大量蒸发，尤其是更靠近板侧面的液滴的大量蒸发，在所述板侧面液滴更易于蒸发。利用此种构造和每隔一天进行的培养基更换，可以将mES细胞、Cos-7细胞和A431.H9细胞培养基的渗透度保持在300mmol/kg至360mmol/kg的稳定范围内(图2a)，所述范围在细胞培养的最佳范围内。在某些实施方案中，将悬滴中的细胞培养基的渗透度保持在相对稳定的范围内，例如在初始渗透度测量值的10％至20％的范围内。活/死染色图像进一步显示大多数细胞在培养2周后仍然是活着的。另外，各种不同尺寸的A431.H9类球体都似乎在1周时间内适当地增殖(图2c)。与悬滴完整性的稳健性一起，悬滴阵列板提供了类球体的长期培养，这对于常规悬滴***或方法将是不可能的。
为了证明使用示例性实施方案进行的药物筛选，测试了2种药物——非常规的低氧敏感的药物替拉扎明(tirapazamine)(TPZ)和常规抗癌药5-氟脲嘧啶(5-FU)对2D和3D培养条件下的A431.H9细胞的作用。TPZ是仅在低氧条件下才会被激活，从而产生导致DNA损害的代谢物的低氧细胞毒素。细胞内还原酶将TPZ转化成在低氧条件下引起DNA单链和双链断裂、碱基损害，以及染色体畸变的细胞毒性自由基。在正常条件下，氧导致TPZ自由基反向氧化成无毒性的母体化合物，并因而大大降低细胞毒性。测试了TPZ对在常规2D条件下作为附着细胞培养以及使用384悬滴阵列板作为3D类球体培养的A431.H9细胞的作用。发现2D条件的IC50(～50μM)大于3D条件的IC50(～8μM)。因此，与大多数药物测试相反，A431.H9细胞在常规2D条件下培养时对TPZ的抗性大于在3D类球体下培养时对TPZ的抗性。这主要是由于存在于3D类球体内的固有氧梯度所引起。因为扩散限，直径大于500μm的类球体通常在中心具有低氧核以及相对于类球体外表面的相应氧梯度。因为TPZ是在低氧条件下具有更大细胞毒性的低氧药物，所以它对作为3D微球体培养的A431.H9细胞的敏感性大于对在不存在氧梯度的2D条件下培养的A431.H9细胞的敏感性。从在2种不同培养条件下测试的相同药物获得的IC50之间的明显差异证明3D模型对于药物筛选和测试目的的实用性。正如类球体一样，固有氧梯度也存在于实体肿瘤内部。3D肿瘤模型因而提供了更加准确且有意义的治疗示值读数。3D肿瘤模型在筛选靶向肿瘤低氧内部中的休眠细胞的药物方面有用。
5-FU是抑制细胞增殖的常规抗癌药物。在5-FU情况下，发现在3D条件下的IC50(～1μM至100μM)大于在2D条件下的IC50(～0.1μM)。与预期的一样，A431.H9细胞在作为3D类球体培养时对5-FU的抗性大于在2D条件下培养时对5-FU的抗性。由于类球体的3D完整性，因此5-FU更难以扩散和穿透到中心细胞团块中。此外，5-FU特异性地靶向增殖细胞，因而可能不能灭杀类球体内部区域中的休眠细胞。尽管如此，这仍证明了3D模型在药物测试和筛选应用方面的重要性。从2D和3D测试高台发现的5-FUIC50对于A431.H9细胞而言非常不同。
生理3D模型提供了从长远来看节省时间和资源的更加准确且有意义的结果。在本公开实施方案的开发过程中进行的实验克服了以高通量方式按比例扩大细胞的长期3D培养的困难，这是通过开发出与各种可商购获得的高通量筛选仪器相容的标准格式的悬滴阵列板实现的。
I.装置和***
下面的描述提供了本公开实施方案的示例性装置的详细描述。下面描述的装置是本公开的示例性非限制性实施方案。本公开不希望局限于本文所述的示例性装置。
图5示出示例性测定板1。图6示出替代测定板4。测定板1和测定板4各自含有多个孔3。然而，应理解，本公开不局限于特定构造。测定板可以含有任意数量的孔。在一些实施方案中，使用12x8、24x16，或其它构造。在一些实施方案中，使用多个阵列板(例如，24x16阵列板)的阵列。测定板1和测定板4还包括沿着所述板的一个或多个(例如，全部四个)边缘的储水器2。
图7和图8示出测定板1的横断面。所述横断面示出孔3，所述孔包含具有底面9和顶面10的孔洞6。在一些实施方案中，孔洞6的直径大约为1.6mm。在一些实施方案中，孔洞6之间的距离大约为4.5mm。在一些实施方案中，所述孔包含紧挨着每个孔洞6的额外突起(protrusion)、高台，或环形物(ring)5。在一些实施方案中，突起5的高度大约为0.5mm。图7也示出滴定板1的横断面，其示出罩盖7和微量滴定板(例如，96孔板)8。所述板8位于孔3的下面。在一些实施方案中，所述板包含在所述板的孔中的液体(例如水)。在一些实施方案中，所述板8中的储水器在所述边缘周围或在另一位置。在一些实施方案中，一个或多个储水器在所述板周围的一个或多个边缘上。在其它实施方案中，一个或多个储水器位于不干扰或基本上不干扰进入孔洞位置的位置处。在一些实施方案中，储器含有水性流体。在其它实施方案中，储器含有不像水性流体那么容易溢出并且可以提供加湿蒸汽的水凝胶如琼脂糖凝胶。在其它实施方案中，储器含有固体，例如以测试化合物形式汽化出来的化学物。
图14示出所述装置的额外实施方案。在一些实施方案中，所述装置包含在孔洞6下方和/或上方的额外环形物11。在一些实施方案中，所述环形物的宽度为0.25μM，但是考虑了其它尺寸。在一些实施方案中，环形物11的高度大约为0.5μM，如从所述板的顶部或所述高台的底部开始测量的。在一些实施方案中，位于孔洞上方的环形物11起到阻止液体散布在顶面上的作用。在一些实施方案中，位于高台底部上的环形物11增强液滴稳定性。
在一些实施方案中，所述板8含有水、其它水性流体、凝胶、测试化合物、吸附材料或其组合。
在一些实施方案中，经由孔洞6的顶面10将液滴***到孔洞6中，使得所述液滴从底面9悬挂下来并延伸到孔6的底部下面而进入突起5中，如图1A所示。在一些实施方案中，孔8中的液体和罩盖7的组合为液滴提供了加湿室。在一些实施方案中，将包括测定板、加湿室和覆盖件的装置包裹在实验室包裹物如PARFILM包裹物中以进一步防止蒸发。
在一些实施方案中，装置包括这样的构造，即在罩盖或其它组件与进入孔洞、悬滴和边缘之间提供了一些接触、接触，或相当大的接触(例如，以将细胞和试剂转移到板中和从板中转移出)。
在一些实施方案中，所述板8是多孔板。然而，在其它实施方案中，利用额外构造，所述额外构造包括但不局限于测定块(assayblock)、容器、凝胶床等。
