CN102858968B - 溶菌酶的变体及编码该变体的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及变体溶菌酶。本发明还涉及编码该变体溶菌酶的多核苷酸，并且涉及包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞。

Description

溶菌酶的变体及编码该变体的多核苷酸

对序列表的提及

本申请含有以计算机可读形式的序列表。计算机可读形式引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及溶菌酶的变体、编码该变体的多核苷酸和产生该变体的方法。

发明背景

溶菌酶(EC 3.2.1.17)，也称为胞壁酸酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanhydrolase)，催化在肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的和在壳糊精中的N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-键的水解。

溶菌酶一般由许多生物体如病毒、植物、昆虫、鸟类、爬行动物和哺乳动物产生作为针对细菌的防御机制。该酶通过切割肽聚糖的糖苷键引起细菌细胞壁的水解；所述肽聚糖是细菌中的重要结构分子。在其细胞壁已由溶菌酶作用削弱后，细菌细胞因渗透压引起裂解。在溶菌酶作为抗菌剂的潜力中存在越来越多的兴趣。例如，溶菌酶活性已显示针对病原体，例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、和单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。

溶菌酶已分类成五个不同糖苷水解酶(GH)家族(CAZy，www.cazy.org)：鸡蛋清溶菌酶(GH22)、鹅蛋清溶菌酶(GH23)、细菌噬菌体T4溶菌酶(GH24)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)鞭毛蛋白质(GH73)和拟鞘孢属(Chalaropsis)溶菌酶(GH25)。已发现溶菌酶家族GH25与其他溶菌酶家族在结构上无关。

溶菌酶的用途已在动物饲料(参见例如WO 00/21381和WO 04/026334)、干酪生产(参见例如WO 05/080559)、食品保存(Hughey和Johnson(1987)ApplEnviron Microbiol 53:2165)、去污剂(参见例如US 5,041,236和EP 0425016)、口腔护理(参见例如US 4,355,022、WO 04/017988和WO 08/124764)、美容学和皮肤病学、避孕、泌尿学和妇科学(参见例如WO 08/124764)中提出。

鸡蛋清溶菌酶是商购可得的溶菌酶产品。从微生物来源中分离的溶菌酶也是已知的。

发明概述

本发明涉及溶菌酶变体及编码它的核苷酸序列。在一个方面，本发明涉及属于糖基水解酶家族25(GH25)的溶菌酶变体，其包含在选自下组的位置编号的一个或多个位置上的氨基酸序列的改变：47、111、108、45、22、110、120、147、196、49、55、193、161、128、131、203、98、112、55、32、89、206 121、120、185、113、119、35、153、158、171、195、76、164、30、85、178、183、186、112、174、187、197、102、134、108、196、197、198、56、19、120、20、135和203，所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO:3中的位置，并且其中所述溶菌酶变体具有抗微生物和/或溶菌酶活性。在一个实施方案中，溶菌酶变体是真菌溶菌酶的变体。在另一个实施方案中，溶菌酶变体包含与SEQ ID NO:3具有至少75%同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，溶菌酶变体是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)溶酶体的变体。

本发明的变体具有与亲本溶菌酶相比较改变的性质，例如改变的温度依赖性活性谱，例如改善的热活性或者在低或中等温度改善的活性(嗜冷或嗜温活性)、改善的温度稳定性、改善的pH活性、改善的pH稳定性和/或对蛋白酶降解增加的抗性。

本发明还涉及包含本发明的溶菌酶变体的抗微生物组合物和抗微生物方法。在实施方案中，本发明还涉及本发明的变体在动物饲料、干酪生产、食品保存、去污剂、口腔护理、美容学和皮肤病学中的用途。

附图简述

图1是下述多种成熟的家族25溶菌酶氨基酸序列的比对：

烟曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:3)；

烟曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:4)；

费氏曲霉(Aspergillus fischerianus)溶菌酶(SEQ ID NO:5)；

棒曲霉(Aspergillus clavatus)溶菌酶(SEQ ID NO:6)；

米曲霉(Aspergillus oryzae)溶菌酶(SEQ ID NO:7)；

土曲霉(Aspergillus terreus)溶菌酶(SEQ ID NO:8)；

费氏曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:9)；

烟曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:10)；

棒曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:11)；

土曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:12)；和

马尔尼菲青霉(Penicillum marneffei)溶菌酶(SEQ ID NO:13)。

信号肽已使用程序Signal P版本3.0进行预测。信号肽不在比对中。

图2列出了烟曲霉溶菌酶的三维结构的原子坐标。

发明详述

本发明涉及溶菌酶变体，尤其是属于糖基水解酶家族25(GH25)的溶菌酶的变体，其包含优选以在一个或多个(几个)位置上的取代和/或***和/或缺失形式的改变，其中所述位置的编号对应于SEQ ID NO:3的位置的编号。本发明的变体具有抗微生物和/或溶菌酶活性。

定义

抗微生物活性：术语“抗微生物活性”在本文中定义为杀死或抑制微生物例如藻类、古细菌、细菌、真菌或原生动物的生长的活性。抗微生物活性可以是例如杀细菌的(意味着细菌的杀死)、抑菌的(意味着细菌生长的预防、或孢子形成的预防)。为了本发明的目的，抗微生物活性根据“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测定。

溶菌酶活性：术语“溶菌酶活性”在本文中定义为肽聚糖N-乙酰胞壁酰水解酶活性(EC 3.2.1.17)，催化在肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的和在壳糊精中的N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-键的水解。为了本发明的目的，溶菌酶活性根据“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测定。

变体：术语“变体”在本文中定义为包含改变的具有抗微生物活性和/或溶菌酶活性的多肽，所述改变例如在一个或多个(几个)特定位置上的一个或多个(几个)氨基酸残基的取代、***和/或缺失，所述位置对应于SEQ ID NO:3中的氨基酸位置。改变的多肽(变体)可以通过人为干预经由修饰编码亲本酶的多核苷酸序列而获得。亲本酶可以由SEQ ID NO:1或这样的序列编码，所述序列与这些序列之一至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同，且编码具有抗微生物和/或溶菌酶活性的多肽。变体多肽序列优选是不能存在于自然界中的那种。

野生型酶：术语“野生型”溶菌酶指示由天然存在的生物表达的溶菌酶，优选来自天然存在的微生物，例如在自然界中发现的藻类、古细菌、细菌、酵母、丝状真菌或原生动物。术语野生型可与术语“天然存在的”互换使用。

亲本酶：如本文使用的术语“亲本”溶菌酶或“亲本的”溶菌酶意指已对其作出修饰例如取代、***、缺失和/或截短的溶菌酶，以产生本发明的酶变体。这个术语还指变体与之相比较且比对的多肽。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽，例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的酶，或与这些序列之一至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%至少99%或100%相同的多肽。亲本多肽还可以是天然存在的多肽的变体，其已在氨基酸序列中进行修饰或改变。亲本还可以是等位基因变体，其是由占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式中的任何所编码的多肽。

分离的变体或多肽：如本文使用的术语“分离的变体”或“分离的多肽”指从来源中分离的变体或多肽，所述来源例如它由其表达的宿主细胞或它通常存在于其中的酶复合体。优选地，如通过SDS-PAGE测定的，多肽是至少40%纯的，例如至少60%纯的、至少80%纯的、至少90%纯的或至少95%纯的。

基本上纯的变体或多肽：术语“基本上纯的变体”或“基本上纯的多肽”在本文中指示含有按重量计至多10%、例如至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%或至多0.5%它与之天然或重组结合的其他多肽材料的多肽制备物。因此，优选基本上纯的变体或多肽是按制备物中存在的总多肽材料的重量计至少92%纯的，例如至少94%纯的、至少95%纯的、至少96%纯的、至少96%纯的、更至少97%纯的、至少98%纯的、至少99%、至少99.5%纯的或甚至100%纯的。本发明的变体和多肽优选以基本上纯的形式存在。这可以例如通过经由众所周知的重组方法或经由典型纯化方法制备变体或多肽来完成。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为具有抗微生物和/或溶菌酶活性的多肽，其处于翻译和任何翻译后修饰后的最终形式，所述翻译后修饰例如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等。对于由SEQ ID NO:2限定的多肽，成熟溶菌酶序列的例子在SEQ ID NO:2的位置18上开始且在SEQ IDNO:2的位置235上结束。这个成熟的溶菌酶序列也显示于SEQ ID NO:3中。另一个例子是当溶菌酶在米曲霉中表达时，那么成熟多肽在SEQ ID NO:2的位置26上开始且在SEQ ID NO:2的位置235上结束。然而，取决于表达***，实际的成熟多肽的长度可以不同，例如与预测的成熟多肽在N和/或C末端在长度上相差1–10个氨基酸(更长或更短)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有抗微生物和/或溶菌酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸51-705。成熟多肽编码序列可以在长度上相差3–30个核苷酸，取决于表达***。当在米曲霉中表达时，成熟多肽编码序列可以例如对应于SEQ ID NO:1的SEQ ID NO1:的核苷酸75-705。

同一性：如本文使用的参数“同一性”描述在两个氨基酸序列之间或在两个核苷酸序列之间的关联性。为了本发明的目的，使用如EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends in Genetics 16:276-277；http://emboss.org)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)，优选3.0.0或以后的版本，测定在两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用的任选参数是缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5、和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的(使用-nobrief选项获得的)Needle输出用作百分比同一性且如下计算：

(相同的残基x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

为了本发明的目的，使用如EMBOSS包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite，Rice等人(2000)同上；http://emboss.org)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)，优选3.0.0或以后的版本，测定在两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。使用的任选参数是缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5、和EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的(使用-nobrief选项获得的)Needle输出用作百分比同一性且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度–比对中的缺口总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用烟曲霉溶菌酶(UniProt登记号A4DA29)在tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，Bioinformatics Methodsand Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz，编辑，第185-219页)中给出小于0.001的E值(或期望得分)的预测多肽。

多肽的功能片段：术语“多肽的功能片段”用于描述衍生自更长多肽例如成熟多肽，并且在N末端区域或C末端区域中或在两个区域中已截短以生成亲本多肽的片段的多肽。为了成为功能多肽，该片段必须维持全长/成熟多肽的至少20%的抗微生物和/或溶菌酶活性，例如全长/成熟多肽的至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的抗微生物和/或溶菌酶活性。

等位基因变体：变体“等位基因变体”在本文中指示占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式中的任何。等位基因变异天然地通过突变而出现，并且可以导致在群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码多肽中无变化)，或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：如本文使用的术语“分离的多核苷酸”指从来源中分离的多核苷酸。在一个方面，如通过琼脂电泳测定的，分离的多核苷酸是至少40%纯的，例如至少60%纯的、至少80%纯的、至少90%纯的或至少95%纯的。

基本上纯的多核苷酸：如本文使用的术语“基本上纯的多核苷酸”指不含其他外来或不需要的核苷酸且以适合于在遗传工程多核苷酸产生***内使用的形式的多核苷酸制备物。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%、例如至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%或至多0.5%它与之天然或重组结合的其他多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3'非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯的，例如至少92%纯的、至少94%纯的、至少95%纯的、至少96%纯的、至少97%纯的、至少98%纯的、至少99%或甚至至少99.5%纯的。本发明的多核苷酸优选以基本上纯的形式，即多核苷酸制备物基本上不含它与之天然或重组结合的其他多核苷酸材料。该多核苷酸可以具有基因组、cDNA、RNA、半合成、合成起源或其任何组合。

编码序列：当在本文中使用时，术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放读码框决定，所述开放读码框通常从ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多核苷酸。

可操作地连接的：术语“可操作地连接的”在本文中指示其中控制序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的合适位置的配置，从而使得编码序列指导多肽的编码序列的表达。

宿主细胞：如本文使用的，术语“宿主细胞”包括对用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或载体的转化、转染、转导等易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包含由于在复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改变的性质：术语“改变的性质”在本文中定义为与变体相关的改变的特征，除非另有说明是针对另一种参考溶菌酶，其相对于亲本溶菌酶是改变的。此类改变的性质包括但不限于，改变的温度依赖性活性谱、改变的温度稳定性、改变的pH活性、改变的pH稳定性和/或对蛋白酶降解改变的抗性。

改善的性质：术语“改善的性质”在本文中定义为与变体相关的改善的特征，除非另有说明是针对另一种参考溶菌酶，其相对于亲本溶菌酶是改善的。此类改善的性质包括但不限于，改善的温度依赖性活性谱例如改善的热活性或在低温改善的活性、改善的温度稳定性、改善的pH活性、改善的pH稳定性和/或对蛋白酶降解增加的抗性。

改善的温度依赖性活性谱：如本文使用的术语“改善的温度依赖性活性谱”描述当与亲本溶菌酶的温度依赖性活性谱相比较时，展示温度依赖性活性谱的改变的变体酶。温度依赖性活性谱提供了在给定条件例如pH和溶剂组成下在整个温度范围在预防微生物生长、消除微生物细胞和/或执行水解反应的催化方面的酶效率的量度。溶菌酶具有在其中所述多肽是稳定的且保留其酶促活性的特定温度范围，在这个范围外溶菌酶活性变得较低且潜在地还变得更不稳定。在该温度范围内，一般存在其中溶菌酶显示最高活性的最适温度。

当温度依赖性活性谱中的改变是朝向更高温度时，生成更具热活性或更嗜热的溶菌酶。通过改善溶菌酶在更高温度的活性，它将能够在要求更高温度(例如45℃-110℃，优选50℃-100℃，更优选60℃-90℃，甚至更优选70℃-80℃)的条件下起作用，所述条件例如消毒或灭菌工艺。此外，由溶菌酶催化的反应的起始速率可以通过温度中的增加而加速，所述温度中的增加是通过测定变体的热活性测量的。当在亲本溶菌酶的最适温度以上的温度使用时，更具热活性的变体将导致水解速率中的增加，减少所需的时间和/或减少用于预防微生物生长、消除微生物细胞和/或水解所需的酶浓度。

当温度依赖性活性谱中的改变是朝向更低或中等温度时，生成在低温(例如0℃-20℃、优选2℃-18℃、优选5℃-15℃、更优选8℃-12℃、甚至最优选10℃-15℃)或中等温度(例如15℃-45℃、优选20℃-40℃、优选22℃-35℃、最优选25℃-30℃)具有改善的活性的溶菌酶。在更低或中等温度具有增加的活性的溶菌酶将在比由亲本的温度依赖性活性谱限定的亲本酶的最适温度低的温度，预防微生物生长、消除微生物细胞和/或催化比亲本酶更快速的水解反应。此类酶可以例如是在减少的温度的洗涤条件下有利的，所述减少的温度例如5℃-40℃、优选10℃-30℃、更优选15℃-25℃、甚至更优选18℃-20℃。它还可以是在热敏感的食物例如乳产品、果汁产品或葡萄酒的加工，或对于在温带国家在冬季期间的土壤和废水的生物修复(biomediation)有利的。在低温具有增加的活性的溶菌酶利用的另一个例子是用于处理冷水鱼物种例如鲑鱼和鳟鱼；此类水处理在鱼类养殖厂中。

