CN111893159A - 一种抗肿瘤药物筛选方法及应用 - Google Patents

一种抗肿瘤药物筛选方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111893159A
CN111893159A CN201910365932.9A CN201910365932A CN111893159A CN 111893159 A CN111893159 A CN 111893159A CN 201910365932 A CN201910365932 A CN 201910365932A CN 111893159 A CN111893159 A CN 111893159A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
screening
cells
tumor cells
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910365932.9A
Other languages
English (en)
Inventor
秦建华
李中玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201910365932.9A priority Critical patent/CN111893159A/zh
Publication of CN111893159A publication Critical patent/CN111893159A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种抗肿瘤药物筛选方法及应用，特别针对构建体外肿瘤模型用于研究肿瘤，试验抗肿瘤药物效力，筛选候选药物。本通过制备3D肿瘤模型，在模拟体内样肿瘤生长的微环境中培养，进行肿瘤细胞的快速培养和药物测试。本发明解决了2D肿瘤细胞无法长期培养，数据相关性差的问题，在低氧的培养条件，更符合体内真实环境，同时所使用3D肿瘤模型，更能接近细胞在体内的生长状态，其在基因及功能表达等诸多方面更接近于实际情况，保证了肿瘤组织的效能。可以单次同时获得多个实验相关参数，数据相关性更佳。