图16-图24示出额外实施方案。在一些实施方案中，所述装置包含测定板161、托架(tray)201，和罩盖211。测定板161包含多个孔163和沿着所述板的一个或多个(例如全部四个)边缘的储水器162。在一些实施方案中，测得测定板161的基部为85.49mm×127.77mm。图17A-D示出测定板161上的孔163的阵列的各种视图。孔163包含具有顶面172和底面173的孔洞171。在一些实施方案中，孔洞171的直径大约为1.6mm。在一些实施方案中，孔洞171之间的距离大约为4.5mm。在一些实施方案中，孔洞171包含在顶面172上的多个上高台结构174。在一些实施方案中，孔洞171包含在顶面173上的多个下高台结构175。在一些实施方案中，上高台结构174有助于使用于液体处理的设备与孔洞171对齐，和/或阻止液体从一个孔散布到另一个孔。在一些实施方案中，下高台结构175基本上将悬滴限制在特定位置并限制为特定几何结构，和/或阻止悬滴散布至相邻孔。
在一些实施方案中，上高台结构174和/或下高台结构175使用与测定板161基本上相同的材料和/或工艺制造。在其它实施方案中，上高台结构174和/或下高台结构175使用与测定板161基本上不同的工艺和/或材料制造。在一些实施方案中，高台结构是使用3D原型法(Prototyping Method)创建的。在其它实施方案中，高台结构是化学实体、生物实体或其组合的印刷结构。
图18示出单孔163的顶视图、横断面视图和底视图。图19示出孔163的阵列的横断面视图和3D表示。
图20A-图20F示出托架201的各种视图。图21A-图21F示出罩盖211的各种视图。图22A-F示出由测定板161、托架201，和罩盖211形成的组合件221的各种视图。罩盖211覆盖测定板161并安放在测定板161的顶部上。测定板161安放在托架201的顶部上。在一些实施方案中，测定板161基本上被托架201和罩盖211封闭。
在一些实施方案中，托架包含板，所述板包含沿着所述板的一个或多个(例如全部四个)边缘的储水器202。在其它实施方案中，储水器在一个或多个其它位置。在一些实施方案中，一个或多个储水器位于可提供孔163的无阻挡的视野的位置，其使成像和分析较容易进行。在某些实施方案中，托架201基本上是光学透明的，使得能够方便地对悬滴进行成像和光学分析。在一些实施方案中，储器含有水性流体。在一些实施方案中，储水器202实质上有助于湿度的保持。在其它实施方案中，储器含有不像水性流体那么容易溢出并且可以提供加湿蒸汽的水凝胶如琼脂糖凝胶。在其它实施方案中，储器含有固体，例如以测试化合物形式汽化出来的化学物。
在一些实施方案中，组合件221的一个或多个组件基本上是光学透明的。在一些实施方案中，所述组合件具有足够的气密性从而允许所述组件的内部和外部之间的气体交换。在一些实施方案中，所述组合件改进了所述组合件内湿气的保存。在一些实施方案中，所述组合件的组件的配合基本上是紧密的，使得所述组件能够在处理期间稳固地安放在彼此上。
图23A-图23B示出堆叠的三个组合件221的侧视图和正视图。在一些实施方案中，托架包含结构203，并且罩盖包含结构212，所述结构允许组合件221基本上稳固地堆叠在彼此上并且在处理期间仍然如此。
图24A-图24D示出根据某些实施方案的进入孔洞结构的示例性变型。用于注射模塑制造的潜在分模线用线241表示。也考虑了分模线的其它位置。图24A示出在顶面上具有长而细的高台结构的示例性进入孔洞结构。图24B示出在顶部上具有短而细的高台结构的示例性进入孔洞结构。图24C示出在顶部上具有长而粗的高台结构的示例性进入孔洞结构。图24D示出在顶部上具有长而细的高台结构、具有不同的示例性进入孔洞结构。
在一些实施方案中，进入孔洞在行和列的多壁或多孔类型的形成物中。在其它实施方案中，利用替代的几何构造(例如，圆形布置、不规则图案等)。在一些实施方案中，进入孔洞和高台在每个板上可以具有相同的尺寸、几何结构和/或设计。在一些实施方案中，进入孔洞和高台在每个板上具有基本上相同的尺寸、几何结构和/或设计。在其它实施方案中，进入孔洞和高台的尺寸和/或形状是可以变化的。在一些实施方案中，进入孔洞结构/几何结构可以合并到其它装置(例如分析装置)中。
装置可以由合适的材料或材料组合建造。实例包括但不局限于：塑料(例如，生物相容性塑料、聚苯乙烯或其它聚合物塑料)、纸、金属、玻璃或其组合。在一些实施方案中，利用注射模塑制造装置。在其它实施方案中，利用合适的方法或方法组合来制造装置。实例包括但不局限于：模塑(例如，注射模塑)、快速原型(例如，立体平版印刷、3D印刷、选择性激光烧结、熔融淀积建模等)、平版印刷术(软性平版印刷)、印刷，或其组合。在一些实施方案中，所述装置的一个或多个零件使用基本上不同的材料和/或工艺制造。
在一些实施方案中，对板进行处理(例如，以化学、物理、生物、质地方式处理)，以例如控制细胞行为、液滴尺寸、位置和几何结构等。用于表面处理的方法包括但不局限于：化学修饰、物理修饰、等离子体处理、汽相沉积、吸附和/或用化学和/或生物实体如药物、DNA、蛋白质等涂覆，及其组合。在一些实施方案中，进行处理：以改变阵列板的表面性质，例如疏水性、蛋白质附着性、化学组成、生物组成、物理粗糙度等，或其组合；以操控悬滴的性质，例如液滴尺寸、位置、几何结构等，或其组合；和/或控制细胞行为，例如增殖和/或分化的速率、分化谱系、某些蛋白质和代谢物的产生。在其它实施方案中，例如通过涂覆进行表面处理，以使得化学和/或生物实体能够释放和/或递送至液滴和/或细胞。在其它实施方案中，进行表面处理以产生涂层，所述涂层检测通过诸如抗体和/或抗原结合的机制引起的液滴和/或细胞性质的变化。在其它实施方案中，所述涂层通过所述涂层的光学、电学或其它可测量性质的改变来指示所述变化。例如，在一些实施方案中，装置在制造后用亲水性涂料涂覆、饰以图案等。
在一些实施方案中，在使用或包装前对板进行灭菌。灭菌利用适合于所述板的材料并适合于使用的任何方法(例如，热量、高压、化学物、辐射或其组合)进行。
在一些实施方案中，将板集成到用于控制氧气浓度、温度、湿度等的腔室/外壳(例如环境控制装置)中。
在一些实施方案中，可以改进湿度的保持。例如，阵列板和/或底板都可以含有帮助加湿密闭***内部的气氛的储水器。