在本发明的一个方面，溶菌酶变体的温度依赖性活性谱的改变改善该变体在低或中等温度的活性。优选地，在比亲本酶的最适温度低5℃，优选比亲本酶的最适温度低10℃，更优选15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，甚至更优选45℃且最优选50℃的温度，溶菌酶变体的活性与亲本溶菌酶的活性相比较，在所述条件下该变体具有比亲本酶的活性高至少1.5倍、优选至少2倍、更优选至少5倍、最优选至少7倍且甚至最优选至少20倍的活性。优选地，溶菌酶变体同时维持亲本溶菌酶在其最适温度显示出的活性的至少40%，优选至少50%、60%、70%或80%、90%，更优选至少95%，甚至更优选至少100%。优选地，该活性使用“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测试，伴随与所需减少的温度的温度偏差。

在本发明的一个方面，溶菌酶变体的温度依赖性活性谱的改变改善该变体在高温的活性。优选地，在比亲本酶的最适温度高5℃，优选比亲本酶的最适温度高10℃，更优选15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃，甚至更优选45℃且最优选50℃的温度，溶菌酶变体的活性与亲本溶菌酶的活性相比较，在所述条件下该变体具有比亲本酶的活性高至少1.5倍、优选至少2倍、更优选至少5倍、最优选至少7倍且甚至最优选至少20倍的活性。优选地，溶菌酶变体同时维持亲本溶菌酶在其最适温度显示出的活性的至少40%，优选至少50%、60%、70%或80%、90%，更优选至少95%，甚至更优选至少100%。优选地，该活性使用“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测试，伴随与所需增加的温度的温度偏差。

改善的温度稳定性：术语“温度稳定性”或“改善的热稳定性”在本文中定义为在升高温度的温育期后，相对于亲本酶展示出酶促活性的保留的变体酶。此类变体可以展示出或可以不展示出相对于亲本改变的热活性谱。例如，该变体在升高的温度可以不是活性的，但能够维持其三维结构，且随后在它被送回更低温度后再次获得活性。可替代地，该变体可以具有相对于亲本酶在升高温度的温育后改善的重折叠能力。

在一个方面，溶菌酶变体的热稳定性是改善的，从而使得该变体可以经得住高温，例如45℃-110℃，优选50℃-100℃，更优选60℃-90℃，甚至更优选70℃-80℃的温度。优选地，当与已在室温维持相同时间的变体相比较时，在给定高温温育1小时后，该变体溶菌酶维持至少40%，优选至少50%、60%、70%或80%、更优选至少90%，甚至更优选至少95%残留活性。优选地，变体溶菌酶的残留活性是已在相同条件下处理的亲本溶菌酶的残留活性的至少1.5倍、优选至少2倍、更优选至少5倍、最优选至少7倍且甚至最优选至少20倍。优选地，该活性使用“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测试，伴随与所需增加的温度的温度偏差。

改善的pH活性：术语“改善的pH活性”在本文中定义为当与亲本溶菌酶的pH活性谱相比较时，展示出pH依赖性活性谱的改变的变体酶。pH活性谱提供了在给定条件例如温度和溶剂组成下在整个pH范围在预防微生物生长、消除微生物细胞和/或执行水解反应的催化方面的酶效率的量度。溶菌酶具有在其中所述多肽是稳定的且保留其酶促活性的特定pH范围，在这个范围外溶菌酶活性变得较低且潜在地还变得更不稳定。在该pH范围内，一般存在其中溶菌酶显示最高活性的最适pH。

在碱性pH(例如pH 7.5-12、优选8-11、更优选8.5-10、甚至更优选9-9.5)具有改善的活性的溶菌酶变体将能够在更碱性的环境例如去污剂中起作用。

在酸性pH(例如pH 2-5.5、优选2.5-5.25、更优选3-5、甚至更优选3.5-4)具有改善的活性的变体将能够在更酸性的环境下例如特定食物中的防腐剂或作为饲料中的益生分子(eubiotic molecule)起作用。

在一个方面，pH活性谱是改变的，从而使得溶菌酶变体在碱性pH具有改善的活性。优选地，在比亲本酶的最适pH高至少0.5单位的pH下，优选比亲本酶的最适pH高至少1、1.5、2、2.5或3pH单位，最优选比亲本酶的最适pH高至少3.5pH单位且最优选比亲本酶的最适pH高至少4pH单位，溶菌酶变体的活性与亲本溶菌酶的活性相比较，在所述条件下，该变体具有比亲本酶的活性高至少1.5倍、优选至少2倍、更优选至少5倍、最优选至少7倍且甚至最优选至少20倍的活性。优选地，溶菌酶变体同时维持亲本溶菌酶在其最适pH显示出的活性的至少40%，优选至少50%、60%、70%或80%或90%，更优选至少95%，甚至更优选至少100%。优选地，该活性使用“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测试，伴随与所需增加的pH的pH偏差。

在一个方面，pH活性谱是改变的，从而使得溶菌酶变体在酸性pH具有改善的活性。优选地，在比亲本酶的最适pH低至少0.5单位的pH下，优选比亲本酶的最适pH低至少1、1.5、2、2.5或3pH单位，最优选比亲本酶的最适pH低至少3.5pH单位且最优选比亲本酶的最适pH低至少4pH单位，溶菌酶变体的活性与亲本溶菌酶的活性相比较，在所述条件下，该变体具有比亲本酶的活性高至少1.5倍、优选至少2倍、更优选至少5倍、最优选至少7倍且甚至最优选至少20倍的活性。优选地，溶菌酶变体同时维持亲本溶菌酶在其最适pH显示出的活性的至少40%，优选至少50%、60%、70%或80%或90%，更优选至少95%，甚至更优选至少100%活性。优选地，该活性使用“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测试，伴随与所需降低的pH的pH偏差。

改善的pH稳定性：术语“改善的pH稳定性”在本文中定义为在其中酶是活性的pH范围(pH活性范围)外的pH的温育一段时间后，相对于亲本酶展示出结构稳定性的变体酶。此类变体可以展示出或可以不展示出相对于亲本改变的pH活性谱。例如，该变体在增加或降低的pH下可以不是活性的，但能够维持其三维结构，且随后在它被送回pH活性范围后再次获得活性。可替代地，在增加或降低的pH下温育后，该变体可以具有相对于亲本改善的重折叠能力。

在一个方面，pH稳定性谱是改变的，从而使得溶菌酶变体在酸性pH(例如pH 2-5.5、优选2.5-5.25、更优选3-5、甚至更优选3.5-4)具有改善的稳定性。优选地，当与已在pH 6.5维持相同时间的变体相比较时，在给定pH温育1小时后，该变体溶菌酶维持至少40%，优选至少50%、60%、70%或80%、更优选至少90%，甚至更优选至少95%残留活性。优选地，变体溶菌酶的残留活性是已在相同条件下处理的亲本溶菌酶的残留活性的至少1.5倍、优选至少2倍、更优选至少5倍、最优选至少7倍且甚至最优选至少20倍。优选地，该活性使用“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测试，伴随与所需降低的pH的pH偏差。

在一个方面，pH稳定性谱是改变的，从而使得溶菌酶变体在碱性pH(例如pH 7.5-12、优选8-11、更优选8.5-10、甚至更优选9-9.5)具有改善的稳定性。优选地，当与已在pH 6.5维持相同时间的变体相比较时，在给定pH温育1小时后，该变体溶菌酶维持至少40%，优选至少50%、60%、70%或80%、更优选至少90%，甚至更优选至少95%残留活性。优选地，变体溶菌酶的残留活性是已在相同条件下处理的亲本溶菌酶的残留活性的至少1.5倍、优选至少2倍、更优选至少5倍、最优选至少7倍且甚至最优选至少20倍。优选地，该活性使用“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测试，伴随与所需增加的pH的pH偏差。

改善的蛋白酶稳定性：术语“改善的蛋白酶稳定性”在本文中定义为在与蛋白酶(例如胃蛋白酶或丝氨酸蛋白酶，例如来自动物或人的消化***的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)和/或胆汁盐的温育期后，相对于亲本酶展示出结构稳定性的变体酶。优选地，蛋白酶稳定变体在酸性pH(例如pH 2-5.5、优选2.5-5.25、更优选3-5、甚至更优选3.5-4)也是稳定的。此类变体可以展示出或可以不展示出相对于亲本改变的活性谱。在与蛋白酶温育后和/或在降低的pH温育后，该变体可以例如具有相对于亲本改善的重折叠能力。就降低的pH而言，该变体在降低的pH下的温育过程中可以不是活性的，但能够维持其三维结构，且随后在它被送回pH活性范围后再次获得活性。

在一个方面，蛋白酶稳定性是改善的，从而使得溶菌酶变体在与蛋白酶和/或胆汁盐温育后具有改善的稳定性。优选地，当与已在不含蛋白酶和/或胆汁盐条件下温育相同时间的变体相比较时，在与丝氨酸蛋白酶和/或胆汁盐温育1小时后，该变体溶菌酶维持至少40%，优选至少50%、60%、70%或80%、更优选至少90%，甚至更优选至少95%残留活性。优选地，变体溶菌酶的残留活性是已在相同条件下处理的亲本溶菌酶的残留活性的至少1.5倍、优选至少2倍、更优选至少5倍、最优选至少7倍且甚至最优选至少20倍。优选地，该活性使用“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测试，伴随加入丝氨酸蛋白酶、胃蛋白酶和/或胆汁盐的偏差。

在进一步方面，蛋白酶稳定性是如上所述改善的，并且pH稳定性谱是改变的，从而使得溶菌酶变体在酸性pH(例如pH 2-5.5、优选2.5-5.25、更优选3-5、甚至更优选3.5-4)具有改善的稳定性。优选地，当与已在pH 6.5不含蛋白酶和/或胆汁盐维持相同时间的变体相比较时，在给定pH与丝氨酸蛋白酶和/或胆汁盐温育1小时后，该变体溶菌酶维持至少40%，优选至少50%、60%、70%或80%、更优选至少90%，甚至更优选至少95%残留活性。优选地，变体溶菌酶的残留活性是已在相同条件下处理的亲本溶菌酶的残留活性的至少1.5倍、优选至少2倍、更优选至少5倍、最优选至少7倍且甚至最优选至少20倍。优选地，该活性使用“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测试，伴随与所需降低的pH的pH偏差以及丝氨酸蛋白酶、胃蛋白酶和/或胆汁盐的加入。

关于变体命名的惯例

为了本发明的目的，将公开于SEQ ID NO:3中的溶菌酶的氨基酸序列用于确定另一种溶菌酶中的相应氨基酸残基。另一种溶菌酶的氨基酸序列与公开于SEQ ID NO:3中的溶菌酶的氨基酸序列比对，并且基于该比对，可以确定对应于公开于SEQ ID NO:3中的溶菌酶的氨基酸序列中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号。

使用如EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite，Rice等人，2000，Trends in Genetics 16:276-277；http://emboss.org)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)，优选3.0.0或以后的版本，可以作出多肽序列的比对。使用的任选参数是缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5、和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替代矩阵。

在描述本发明的多种溶菌酶变体中，下文描述的命名法为参考方便而修改。在所有情况下，采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

改变是占据该位置的氨基酸***和/或缺失，和/或用不同氨基酸取代占据该位置的氨基酸。

取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸/位置/取代的氨基酸。相应地，在位置226上的苏氨酸由丙氨酸的取代指定为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变由加号(“+”)分开，例如“G205R+S411F”，代表在位置205和411上分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)和用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)的突变。当原始氨基酸可以由选自某个组的氨基酸取代时，它指定为“K129R,S,A,I,F,Q”，代表在位置129上的赖氨酸由选自下组的氨基酸的取代：精氨酸(R)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)和谷氨酰胺(Q)。可替代地，“K129R,S,A,I,F,Q”可以书写为K129R或K129S、或K129A、或K129I或K129F或K129Q。

缺失。对于氨基酸缺失，使用下述命名法：原始氨基酸/位置/星号(*)。相应地，在位置195上的甘氨酸的缺失指定为“Gly195*”或“G195*”。多重缺失由加号(“+”)分开，例如G195*+S411*。

***。对于氨基酸***，使用下述命名法：星号(*)/位置/小写字母/***的氨基酸，其中小写字母指示位置编号下游的氨基酸添加。相应地，位置10下游的谷氨酸(E)***指定“*10aE”。如果第二个氨基酸例如缬氨酸(V)待在谷氨酸(E)后***位置10的下游，那么它指定“*10aE+*10bV”。对于多肽N末端的添加由0(零)指定。对于多肽的N末端氨基酸加入的谷氨酸(E)和缬氨酸(V)添加指定为“*0aE+*0bV”。“下游”***还可以描述为在命名位置和紧接命名位置后的位置之间的一个或多个氨基酸添加，例如位置195下游的***导致在位置195和196之间的一个或多个氨基酸添加，从而生成新位置*195a，*195b等等。

亲本溶菌酶

在本发明中，亲本溶菌酶是属于糖基水解酶的家族25的溶菌酶，也称为“家族25溶菌酶”，优选真菌家族25溶菌酶。糖基水解酶的家族25或溶菌酶在本文中定义为根据Henrissat B.(1991)Biochem.J.280:309-316；以及Henrissat B.和Bairoch A.(1996)Biochem.J.316:695-696，属于糖苷水解酶家族25的多肽。

亲本溶菌酶的例子包括衍生自曲霉属(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)，例如烟曲霉、费氏曲霉、棒曲霉、米曲霉、土曲霉、马尔尼菲青霉的溶菌酶。溶菌酶的具体例子包括烟曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:3)；烟曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:4)；费氏曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:5)；棒曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:6)；米曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:7)；土曲霉溶菌酶(SEQ IDNO:8)；费氏曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:9)；(SEQ ID NO:10)烟曲霉溶菌酶；棒曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:11)；土曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:12)；和马尔尼菲青霉溶菌酶(SEQ ID NO:13)。这些溶菌酶氨基酸序列的比对显示于图1中。

家族25溶菌酶的代表性结构在作为图2附带的关于SEQ ID NO:3的烟曲霉溶菌酶的原子坐标中提供。

在一个实施方案中，GH25溶菌酶定义为包含下述基序的多肽：

[GA]-X-Y-[HF]-[FY]-X(6,15)-[QED]-[AV]-X(2,5)-[FYW]-X(8,17)-[PKMYASRVLI]-X(2)-[VLI]-D-X-E，

其中使用用于氨基酸的标准IUPAC单字母编码。符号“X”用于其中接受任何氨基酸的位置。不定性通过在方括号“[]”之间列出对于给定位置的可接受氨基酸指示。例如，[QED]代表Gln或Glu或Asp。模式中的缺口(“X”)由括号之间的数字范围指示。例如，“X(2)”对应于在两个连续位置上的任何氨基酸(例如X-X)，并且X(2,5)对应于从两个到五个连续位置上的任何氨基酸(例如X-X或X-X-X或X-X-X-X或X-X-X-X-X)。

在另一个实施方案中，亲本溶菌酶是(a)对应于SEQ ID NO:2的成熟肽的多肽；或(b)包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的氨基酸序列的多肽；或(c)由在至少中等严格条件下与下述杂交的多核苷酸编码的多肽：(i)由SEQ ID NO:1的序列编码的成熟多肽，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或(d)由包含核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。