Description

一种抗肿瘤药物筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物评价技术领域，涉及一种抗肿瘤药物筛选方法及应用，特别涉及一种制备培养三维肿瘤模型以及利用该肿瘤模型进行抗肿瘤药物评价的方法。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的恶性疾病，死亡率呈明显上升趋势，已经成为影响我国居民健康的主要的死亡原因之一。世界卫生组织(WHO)专家预测，2020年全球人口80亿，癌症新发病例将达到2000万，1200万人死于癌症，癌症将成为新世纪人类的第一杀手,并成为全球最大的公共卫生问题之一。因此，采取有效的手段研究和开发抗肿瘤药物就显得极其重要。
目前主要的抗肿瘤药物筛选方法，如ATP-生物荧光体外肿瘤药物敏感性检测技术(ATP-TCA)、四唑盐(MTT)比色法、细胞毒性差异染色法(DiSC)等。但他们都是基于常规的二维肿瘤细胞培养方式，药物筛选准确性低，预测能力差，导致药物在研发后期的大量失败，造成大量的时间和经济浪费。
众所周知，人体中的绝大多数细胞生活在三维的环境中，细胞必须通过细胞-细胞以及细胞-细胞外基质之间的相互作用，获得各种生化和机械信号，才能维持其正常的生理活动。大量研究表明，细胞与细胞外基质以及细胞与细胞之间的相互作用对于调控细胞的迁移、增殖和分化有重要的作用。现有的二维单层细胞培养不能真实体现细胞在体内的生存环境，缺乏这样的信号传递，不能很好地模拟体内细胞的微环境，与体内存在巨大差异，成为了体外细胞实验模拟生理状态难以逾越的鸿沟。细胞3D培养技术则可以缩小体外实验和体内实验的差距，更好地体现仿生的思想。在三维的细胞球中细胞与外部环境之间的相互作用可大部分得到重建。因此，和单层细胞相比，三维细胞能更好地模拟体内细胞的微环境，更能接近细胞在体内的生长状态，其在基因及功能表达等诸多方面更接近于实际情况，同时使培养的细胞具有更真实的功能。利用三维细胞培养形成的肿瘤细胞球进行药物测试，可以获得与体内相关性更好的结果。
低氧是实体肿瘤中普遍具有的特性之一，在多种生理过程(细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭等)中发挥重要作用，可以激活各种信号通路导致肿瘤细胞对放化疗的耐药。低氧环境可以很好地模拟体内肿瘤组织的微环境，这样能最大程度在线肿瘤细胞的生物学特征和对药物的反应特征。当前抗肿瘤药物测试基本没有考虑到氧浓度的影响。
本发明解决了传统体外筛药方法相关性差的问题，培养的三维肿瘤细胞可以用来进行抗肿瘤药物评价，进行候选药物的筛选测试。还解决了传统培养方法不考虑体内微环境等问题，更加真实反映肿瘤的药物反应，提高药物筛选的准确性，利用商品化的孔板形式，可以快速的进行药物的高通量测试筛选，为临床前抗肿瘤药物评价提供了一种新的方法。在肿瘤研究、抗肿瘤药物开发等领域具有重大应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗肿瘤药物筛选方法，具体一种制备培养三维肿瘤模型以及利用该肿瘤模型进行抗肿瘤药物评价的方法。
本发明通过以下技术方案来实现发明目的：
一种抗肿瘤药物筛选方法，该方法采用三维肿瘤细胞模型，模拟体内微环境培养，进行抗肿瘤药物筛选，具体包括以下步骤，
步骤一、3D肿瘤细胞的制备，将细胞接种到底面带有凹陷结构的孔板中，制成目标大小的3D肿瘤细胞；
步骤二、3D肿瘤细胞的培养，将3D肿瘤细胞培养在低氧环境下；
步骤三、3D肿瘤细胞的药物评价，加入药物刺激后，评价药物对3D肿瘤细胞的作用。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，所述孔板为96孔板。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，肿瘤细胞可以通过底面凹陷结构形成三维细胞球。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，所述肿瘤细胞为细胞系或肿瘤原代细胞。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，所述目标大小3D肿瘤细胞的直径大小为0.05-2mm。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，所述目标大小3D肿瘤细胞在一次实验中大小应均一。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，所述低氧环境，其氧浓度在0.1％-12％。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，药物评价的具体过程如下：
(1)药物刺激；
(2)结果测定；包括活力测定与染色测定；
(3)结果分析。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，所述的药物刺激的时间可以为1-96小时。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，所述的活力测定，使用细胞毒性试剂盒进行细胞活性的检测，包括但不限于CCK-8，MTT等。
上述一种抗肿瘤药物筛选方法中，所述的染色测定，可以进行常规免疫荧光染色，包括但不限于Live/Dead染色，蛋白表达染色，中性红染色等。
所述抗肿瘤药物筛选方法的应用，应用于在体外制备培养三维肿瘤模型进行抗肿瘤药物筛选。
本发明应用三维肿瘤细胞模型，模拟体内微环境培养，进行抗肿瘤药物测试。在肿瘤研究、抗肿瘤药物开发等领域具有重大应用前景。
本发明的有益效果是：与现有的三维细胞制备抗肿瘤药物测试技术相比，主要有如下几个优点：采用与商业化孔板结合的方式，仍然属于传统的实验操作范畴，容易被接受。细胞形成三维细胞模型，肿瘤细胞培养在微环境里，这些优势都导致细胞对药物的反应与体内相关性更高。本发明能很好地维持肿瘤细胞近似体内的生物学特征和对药物的反应特征，因此可以更准确地反应抗肿瘤药物的效果,并可以减少无效药物产生的假阳性结果，减少了药物开发的盲目性和后期的失败率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1：本发明技术流程示意图；低氧微环境下，肿瘤细胞接种，聚集，成球，药物刺激，分析检测；
图2：药物处理后三维肿瘤细胞的Live/Dead染色图；
其中，a不同浓度的紫杉醇对四种三维肿瘤细胞球的影响；b不同浓度的氟尿嘧啶对四种三维肿瘤细胞球的影响；c不同浓度的奥沙利铂对四种三维肿瘤细胞球的影响。
图3：药物处理后三维肿瘤细胞的CCK-8细胞活力图；
其中，a不同浓度的紫杉醇对四种三维肿瘤细胞球的影响；b不同浓度的氟尿嘧啶对四种三维肿瘤细胞球的影响；c不同浓度的奥沙利铂对四种三维肿瘤细胞球的影响。
图4：在2D+常氧(Normal)，2D+低氧(Hypoxic)，3D+常氧，3D+低氧的不同条件下，紫杉醇对MDA-MB-231、HepG2、U87、Caco-2细胞的抑制率示意图。
图5：在2D+常氧(Normal)，2D+低氧(Hypoxic)，3D+常氧，3D+低氧的不同条件下，氟尿嘧啶对MDA-MB-231、HepG2、U87、Caco-2细胞的抑制率示意图。
图6：在2D+常氧(Normal)，2D+低氧(Hypoxic)，3D+常氧，3D+低氧的不同条件下，奥沙利铂对MDA-MB-231、HepG2、U87、Caco-2细胞的抑制率示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
如图1所示，Caco-2、U87、HepG2、MDA-MB-231细胞消化并重悬在细胞培养基中，以3×105个/孔的密度分别接种到具凹陷结构的96孔板中的孔中，将细胞置于37度，5％CO2，5％O2的环境中培养。肿瘤细胞聚并形成三维细胞球。对三维肿瘤细胞进行药物刺激。使用0.4，2，10，50μg/mL氟尿嘧啶，0.16，0.8，4，20μg/mL的奥沙利铂，0.096，0.48，2.4，12μg/mL的紫杉醇处理48小时，对三维肿瘤细胞进行指标检测，使用CCK-8试剂盒对细胞活力进行定量，如图3所示。Live/Dead染色对死细胞和活细胞分别荧光标记，使用荧光显微镜拍照，如图2所示。使用CCK-8对细胞活力进行定量统计，结果如图3所示。可见三种药物对四种细胞活力都有一定影响，且呈现剂量依赖效应。其中，Caco-2细胞活力降低更多，可能对Caco-2更加敏感。这也符合这几种药物在临床上首选结直肠癌的实际应用。这种药物测试方法，即可以直观评估细胞的凋亡或存活状态，又可以通过酶标仪方便快捷的获得定量数据进行分析。
实施例2
Caco-2、U87、HepG2、MDA-MB-231细胞消化并重悬在细胞培养基中，分别接种到常规2D平面的96孔板和具凹陷结构的96孔板中的孔中，分别将细胞置于37度，5％CO2，5％O2和21％O2的环境中培养。静置于细胞培养箱中培养，肿瘤细胞聚并形成三维细胞球。对三维肿瘤细胞进行药物刺激。使用0.4，2，10，50μg/mL氟尿嘧啶，0.16，0.8，4，20μg/mL的奥沙利铂，0.096，0.48，2.4，12μg/mL的紫杉醇处理48小时，对三维肿瘤细胞进行指标检测，使用CCK-8试剂盒对细胞活力进行定量，绘制药物对肿瘤细胞抑制率曲线，如图4-6所示。
结果显示，大部分肿瘤细胞在低氧(5％)条件下培养，药物的抑制率较常氧(21％)条件要低；药物对三维肿瘤细胞的抑制率也较二维细胞要低。这说明肿瘤，在三维及低氧条件下对药物反应的敏感性下降，这更接近实际的反应。常规培养方式(二维+常氧)下的药物测试方法，大都可以获得比较高的抑制率，这与大多药物在开发后期在人体上未能展现相应的药效相矛盾，与体内肿瘤实际的药物反应不符，造成了早期药物评价的预测能力较差。而在缺氧及三维环境下这种接近体内的条件下，肿瘤对药物下降的敏感性，与其对药物的实际反应可能更接近，这样获得数据相关性更好。