在一些实施方案中，本公开提供了***和/或试剂盒，其包含装置(例如，包含测定板、储器和覆盖件)，所述装置是单独存在的或者与用于利用此类装置培养和表征细胞的试剂(例如细胞、缓冲剂、生长培养基、测试化合物、对照等)组合。在一些实施方案中，***和试剂盒包含用于高通量分析(例如样本处理和分析(例如读板仪)器材)的机器人技术(robotics)。
II.用途
本公开某些实施方案的测定板装置可用于多种应用。在一些实施方案中，本文描述的装置用于细胞如类球体(例如，癌细胞系类球体)或其它微生物或生物分子的培养。在一些实施方案中，在如本文描述的悬滴中培养类球体。培养的类球体或其它细胞可用于多种研究和筛选应用中。
在一些实施方案中，为了形成悬滴，从顶侧通过孔洞转移(使用移液管)细胞混悬液。在一些实施方案中，将移液管尖端或其它液体转移装置的端部***到孔洞中从而将样本液体引导至底面(参见图10c)。一旦有液滴形成在较低的表面上，额外液体添加(例如，生长培养基、测试化合物等)就可以不用使移液管尖端或针分配器或其它工具通过孔洞来进行，而只需要简单地通过在顶面处触碰孔洞来进行。因为较低的液滴较大，所以表面张力将会使流体从顶面流向较低表面处的液滴。这使得在随后的液体处理期间悬滴中的细胞受到的干扰最小。在一些实施方案中，更换培养基并通过经由所述板顶部的抽吸或使用毛细管和/或微流体作用和/或装置来进行细胞处理。
本公开某些实施方案的装置提供了以下优势：允许控制时间、类球体尺寸、类球体组成(例如，一种(多种)细胞类型、细胞组成、细胞的物理分布)、处理(例如，一种(多种)测试化合物、方案、持续时间、浓度)、环境(例如温度、氧气浓度、湿度等)或其组合。
也可以使用例如移液管或狭槽针(slot pin)(V&P Scientific，Inc.，San Diego，CA)通过进入孔洞从液滴中除去液体或细胞样本。而且，在悬滴中，因为不存在硬孔底，而存在根据流体体积改变位置的液滴-空气界面，所以可以吸出细胞，而无需担忧移液管尖端会把细胞或类球体压碎在硬壁上。从液滴中除去细胞的额外方法包括但不局限于：从所述板的顶部抽吸，冲洗到底板、装置或容器中，通过触碰液滴而转移到底板、装置或容器中，离心到底板、装置或容器(例如，空容器或含有供进一步生长或分化用或供用以分析的收集用的试剂或凝胶的容器)，或使用毛细管和/或微流体作用或其组合转移到另一个板、装置、容器等中。
悬滴的尺寸至少部分地受到底面上的高台的直径限制。结果，悬滴的几何结构在培养过程期间保持一致或基本上一致，而没有散布，这产生常规平直悬滴基底不可能实现的更稳健和稳定的培养条件。常规悬滴方法涉及在将液滴分配在罩盖内部上后倒置培养皿或培养板的罩盖。倒置罩盖的动作和限制每个液滴的物理结构的缺乏可能会导致液滴的散布、融合、掉落和其它改变，从而使得液滴中类球体的尺寸、几何结构、活力和其它可测量的品质具有可变性。
本公开实施方案的装置可用于多种研究、临床和筛选应用。实例包括但不限于，用于研究、药物发现和毒性测试的细胞团的形成；胚胎、组织切片、小生物体和蠕虫(例如，秀丽隐杆线虫(c.elegans))的培养；细菌培养(与表面的最低程度的接触阻止生物膜形成并增加气体交换，气体交换对于许多类型的细胞是重要的)；环境监测；气态物质的毒理学研究；水质量测试；种子发芽；诸如细胞、纳米粒子、蛋白质、肽、DNA等生物和化学实体的自组装；化学物质的结晶；通过逐渐蒸发浓缩水性溶液，成像(例如，上述过程的成像)；体外生物化学测定(例如，酶测定和受体、蛋白质-蛋白质相互作用的测定)；测量(例如比色分析、荧光分析、发光分析、辐射测量等)；细胞接种等或其组合。本文描述了某些示例性应用。
在一些实施方案中，装置用于细胞接种应用。在一些实施方案中，将细胞接种在水性培养基/试剂或凝胶中。在一些实施方案中，利用化学物、生物分子，和/或粒子(例如，纳米粒子、微球体等)接种细胞。在一些实施方案中，将细胞作为分散体或单独的单细胞或细胞团接种。本公开不局限于特定细胞来源。在一些实施方案中，细胞具有多种起源(例如，人、大鼠、小鼠等)并可以使用不同的形式(例如，原代细胞、细胞系、干细胞、诱导的多能干细胞等)。在一些实施方案中，接种多种细胞类型以实现细胞的共培养(例如，一次或单次接种多种细胞类型的混合物，和/或以顺序方式接种多种细胞类型的混合物)。在一些实施方案中，可以使用活着的、生长中的、处于休眠状态的或经化学处理(例如通过化学固定剂固定)的细胞。
在一些实施方案中，使用本公开装置和方法培养的细胞或类球体可用于药物筛选应用。例如，在一些实施方案中，使培养的癌细胞系类球体或其它细胞与抗癌或其它测试药物接触。在一些实施方案中，可以使用诸如化学物、蒸汽(例如，萘)、生物分子或纳米粒子(例如，单独或缀合至药物的生物分子或纳米粒子)的测试化合物或条件。然后监测细胞的活力(例如，使用针对活力染色的染料和读板仪)。
在一些实施方案中，所述装置可用于保持干细胞(例如，癌症干细胞)。在一些实施方案中，可以将癌症干细胞与类球体共培养以模拟肿瘤的体内环境。使用此类方法培养的癌症干细胞可用于研究和药物筛选应用。
根据某些实施方案的阵列装置的使用允许高通量筛选和研究应用。在一些实施方案中，装置可以包含一个或多个96、384或其它尺寸的孔阵列。具有标准尺寸的阵列的使用允许使用用于高通量筛选应用的现存机器人器材(例如，可商购获得的器材如液体处理和读板仪)。本发明某些装置实施方案也适于堆叠。
实验
提供以下实施例以演示和进一步说明本公开内容的某些优选实施方案和方面，且不能被解释为限制其范围。
实施例1
A.方法
装置设计：
图1a中示出基于悬滴细胞培养技术的类球体培养装置。所述装置通过使用聚苯乙烯树脂进行注射成型来制造。为了克服在悬滴方法的液体处理中的缺点，每个细胞培养位点由穿过培养基的进入孔洞组成，培养基在底面具有高台。这些细胞培养位点以384孔板格式(16行、24列且在两个方向上相距4.5mm，如图1b和图1c所示)布置，这使得可以使用通常在生物医学实验室中使用的可商购的高通量筛选仪器(如流体操纵机器人和读板仪)。此外，板尺寸也被设计成与一般的384孔板相同，且可与其它孔板堆叠。为减轻常见的由于悬滴的小体积(数十μl)所导致的蒸发问题，已环绕培养位点***构建了储水器。