亲本溶菌酶还可以包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性程度的氨基酸序列，且所述氨基酸序列具有抗微生物和/或溶菌酶活性(以下“同源多肽”)。在一个方面，同源多肽具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的成熟多肽相差二十个氨基酸、十九个氨基酸、十八个氨基酸、十七个氨基酸、十六个氨基酸、十五个氨基酸、十四个氨基酸、十三个氨基酸、十二个氨基酸、十一个氨基酸、十个氨基酸、九个氨基酸、八个氨基酸、七个氨基酸、六个氨基酸、五个氨基酸、四个氨基酸、三个氨基酸、两个氨基酸、或仅一个氨基酸的氨基酸序列。

基本上同源的亲本溶菌酶可以具有一个或多个(几个)氨基酸改变，例如取代、缺失和/或***。这些改变优选具有较不重要的性质(minor nature)，即保守氨基酸取代和不显著影响蛋白质或多肽的三维折叠或活性的其他取代；小缺失，一般为一个至约9个氨基酸、一个至约15个氨基酸或一个至约30个氨基酸；和小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基，高达约五至十个残基、10-15个残基或20-25个残基的小接头肽，或促进纯化的小延伸(亲和标记)，例如聚组氨酸标签或蛋白A(Nilsson等人(1985)EMBOJ.4:1075；Nilsson等人(1991)Methods Enzymol.198:3。一般还参见Ford等人(1991)Protein Expression and Purification 2:95-107。

尽管上述变化优选具有较不重要的性质，但此类变化还可以具有实质性性质，例如高达300个氨基酸或更多的较大多肽作为氨基或羧基末端延伸的融合。融合多肽的例子包括结合结构域和/或接头区段向本发明的溶菌酶的添加。

保守取代的例子在下述组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的且例如由Neurath和Hill(1979)The Proteins，Academic Press，New York描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

在本发明的溶菌酶多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的程序进行鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells(1989)Science244:1081-1085)。在后面一种技术中，单个丙氨酸突变在分子中的每一个残基上引入，并且所得到的突变分子就生物学活性(即抗微生物和/或溶菌酶活性)进行测试，以鉴定对于分子的活性关键的氨基酸残基。还参见Hilton等人(1996)J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过结构的物理分析进行测定，如通过此类技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记与假定接触位点氨基酸的突变结合进行测定。参见例如de Vos等人(1992)Science 255:306-312；Smith等人(1992)J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等人(1992)FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份还可以由与多肽的同源性分析进行推断，所述多肽与根据本发明的多肽有关。以的分辨率来自烟曲霉的真菌GH25(亲本溶菌酶)的晶体结构包括在本发明中。这是溶酶体GH25家族的真核代表的首个晶体结构。该结构用作蛋白质二级结构词典(Dictionary of Protein Secondary Structure)(DSSP)程序的输入，以便计算其二级结构。DSSP程序由Wolfgang Kabsch和Chris Sander设计，以标准化二级结构指定。DSSP是关于蛋白质数据库中的所有蛋白质条目的二级结构指定的数据库。DSSP还是由PDB条目计算DSSP条目的程序。DSSP在Kabsch W.和Sander C.(1983)“Dictionary of protein secondarystructure:pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features”，Biopolymers Dec，22(12):2577-637”中描述。

下述是烟曲霉GH25溶菌酶的二级结构元件：

烟曲霉GH25溶菌酶的结构包含单个结构域，具有扁平椭圆体的形状伴随的尺寸。该酶具有β/α-桶折叠，其不同于在磷酸丙糖异构酶(TIM)和许多其他酶中发现的(β/α)8-桶(关于更多细节，参见由Rau A.，Hogg T.，Marquardt R.和Hilgenfeld R.，A new lysozyme fold.Crystal structureof the muramidase from Streptomyces coelicolor at 1.65 A resolution，Journal ofBiological Chemistry 2001，第276卷，第31994-9页的论文)。它由八个β-链和六个α-螺旋组成，其中所述链形成桶的桶板，并且所述螺旋位于其周围。如常规TIM桶中，前五个β-链和α-螺旋交替。然而，第五个α-螺旋随后为链β6-β8，其由缺乏任何螺旋的环连接。螺旋α6位于多肽链的C末端，栖于桶的底部(N末端)。所有β-链彼此平行排列，除了链β8外，非常罕见地，所述链β8处于就其他链而言的反向平行方向。

基于结构残基，SEQ ID NO:3中的D105和E107已鉴定为催化残基。在优选实施方案中，本发明的变体含有在位置105上的天冬氨酸(使用SEQ IDNO:3编号)，且含有在位置107上的谷氨酸(使用SEQ ID NO:3编号)。此外，基于该结构，SEQ ID NO:3中的下述残基D16、Q191、Y145、Y69、D201、G200、G44、G67、G14和H70已鉴定为与活性部位紧密相关。在进一步优选的实施方案中，本发明的变体含有在位置16上的天冬氨酸、在位置191上的谷氨酰胺、在位置145上的酪氨酸、在位置69上的酪氨酸、在位置201上的天冬氨酸、在位置200上的甘氨酸、在位置44上的甘氨酸、在位置67上的甘氨酸、在位置14上的甘氨酸和/或在位置70上的组氨酸(使用SEQ IDNO:3编号)。

亲本溶菌酶优选包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其等位基因变体，或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段。在一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:3的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:4的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:5的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:6的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:7的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:8的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:9的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:10的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:11的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ ID NO:12的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶包含SEQ IDNO:13的多肽或其成熟多肽。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ IDNO:12的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶由SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有抗微生物和/或溶菌酶活性的片段组成。在另一个方面，亲本溶菌酶包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列。多肽的片段是从这个氨基酸序列的氨基和/或羧基末端中缺失一个或多个(几个)氨基酸且仍维持抗微生物和/或溶菌酶活性的多肽。

在另一个方面，亲本溶菌酶可以由在极低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中-高严格条件、甚至更优选高严格条件且最优选极高严格条件下，与下述杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第2版)，Cold Spring Harbor，New York)。亚序列可以编码具有抗微生物和/或溶菌酶活性的多肽片段。在一个方面，互补链是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的亚序列或其同系物是这样的核苷酸序列，其中一个或多个(几个)核苷酸已从5'和/或3'末端中缺失，其中由亚序列编码的多肽具有抗微生物和/或溶菌酶活性。

亲本酶还可以是具有抗微生物和/或溶菌酶活性的多肽的等位基因变体。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或其片段，可以用于设计核酸探针，以根据本领域众所周知的方法鉴定且克隆编码来自不同属或种的菌株的亲本溶菌酶的DNA。特别地，根据标准Southern印迹程序，此类探针可以用于与目的属或种的基因组或cDNA杂交，以便在其中鉴定且分离相应基因。此类探针可以相当大地短于整个序列，但长度应是至少14、至少25、至少35或至少70个核苷酸。然而，优选核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如，核酸探针可以是长度至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸或至少500个核苷酸。可以使用甚至更长的探针，例如长度至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、至少900个核苷酸，长度至少1000个核苷酸、长度至少1100个核苷酸、长度至少1200个核苷酸、长度至少1300个核苷酸、长度至少1400个核苷酸、长度至少1500个核苷酸或长度至少1600个核苷酸的核酸探针。可以使用DNA和RNA探针。该探针一般是标记的用于检测相应基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白标记的)。此类探针由本发明包含。

可以在由其他生物制备的基因组DNA文库中筛选与上述探针杂交且编码亲本溶菌酶的DNA。来自其他生物的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术进行分离。来自文库的DNA或分离的DNA可以转移至且固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用该载体材料。为了本发明的目的，杂交指示在低至极高严格条件下，多核苷酸与对应于SEQ ID NO:1中所示多核苷酸、其互补链或其亚序列的标记的核苷酸探针杂交。探针与之杂交的分子可以使用例如X射线胶片或本领域已知的任何其他检测工具进行检测。

在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸51-705，或SEQ ID NO:1的核苷酸75-705。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，极低至极高严格条件定义为在42℃在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的鲑精DNA，和对于极低和低严格性25%甲酰胺，对于中等和中-高严格性35%甲酰胺，或对于高和极高严格性50%甲酰胺中，根据标准DNA印迹程序预杂交和杂交最佳12–24小时。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将载体材料最后洗涤三次，各15分钟，使用2X SSC、0.2%SDS优选在45℃(极低严格性)、更优选在50℃(低严格性)、更优选在55℃(中等严格性)、更优选在60℃(中-高严格性)、甚至更优选在65℃(高严格性)、且最优选在70℃(极高严格性)。

对于长度约15个核苷酸–约70个核苷酸的短探针，严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy的计算(参见Bolton和McCarthy(1962)Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390)计算的T_m低约5℃-约10℃，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5%NP-40、1X Denhardt's溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA/ml中，根据标准DNA印迹程序预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12–24小时。

对于长度约15个核苷酸–约70个核苷酸的短探针，将载体材料在6XSCC加上0.1%SDS中洗涤一次15分钟，且在比计算的T_m低5℃-10℃使用6X SSC洗涤两次，各15分钟。

在第三个方面，亲本溶菌酶通过包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%且甚至最优选96%、97%、98%或99%的同一性程度，其编码活性多肽。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸82-1653，或SEQ ID NO:1的核苷酸97-1653。

亲本溶菌酶可以得自任何属的微生物。在一个方面，亲本溶菌酶是细胞外分泌的。

在一个实施方案中，亲本溶菌酶是真菌溶菌酶。亲本真菌溶菌酶的例子包括衍生自曲霉属或青霉属，例如烟曲霉、费氏曲霉、棒曲霉、米曲霉、土曲霉、马尔尼菲青霉的溶菌酶。亲本真菌溶菌酶的具体例子包括烟曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:3)；烟曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:4)；费氏曲霉溶菌酶(SEQ IDNO:5)；棒曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:6)；米曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:7)；土曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:8)；费氏曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:9)；(SEQ ID NO:10)烟曲霉溶菌酶；棒曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:11)；土曲霉溶菌酶(SEQ IDNO:12)；和马尔尼菲青霉溶菌酶(SEQ ID NO:13)。

在进一步方面，亲本溶菌酶可以是细菌溶菌酶。例如，溶菌酶可以是***多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)，优选来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)BA_GH25C(Martinez-Fleites等人(2009)Carbohydr Res，344(13):1753-1757)。其他亲本细菌溶菌酶可以是天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)cellosyl(Rau等人(2001)J Biol Chem，276(34):31994-31999)、细菌噬菌体溶素PlyB(Porter等人(2007)J Mol Biol，366(2):540-550)、或来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)噬菌体的Clp-1溶菌酶(Perez-Dorado等人(2007)J Biol Chem，282(34):24990-24999)。

变体的生成

亲本溶菌酶的变体可以根据本领域已知的任何诱变程序进行制备，例如随机和/或定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成，以编码目的多肽分子。基因合成可以利用许多技术执行，例如由Tian等人(Tian等人，Nature432:1050-1054)描述的基于多路微芯片的技术和相似技术，其中在光程序控制的微流体芯片上合成且装配寡核苷酸。

半合成基因构建通过组合合成基因构建和/或定点诱变和/或随机诱变和/或改组的方面来完成。半合成构建通过与PCR技术组合的利用合成的多核苷酸片段的过程代表。基因的限定区域因而可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物进行扩增，而另外其他区域可以实施易错PCR或非易错PCR扩增。多核苷酸片段随后可以是改组的。

定点诱变是其中在编码亲本溶菌酶的多核苷酸分子的限定位点上产生一个或多个突变的技术。该技术可以在体外或体内实施。

定点诱变可以通过PCR在体外完成，所述PCR涉及含有所需突变的寡核苷酸引物的使用。定点诱变还可以通过盒式诱变在体外执行，所述盒式诱变涉及通过限制性酶在包含编码亲本溶菌酶的多核苷酸的质粒中的位点上的切割，和在多核苷酸中含有突变的寡核苷酸的后续连接。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，允许质粒和***片段的粘性末端彼此连接。关于合适技术的进一步描述，参考下述：Sambrook等人(1989)Molecularcloning:A laboratory manual，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.等人(编辑)Current protocols in Molecular Biology，JohnWiley和Sons(1995)；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)MolecularBiological Methods for Bacillus，John Wiley和Sons(1990)；WO 96/34946；Scherer和Davis(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等人(1990)Nucleic Acids Research 18:7349-4966。

在连接酶反应后，连接混合物可以用于转化宿主细胞，对于克隆目的，大肠杆菌(E.coli)细胞通常如Ausubel，F.M.等人中所述使用。经转化的大肠杆菌细胞可以在液体培养基中或在固体琼脂平板上增殖，质粒可以从经转化的细胞拯救且用于转化枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞。可以如WO 03/095658中所述转化合适的感受态芽孢杆菌属细胞，例如MB1510，168-衍生物(例如可用登记号1A1 168 trpC2从BGSC获得)。用于文库构建的大肠杆菌质粒携带的整合盒可以用于芽孢杆菌属转化。该方法在WO 03/095658中详细描述。可替代地，可以使用体外扩增的PCR-SOE-产物(Melnikov和Youngman，Nucleic Acid Research 27:1056)。

定点诱变可以通过本领域已知的方法在体内完成(参见例如美国专利申请公开2004/0171154；Storici等人(2001)Nature Biotechnology 19:773-776；Kren等人(1998)Nat.Med.4:285-290；以及Calissano和Macino(1996)FungalGenet.Newslett.43:15-16)。

任何定点诱变程序可以用于本发明中。存在可用于制备亲本溶菌酶的变体的许多可获得的商品化试剂盒。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后为有关筛选程序，例如由Reidhaar-Olson和Sauer(1988)Science 241:53-57；Bowie和Sauer(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625公开的那些，可以制备且测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人(1991)Biochem.30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和定位诱变(Derbyshire等人(1986)Gene 46:145；Ner等人(1988)DNA 7:127)。

如上所述的诱变/改组方法可以与高流通量、自动化筛选方法组合，以检测由宿主细胞例如如上所述的芽孢杆菌属表达的经克隆、诱变的多肽的活性。可以从宿主细胞中回收编码具有抗微生物和/或溶菌酶活性的多肽的经诱变的DNA分子，且使用本领域的标准方法快速测序。

变体

本发明的分离的变体包含在选自下组的位置编号的一个或多个(几个)位置上的氨基酸改变：47、111、108、45、22、110、120、147、196、49、55、193 161、128、131、95、203、98、112、55、32、89、206 121、120、185、186、176、113、122、119、35、65、139、141、153、158、171、195、76、164、30、85、178、183、186、112、174、187、197、102、134、108、196、197、198、56、19、120、20、135和203，其中所述变体具有抗微生物和/或溶菌酶活性。位置的编号是相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