Claims (12)

1.一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，该方法采用三维肿瘤细胞模型，模拟体内微环境培养，进行抗肿瘤药物筛选，具体包括以下步骤：
步骤一、3D肿瘤细胞的制备，将细胞接种到底面带有凹陷结构的孔板中，制成目标大小的3D肿瘤细胞；
步骤二、3D肿瘤细胞的培养，将3D肿瘤细胞培养在低氧环境下；
步骤三、3D肿瘤细胞的药物评价，加入药物刺激后，评价药物对3D肿瘤细胞的作用。
2.如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，所述孔板为96孔板。
3.如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物测试方法，其特征在于，所述肿瘤细胞可以通过底面凹陷结构形成三维细胞球。
4.如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为细胞系或肿瘤原代细胞。
5.如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，所述目标大小3D肿瘤细胞的直径为0.05-2mm。
6.如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，所述目标大小3D肿瘤细胞在一次实验中大小应均一。
7.如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，所述低氧环境，其氧浓度在0.1％-12％。
8.如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，所述药物评价的具体过程如下：
(1)药物刺激；
(2)结果测定；包括活力测定与染色测定；
(3)结果分析。
9.如权利要求8所述的一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，所述药物刺激的时间为1-96小时。
10.如权利要求8所述的的一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，所述活力测定使用细胞毒性试剂盒进行细胞活性的检测，包括但不限于CCK-8，MTT。
11.如权利要求8所述的一种抗肿瘤药物筛选方法，其特征在于，所述染色测定可以进行常规免疫荧光染色，包括但不限于Live/Dead染色，蛋白表达染色，中性红染色。
12.一种如权利要求1-11任一项所述抗肿瘤药物筛选方法的应用，其特征在于：应用于在体外制备培养三维肿瘤模型进行抗肿瘤药物筛选。
CN201910365932.9A 2019-05-05 2019-05-05 一种抗肿瘤药物筛选方法及应用 Pending CN111893159A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910365932.9A CN111893159A (zh) 2019-05-05 2019-05-05 一种抗肿瘤药物筛选方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910365932.9A CN111893159A (zh) 2019-05-05 2019-05-05 一种抗肿瘤药物筛选方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111893159A true CN111893159A (zh) 2020-11-06