在板使用之前，在整个装置表面涂敷亲水涂层(Pluronic F108，0.1％)一小时。然后使用蒸馏水冲洗板，使用氮气将板吹干，且通过使板暴露于紫外线灯半小时来灭菌。为形成悬滴，使用或者单通道或多通道移液管或自动化液体处理机器人将细胞混悬液经进入孔洞移走。注意，每个移液管的末端被***进入孔洞，以将样本液体引导至底面。还可使用移液管或槽针移液器(V&P Scientific，Inc.)经进入孔洞从滴中移除液体或细胞样本。因此，整个样本处理过程可自板的顶面完成，从而避免了在常规悬滴方法中使用的繁琐的培养皿倒置。此外，此液体处理方案使所述装置完全与自动化高通量筛选仪器相容，且使得增大类球体实验的规模成为可行。此外，悬滴的尺寸受底面上的高台的直径限制。结果，悬滴的几何结构可在培养过程中保持一致而不会铺开，从而导致更健壮和稳定的培养条件。
方法：
为调查使用所述设计的阵列板进行的长期悬滴类球体培养的稳定性，在培养以下三种细胞时进行渗透度测量：肾成纤维细胞(COS7)、小鼠胚胎干(MES)细胞(ES-D3)以及稳定表达间皮素的人类癌细胞(A431.H9)。在使用板进行悬滴培养之前，在涂敷有0.1％w/v猪凝胶(Sigma-Aldrich)的培养皿中培养ES-D3细胞且将其保持在由以下物质组成的培养基中：具有15％v/v胎牛血清(FBS)(Gibco 10082，Invitrogen)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)(Gibco 11960，Invitrogen)；4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)；0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)；0.02％v/v丙酮酸钠(Sigma-Aldrich)；100U ml-1青霉素(Invitrogen)，100U ml-1链霉素(Invitrogen)以及含有白血病抑制因子(LIF)的1000U ml-1 ESGRO(Invitrogen)。COS7和A431.H9细胞在具有10％v/v FBS(Gibco 10082，Invitrogen)和1％v/v抗生抗菌素(Gibco 15240，Invitrogen)的DMEM(Gibco 11965，Invitrogen)中培养。所有细胞在加湿孵育器(37℃、5％CO2气氛)中培养。用于悬滴实验的细胞混悬液由具有0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco25200，Invitrogen)的游离细胞制成，游离细胞在室温中以1000rpm离心过滤1分钟，然后被重新混悬在生长培养基中。细胞密度用血球计估计。
对类球体培养板上，15μl细胞混悬液被分配进每个细胞培养位点的进入孔洞中以形成悬滴。为防止蒸发，向***储水器中加入4ml蒸馏水。此外，板被夹在孔板罩盖与填充有蒸馏水的96孔板之间，且使用封口膜包裹。通过从滴中取出5μl溶液并加入7μl新生长培养基进入滴中来每隔一天交换生长培养基。为进行渗透度测量，从滴中吸出10μl样本溶液并将其转移到蒸气压渗压计(Vapro Model 5520，Wesco，Inc.)中进行分析。
为演示抗癌药物敏感性测试，在两种药物-替拉扎明(TPZ)(Toronto Research Chemicals)和5-氟尿嘧啶(5-FU)(Sigma-Aldrich)的作用下测试三个不同尺寸(300、1500和7500细胞类球体)的A431.H9类球体。根据上述步骤，规定细胞数的A431.H9类球体形成，且每隔一天交换各自的生长培养基。开始时在达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)(Gibco 14190，Invitrogen)中制备4倍于最终测试浓度(0、0.1、1、10、100、1000、5000μM)的TPZ和5-FU原液。在A431.H9类球体培养的第2天，连续在每个15μl A431.H9细胞悬滴液滴中加入5μl适合浓度的TPZ(或5-FU)原液。在使用阿尔玛蓝(alamarBlue)(Invitrogen)进行药物培养24、48、72和96小时后监测细胞活力。根据制造商协议，在每个A431.H9悬滴类球体样本中加入2μl(每个悬滴样本体积的十分之一)的阿尔玛蓝并培养2小时。在培养之后，使用在525nm激发和590nm发射的读板仪(FLx800 FluorescenceMicroplate Reader，Biotek)读取每个A431.H9悬滴类球体样本板以获得荧光强度读数。因为阿尔玛蓝的荧光强度与细胞数成正比，通过常化至0μM未处理的类球体对照，可容易计算出针对每一药物浓度的平均百分数细胞活力。在标准组织培养处理的96孔板(Corning Costar3596)中进行2D控制条件下的抗癌药物敏感性实验，而其它全部与3D类球体实验相同。每隔一天用新培养基更换50％的培养基。
B.结果
图1a示出384悬滴阵列板的示意图，图1b示出含有以交替方式布置的192悬滴的板的图片。悬滴类球体培养位点以标准化384孔板格式(16行，24列，在两个方向上以4.5mm隔开)布置。设计在板的外环的储器进一步容纳4达ml的水，以减轻蒸发。图1a的放大草图进一步示出板的顶面的进入孔洞，所述进入孔洞有液滴悬挂且受底面上的高台的直径限制。由聚苯乙烯板造成的这种惯例允许以高通量阵列格式有效形成悬滴。图1c为借助可商购的液体处理器(CyBi-Well)在384悬滴阵列板上形成悬滴的过程的快照，所述快照表明以高通量方式使用此板按比例扩大悬滴类球体培养规模的实用性。
图2a示出COS7、mES和A431.H9细胞培养基的平均渗透度与为期5天的时间的关系图。由于每隔一天的～50％的培养基交换，细胞培养基的渗透度在为期2周的时间中相对稳定。图2b示出COS7和mES细胞类球体的存活/死亡图像。图像表明，大部分细胞在12天培养之后仍然存活。图2c示出A431.H9类球体尺寸(直径)和细胞数之间的关系。为调查在384悬滴阵列板上培养的类球体否生长正常，每天对类球体尺寸进行监测。图2c还示出1周的时期中平均A431.H9类球体的尺寸。关系图清楚地示出各种不同尺寸的A431.H9类球体在7天培养期中仍在增殖。培养基渗透度的稳定性与正常的类球体生长共同表明，384悬滴阵列板为类球体培养提供了适合的环境。悬滴培养条件的稳定性以及不会铺开的悬滴几何结构的健壮性允许容易的长期类球体培养。