本发明的分离的变体包含在选自下组的位置编号的一个或多个(几个)位置上的氨基酸改变：47、111、108、45、22、110、120、147、196、49、55、193、161、128、131、203、98、112、55、32、89、206 121、120、185、113、119、35、153、158、171、195、76、164、30、85、178、183、186、112、174、187、197、102、134、108、196、197、198、56、19、120、20、135和203，其中所述变体具有抗微生物和/或溶菌酶活性。位置的编号是相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在一个实施方案中，上述变体包含在选自位置编号95、186、65、122、139、141和176的一个或多个位置上的另外的氨基酸改变。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置19上的改变或由在位置19上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置19上的氨基酸由Asn的取代。例如，本发明的分离的变体包含N19D的改变或由N19D的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置20上的改变或由在位置20上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置20上的氨基酸由His或Tyr的取代。例如，本发明的分离的变体包含H20W或H20Y的改变或由H20W或H20Y的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置22上的改变或由在位置22上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置22上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含K22G的改变或由K22G的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置30上的改变或由在位置30上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置30上的氨基酸由Tyr的取代。例如，本发明的分离的变体包含K30Y的改变或由K30Y的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置32上的改变或由在位置32上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置32上的氨基酸由Ser的取代。例如，本发明的分离的变体包含D32S的改变或由D32S的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置35上的改变或由在位置35上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置35上的氨基酸由Arg的取代。例如，本发明的分离的变体包含Q35R的改变或由Q35R的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置45上的改变或由在位置45上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置45上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含T45G的改变或由T45G的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置47上的改变或由在位置47上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置47上的氨基酸由Phe的取代。例如，本发明的分离的变体包含Y47F的改变或由Y47F的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置49上的改变或由在位置49上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置49上的氨基酸由Ala的取代。例如，本发明的分离的变体包含D49A的改变或由D49A的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置55上的改变或由在位置55上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置55上的氨基酸由Ala或Asn的取代。例如，本发明的分离的变体包含H55A或H55N的改变或由H55A或H55N的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置56上的改变或由在位置56上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置56上的氨基酸由Trp的取代。例如，本发明的分离的变体包含Y56W的改变或由Y56W的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置65上的改变或由在位置65上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置65上的氨基酸由ILe的取代。例如，本发明的分离的变体包含L65I的改变或由L65I的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置76上的改变或由在位置76上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置76上的氨基酸由Ser的取代。例如，本发明的分离的变体包含K76S的改变或由K76S的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置85上的改变或由在位置85上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置85上的氨基酸由Tyr的取代。例如，本发明的分离的变体包含K85Y的改变或由K85Y的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置89上的改变或由在位置89上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置89上的氨基酸由Thr的取代。例如，本发明的分离的变体包含N89T的改变或由N89T的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置95上的改变或由在位置95上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置95上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含D95G的改变或由D95G的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置98上的改变或由在位置98上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置98上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含R98G的改变或由R98G的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置102上的改变或由在位置102上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置102上的氨基酸由Pro的取代。例如，本发明的分离的变体包含G102P的改变或由G102P的改变组成。该变体还可以进一步包含Y134V的改变。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置108上的改变或由在位置108上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置108上的氨基酸由Phe或Trp的取代。例如，本发明的分离的变体包含Y108F或Y108W的改变或由Y108F或Y108W的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置110上的改变或由在位置110上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置110上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含P110G的改变或由P110G的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置111上的改变或由在位置111上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置111上的氨基酸由Phe的取代。例如，本发明的分离的变体包含Y111F的改变或由Y111F的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置112上的改变或由在位置112上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置112上的氨基酸由Ser的取代。例如，本发明的分离的变体包含G112S的改变或由G112S的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置113上的改变或由在位置113上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置113上的氨基酸由Pro的取代。例如，本发明的分离的变体包含A113P的改变或由A113P的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置119上的改变或由在位置119上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置119上的氨基酸由Asn的取代。例如，本发明的分离的变体包含S119N的改变或由S119N的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置120上的改变或由在位置120上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置120上的氨基酸由Ala、Gln或Pro的取代。例如，本发明的分离的变体包含H120A、H120Q或H120P的改变或由H120A、H120Q或H120P的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置121上的改变或由在位置121上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置121上的氨基酸由Ala的取代。例如，本发明的分离的变体包含S121A的改变或由S121A的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置122上的改变或由在位置122上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置122上的氨基酸由Ala的取代。例如，本发明的分离的变体包含Q122A的改变或由Q122A的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置128上的改变或由在位置128上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置128上的氨基酸由Arg的取代。例如，本发明的分离的变体包含H128R的改变或由H128R的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置131上的改变或由在位置131上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置131上的氨基酸由Cys的取代。例如，本发明的分离的变体包含V131C的改变或由V131C的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置134上的改变或由在位置134上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置134上的氨基酸由Val的取代。例如，本发明的分离的变体包含Y134V的改变或由Y134V的改变组成。该变体可以进一步包含G102G的改变。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置135上的改变或由在位置135上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置135上的氨基酸由Asn的取代。例如，本发明的分离的变体包含H135N的改变或由H135N的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置139上的改变或由在位置139上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置139上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含S139G的改变或由S139G的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置141上的改变或由在位置141上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置141上的氨基酸由Tyr的取代。例如，本发明的分离的变体包含W141Y的改变或由W141Y的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置147上的改变或由在位置147上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置147上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含T147G的改变或由T147G的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置153上的改变或由在位置153上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置153上的氨基酸由Thr的取代。例如，本发明的分离的变体包含R153T的改变或由R153T的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置158上的改变或由在位置158上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置158上的氨基酸由Ser的取代。例如，本发明的分离的变体包含A158S的改变或由A158S的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置161上的改变或由在位置161上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置161上的氨基酸由Tyr的取代。例如，本发明的分离的变体包含F161Y的改变或由F161Y的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置164上的改变或由在位置164上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置164上的氨基酸由Thr的取代。例如，本发明的分离的变体包含K164T的改变或由K164T的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置171上的改变或由在位置171上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置171上的氨基酸由Arg的取代。例如，本发明的分离的变体包含A171R的改变或由A171R的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置176上的改变或由在位置176上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置176上的氨基酸由Val的取代。例如，本发明的分离的变体包含P176V的改变或由P176V的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置178上的改变或由在位置178上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置178上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含K178G的改变或由K178G的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置183上的改变或由在位置183上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置183上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含D183G的改变或由D183G的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置185上的改变或由在位置185上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置185上的氨基酸由Pro的取代。例如，本发明的分离的变体包含K185P的改变或由K185P的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置186上的改变或由在位置186上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置186上的氨基酸由Tyr的取代。例如，本发明的分离的变体包含T186Y的改变或由T186Y的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置193上的改变或由在位置193上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置193上的氨基酸由Ala的取代。例如，本发明的分离的变体包含S193A的改变或由S193A的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置195上的改变或由在位置195上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置195上的氨基酸由Ser的取代。例如，本发明的分离的变体包含K195S的改变或由K195S的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置196上的改变或由在位置196上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置196上的氨基酸由Gly的取代。例如，本发明的分离的变体包含Y196G的改变或由Y196G的改变组成。该变体可以进一步包含K197P的改变。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置197上的改变或由在位置197上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置197上的氨基酸由Pro的取代。例如，本发明的分离的变体包含K197P的改变或由K197P的改变组成。该变体可以进一步包含Y196G的改变。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置198上的改变或由在位置198上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置198上的氨基酸由Asn或Phe的取代。例如，本发明的分离的变体包含H198N或H198F的改变或由H198N或H198F的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置203上的改变或由在位置203上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置203上的氨基酸由Asn的取代。例如，本发明的分离的变体包含D203N的改变或由D203N的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在位置206上的改变或由在位置206上的改变组成(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在一个实施方案中，改变是在位置19上的氨基酸由Ala或Ser的取代。例如，本发明的分离的变体包含N206A或N206S的改变或由N206A或N206S的改变组成。

在一个实施方案中，本发明的分离的变体包含与属于糖基水解酶的家族25的溶菌酶、优选真菌家族25溶菌酶的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本发明的分离的变体包含与对应于SEQ ID NO:2的成熟肽的多肽的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，该变体包含与SEQ ID NO:3具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本发明的分离的变体包含在至少中等严格条件下与下述杂交的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列：(i)由SEQ ID NO:1的序列编码的成熟多肽，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

在另一个实施方案中，本发明的分离的变体包含由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%同一性的核苷酸序列。

在一个实施方案中，分离的变体进一步包含在位置105上的天冬氨酸和在位置107上的谷氨酸(使用SEQ ID NO:3进行编号)。在另一个实施方案中，分离的变体进一步包含在位置16上的天冬氨酸、在位置191上的谷氨酰胺、在位置145上的酪氨酸、在位置69上的酪氨酸、在位置201上的天冬氨酸、在位置200上的甘氨酸、在位置44上的甘氨酸、在位置67上的甘氨酸、在位置14上的甘氨酸和/或在位置70上的组氨酸(使用SEQ ID NO:3编号)。

在一个实施方案中，本发明提供了相对于亲本溶菌酶具有改变的性质的溶菌酶变体。在一个实施方案中，与亲本溶菌酶相比较，溶菌酶变体在碱性pH条件下(例如pH 7.5-12、优选8-11、更优选8.5-10、甚至更优选9-9.5)具有改善的pH稳定性和/或活性。相应地，本发明提供了亲本溶菌酶的变体，其中所述变体包含在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变或由在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变组成：102、134、108、196、197、198、56、19、120、20、135和/或203(使用SEQ ID NO:3进行编号)，并且其中与亲本溶菌酶相比较，所述变体在碱性pH具有增加的稳定性和/或活性。构建下述溶菌酶变体，以与亲本酶相比较，在碱性pH条件下(例如pH 7.5-12、优选8-11、更优选8.5-10、甚至更优选9-9.5的pH)具有改善的pH稳定性和/或活性(使用SEQ ID NO:3进行编号)。

G102P；    Y134V；

G102P；    T108W；

T196G；    K197G；

Y196G；    K197P；

Y56W；     N19D；

H120Q；    H198N；

H198F；    H20W；

H20Y；和/或H135N。

构建下述改变的组合，以与亲本酶相比较，在碱性pH条件下(pH 7.5-12、优选8-11、更优选8.5-10、甚至更优选9-9.5)具有改善的pH稳定性和/或活性(使用SEQ ID NO:3进行编号)：G102P和Y134V和/或Y196G和K197P。

在一个实施方案中，与亲本溶菌酶相比较，溶菌酶变体在碱性pH条件下(例如pH 7.5-12、优选8-11、更优选8.5-10、甚至更优选9-9.5)具有改善的活性。与亲本酶相比较，构建为在碱性pH(例如pH 7.5-12、优选8-11、更优选8.5-10、甚至更优选9-9.5)具有改善的活性的溶菌酶变体的例子是D203N(使用SEQ ID NO:3进行编号)。

在一个实施方案中，与亲本溶菌酶相比较，溶菌酶变体在酸性pH条件下(例如pH 2-5.5、优选2.5-5.25、更优选3-5、甚至更优选3.5-4)具有改善的pH稳定性。相应地，本发明提供了亲本溶菌酶(patent lysozyme)的变体，其中所述变体包含在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变或由在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变组成：161、128、131、95、203、98、112、55、32、89和/或203(使用SEQ ID NO:3进行编号)，并且其中与亲本溶菌酶相比较，所述变体在酸性pH条件下具有增加的活性。构建下述溶菌酶变体，以与亲本酶相比较，在酸性pH(例如pH 2-5.5、优选2.5-5.25、更优选3-5、甚至更优选3.5-4)具有改善的pH稳定性(使用SEQ IDNO:3进行编号)。

F161Y；    H128R；

V131C；    D95G；

D203N；    R98G；

G112S；    H55N；

D32S；     N89T；

N206A；和/或N206S。

在一个实施方案中，与亲本溶菌酶相比较，溶菌酶变体在酸性pH的条件下(例如pH 2-5.5、优选2.5-5.25、更优选3-5、甚至更优选3.5-4)和在胃的蛋白酶的存在下具有改善的稳定性。在这一点上，胃的蛋白酶意指在消化过程中由生物分泌到胃肠道内的蛋白酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶；或外部添加的蛋白酶，例如加入饲料的蛋白酶，例如在ProAct(Novozymes A/S)的名称下销售的商购可得的蛋白酶，或其任何混合物。相应地，本发明提供了亲本溶菌酶(patent lysozyme)的变体，其中所述变体包含在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变或由在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变组成：56、131和/或161(使用SEQ ID NO:3进行编号)，并且其中与亲本溶菌酶相比较，所述变体在酸性pH条件下在一种或多种胃的蛋白酶的存在下具有增加的稳定性。构建溶菌酶变体，以与亲本酶相比较，在酸性pH(例如2-5.5、优选2.5-5.25、更优选3-5、甚至更优选3.5-4)在一种或多种胃的蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶及其任何混合物)的存在下具有改善的稳定性，所述溶菌酶变体包括包含下述取代的变体(使用SEQ ID NO:3进行编号)：

Y56W；    V131C和/或

F161C。

在一个实施方案中，与亲本溶菌酶相比较，溶菌酶变体在低温(例如0℃-20℃、优选2℃-18℃、优选5℃-15℃、更优选8℃-12℃、甚至最优选10℃-15℃)或中等温度(例如15℃-45℃、优选20℃-40℃、优选22℃-35℃、最优选25℃-30℃)具有改善的活性。相应地，本发明提供了亲本溶菌酶的变体，其中所述变体包含在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变或由在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变组成：47、111、108、45、22、110、120、147、196、49、55和/或193，并且其中与亲本溶菌酶相比较，所述变体在低温具有改善的活性。构建下述变体，以与亲本溶菌酶相比较，在低温(例如0℃-20℃、优选2℃-18℃、优选5℃-15℃、更优选8℃-12℃、甚至最优选10℃-15℃)或中等温度(例如15℃-45℃、优选20℃-40℃、优选22℃-35℃、最优选25℃-30℃)具有改善的活性(使用SEQ IDNO:3进行编号)。

Y47F；    Y111F；

Y108F；   T45G；

K22G；    P110G；

H120A；   T147G；

Y196G；   D49A；

H55A；和/或S193A。

在一个实施方案中，与亲本溶菌酶相比较，溶菌酶变体具有改善的热稳定性(例如45℃-110℃，优选50℃-100℃，更优选60℃-90℃，甚至更优选70℃-80℃的温度)。相应地，本发明提供了亲本溶菌酶的变体，其中所述变体包含在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变或由在选自下组的位置编号的一个或多个位置的改变组成：121、120、185、186、176、113、122、119、35、65、139、141、153、158、171、195、76、164、30、85、178、183、186、112和/或197，并且其中与亲本溶菌酶相比较，所述变体具有改善的热稳定性。构建下述变体，以与亲本溶菌酶相比较，具有改善的热稳定性(例如45℃-110℃，优选50℃-100℃，更优选60℃-90℃，甚至更优选70℃-80℃的温度)(使用SEQ ID NO:3进行编号)：