Family

ID=73169143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910365932.9A Pending CN111893159A (zh) 2019-05-05 2019-05-05 一种抗肿瘤药物筛选方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111893159A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100056390A1 (en) * 2008-07-29 2010-03-04 Claudia Fischbach Pathologically relevant tumor microenvironments for high-throughput drug screening
US20130040855A1 (en) * 2010-01-28 2013-02-14 3D Biomatrix, Inc. Hanging drop devices, systems and/or methods
CN104403923A (zh) * 2014-11-11 2015-03-11 南京卡迪奥密生物技术有限公司 三维组织器官培养模型及其高通量自动化立体图像分析平台及其应用
CN107557426A (zh) * 2017-10-19 2018-01-09 宋焱艳 基于三维微组织水平的抗肿瘤药物筛选试剂盒及其使用方法
CN108060132A (zh) * 2016-11-09 2018-05-22 复旦大学 一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3d共培养模型

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100056390A1 (en) * 2008-07-29 2010-03-04 Claudia Fischbach Pathologically relevant tumor microenvironments for high-throughput drug screening
US20130040855A1 (en) * 2010-01-28 2013-02-14 3D Biomatrix, Inc. Hanging drop devices, systems and/or methods
CN104403923A (zh) * 2014-11-11 2015-03-11 南京卡迪奥密生物技术有限公司 三维组织器官培养模型及其高通量自动化立体图像分析平台及其应用
CN108060132A (zh) * 2016-11-09 2018-05-22 复旦大学 一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3d共培养模型
CN107557426A (zh) * 2017-10-19 2018-01-09 宋焱艳 基于三维微组织水平的抗肿瘤药物筛选试剂盒及其使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
罗劲等: "多细胞三维肿瘤球模型的构建及其在药物筛选和制剂评价中的应用", 《中国现代应用药学》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. Characterization of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cell spheroid model
Sreepadmanabh et al. Investigations into the cancer stem cell niche using in-vitro 3-D tumor models and microfluidics
CN105143883B (zh) 基于细胞的药物筛选分析方法和其用途
Hsieh et al. The effect of primary cancer cell culture models on the results of drug chemosensitivity assays: the application of perfusion microbioreactor system as cell culture vessel
CN104232567A (zh) 获得干细胞及其数据的方法
Totti et al. Designing a bio-inspired biomimetic in vitro system for the optimization of ex vivo studies of pancreatic cancer
Ino et al. Electrochemicolor imaging of endogenous alkaline phosphatase and respiratory activities of mesenchymal stem cell aggregates in early-stage osteodifferentiation
Alexander et al. From cellular cultures to cellular spheroids: is impedance spectroscopy a viable tool for monitoring multicellular spheroid (MCS) drug models?
Charwat et al. Monitoring dynamic interactions of tumor cells with tissue and immune cells in a lab-on-a-chip
JP2008011797A (ja) 抗がん作用の評価方法
Jang et al. Mitochondrial networking in human blood cells with application in acute care illnesses
Zhang et al. Bone-on-a-chip platforms and integrated biosensors: Towards advanced in vitro bone models with real-time biosensing
CN103396995B (zh) 一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法
CN106566863A (zh) 一种基于微流控芯片的细胞双向侵袭监测方法
Zippel et al. A parallelized, perfused 3D triculture model of leukemia for in vitro drug testing of chemotherapeutics
CN111893159A (zh) 一种抗肿瘤药物筛选方法及应用
CN108265055A (zh) 特异性结合人乳腺癌细胞mcf-7的dna核酸适配体及其应用
US9723989B2 (en) Ex vivo motility contrast imaging
Ramachandran et al. Identification of gastric cancer biomarkers using 1H nuclear magnetic resonance spectrometry
CN107540736B (zh) 与***顺药性相关的生物大分子nherf1及其应用
CN111896725A (zh) 一种肿瘤精准、个性化药物治疗方法及应用
Frongia et al. 3D imaging of the response to CDC25 inhibition in multicellular spheroids
Liu et al. Development of a sandwiched microarray platform for studying the interactions of antibiotics with Staphylococcus aureus
Pei et al. Combined Molecular and Morphological Imaging of CTCs for HER2-Targeted Chemotherapy Guidance
CN115855606B (zh) 一种用3d模型检测car-t细胞在实体瘤中浸润的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201106

RJ01 Rejection of invention patent application after publication