为演示在384悬滴阵列板中的抗癌药物敏感性测试，测试两种抗癌药物，TPZ和5-FU。图3a-c示出针对3个不同类球体尺寸(300、1500和7500细胞类球体)以0、10和5000μM TPZ处理的A431.H9类球体的时移图像。所有3个尺寸的对照未处理A431.H9类球体在药物处理的持续期间生长和增殖正常。另一方面，针对所有3个类球体尺寸以10μM的TPZ处理的A431.H9类球体的尺寸在药物处理期间保持相对恒定，表明对类球体生长的抑制。最后，针对所有3个尺寸以5000μM TPZ处理的A431.H9类球体在96小时的药物处理期间越来越展现出差的活力，表明药物的细胞毒性。图3d示出针对所有3个A431.H9类球体尺寸和常规2D培养条件，在初始药物处理96小时之后，在各种TPZ浓度下的％细胞活力的条形图。在常规2D条件下培养的A431.H9细胞的IC50为约50μM，而的所有3个尺寸的A431.H93D类球体IC50为约8μM。与大多数抗癌药物相反，TPZ处理的A431.H9细胞在2D条件下培养比在3D条件下培养时耐受性更强。
类似地，图4a-c示出针对3个不同类球体尺寸(300、1500和7500细胞类球体)以0、10和5000μM 5-FU处理的A431.H9类球体的时移图像。再次，所有3个尺寸的对照未处理A431.H9看起来都很健康且在药物处理期间仍然正常增值。然而，当A431.H9类球体以10μM5-FU处理时，所有3个尺寸的A431.H9类球体在96小时的药物处理期间缓慢变小，表明类球体生长的抑制。最后，当A431.H9类球体以5000μM 5-FU处理时，类球体的完整性被极大破坏，其中所有3个尺寸的细胞在药物处理的48小时之后开始脱离。在药物处理的96小时之后，大部分细胞已脱离A431.H9类球体，表明药物的细胞毒性。图4d以5-FU条形图总结了结果，图中概括了在针对所有3个A431.H9类球体尺寸和传统2D培养条件处理96小时之后，各种浓度的％细胞活力。在传统的2D条件下培养的A431.H9细胞的IC50为约0.1μM，而300、1500和7500细胞类球体的A431.H93D类球体的IC50分别为约3、1和90μM。如所预期的，在大多数抗癌药物中，以5-FU处理的A431.H9细胞在3D条件下培养比在传统2D条件下培养时耐受性更强。
实施例2
额外板设计
本公开内容的某些实施方案的装置能够健壮地产生悬滴，保持悬滴，提供向悬滴中加入流体和/或从悬滴中移除流体或其组合的能力。因为每个进入孔洞被构造成将悬滴牢固地固持在适当位置，所以大量悬滴可复制形成。在某些实施方案中，每个进入孔洞基本上相同。具有在阵列板的顶面上的开口的进入孔洞允许收回或加入流体，以形成悬滴，或从已形成的悬滴收回流体或向已形成的悬滴加入流体。这意味流体可在整个实验期间收回或加入流体，以操纵和/或保持悬滴的可测量性质和/或所述悬滴中的内容物。此实施例描述了一种装置(例如图14所描述的)，所述装置提供额外的地形障碍，以稳定地限制液滴。障碍图14B示出障碍。所述装置包括在孔洞的顶和底上的额外环(从板的顶面或高台的底测得宽0.25μM和高0.5μM)。可利用障碍稳定通孔洞中的水滴，其中环不在表面上，而在孔洞的边缘，其中液体可在孔洞中上下移动。
使用Z因子分析测定装置的性能。所述Z因子为用于优化信号响应的动态范围和其在筛选测定中的变异性的测定性能测量。通常，当Z因子大于0.5时，认为测定为“极佳”。然而，在某些应用中，较低的Z因子就已足够。
对用于384悬滴板和标准384孔板中的基于荧光度测定和基于吸光度测定的Z-因子的计算方式如下：一系列荧光素或黄色食物的颜色浓度被放置在384悬滴板和标准384孔板中。使用读板仪测量读数。针对每种板，根据每一浓度获得的值计算Z-因子。图15示出结果。对于大多数浓度来说，Z-因子都在0.5以上。384悬滴板的Z-因子与标准384孔板的Z-因子相似。
实施例3
此实施例提供方法、***和装置的实施例，所述实施例进一步说明本公开的某些非限制实施方案：
实施例1.一种***，其包括：
a)至少一个阵列板，所述至少一个阵列板包括顶面和底面以及其中的多个孔洞，其中所述多个孔洞中的每个孔洞都包括顶部和底部，并且其中所述阵列板的所述底面包括至少一个基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的所述底部相邻的高台；以及
b)其中所述至少一个阵列板被构造用于容纳多个悬滴，其中每一个液滴悬挂于多个所述孔洞中的相应的一个孔洞并且伸到所述孔洞的下方，其中所述至少一个阵列板所能容纳的悬滴数等于或少于所述至少一个阵列板中孔洞数。
2.如实施例1所述的***，其进一步包括至少一个放置在所述至少一个阵列板下方的第二板。
3.如实施例1或2所述的***，其中所述至少一个阵列板进一步包括至少一个储器。
4.如实施例1、2或3所述的***，其中所述至少一个第二板进一步包括至少一个储器。
5.如实施例1至3或4所述的***，其中所述至少一个阵列板和所述至少一个第二板都含有至少一个储器。
6.如实施例1至4或5所述的***，其包括以下中的一种或多种：在所述至少一个阵列板内的一个或多个储器；一个或多个储器与所述至少一个第二板；在所述至少一个阵列板内的一个或多个储器，其中所述至少一个第二板没有储器；在经过放置的所述第二板内的一个或多个储器，其中所述至少一个阵列板没有储器；或在所述至少一个阵列板和所述至少一个第二板内的一个或多个储器。
7.如实施例1至5或6所述的***，其中每一个液滴悬挂于所述多个所述孔洞中的对应的一个孔洞，并且伸到所述孔洞的下方。
8.如实施例1至6或7所述的***，其中所述至少一个第二板与所述至少一个阵列板的边缘的至少一部分接触，且其中所述至少一个第二板与一个或多个所述悬滴基本上不接触。
9.如实施例1至7或8所述的***，其进一步包括用于所述至少一个阵列板的至少一个罩盖，其中所述至少一个罩盖被放置在一个或多个所述至少一个阵列板的顶部，且其中所述至少一个盖与所述多个孔洞上被构造成容纳所述多个悬滴的所述部分不接触。
10.如实施例1至8或9所述的***，其中所述一个或多个储器进一步含有一种或多种物质。
11.如实施例1至9或10所述的***，其中所述多个悬滴中的一个或多个含有以下中的一种或多种物质：多个细胞；至少一个复合组织或生物体；含有生物和/或化学实体的水性流体；一种或多种蛋白质；一个或多个纳米粒子，一种或多种测试化合物；一种或多种药物；由水性液体形成的固体或凝胶；或其组合。