S121A；    H120P；

T186T；    A113P；

K185P；    P176V；

Q122A；    S119N；

Q35R；     L65I；

S139G；    W141Y；

R153T；    A158S；

A171R；    K195S；

K76S；     K164T；

K30Y；     F85Y；

K178C；    D183G；

Y186Y；    G112S；和/或

K197P。

与亲本溶菌酶相比较，具有改善的热稳定性的优选变体包括包含下述取代的变体(使用SEQ ID NO:3进行编号)：

N19D；    H20Y；

K22G；    T45G；

Y47F；    D49G；

H55A；    R98G；

A158S和/或K164T。

与亲本溶菌酶相比较，包含在一个或多个上文鉴定的位置上的改变的变体在去污剂中优选在液体去污剂中具有增加的稳定性。

本发明的溶菌酶变体具有抗微生物活性和/或溶菌酶活性。不能催化在肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的和在壳糊精中的N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-键的水解的溶菌酶变体仍可以具有抗微生物效应，因为此类无活性的溶菌酶变体可以结合微生物的表面且潜在抑制其生长。此类溶菌酶变体还可以称为“抑菌剂”。

应当理解，需要时，上述实施方案可以组合，尤其是所示位置和具体取代可以与变体的序列身份(identity)组合。

多核苷酸

本发明还涉及编码根据本发明的亲本溶菌酶的变体的分离的多核苷酸。特别地，编码如上文变体部分中所述的溶菌酶变体的多核苷酸由本发明包含。在至少中等严格条件下，但优选在高严格条件下，本发明的多核苷酸将与变性的双链DNA探针、或具有至少约100个碱基对的包含其变体亚序列的任何探针杂交，所述DNA探针包含对应于SEQ ID NO:1的位置1–705，或SEQ ID NO:1的位置51–705或SEQ ID NO:1的75–705的完全变体序列，其中对应于变体中的实际氨基酸改变具有适当的序列改变。本发明的变体多核苷酸还可以包含沉默突变，加上引起上文变体部分中所述的氨基酸改变的突变。沉默突变是不引起氨基酸变化的三字母编码的突变，例如GTT至GAT的突变，二者均编码缬氨酸。

编码本发明的溶菌酶变体的多核苷酸包括DNA和RNA。用于分离DNA和RNA的方法是本领域众所周知的。编码目的基因的DNA和RNA可以通过本领域已知的方法手段在Gene Banks或DNA文库中克隆。随后通过例如杂交或PCR鉴定且分离编码本发明具有抗微生物和/或溶菌酶活性的多肽的多核苷酸。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的表达载体，特别是重组表达载体。本发明的核酸构建体包含优选与一种或多种控制序列可操作地连接的，编码本发明的变体溶菌酶的分离的多核苷酸，所述一种或多种控制序列指导在与控制序列相容的条件下编码序列在合适的宿主细胞中的表达。在产生该表达载体中，编码序列位于该载体中，从而使得编码序列与用于表达的合适控制序列可操作地连接。控制序列可以由载体或***该载体内的核酸构建体提供。

控制序列可以是合适的启动子序列，即由宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变型、截短的和杂合启动子，并且可以得自与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因。此类启动子是本领域众所周知的。控制序列还可以是合适的转录终止子序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列是与编码多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地连接的。在选择的宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中；此类终止子是本领域众所周知的。控制序列还可以是合适的前导序列，即对于通过宿主细胞的翻译是重要的mRNA的非翻译区。前导序列是与编码多肽的核苷酸序列的5'末端可操作地连接的。在选择的宿主细胞中起作用的任何前导序列都可以用于本发明中；此类前导序列是本领域众所周知的。控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，并且将所编码的多肽导向细胞的分泌途径内。核苷酸序列的编码序列的5'末端可以固有地含有在翻译读码框中与编码所分泌多肽的编码区的区段天然连接的信号肽编码区。可替代地，编码序列的5'末端可以含有对于编码序列是外源的信号肽编码区。当编码序列天然地不含有信号肽编码区时，可能需要外源信号肽编码区。可替代地，外源信号肽编码区可以简单地替换天然信号肽编码区，以便增强多肽的分泌。然而，将所编码的多肽导向选择的宿主细胞的分泌途径内的任何信号肽编码区都可以用于本发明中。控制序列还可以是多聚腺苷酸化序列，即与核苷酸序列的3'末端可操作地连接的序列，并且当转录时，由宿主细胞识别为对所转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基的信号。在选择的宿主细胞中起作用的任何多聚腺苷酸序列都可以用于本发明中。还可能希望加入允许相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达的调节序列。调节序列的例子是引起基因的表达响应化学或物理刺激包括调节化合物的存在而打开或关闭的那些。

编码本发明的变体溶菌酶的分离的多核苷酸可以以多种方法进行操纵，以提供多肽的表达。在***载体内之前的多核苷酸序列操纵可能是希望或需要的，取决于表达载体。利用重组DNA方法用于修饰多核苷酸序列的技术是本领域众所周知的。此外，可以帮助多肽的纯化或固定的标签可以加入多肽中。此类标签可以例如是多组氨酸标签(His标签)。优选地，该标签位于多肽的N末端或C末端，并且可以由载体编码。可替代地，该标签可以位于多肽内部，只要它不影响多肽的功能性。

重组表达载体可以是任何载体(例如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒)，其可以方便地实施重组DNA程序且可以造成核苷酸序列的表达。载体的选择一般取决于载体与该载体待引入其内的宿主细胞的相容性。

该载体可以是线性或闭合环状质粒。该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。

该载体可以含有用于确保自复制的任何手段。可替代地，该载体可以是当引入宿主细胞内时，整合到基因组内且连同它已整合到其内的染色体一起复制的那种。此外，可以使用单个载体或质粒或一起含有待引入宿主细胞的基因组内的全部DNA的两种或更多种载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选含有允许容易选择经转化的细胞的一种或多种选择标记。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养等的基因。细菌选择标记的例子是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的dal基因，或赋予抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等价物。优选用于在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体可以含有允许载体稳定整合到宿主细胞的基因组内或载体不依赖于基因组在细胞中自主复制的元件。

本发明的核苷酸序列的超过一个拷贝可以***宿主细胞内，以增加基因产物的产生。可以通过将序列的至少一个另外拷贝整合到宿主细胞基因组内或通过包括可扩增的选择标记基因与核苷酸序列而获得核苷酸序列的拷贝数中的增加，其中可以通过在合适选择试剂的存在下培养细胞来选择含有选择标记基因的扩增拷贝并且从而含有核苷酸序列的另外拷贝的细胞。

用于将上述元件连接以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook等人(1989)同上)。

在本发明的一个实施方案中，该质粒载体可以含有下述元件：

i)信号肽编码区(例如得自关于芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA的基因)，随后为编码成熟溶菌酶变体的多核苷酸序列。这种序列可以在下述前且与之可操作地连接：

ii)包含mRNA稳定区段(例如衍生自CryIIIa基因，如WO 99/043835中所示)的DNA序列；

iii)标记基因(例如氯霉素抗性基因)；和

iv)分别作为多核苷酸上游和下游的5'和3'侧翼区段的来自枯草芽孢杆菌的基因组DNA，以使得通过同源重组在侧翼区段和芽孢杆菌属基因组之间的基因组整合成为可能。

上述载体还可以用于使用先前描述的诱变程序的变体生成和筛选。

宿主细胞

本发明还涉及包含编码本发明的变体溶菌酶的多核苷酸的重组宿主细胞，其有利地用于多肽的重组产生中。将包含本发明的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞内，从而使得该载体作为染色体整合体或作为如早先描述的自复制的染色体外载体维持。

宿主细胞可以是原核生物例如细菌细胞、古细菌或真核生物例如真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

有用的原核生物是细菌细胞例如***，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、耐盐嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；或链霉菌属(Streptomyces)细胞，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌和假单胞菌属(Pseudomonas)菌种。在优选实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选实施方案中，芽孢杆菌属细胞是嗜碱性芽孢杆菌。

载体引入细菌宿主细胞内可以例如通过下述来实现：原生质体转化(参见例如Chang和Cohen(1979)Molecular General Genetics 168:111-115)、使用感受态细胞(参见例如Young和Spizizin(1961)Journal of Bacteriology81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson(1971)Journal of MolecularBiology 56:209-221)、电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower(1988)Biotechniques 6:742-751)、或缀合(参见例如Koehler和Thorne(1987)Journal ofBacteriology 169:5771-5278)。

在优选实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如由Hawksworth等人(1995)Ainsworthand Bisby’sDictionary of The Fungi(第8版)，CAB International，UniversityPress，Cambridge，UK定义)以及卵菌门(如Hawksworth等人(1995)Ainsworthand Bisby’s Dictionary of The Fungi(第8版)，CAB International，UniversityPress，Cambridge，UK，第171页中引用的)和所有有丝***孢子真菌(Hawksworth等人(1995)Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi(第8版)，CAB International，University Press，Cambridge，UK)。在更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。如本文使用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于不完全真菌的酵母(芽生菌目)。因为酵母的分类在未来可能改变，所以为了本发明的目的，酵母应是如Biology andActivities of Yeast(Skinner，Passmore和Davenport(编辑)(1980)Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)中所述定义的。

在甚至更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞。在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、Saccharomyces norbensis、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。丝状真菌包括亚门真菌门和卵菌门(如由Hawksworth等人(1995)Ainsworth andBisby’s Dictionary of The Fungi(第8版)，CAB International，UniversityPress，Cambridge，UK定义)的所有丝状体形式。丝状真菌的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖及其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，通过酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，并且碳分解代谢可以是发酵的。在甚至更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是下述属(但不限于)的菌种的细胞：枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、或木霉属(Trichoderma)。在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、网状镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红色镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在甚至最优选的实施方案中，丝状真菌亲本细胞是镶片镰孢Nirenberg新种(Fusarium venenatumNirenberg sp.nov.)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

真菌细胞可以通过以本身已知方式的涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的过程进行转化。用于转化曲霉属宿主细胞的合适程序在EP238023和Yelton等人(1984)Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等人(1989)Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由Becker和Guarente，Abelson和Simon(编辑)Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology 194:182-187，Academic Press，Inc.，NewYork；Ito等人(1983)Journal of Bacteriology 153:163；和Hinnen等人(1978)Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920描述的程序转化酵母。

本发明的特定实施方案是用编码本发明的变体溶菌酶的多核苷酸转化的重组宿主细胞。优选地，此类宿主细胞不含有固有的溶菌酶编码基因，或此类基因已被破坏。从而重组变体溶菌酶是由本发明的重组宿主细胞产生的唯一溶菌酶。

产生方法

本发明还涉及产生溶菌酶变体的方法，其包括：(a)在适合于该变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)从培养基中回收该变体。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法，在适合于产生溶菌酶变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在实验室或工业发酵罐中在合适培养基中执行的摇瓶培养、或小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)且在允许多肽被表达和/或分离的条件下培养细胞。培养在包含碳和氮源以及无机盐的合适营养培养基中发生，使用本领域已知的程序。合适培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如在美国典型培养物中心的目录中)进行制备。如果多肽被分泌到营养培养基内，那么该多肽可以直接从培养基中回收。如果多肽不被分泌，那么它可以从细胞裂解产物中回收。

本发明的一个实施方案是产生亲本溶菌酶的变体的方法，其中所述变体具有抗微生物和/或溶菌酶活性，所述方法包括：a)在适合于该变体表达的条件下培养细胞，其中所述细胞含有编码亲本溶菌酶的变体的多核苷酸序列，其中所述变体在选自下组的位置的一个或多个(几个)氨基酸位置中是改变的：47、111、108、45、22、110、120、147、196、49、55、193 161、128、131、95、203、98、112、55、32、89、206121、120、185、186、176、113、122、119、35、65、139、141、153、158、171、195、76、164、30、85、178、183、186、112、174、187、197、102、134、108、196、197、198、56、19、120、20、135和203，并且所述多核苷酸序列是通过对下述的诱变制备的：SEQ ID NO:1的亲本多核苷酸序列，或与SEQ IDNO:1的核苷酸序列具有至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%同一性的亲本多核苷酸序列；和b)从培养基中回收溶菌酶变体。

在可替代方面，不回收溶菌酶变体，相反，表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。

溶菌酶变体可以使用对于所表达多肽特异性的本领域已知的方法进行检测。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，酶测定可以如本文实施例中描述的用于测定变体溶菌酶的活性。

所得到的溶菌酶变体可以通过本领域已知的方法进行回收。例如，该多肽可以通过常规程序从营养培养基中回收，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的溶菌酶变体可以通过本领域已知的多种程序进行纯化，包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如J.-C.Janson和Lars Ryden(编辑)(1989)Protein Purification VCHPublishers，New York)，以获得基本上纯的溶菌酶变体。

组合物

本发明还涉及包含本发明的变体溶菌酶或具有抗微生物和/或溶菌酶活性的多肽和载体和/或赋形剂的组合物。优选地，该组合物富含此类变体或多肽。术语“富含”指示组合物的抗微生物和/或溶菌酶活性已经增加，例如具有1.1或更多的富集因子。优选地，该组合物配制为提供希望特征例如低色彩、低气味和可接受的贮存稳定性。

该组合物可以包含本发明的变体或多肽作为主要酶促组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多重酶促活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

多肽组合物可以依照本领域已知的方法进行制备且以液体、糊、凝胶或干燥制剂的形式。例如，多肽可以是以颗粒或微颗粒的形式配制的。待包括在该组合物中的变体或多肽可以依照本领域已知的方法稳定化。在优选实施方案中，变体溶菌酶配制在液体组合物中。

本发明的优选实施方案是包含本发明的溶菌酶变体的饲料组合物。特别地，在酸性pH具有改善的稳定性和/或增加的蛋白酶稳定性的变体是优选的。

去污剂组合物

本发明还包括包含本发明的溶菌酶变体的去污剂组合物。特别地，在碱性pH具有改善的稳定性和/或活性的变体和/或在低或中等温度具有改善的活性的变体是优选的。去污剂组合物可以适合于特定用途例如洗衣特别是家庭洗衣、餐具洗涤或硬表面清洁。

去污剂组合物一般包含常规去污剂成分，例如表面活性剂、助剂(builders)、漂白剂、酶和其他成分。

在优选实施方案中，去污剂组合物包含溶菌酶和蛋白酶。

去污剂组合物可以是任何形式，例如固体、液体、糊、凝胶或其任何组合。该组合物可以是片剂、条或小袋包括多区室小袋的形式。该组合物可以是粉末例如自由流动的粉末例如凝聚物、喷雾干燥粉末、囊粒、挤出物(extrudate)、针、面条、薄片或其任何组合的形式。

酶

在一个方面，本发明提供了包含本发明的溶菌酶变体的去污剂添加剂。去污剂添加剂以及去污剂组合物可以包含一种或多种酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、***糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。

一般而言，所选酶的性质应与所选去污剂相容(即最适pH、与其他酶促和非酶促成分的相容性等)，并且酶应以有效量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些。微生物起源是优选的。包括化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。蛋白酶可以例如是金属蛋白酶(EC 3.4.17或EC 3.4.24)或丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)，尤其是衍生自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述的)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的胰蛋白酶(例如具有猪或牛起源)和镰孢属蛋白酶。

有用的蛋白酶的例子是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，尤其是在一个或多个下述位置中具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

优选的商购可得的蛋白酶包括 和(Novozymes A/S)、 PurafectFN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

蛋白酶可以依照本发明以按组合物的重量计0.000001%-2%酶蛋白质的水平掺入去污剂组合物内，优选以按组合物的重量计0.00001%-1%酶蛋白质的水平，更优选以按组合物的重量计0.0001%-0.5%酶蛋白质的水平，甚至更优选以按组合物的重量计0.001%-0.2%酶蛋白质的水平。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括具有细菌或真菌起源的那些。在这一点上，包括此类脂肪酶的化学或遗传修饰的突变体。脂肪酶可以例如是三酰基甘油脂肪酶(EC3.1.1.3)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)、甘油单酯脂肪酶(EC 3.1.1.23)、半乳糖脂肪酶(EC 3.1.1.26)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、脂蛋白脂肪酶(EC 3.1.1.34)。有用的脂肪酶的例子包括例如如EP 258 068和EP 305 216中所述的疏棉状腐质霉脂肪酶；例如如EP 238 023中所述的米赫根毛霉脂肪酶或如WO 96/13580中所述的来自特异腐质霉；假丝酵母属脂肪酶，例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶，例如EP 214 761中所述的南极假丝酵母脂肪酶A或B；假单胞菌属脂肪酶，例如EP 721 981(例如可从具有保藏登记号FERM BP-4772的假单胞菌属菌种SD705菌株获得的脂肪酶)、PCT/JP96/00426、PCT/JP96/00454(例如茄青枯假单胞菌(P.solanacearum)脂肪酶)、EP 571 982或WO 95/14783(例如门多萨假单胞菌(P.mendocina)脂肪酶)中所述的那些之一，例如如EP 218 272中所述的产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶，例如如EP 331376中所述的洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶，例如如公开于GB 1,372,034中的斯氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶，或荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶，例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等人(1993)Biochemica et Biophysica Acta 1131:253-260)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(JP64/744992)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶(WO 91/16422)。

其他例子是脂肪酶变体，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所述的那些。优选的脂肪酶变体是如WO 00/60063中所述的疏棉状腐质霉DSM 4109的那种。尤其优选的是公开于WO 00/60063的实施例中的变体，具有改善的首次洗涤性能，即T231R+N233R；G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+R209P+T231R+N233R；N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R；E99N+N101S+T231R+N233R+Q249R；E99N+N101S+T231R+N233R+Q249R。

合适的商购可得的脂肪酶包括和脂肪酶 (可从Novozymes A/S获得)、M1 Lipase^TM和Lipomax^TM(可从Genencor Inc.获得)和脂肪酶P"Amano"(可从Amano Pharmaceutical Co.Ltd.获得)。商购可得的角质酶包括来自Genencor Inc的Lumafast^TM。

脂肪酶通常以按组合物的重量计0.000001%-2%酶蛋白质的水平掺入去污剂组合物内，优选以按组合物的重量计0.00001%-1%酶蛋白质的水平，更优选以按组合物的重量计0.0001%-0.5%酶蛋白质的水平，甚至更优选以按组合物的重量计0.001%-0.2%酶蛋白质的水平。

角质酶：潜在有用类型的角质酶包括(EC 3.1.1.74)，例如如WO 88/09367中所述的衍生自门多萨假单胞菌的角质酶，或衍生自茄病镰孢(Fusariumsolani pisi)的角质酶(例如在WO 90/09446中描述的)。由于角质酶的脂肪分解活性，它们可以与脂肪酶针对一样的菌株有效。商购可得的角质酶包括来自Genencor Inc的Lumafast^TM。

角质酶通常以按组合物的重量计0.000001%-2%酶蛋白质的水平掺入去污剂组合物内，优选以按组合物的重量计0.00001%-1%酶蛋白质的水平，更优选以按组合物的重量计0.0001%-0.5%酶蛋白质的水平，甚至更优选以按组合物的重量计0.001%-0.2%酶蛋白质的水平。

糖酶：糖酶涵盖糖苷水解酶(EC 3.2.1.-)和多糖裂解酶(EC 4.2.2.-)。糖苷水解酶催化在两个或更多个碳水化合物之间或在碳水化合物和非碳水化合物部分之间的糖苷键的水解。多糖裂解酶通过β消除机制催化多糖链的切割，导致新近形成的还原末端的双键。糖酶包括例如下文更详细地描述的淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶和纤维素酶。其他糖酶可以是黄原胶酶或支链淀粉酶。

合适的黄原胶酶包括具有细菌或真菌起源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。黄原胶酶的来源例如在Cadmus等人(1988)J of Industrial  Microbiology and Biotechnology 4:127-133；EP0030393；和Hashimoto等人(1998)Appl Environ Microbiol.64:3765–3768中描述。

合适的支链淀粉酶包括具有细菌或真菌起源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。支链淀粉酶的来源包括例如和D2(Novozymes A/S)。

淀粉酶：淀粉酶包含例如具有细菌或真菌起源的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和/或葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。在这一点上，包括此类淀粉酶的化学或遗传修饰的突变体。α-淀粉酶相对于本发明是优选的。有关的α-淀粉酶包括例如可从芽孢杆菌属菌种特别是GB 1296839中更详细地描述的地衣芽孢杆菌的专门菌株获得的α-淀粉酶。

有用的淀粉酶的例子是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，尤其是在一个或多个下述位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

有用的淀粉酶的进一步例子是衍生自芽孢杆菌属菌种菌株NCIB12289、NCIB 12512、NCIB 12513和DSM 9375的α-淀粉酶；WO 95/26397(在此引入作为参考)的SEQ ID NO 1和2中所示的α-淀粉酶；在WO 00/60060(在此引入作为参考)中作为SEQ ID NO:2公开的衍生自芽孢杆菌属菌种DSM12649的AA560α-淀粉酶；和AA560α-淀粉酶的变体，包括公开于实施例7和8(在此引入作为参考)中的AA560变体。

有关的商购可得的淀粉酶包括 Termamyl^TM Ultra、和(都可从Novozymes A/S，Bagsvaerd，丹麦获得)、以及和P(可从DSM，Holland获得)以及Purastar OxAm和Powerase^TM(可从Danisco A/S获得)。

其他有用的淀粉酶是CGT酶(环糊精葡聚糖转移酶，EC 2.4.1.19)，例如可从芽孢杆菌属、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobactor)或热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)菌种获得的那些。

淀粉酶通常以按组合物的重量计0.000001%-2%酶蛋白质的水平掺入去污剂组合物内，优选以按组合物的重量计0.00001%-1%酶蛋白质的水平，更优选以按组合物的重量计0.0001%-0.5%酶蛋白质的水平，甚至更优选以按组合物的重量计0.001%-0.2%酶蛋白质的水平。

半纤维素酶：合适的半纤维素酶包括具有木聚糖分解活性、***糖分解活性、半乳糖分解活性和/或甘露糖分解活性(mannolytic activity)的酶。本发明的半纤维素酶可以例如选自木聚糖酶(EC 3.2.1.8、EC 3.2.1.32和EC3.2.1.136)、木葡聚糖酶(EC 3.2.1.4和EC 3.2.1.151)、***呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、乙酰基木聚糖酯酶(EC EC 3.1.1.72)、葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.31、EC 3.2.1.56、3.2.1.128和3.2.1.139)、葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.11、EC 3.2.1.83和EC 3.2.1.73)、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、香豆酸酯酶(EC 3.1.1.73)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25；EC 3.2.1.78和EC 3.2.1.101)、***糖苷酶(EC 3.2.1.88)、***聚糖酶(arabinanases)(EC 3.2.1.99)、半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89、EC3.2.1.23和3.2.1.164)和地衣多糖酶(EC 3.2.1.73)。然而，这并不视为穷尽列表。

甘露聚糖酶是相对于本发明的优选半纤维素酶。合适的甘露聚糖酶包括具有细菌或真菌起源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。在优选实施方案中，甘露聚糖酶衍生自芽孢杆菌属菌株，尤其是公开于WO 99/64619(在此引入作为参考)的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的位置31-330中的芽孢杆菌属菌种I633或Bacillus agaradhaerens，例如来自DSM 8721型菌株。合适的商购可得的甘露聚糖酶是由Novozymes A/S生产的或由Genencor(Danisco的公司)生产的Purabrite^TM。

木聚糖酶是相对于本发明的优选半纤维素酶。合适的商购可得的木聚糖酶是HC(可从Novozymes A/S获得)。

半纤维素酶通常以按组合物的重量计0.000001%-2%酶蛋白质的水平掺入去污剂组合物内，优选以按组合物的重量计0.00001%-1%酶蛋白质的水平，更优选以按组合物的重量计0.0001%-0.5%酶蛋白质的水平，甚至更优选以按组合物的重量计0.001%-0.2%酶蛋白质的水平。

果胶酶：合适的果胶分解酶包括在WO 99/27083、WO 99/27084、WO00/55309和WO 02/092741中描述的那些。

合适的果胶裂解酶包括具有细菌或真菌起源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。在优选实施方案中，果胶裂解酶衍生自芽孢杆菌属菌株，尤其是枯草芽孢杆菌菌株，尤其是公开于WO 02/092741(在此引入作为参考)的SEQ ID NO:2中的枯草芽孢杆菌DSM14218或实施例6中公开的它的变体，或公开于WO 03/095638(在此引入作为参考)中的变体。可替代地，果胶裂解酶衍生自地衣芽孢杆菌菌株，尤其是在WO 99/27083(在此引入作为参考)中作为SEQ ID NO:8公开的果胶裂解酶或其在WO 02/06442中描述的变体。

合适的商购可得的果胶裂解酶是由Novozymes A/S生产的或

果胶分解酶通常以按组合物的重量计0.000001%-2%酶蛋白质的水平掺入去污剂组合物内，优选以按组合物的重量计0.00001%-1%酶蛋白质的水平，更优选以按组合物的重量计0.0001%-0.5%酶蛋白质的水平，甚至更优选以按组合物的重量计0.001%-0.2%酶蛋白质的水平。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括具有细菌或真菌起源的完全纤维素酶或单组分内切葡聚糖酶。包括化学或遗传修饰的突变体。纤维素酶可以例如是单组分或单组分内切-1,4-β-葡聚糖酶(通常仅称为“内切葡聚糖酶”)(EC3.2.1.4)的混合物。某些木葡聚糖酶还可以具有内切葡聚糖酶活性，并且也视为在本发明中合适的纤维素酶。合适的纤维素酶公开于US 4,435,307中，其公开了由特异腐质霉产生的真菌纤维素酶。尤其合适的纤维素酶是具有纺织品护理益处的纤维素酶。此类纤维素酶的例子是在欧洲专利申请号0 495 257中描述的纤维素酶。

合适的单组分内切葡聚糖酶可以得自下述菌种中的一个或多个：黑耳(Exidia glandulosa)、柄毛皮伞(Crinipellis scabella)、木蹄(Fomes fomentarius)、绵皮孔菌属菌种(Spongipellis sp.)、红根囊壶菌(Rhizophlyctis rosea)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、闪光须霉(Phycomyces nitens)和弗雷生剌枝霉(Chaetostylum fresenii)、棉色二胞(Diplodia gossypina)、小球壳孢属菌种(Microsphaeropsis sp.)、Ulospora bilgramii、短梗霉属菌种(Aureobasidium sp.)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、Ascobolus stictoides、Saccobolusdilutellus、盘菌属(Peziza)、疣孢青霉(Penicillium verruculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和疣状顶孢霉(Thermomyces verrucosus)、里氏木霉即红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、Diaporthe syngenesia、葫芦科毛盘孢(Colletotrichum lagenarium)、鹿角炭角菌(Xylaria hypoxylon)、黑孢霉属菌种(Nigrospora sp.)、多节孢属菌种(Nodulisporum sp.)和点孔座壳(Poroniapunctata)、柱孢属菌种(Cylindrocarpon sp.)、Nectria pinea、Volutellacolletotrichoides、粪生粪壳(Sordaria fimicola)、大孢粪壳(Sordariamacrospora)、嗜热梭孢壳(Thielavia thermophila)、Syspastospora boninensis、Cladorrhinum foecundissimum、突孢毛壳(Chaetomium murorum)、变绿毛壳(Chaetomium virescens)、巴西毛壳(Chaetomium brasiliensis)、Chaetomium cuni-colorum、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、链孢粘帚霉(Gliocladiumcatenulatum)、Scytalidium thermophila、枝顶孢属菌种、茄病镰孢、Fusariumanguioides、梨孢镰孢(Fusarium poae)、尖镰孢番茄专化型(Fusariumoxysporum ssp.lycopersici)、尖镰孢西番莲专化型(Fusarium oxysporum ssp.passiflora)、黑腐质霉(Humicola nigrescens)、灰腐质霉(Humicola grisea)、尖镰孢、土生梭孢壳或特异腐质霉。一种优选的内切葡聚糖酶作为SEQ ID NO:9公开于WO 96/29397(在此引入作为参考)中，或与之具有至少70%同一性的酶及其如公开于WO 98/12307的实施例1中的变体。另一种优选的内切葡聚糖酶公开于WO 91/017243(SEQ ID NO:2)中或如公开于WO 94/007998中的内切葡聚糖酶变体。

具有抗再沉积效应的内切葡聚糖酶可以得自来自许多细菌来源的缺乏碳水化合物结合模块(CBM)的真菌内切葡聚糖酶。某些来源是特异腐质霉、作为DSM 12648保藏的芽孢杆菌属菌种、作为FERM P-16067保藏的芽孢杆菌属菌种KSMS237、多粘类芽孢杆菌(Panibacillus polymyxa)、和饲料类芽孢杆菌(Panibacillus pabuli)。特异性抗再沉积内切葡聚糖酶公开于WO91/17244(图14)(在此引入作为参考)、WO 04/053039(SEQ ID NO:2)(在此引入作为参考)、JP 2000210081(SEQ ID NO:1的位置1-824)(在此引入作为参考)中。

具有抗再沉积效应的木葡聚糖酶可以得自来自许多细菌来源。某些来源是地衣芽孢杆菌、Bacillus agaradhaerens(WO 99/02663)、多粘类芽孢杆菌和饲料类芽孢杆菌(WO01/62903)。木葡聚糖酶的合适变体还在PCT/EP2009/056875中描述。商购可得的木葡聚糖酶是(Novozymes A/S)。

商购可得的纤维素酶包括由里氏木霉产生的由特异腐质霉产生的商购可得的内切葡聚糖酶是 和(Novozymes A/S)和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)和Clazinase^TM、Puradax^TM EG L和Puradax HA(Danisco A/S)。

纤维素酶通常以按组合物的重量计0.000001%-2%酶蛋白质的水平掺入去污剂组合物内，优选以按组合物的重量计0.00001%-1%酶蛋白质的水平，更优选以按组合物的重量计0.0001%-0.5%酶蛋白质的水平，甚至更优选以按组合物的重量计0.001%-0.2%酶蛋白质的水平。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括具有植物、细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的氧化酶的例子是漆酶(EC 1.10.3.2)。有用的过氧化物酶的例子包括过氧化氢酶(EC1.11.1.6)和来自鬼伞属(Coprinus)例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，和它们的变体，例如在WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所述的那些。

商购可得的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

芳基酯酶：合适的芳基酯酶包括具有植物、细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的芳基酯酶的例子例如得自如WO 05/056782中所述的耻垢分枝杆菌(M.Smegmatis)。