12.如实施例1至10或11所述的***，其中所述孔洞的直径约1.6mm。
13.如实施例1至11或12所述的***，其中所述孔洞相距约4.5mm。
14.如实施例1至12或13所述的***，其中所述阵列板包括其中的所述孔洞的多个行和多个列。
15.如实施例1至10或11所述的***，其中所述至少一个高台的所述边缘包括至少一个环状结构。
16.如实施例1至14或16所述的***，其中所述至少一个阵列板被处理，以改进所述至少一个阵列板的性质。
17.如实施例1至15或16所述的***，其中所述至少一个阵列板被处理，以改进所述至少一个阵列板的物理、化学和/或生物学性质。
18.如实施例1至16或17所述的***，其中所述至少一个阵列板、所述至少一个第二板和/或所述至少一个罩盖中的一个或多个被处理，以改进所述相应经处理表面的性质。
19.如实施例1至17或18所述的***，其中所述至少一个阵列板、所述至少一个第二板和/或所述至少一个罩盖被处理，以改进所述经处理的相应表面的物理、化学和/或生物学性质。
20.如实施例1至18或19所述的***，其中所述至少一个阵列板的所述顶面包括至少一个第二高台，所述第二高台与其中的一个或多个所述孔洞的所述顶面基本上相邻或相邻。
21.如实施例1至19或20所述的***，其中所述***符合美国国家标准协会和/或生物分子科学协会的标准。
22.如实施例1至20或21所述的***，其中所述至少一个测定板、所述至少一个第二板和所述至少一个罩盖中的一个或多个为光学透明的，且提供用于光学成像和/或分析的基本上无遮挡的视野。
23.如实施例1至21或22所述的***，其中所述***与高通量筛选相容。
24.如实施例1至22或23所述的***，其中所述***可堆叠。
25.如实施例1至23或24所述的***，其中在所述至少一个阵列板的所述底面上的所述至少一个高台被构造用于稳定所述多个悬滴的几何结构。
26.如实施例1至24或25所述的***，其中在所述至少一个阵列板的所述底面上的所述至少一个高台被构造用于稳定所述多个悬滴的位置。
27.如实施例1至25或26所述的***，其中所述至少一个阵列板被构造成稳定和保持所述多个悬滴的可测量性质。
28.如实施例1至26或27所述的***，其中所述至少一个阵列板进一步包括至少一个在所述顶面上基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的顶部相邻的高台。
29.如实施例1至27或28所述的***，其中所述至少一个阵列板进一步包括至少一个在所述顶面上基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的顶部相邻的高台，其中在所述至少一个阵列板的所述顶面上的所述至少一个高台被构造用于增进孔洞内和/或外的液体的转移。
30.如实施例1至28或29所述的***，其中所述***被构造成保持基本上稳定的湿度。
31.如实施例1至29或30所述的***，其中所述***被构造成保持所述多个悬滴的环境的可测量性质。
32.如实施例1至30或31所述的***，其中所述***被构造成处理少量的流体。
33.如实施例1至31或32所述的***，其中所述***被构造成允许在所述一个或多个悬滴内的多个细胞的长期培养。
34.如实施例1至32或33所述的***，其中所述***被构造成允许以下中的一种或多种：多个细胞的长期培养、保持、分析和/或测试；至少一个复合组织或生物体的长期培养、保持、分析和/或测试；含有生物和/或化学实体的水性流体的长期培养、保持、分析和/或测试；一种或多种蛋白质的长期培养、保持、分析和/或测试；一个或多个纳米粒子的长期培养、保持、测试和或分析；一种或多种测试化合物的长期培养、保持、分析和/或测试；一种或多种药物的长期培养、保持、分析和/或测试；或其组合。
35.如实施例1至33或34所述的***，其中所述多个细胞在类球体中生长。
36.如实施例1至34或35所述的***，其中所述***进一步包括一个或多个高通量样本处理装置，所述装置选自机器人样本处理装置和读板仪。
37.使用实施例1至35或36所述的一个或多个***的任何方法。
38.一种方法，所述方法包括：将多个悬滴******，所述***包括：
a)至少一个阵列板，所述至少一个阵列板包括顶面和底面以及其中的多个孔洞，其中所述多个孔洞中的每个孔洞都包括顶部和底部，并且其中所述阵列板的所述底面包括至少一个基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的所述底部相邻的高台；以及
b)其中所述至少一个阵列板被构造用于容纳多个悬滴，其中每一个液滴悬挂于多个所述孔洞中的相应的一个孔洞并且伸到所述孔洞的下方，其中所述至少一个阵列板所能容纳的悬滴数等于或少于所述至少一个阵列板中孔洞数；以及
对一个或多个所述悬滴进行培养、保持、分析、测试，或其组合。
39.如实施例38所述的方法，其中所述每一个液滴从所述至少一个所述阵列板的所述顶侧或所述底侧经所述孔洞***。
40.如实施例38或39所述的方法，其进一步包括经所述孔洞移除所述悬滴的步骤。
41.如实施例38、39或40所述的方法，其进一步包括从至少一个或多个悬滴中移除流体或向其加入流体的步骤。
42.如实施例38至40或41所述的方法，其进一步包括放置在所述至少一个阵列板下的至少一个第二板。
43.如实施例38至41或42所述的方法，其中所述至少一个阵列板进一步包括至少一个储器。
44.如实施例38至42或43所述的方法，其中所述至少一个第二板进一步包括至少一个储器。
45.如实施例38至43或44所述的方法，其中所述至少一个阵列板和所述至少一个第二板都含有至少一个储器。
46.如实施例38至44或45所述的方法，其中每一个液滴悬挂于多个所述孔洞中的对应的一个孔洞，并且伸到所述孔洞的下方。
47.如实施例38至45或46所述的方法，其中所述多个悬滴中的一个或多个含有以下中的一种或多种物质：多个细胞；至少一个复合组织或生物体；含有生物和/或化学实体的水性流体；一种或多种蛋白质；一个或多个纳米粒子，一种或多种测试化合物；一种或多种药物；或其组合。
48.如实施例38至46或47所述的方法，其中所述至少一个阵列板、所述至少一个第二板和/或所述至少一个罩盖中的一个或多个被处理，以改进所述相应经处理表面的性质。