表面活性剂

一般地，去污剂组合物包含(按组合物的重量计)在0%-50%范围中的一种或多种表面活性剂，优选2%-40%、更优选5%-35%、更优选7%-30%、最优选10%-25%、甚至最优选15%-20%。优选的表面活性剂是阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂、两性表面活性剂及其混合物。优选地，表面活性剂的主要部分是阴离子的。合适的阴离子型表面活性剂是本领域众所周知的，并且可以包含脂肪酸羧酸酯(肥皂)，支链、直链和随机链烷基硫酸酯或脂肪醇硫酸酯或伯醇硫酸酯或烷基苯磺酸酯例如LAS和LAB或苯基链烷烃磺酸酯(phenylalknesulfonates)或烯基磺酸酯或烯基苯磺酸酯或烷基乙氧基硫酸酯或脂肪醇醚硫酸酯或α-烯烃磺酸酯或十二烯基/十四烷基琥珀酸。阴离子型表面活性剂可以是烷氧基化的。去污剂组合物还可以包含1重量%-10重量%的非离子型表面活性剂，优选2重量%-8重量%、更优选3重量%-7重量%、甚至更优选小于5重量%的非离子型表面活性剂。合适的非离子型表面活性剂是本领域众所周知的，并且可以包含醇乙氧基化物、和/或烷基乙氧基化物、和/或烷基酚乙氧基化物、和/或葡糖酰胺(glucamide)例如脂肪酸N-葡糖基N-甲基酰胺、和/或烷基多聚葡糖苷和/或单或二乙醇酰胺或脂肪酸酰胺。去污剂组合物还可以包含0重量%-10重量%的阳离子型表面活性剂，优选0.1重量%-8重量%、更优选0.5重量%-7重量%、甚至更优选小于5重量%的阳离子型表面活性剂。合适的阳离子型表面活性剂是本领域众所周知的，并且可以包含烷基季铵化合物、和/或烷基吡啶鎓化合物、和/或烷基季磷鎓化合物和/或烷基叔锍化合物。该组合物优选包含以在洗衣过程期间在洗液中提供100ppm-5,000ppm表面活性剂的量的表面活性剂。在与水接触后，该组合物一般形成包含0.5g/l-10g/l去污剂组合物的洗液。许多合适的表面活性化合物是可获得的，且在文献中例如在通过Schwartz、Perry和Berch在"Surface-Active Agents and Detergents"中，第I和11卷中充分描述。

助剂

助剂的主要作用是隔离来自洗涤溶液的二价金属离子(例如钙和镁离子)，其否则会与表面活性剂***消极相互作用。助剂在去除来自织物表面的金属离子和无机污垢方面也是有效的，导致微粒和饮料污渍的改善去除。助剂也是碱度的来源且将洗涤水的pH缓冲至9.5-11的水平。缓冲能力也称为“储备碱度”，并且应优选大于4。

本发明的去污剂组合物可以包含一种或多种去污剂助剂或助剂***。许多合适的助剂***在文献中例如在Powdered Detergents，Surfactant科学系列第71卷，Marcel Dekker，Inc中描述。助剂可以包含按主题组合物的重量计0%-60%、优选5%-45%、更优选10%-40%、最优选15%-35%、甚至更优选20%-30%的助剂。助剂包括但不限于碱金属，聚磷酸盐的铵和烷醇铵盐(例如三聚磷酸盐STPP)，碱金属硅酸盐，碱土和碱金属碳酸盐，硅铝酸盐助剂(例如沸石)和聚羧酸盐化合物，醚羟基聚羧酸盐，马来酸酐与乙烯或乙烯甲醚的共聚物，1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸，和羧甲氧基琥珀酸，聚乙酸例如乙二胺四乙酸和氮川三乙酸的多种碱金属、铵和取代的铵盐，以及聚羧酸盐例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、羟二琥珀酸(oxydisuccinic acid)、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧甲氧基琥珀酸及其可溶性盐。乙醇胺(Ethanoleamines)(MEA、DEA和TEA)也可以促成液体去污剂中的缓冲能力。

漂白剂

本发明的去污剂组合物可以包含一种或多种漂白试剂。特别地，粉末状去污剂可以包含一种或多种漂白试剂。合适的漂白试剂包括其他光漂白剂、预先形成的过酸、过氧化氢来源、漂白活化剂、过氧化氢、漂白催化剂及其混合物。一般而言，当使用漂白试剂时，本发明的组合物可以包含按主题清洁组合物的重量计约0.1%-约50%或约0.1%-约25%漂白试剂。合适的漂白试剂的例子包括：

(1)其他光漂白剂，例如维生素K3；

(2)预先形成的过酸；合适的预先形成的过酸包括但不限于选自下组的化合物：过羧酸和盐、过碳酸和盐、过碘酸和盐、过一硫酸和盐，例如臭氧及其混合物。合适的过羧酸包括具有式R-(C=O)O-O-M的疏水性过酸和亲水性过酸，其中R是任选分支的烷基，当过酸是疏水性的时，具有6–14个碳原子或8–12个碳原子，并且当过酸是亲水性的时，具有小于6个碳原子或甚至小于4个碳原子；并且M是抗衡离子，例如钠、钾或氢；

(3)过氧化氢的来源，例如无机过氧化氢盐，包括碱金属盐例如过硼酸盐的钠盐(通常为单或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐及其混合物。在本发明的一个方面，无机过氧化氢盐选自过碳酸盐、过硼酸盐的钠盐、及其混合物。当采用时，无机过氧化氢盐一般以总组合物0.05-40重量%或1-30重量%的量存在，并且一般作为可能被包被的结晶固体掺入此类组合物内。合适的包衣包括无机盐例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料例如水溶性或水可分散的聚合物、蜡、油或脂肪肥皂。有用的漂白组合物在美国专利号5,576,282和6,306,812中描述；

(4)具有R-(C=O)-L的漂白活化剂，其中R是任选分支的烷基，当漂白活化剂是疏水性的时，具有6-14个碳原子或8-12个碳原子，并且当漂白活化剂是亲水性的时，具有小于6个碳原子或甚至小于4个碳原子；并且L是离去基团。合适的离去基团的例子是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸酯。合适的漂白活化剂包括十二烷酰羟苯磺酸酯、癸酰羟苯磺酸酯、癸酰羟苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰羟苯磺酸酯、四乙酰乙二胺(TAED)和壬酰羟苯磺酸酯(NOBS)。合适的漂白活化剂也公开于WO 98/17767中。虽然可以采用任何合适的漂白活化剂，但在本发明的一个方面，主题清洁组合物可以包含NOBS、TAED或其混合物；和

(5)能够接受来自过酸的氧原子且将该氧原子转移给可氧化底物的漂白催化剂在WO2008/007319(在此引入作为参考)中描述。合适的漂白催化剂包括但不限于：亚胺鎓阳离子和聚离子；亚胺鎓两性离子；经修饰的胺；经修饰的氧化胺；N-磺酰亚胺；N-膦酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。漂白催化剂一般以按重量计0.0005%-0.2%、0.001%-0.1%、或甚至0.005%-0.05%的水平包含在去污剂组合物中。

当存在时，过酸和/或漂白活化剂一般以基于组合物约0.1-约60重量%、约0.5-约40重量%或甚至约0.6-约10重量%的量存在于组合物中。一种或多种疏水性过酸或其前体可以与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。

过氧化氢来源和过酸或漂白活化剂的量可以这样选择，从而使得可获得的氧(来自过氧化物来源)与过酸的摩尔比是1:1-35:1或甚至2:1-10:1。

辅助材料

分散剂：本发明的去污剂组合物还可以含有分散剂。特别地，粉末状去污剂可以包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括同或共聚合酸或其盐，其中聚羧酸包含通过不超过两个碳原子彼此分开的至少两个羧基原子团。合适的分散剂是例如在Powdered Detergents，Surfactant科学系列第71卷，MarcelDekker，Inc中描述的。

染料转移抑制试剂：本发明的去污剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制试剂。合适的聚合染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制试剂可以以按组合物的重量计约0.0001%-约10%、约0.01%-约5%或甚至约0.1%-约3%的水平存在。

荧光增白剂：本发明的去污剂组合物将优选含有可以着色待清洁的物品的另外组分，例如荧光增白剂或光学增亮剂。适合于在洗衣去污剂组合物中使用的任何荧光增白剂可以用于本发明的组合物中。最常用的荧光增白剂是属于二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-二苯乙烯基衍生物类别的那些。二氨基芪-磺酸衍生物型荧光增白剂的例子包括下述的钠盐：

4,4'-二-(2-二乙醇胺-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，

4,4'-二-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐，

4,4'-二-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，

4,4'-二-(4-苯基-2,1,3-***-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐，

4,4'-二-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和，

2-(stilbyl-4"-萘并-1.,2':4,5)-1,2,3-***-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从Ciba-Geigy AG，Basel，瑞士获得的Tinopal DMS和Tinopal CBS。TinopalDMS是4,4'-二-(2-吗啉代-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。Tinopal CBS是2,2'-二-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。

还优选的是荧光增白剂是由Paramount Minerals and Chemicals，Mumbai，印度供应的商购可得的Parawhite KX。

适合于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。

合适的荧光增亮剂水平包括从约0.01、从0.05、从约0.1或甚至从约0.2重量%的更低水平到0.5或甚至0.75重量%的更高水平。

织物固色剂(Fabric hueing agents)：本发明的去污剂组合物还可以包括织物固色剂例如染料或色素，当配制在去污剂组合物中时，当所述织物与包含所述去污剂组合物的洗液接触时，所述织物固色剂可以沉积到织物上，从而通过可见光的吸收改变所述织物的色调。荧光增白剂发出至少某些可见光。相比之下，当织物固色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色调。合适的织物固色剂包括染料和染料-粘土缀合物，并且还可以包括色素。合适的染料包括小分子染料和聚合染料。合适的小分子染料包括选自下述的小分子染料：属于Direct Blue、Direct Red、Direct Violet、Acid Blue、AcidRed、Acid Violet、Basic Blue、Basic Violet和Basic Red的颜色指数(C.I.)分类的染料，或其混合物，例如如WO 05/03274、WO 05/03275、WO 05/03276和EP1876226(在此引入作为参考)中所述的。去污剂组合物优选包含0.00003重量%-约0.2重量%、约0.00008重量%-约0.05重量%、或甚至约0.0001重量%-约0.04重量%织物固色剂。该组合物可以包含0.0001重量%-0.2重量%织物固色剂，当该组合物是单位剂量小袋的形式时，这可以是尤其优选的。

污垢释放聚合物：本发明的去污剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放组合物，其帮助从织物例如基于棉和聚酯的织物去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放组合物可以例如是基于非离子或阴离子对苯二酸酯(terephthalte)的聚合物、聚乙烯己内酰胺和有关共聚物、乙烯接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents，Surfactant科学系列第71卷，Marcel Dekker，Inc中的第7章。另一类污垢释放聚合物是两性烷氧基化的猪油清洁聚合物，其包含核心结构和附着至那个核心结构的多个烷氧基化物基团。该核心结构可以包含如WO 09/087523(在此引入作为参考)中详细描述的聚烷撑亚胺结构或聚链烷醇胺结构。进一步的随机接枝共聚物是合适的污垢释放聚合物。合适的接枝共聚物在WO 07/138054、WO06/108856和WO 06/113314(在此引入作为参考)中更详细地描述。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如经修饰的纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 03/040279(两者都在此引入作为参考)中所述的那些。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、两性离子修饰的纤维素及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素酯及其混合物。

抗再沉积剂：本发明的去污剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸同聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化聚乙烯亚胺。在上文污垢释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物也可以充当抗再沉积剂。

其他合适的辅助材料包括但不限于防缩剂、防皱剂、杀菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶物、香料、色素、抑泡剂(sod suppressor)、溶剂、用于液体去污剂的结构化剂(structurants)和/或结构弹性剂(elasticizing agent)。

在一个方面，去污剂是致密流体洗衣去污剂组合物，其包含：a)按组合物的重量计至少约10%、优选20-80%的选自阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、肥皂及其混合物的表面活性剂；b)按组合物的重量计约1%-约30%、优选5-30%的水；c)按组合物的重量计约1%-约15%、优选3-10%的非氨基功能溶剂；和d)按组合物的重量计约5%-约20%的选自螯合剂、污垢释放聚合物、酶及其混合物的性能添加剂；其中所述紧密流体洗衣去污剂组合物包含下述中的至少一种：

(i)该表面活性剂具有约1.5:1-约5:1的阴离子型表面活性剂与非离子型表面活性剂的重量比，该表面活性剂包含按组合物的重量计约15%-约40%的阴离子型表面活性剂，且包含按组合物的重量计约5%-约40%的肥皂；(ii)按组合物的重量计约0.1%-约10%的选自下述的泡沫增强剂(sudsboosting agent)：泡沫增强聚合物、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂、氧化胺表面活性剂、两性表面活性剂及其混合物；和(iii)(i)和(ii)两者。所有成分在此整体引入作为参考的WO 07/130562中描述，在去污剂制剂中有用的进一步聚合物在此整体引入作为参考的WO 07/130562中描述。

在另一个方面，去污剂是致密颗粒(粉末状)去污剂，其包含：a)按组合物的重量计至少约10%、优选15-60%的选自阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、肥皂及其混合物的表面活性剂；b)按组合物的重量计约10%-约80%、优选20%-60%的助剂，其中所述助剂可以是选自下述的助剂混合物：i)磷酸盐助剂，优选小于20%、更优选小于10%、甚至更优选小于5%的总助剂是磷酸盐助剂；ii)沸石助剂，优选小于20%、更优选小于10%、甚至更优选小于5%的总助剂是沸石助剂；iii)柠檬酸盐，优选0-5%的总助剂是柠檬酸盐助剂；iv)聚羧酸盐，优选0-5%的总助剂是聚羧酸盐助剂，v)碳酸盐，优选0-30%的总助剂是碳酸盐助剂，和vi)硅酸钠，优选0-20%的总助剂是硅酸钠助剂；c)按组合物的重量计约0%-25%的填充剂，例如硫酸盐，按组合物的重量计优选1%-15%、更优选2%-10%、更优选3%-5%的填充剂；和d)按组合物的重量计约0.1%-20%的酶，按组合物的重量计优选1%-15%、更优选2%-10%的酶。

用途

本发明的溶菌酶变体或其组合物可以用于数种应用中，以通过用多肽或其组合物处理材料来降解包含肽聚糖或壳糊精的材料(参见例如Proctor和Cunningham，(1988)Critical Reviews in Food Science and Nutrition26:359-395；Carini等人(1985)Microbiol.Alimen.Nutr.3:299–320；Hughey和Johnson(1987)Appl.Environ.Microbiol.53:2165–2170；Cunningham等人(1991)World′s Poultry Science Journal 47:141-163)。