49.如实施例38至47或48所述的方法，其中所述至少一个阵列板、所述至少一个第二板和/或所述至少一个罩盖被处理，以改进所述经处理的相应表面的物理、化学和/或生物学性质。
50.如实施例38至48或49所述的方法，其中所述至少一个阵列板的所述顶面包括至少一个与其中的一个或多个所述孔洞的所述顶面基本上相邻或相邻的第二高台。
51.如实施例38至49或50所述的方法，其中所述方法符合美国国家标准学会和/或生物分子科学协会的标准。
52.如实施例38至50或51所述的方法，其中所述至少一个测定板、所述至少一个第二板和所述至少一个罩盖中的一个或多个为光学透明的，且提供用于光学成像和/或分析的基本上无遮挡的视野。
53.如实施例38至51或52所述的方法，其中所述方法与高通量筛选相容。
54.如实施例38至52或53所述的方法，其中所述***可堆叠。
55.如实施例38至53或54所述的方法，其中在所述至少一个阵列板的所述底面上的所述至少一个高台被构造用于稳定所述多个悬滴的几何结构。
56.如实施例38至54或55所述的方法，其中在所述至少一个阵列板的所述底面上的所述至少一个高台被构造用于稳定所述多个悬滴的位置。
57.如实施例38至55或56所述的方法，其中所述至少一个阵列板被构造成稳定和保持所述多个悬滴的可测量性质。
58.如实施例38至56或57所述的方法，其中所述至少一个阵列板进一步包括至少一个在所述顶面上基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的顶部相邻的高台。
59.如实施例38至57或58所述的方法，其中所述至少一个阵列板进一步包括至少一个在所述顶面上基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的顶部相邻的高台，其中在所述至少一个阵列板的所述顶面上的所述至少一个高台被构造用于增进孔洞内和/或外的液体的转移。
60.如实施例38至58或59所述的方法，其中所述方法被设定成保持基本上稳定的湿度。
61.如实施例38至59或60所述的方法，其中所述方法被设定成保持所述多个悬滴的环境的可测量性质。
62.如实施例38至60或61所述的方法，其中所述方法被设定成处理少量的流体。
63.如实施例38至61或62所述的方法，其中所述方法被设定成允许在所述一个或多个悬滴内的多个细胞的长期培养。
64.如实施例38至62或63所述的方法，其中所述方法被设定成允许以下中的一种或多种：多个细胞的长期培养、保持、分析和/或测试；至少一个复合组织或生物体的长期培养、保持、分析和/或测试；含有生物和/或化学实体的水性流体的长期培养、保持、分析和/或测试；一种或多种蛋白质的长期培养、保持、分析和/或测试；一个或多个纳米粒子的长期培养、保持、测试和或分析；一种或多种测试化合物的长期培养、保持、分析和/或测试；一种或多种药物的长期培养、保持、分析和/或测试；或其组合。
65.如实施例38-63或64所述的方法，其中所述方法进一步包括一个或多个高通量样本处理装置，所述装置选自机器人样本处理装置和读板仪。
以下额外实施例进一步说明本公开内容所述的某些非限制性装置实施方案：
装置实施例1.一种装置，所述装置包括：
阵列板，其包括顶面和底面，其中所述阵列板包括多个在其中的孔洞，其中每个孔洞包括顶面和底面且其中所述阵列板的所述底面包括至少一个与一个或多个所述孔洞的底面相邻或基本上相邻的高台。
2.如实施例1所述的装置，其中所述装置进一步包括储器。
板，其中所述储器板与所述阵列板的所述边缘基本上接触，且其中所述储器板与一个或多个所述孔洞基本上不接触。
3.如实施例1或2所述的装置，其中所述储器板仅与所述阵列板的所述边缘接触。
4.如实施例1、2或3所述的装置，其进一步包括用于所述阵列板的覆盖件，其中所述覆盖件被放置在所述阵列板的顶部上，且其中所述覆盖件与一个或多个所述孔洞基本上不接触。
5.如实施例1至3或4所述的装置，其中所述储器进一步包括加湿物质。
6.如实施例1至4或5所述的装置，其中所述储器板基本上位于所述阵列板之下。
7.如实施例1至5或6所述的装置，其中所述储器板不与所述阵列板的所述多个孔洞接触。
8.如实施例1至6或7所述的装置，其中所述阵列板包括384个孔洞。
9.如实施例1至7或8所述的装置，其中所述孔洞的直径约1.6mm。
10.如实施例1至8或9所述的装置，其中所述孔洞相距约4.5mm。
11.如实施例1至9或10所述的装置，其中所述阵列板包括其中的所述孔洞的多个行和多个列。
12.如实施例1至10或11所述的装置，其中所述至少一个高台的所述边缘包括至少一个环状结构。
13.如实施例1至11或12所述的装置，其中所述阵列板的所述底面涂敷有至少一种表面处理材料。
14.如实施例1至12或13所述的装置，其中所述阵列板的所述顶面包括至少一个第二高台，所述第二高台与其中的一个或多个所述孔洞的所述顶面基本上相邻。
15.如实施例1至13或14所述的装置，其中所述装置符合美国国家标准学会和/或生物分子科学协会的标准。
16.如实施例1至14或15所述的装置，其中所述储器板进一步包括底面部分，所述底面部分为光学透明的，且提供用于光学成像和/或分析的基本上无遮挡的视野。
17.如实施例1至15或16所述的装置，其中所述装置与高通量筛选相容。
18.如实施例1至16或17所述的装置，其中多个所述装置可堆叠。
以上说明书提及的所有出版物和专利以引用方式被全文并入本文。对已描述装置、方法和/或***的各种修改和改变对本领域技术人员来说将是显而易见的，且不会脱离本公开内容的范围和精神。虽然本发明是结合具体优选实施方案描述的，但应理解，所请求保护的本发明不应过于限于这些具体实施方案。实际上，相关领域技术人员可明显看出的对用于执行本发明的所描述的方式的各种修改旨在处于下述权利要求的范围内。

Claims (37)

1.一种***，其包括：
a)至少一个阵列板，所述至少一个阵列板包括顶面和底面以及其中的多个孔洞，其中所述多个孔洞每个孔洞都包括顶部和底部，并且其中所述阵列板的所述底面包括至少一个基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的所述底部相邻的高台；以及
b)其中所述至少一个阵列板被构造用于容纳多个悬滴，其中每一个液滴悬挂于多个所述孔洞中的一个相应的孔洞并且伸到所述孔洞的下方，其中所述至少一个阵列板所能容纳的悬滴数等于或少于所述至少一个阵列板中孔洞数。
2.如权利要求1所述的***，其进一步包括至少一个放置在所述至少一个阵列板下方的第二板。
3.如权利要求1或2所述的***，其中所述至少一个阵列板进一步包括至少一个储器。
4.如权利要求1、2或3所述的***，其中所述至少一个第二板进一步包括至少一个储器。
5.如权利要求1至3或4所述的***，其中所述至少一个阵列板和所述至少一个第二板都含有至少一个储器。
6.如权利要求1至4或5所述的***，其包括以下中的一种或多种：在所述至少一个阵列板内的一个或多个储器；一个或多个储器与所述至少一个第二板；在所述至少一个阵列板内的一个或多个储器，其中所述至少一个第二板没有储器；在经过放置的所述第二板内的一个或多个储器，其中所述至少一个阵列板没有储器；或在所述至少一个阵列板和所述至少一个第二板内的一个或多个储器。
7.如权利要求1至5或6所述的***，其中每一个液滴悬挂于所述多个所述孔洞中的一个对应的孔洞，并且伸到所述孔洞的下方。
8.如权利要求1至6或7所述的***，其中所述至少一个第二板与所述至少一个阵列板的边缘的至少一部分接触，且其中所述至少一个第二板与一个或多个所述悬滴基本上不接触。
9.如权利要求1至7或8所述的***，其进一步包括用于所述至少一个阵列板的至少一个罩盖，其中所述至少一个罩盖被放置在一个或多个所述至少一个阵列板的顶部，且其中所述至少一个罩盖与所述多个孔洞上被构造成容纳所述多个悬滴的所述部分不接触。
10.如权利要求1至8或9所述的***，其中所述一个或多个储器进一步含有一种或多种物质。
11.如权利要求1至9或10所述的***，其中所述多个悬滴中的一个或多个含有以下物质中的一种或多种：多个细胞；至少一个复合组织或生物体；含有生物和/或化学实体的水性流体；一种或多种蛋白质；一个或多个纳米粒子，一种或多种测试化合物；一种或多种药物；由水性液体形成的固体或凝胶；或其组合。
12.如权利要求1至10或11所述的***，其中所述孔洞的直径约1.6mm。
13.如权利要求1至11或12所述的***，其中所述孔洞相距约4.5mm。
14.如权利要求1至12或13所述的***，其中所述阵列板包括所述阵列板中的所述孔洞的多个行和多个列。
15.如权利要求1至10或11所述的***，其中所述至少一个高台的所述边缘包括至少一个环状结构。
16.如权利要求1至14或16所述的***，其中所述至少一个阵列板被处理，以改进所述至少一个阵列板的性质。
17.如权利要求1至15或16所述的***，其中所述至少一个阵列板被处理，以改进所述至少一个阵列板的物理、化学和/或生物学性质。
18.如权利要求1至16或17所述的***，其中所述至少一个阵列板、所述至少一个第二板和/或所述至少一个罩盖中的一个或多个被处理，以改进相应经处理表面的性质。
19.如权利要求1至17或18所述的***，其中所述至少一个阵列板、所述至少一个第二板和/或所述至少一个罩盖被处理，以改进经处理的相应表面的物理、化学和/或生物学性质。
20.如权利要求1至18或19所述的***，其中所述至少一个阵列板的所述顶面包括至少一个第二高台，所述第二高台与其中的一个或多个所述孔洞的所述顶面基本上相邻或相邻。
21.如权利要求1至19或20所述的***，其中所述***符合美国国家标准学会和/或生物分子科学协会的标准。
22.如权利要求1至20或21所述的***，其中所述至少一个测定板、所述至少一个第二板和所述至少一个罩盖中的一个或多个为光学透明的，且提供用于光学成像和/或分析的基本上无遮挡的视野。
23.如权利要求1至21或22所述的***，其中所述***与高通量筛选相容。
24.如权利要求1至22或23所述的***，其中所述***可堆叠。
25.如权利要求1至23或24所述的***，其中在所述至少一个阵列板的所述底面上的所述至少一个高台被构造用于稳定所述多个悬滴的几何结构。
26.如权利要求1至24或25所述的***，其中在所述至少一个阵列板的所述底面上的所述至少一个高台被构造用于稳定所述多个悬滴的位置。
27.如权利要求1至25或26所述的***，其中所述至少一个阵列板被构造成稳定和保持所述多个悬滴的可测量性质。
28.如权利要求1至26或27所述的***，其中所述至少一个阵列板进一步包括至少一个在所述顶面上基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的顶部相邻的高台。
29.如权利要求1至27或28所述的***，其中所述至少一个阵列板进一步包括至少一个在所述顶面上基本上与所述多个孔洞中的至少一个孔洞的顶部相邻的高台，其中在所述至少一个阵列板的所述顶面上的所述至少一个高台被构造用于增进所述孔洞内和/或外的液体的转移。
30.如权利要求1至28或29所述的***，其中所述***被构造成保持基本上稳定的湿度。
31.如权利要求1至29或30所述的***，其中所述***被构造成保持所述多个悬滴的环境的可测量性质。
32.如权利要求1至30或31所述的***，其中所述***被构造成处理少量的流体。
33.如权利要求1至31或32所述的***，其中所述***被构造成允许在所述一个或多个悬滴内的多个细胞的长期培养。
34.如权利要求1至32或33所述的***，其中所述***被构造成允许以下中的一种或多种：多个细胞的长期培养、保持、分析和/或测试；至少一个复合组织或生物体的长期培养、保持、分析和/或测试；含有生物和/或化学实体的水性流体的长期培养、保持、分析和/或测试；一种或多种蛋白质的长期培养、保持、分析和/或测试；一个或多个纳米粒子的长期培养、保持、测试和或分析；一种或多种测试化合物的长期培养、保持、分析和/或测试；一种或多种药物的长期培养、保持、分析和/或测试；或其组合。
35.如权利要求1至33或34所述的***，其中所述多个细胞在类球体中生长。
36.如权利要求1至34或35所述的***，其中所述***进一步包括一个或多个高通量样本处理装置，所述装置选自机器人样本处理装置和读板仪。
37.使用如权利要求1至35或36所述的一个或多个***的任何方法。
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