本发明的溶菌酶变体或其组合物的优选用途的例子在下文给出。溶菌酶变体的剂量和在其下使用该溶菌酶变体的其他条件可以在本领域已知的方法的基础上进行测定。

本发明的变体溶菌酶可以用作抗微生物剂。本发明的一个方面是用于减少微生物污染的方法，其包括用本发明的溶菌酶变体处理微生物污染的表面。

为了评估本发明的溶菌酶变体是否能够充当抗微生物剂，它可以在浊度测定中进行测试。在这种测定中，测试该溶菌酶是否能够降解微生物细胞，例如溶解于缓冲液或去污剂中的Exiguobacterium undae细胞(从臭袜子中分离的)或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)细胞的干燥底物，并且从而当与仅用缓冲液处理的微生物悬液相比较时，减少在例如540nm处的光密度(OD)。

变体溶菌酶优选掺入如上所述的去污剂组合物内和/或与如上所述的去污剂组合物一起使用。

当洗涤在低于60℃的温度重复执行时，存在在洗涤机(洗衣以及洗餐具)中和在机器中洗涤的纺织品上增加的恶臭危险。这种恶臭可能由在洗涤机中生长的微生物生物例如细菌、真菌、藻类或其他单细胞生物引起。本发明提供了通过用本发明的溶菌酶变体或溶菌酶变体组合物处理微生物污染的表面来减少表面例如纺织品衣服或硬表面上的微生物污染的方法，所述硬表面例如洗涤机中的金属、塑料或橡胶部分、浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽和洗脸盆中。此类处理还期望减少在含有微生物污染的纺织品和硬表面上的恶臭。

微生物污染的减少可以以几种方式进行评估，例如通过让专家组评估气味是否已减少，可替代地，可以从表面获得样品且培养，以评估与不含溶菌酶的处理相比较，由于处理微生物计数是否已减少。

此外，本发明涉及用于织物洗涤的过程，其包括用含有本发明的去污剂组合物和溶菌酶变体或溶菌酶变体组合物的洗涤液处理织物。洗衣处理可以例如在机器洗涤过程或人工洗涤过程中进行。洗涤液可以例如是含有去污剂组合物的水性洗涤液且具有在3–12之间的pH、优选在pH 7–12之间、更优选在pH 8–10之间。

实施本发明的方法的织物可以是常规可洗涤的洗衣，例如家庭洗衣。优选地，洗衣的主要部分是衣服和织物，包括由棉、混棉或天然或人造纤维素(例如源于木浆)或其掺和物制成的编织物、纺织物、粗斜纹棉布、纱线和毛巾布。掺和物的例子是棉或人造丝/粘胶(rayon/viscose)与一种或多种伴侣材料的掺和物，所述伴侣材料例如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维(aramid))、和含纤维素纤维(例如人造丝/粘胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、乙酸纤维素纤维、lyocell)。

本发明的溶菌酶变体还可以用于动物饲料中。在一个实施方案中，本发明提供了用于制备动物饲料组合物的方法，其包括将本发明的溶菌酶变体加入一种或多种动物饲料成分中。优选地，该动物饲料不含有抗生素。

本发明的溶菌酶变体可以例如通过抑制病原体的生长/肠内建群用于稳定动物的健康微生物区系，所述动物特别是家畜例如但不限于牛、鹿、山羊、猪、家禽、兔和绵羊，以及在鱼类中，所述病原体例如产气荚膜梭菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和姆班达卡沙门氏菌(Salmonella Mbandaka)、和弯曲杆菌属菌种(Camplylobacter sp)。在优选实施方案中，溶菌酶变体替代动物饮食中的抗生素。尤其是在酸性pH具有增加的稳定性和/或针对蛋白酶改善的稳定性的变体适合于饲料应用，因为它们可以通过消化道的过程后能够存活。在优选实施方案中，将溶菌酶变体应用于鸡，并且具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。在进一步的实施方案中，本发明的溶菌酶变体用作饲料添加剂，在其中它可以对鸡消化道的微生物平衡提供积极作用，并且以这种方式改善动物性能。

根据WO 00/21381和WO 04/026334，溶菌酶变体还可以作为饲料增强酶用于动物饲料中，所述饲料增强酶改善饲料可消化性以增加其利用效率。

根据美国专利号6,777,223，溶菌酶变体可以用于消毒且预防或去除在表面上的生物薄膜。

溶菌酶变体还可以用于选择性抑制在干酪成熟过程中酪丁酸梭菌不受控制的生长，所述干酪特别是由挤压且蒸煮的凝乳制成的那些，例如SwissCheese、Parmesan、Edam、Gouda、Cheddar及许多其他。

溶菌酶变体还可以用于口腔护理中。例如，溶菌酶可以单独或与其他酶或甚至抗微生物肽组合用于牙膏或其他口腔护理产品中。该多肽可以引入口腔内或应用于待引入口腔内的物品。参见例如WO 08/124764。

溶菌酶变体还可以用于皮肤和软组织的营养不良和炎性病变的局部处理中。参见例如Palmieri和Boraldi(1977)Arch.Sci.Med.(Torino)134:481-485。

溶菌酶变体还可以用于皮肤护理中。例如，将该多肽应用于患有皮肤感染例如痤疮的患者的皮肤。溶菌酶变体还可以用于创伤敷料中，将其应用于受创皮肤，例如以帮助伤口的愈合。参见例如，美国申请号20080254079。

溶菌酶变体还可以用于口红、唇膏、唇凝胶或唇彩中。例如，此类产品可以用于治疗局限性唇感染，例如冷疱。参见例如，美国申请号20080254079。

溶菌酶变体还可以用于支气管肺疾病的治疗中。

本发明通过下述实施例进一步描述，所述实施例不应解释为限制本发明的范围。

实施例

材料与方法

浊度测定

通过在分光光度计中在540nm处测量的Exiguobacterium undae的重悬浮干燥细胞溶液的吸光度/光密度中的减少(下降)测定溶菌酶的活性。

Exiguobacterium undae的干燥细胞(底物)的制备

将E.undae(DSM14481)的培养物在500mL摇瓶中在100mL LB培养基(Fluka 51208，25g/L)中在30℃、250rpm生长过夜。随后将过夜培养物在20℃、5000g离心10分钟，并且将团块在无菌milliQ水中洗涤两次，且重悬浮于MilliQ水中。将洗涤的细胞以13000rpm离心1分钟，并且倾析尽可能多的上清液。在测定细胞的重量前，将洗涤的细胞在真空离心机中干燥1小时。将干燥的细胞贮存于-20℃。在使用前，将细胞重悬浮于以pH 6的通用缓冲液至0.5mg细胞/mL的浓度，并且测量在540nm处的光密度(OD)。随后调整细胞悬液，使得细胞浓度等于OD540=1.0。随后在使用前将调整的细胞悬液冷贮存。重悬浮的细胞应在4小时内使用。

在浊度测定中的溶菌酶抗微生物活性的测量

将待测量的溶菌酶样品在以pH 6的通用缓冲液(参见下文)中稀释至100-200mg酶蛋白质/L的浓度，并且在冰上保持直至使用时。在96孔微量滴定板(Nunc)中，将200μL底物加入每个孔中，并且将板在PowerWaveX分光光度计(Bio-Tek Instruments INC)在37℃温育5分钟中。在温育后，在540nm处测量每个孔的吸光度(起始值)。为了起始活性测量，将20μL稀释的溶菌酶样品加入每个孔中的200μL底物，并且在37℃开始在540nm处的吸光度的动态测量，最低限度30分钟直到24小时。对于每个孔监控在540nm处测量的吸光度，并且如果溶菌酶具有抗微生物活性，那么可见随着时间过去在吸光度中的下降。吸光度中的下降越大，溶菌酶抗微生物活性越大。

通用缓冲液原液的制备

原液：

在500mL水中混合。用HCl或NaOH将pH调整至pH 6。在使用前将缓冲液稀释10倍。

为了比较来自浊度测定的结果，待比较的样品应优选在相同实验运行中使用相同缓冲液和底物分批进行测试。

在浊度测定中的溶菌酶抗微生物活性中的变动

上述测定是用于本发明的优选的标准微生物活性测试。然而，对于为达到改善的性质而生成的溶菌酶变体，该测定可以修改适用。

为了测试改善的热活性，温育温度可以增加至所需温度，例如45℃-110℃。如果温度超过50℃，那么样品必须在外部热源中而不是直接在分光光度中进行温育，随后通过测量起始值和终止值来执行测量。

为了测试在低或中等温度改善的活性，温育温度可以变成所需温度，例如0℃-40℃。

为了测试改善的温度稳定性，溶菌酶样品可以在所需温度例如45℃-110℃预温育30分钟–24小时，且随后冷却至上文描述的在测量活性前测定的温度。

为了测试改善的pH活性，pH可以增加至例如pH 7.5–12或减少至例如2–5.5的pH。

为了测试改善的pH稳定性，溶菌酶样品可以在所需pH预温育30分钟–24小时，且随后返回上文描述的在测量活性前测定的pH。

为了测试对蛋白酶降解增加的抗性，在进行上文描述的测定前，溶菌酶样品可以与以0.5-2mg/ml、优选1-1.5mg/ml的胃蛋白酶或丝氨酸蛋白酶例如10mg/L Savinase在25-40℃预温育30分钟–24小时。

溶菌酶的最适温度和pH也可以使用浊度测定进行评估。对于最适温度评估，测定在某个温度范围例如5℃-80℃运行，而pH维持在6。对于最适pH，测定的pH在某个范围内例如pH 2–12改变，而温度维持在37℃。

实施例1

变体的生成

使用上文描述的方法，制备烟曲霉溶菌酶(lyzozyle)(SEQ ID NO:2)的下述变体

N19D，    H20W，

H20Y，    K22G，

K30Y，    Q35R，

T45G，    Y47F，

D49G，    H55A，

Y56W，    L65I，

K76S，    F85Y，

N89S，    D95G，

R98G，    G102P+Y134V，

Y108F，   Y111F，

H120Q，   V131C，

H136N，   S139G，

W141Y，   T147G，

R153T，        A158S，

F161Y，        K164T，

A171R，        K178G，

D183G，        T186Y+W187Y，

S193A，        K195S，

Y196G+K197P，  H198F，

D203N，        N206A，

N206S，        E107A，

D105A。

实施例2

在胃液中的低pH时的稳定性

对于pH 2和胃蛋白酶温育的溶菌酶稳定性的测量

为了测量在模拟的胃条件下的溶菌酶稳定性，我们将野生型溶菌酶以及所选变体在人工胃液(0.01M HCl、0.1M NaCl、1mg/ml胃蛋白酶)中温育。将溶菌酶样品在milliQ水中稀释至50mg酶蛋白质/L的浓度。在96孔微量滴定板(Nunc)中，在t=0分钟时，将162μL人工胃液连同18μL溶菌酶样品一起加入每个孔中。将样品在37℃、350rpm在Eppendorf热混合器中温育1小时。每种溶菌酶一式三份地测试。为了在t=60分钟时停止胃温育，将20μL柠檬酸Na₂PO₄缓冲溶液pH 6.8(通过将22.75ml 0.1M柠檬酸与77.25ml 0.2M Na₂PO₄混合制备的)加入每个孔中。不含溶菌酶的微量滴定孔用作阴性对照，并且在加入溶菌酶前在t=0分钟时将加入柠檬酸Na₂PO₄缓冲溶液pH 6.8的孔用作阳性对照。

为了测量残留溶菌酶活性，将20μL E.undae悬液加入每个孔中，并且在Sunrise分光光度计(Tecan)中在37℃每分钟测量OD 540nm，共1小时。在t=60分钟时的OD 540nm测量用于计算。将百分比的溶菌酶残留活性计算为溶菌酶残留活性=((OD(540nm)阴性对照-OD(540nm)胃测试)/OD(540nm)阳性对照)*100%

结果

溶菌酶野生型和所选变体就针对在人工胃液中温育的稳定性进行测试。所测试变体的残留活性显示于表1中。与野生型相比较，7种变体中的3种具有改善的稳定性。

表1在人工胃液中温育的溶菌酶变体的残留活性。

变体	残留活性%
		Y56W	98
V131C	81
		F161C	51
野生型	40
		D95G	38
R98G	15
		D203N	3
N206A	0

实施例3

变体的热稳定性

溶菌酶热稳定性的测量

将纯化的样品溶菌酶和变体在40x稀释的缓冲液中悬浮至10ppm的浓度，所述缓冲液最初由11,8g琥珀酸；23,8g HEPES；20,8g CHES；22,2gCAPS和8,76g NaCl每L组成。在使用前，用HCl或NaOH将pH调整至pH 6。通过在Veriti热循环仪(Applied Biosystems)中在90℃温育纯化的溶菌酶及其变体10分钟测试溶菌酶热稳定性。同时，将对照样品在冰上温育。在温育后立即将样品放在冰上，加入底物(底物是如上所述制备的)。残留活性基本上如上所述进行测定，除了活性测试20分钟外。

热稳定性结果

溶菌酶野生型和所选变体就热稳定性进行测试。相对于野生型所测试变体的残留活性显示于表2中。10种变体具有大于5%的相对残留活性，并且因此可以视为与野生型相比较具有增强的热稳定性。

表2，在加热后相对于野生型，溶菌酶变体的残留活性

变体突变	相对残留活性%
		N19D	15
H20Y	37
		K22G	26
T45G	21
		Y47F	18
D49G	14
		H55A	20
R98G	9
		G102P+Y134V	-5
Y111F	-1
		H120Q	-6
H136N	2
		S139G	-10
R153T	4
		A158S	11
K164T	10
		A171R	-11
K178G	-5
		S193A	-3
H198F	-9
		D203N	-13
N206A	-4
		E107A	3

Claims (12)

1.一种亲本溶菌酶的分离的变体，所述变体溶菌酶为在SEQ ID NO:3的基础上进行了如下一个位置上的氨基酸改变：N19D，H20Y，K22G，T45G，Y47F，D49G，H55A，R98G，A158S，K164T，Y56W，V131C和F161C，并且其中所述变体溶菌酶具有抗微生物活性。

2.权利要求1的变体，其中所述的氨基酸改变是Y56W。

3.权利要求1的变体，其中所述的氨基酸改变是V131C。

4.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1–3中任一项的变体。

5.根据权利要求4的多核苷酸，其中所述多核苷酸是通过对应于核苷酸序列SEQ ID NO:1的亲本多核苷酸的诱变制备的。

6.一种包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含根据权利要求4或5的多核苷酸。

7.一种产生如权利要求1所述亲本溶菌酶的变体的方法，其中所述变体具有抗微生物活性，所述方法包括：

a)在适合于所述变体表达的条件下培养细胞，其中所述细胞含有编码亲本溶菌酶的变体的多核苷酸序列；和

b)从所述培养基中回收所述溶菌酶变体。

8.一种用于产生亲本溶菌酶的变体的方法，其中所述变体具有抗微生物活性，所述方法包括：

a)在适合于所述变体表达的条件下培养权利要求6的宿主细胞；和

b)从所述培养基中回收所述变体。

9.一种去污剂组合物，其包含权利要求1–3中任一项的溶菌酶变体和表面活性剂。

10.一种饲料组合物，其包含权利要求1–3中任一项的溶菌酶变体和饲料组分。

11.一种用于减少微生物污染的方法，其包括用权利要求1–3中任一项的溶菌酶变体处理微生物污染的表面。

12.权利要求1–3中任一项的溶菌酶变体在制备作为抗微生物剂的药物中的用途。