CN1177928C

CN1177928C - 碱性木糖葡聚糖酶

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Publication number: CN1177928C
Application number: CNB988069407A
Authority: CN
Inventors: M; M·舒兰; 3; H·奥特鲁普; ��ɭ; P·L·卓根森; M·E·卓恩瓦德
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1997-07-07
Filing date: 1998-07-01
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: BR9810548A; DE69833197D1; EP1002060A1; EP1002060B1; JP3961767B2; AU7908598A; CN1261914A; ATE315639T1; WO1999002663A1; DE69833197T2; JP2001509377A

Abstract

在pH7条件下的相对木糖葡聚糖酶活性至少为50%、没有或者仅有微弱纤维素分解活性的木糖葡聚糖酶是可获得的，例如可从芽孢杆菌属的菌株中获得。含SEQ ID NO：2第30-261位所示氨基酸序列的木糖葡聚糖酶或同系物可获自如地衣芽孢杆菌ATCC 14580，并且可由含SEQ ID NO：1中从第88-783位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子编码；含SEQ ID NO：4第1-537位所示氨基酸序列的木糖葡聚糖酶或同系物可获自如B.agaradhaerens，NCIMB40482，并可由含SEQID NO：3中第1-1611位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子编码。所述木糖葡聚糖酶可用于例如洗涤剂组合物中，并可用于纤维素纤维的处理中。

Description

碱性木糖葡聚糖酶

本发明涉及碱性木糖葡聚糖酶(xyloglucanase)，即在中性和碱性pH范围内呈现木糖葡聚糖酶活性作为它们的主要酶活性的酶；涉及这些酶的制备方法；还涉及将这些酶用于纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业中的方法。

发明背景

木糖葡聚糖是植物初生(正生长的)细胞壁中的一种主要结构多糖。从结构上讲，木糖葡聚糖由频繁被多种侧链取代的纤维素样β-1，4-键连接的葡萄糖骨架组成。多数双子叶植物、某些单子叶植物和裸子植物的木糖葡聚糖是高度分支多糖，其中骨架中约75％的葡萄糖残基在0-6位带有糖基侧链。直接与分支葡萄糖残基连接的糖基都是α-D-木糖。由于木糖残基在0-2位上有β-D-半乳糖或α-L-岩藻糖-(1-2)-β-D-半乳糖组成部分，因此木糖葡聚糖中高达50％的侧链包含1个以上的残基(C.Ohsumi和T.Hayashi(1994)植物和细胞生理学35：963-967；G.J.McDougall和S.C.Fry(1994)植物生理学杂志143：591-595；J.L.Acebes等人(1993)植物化学33：1343-1345)。在酸水解中，抽提自棉纤维的木糖葡聚糖以50∶29∶12∶7的比例产生葡萄糖、木糖、半乳糖和岩藻糖(Hayashi等人，1988)。

茄科植物产生的木糖葡聚糖比较特殊，因为通常其中只有40％的β-1，4-键连接的葡萄糖残基在O-6上带糖基侧链。此外，高达60％的木糖残基在O-2位被α-L-***糖基取代，一些茄科植物，诸如马铃薯之类，也有在一些木糖残基O-2位存在β-D-半乳糖取代基的木糖葡聚糖(York等人(1996))。

木糖葡聚糖被认为通过交联纤维素微丝形成纤维素-木糖葡聚糖网而在植物初生壁中起作用。该网状结构被认为是初生细胞壁的结构完整性所必需的(Carpita等人，1993)。木糖葡聚糖的另一重要功能是作为木糖葡聚糖亚基寡糖的贮藏器，它是植物细胞生长的生理活性调节剂。木糖葡聚糖亚基也可调节木糖葡聚糖内切转糖苷酶(XET)的作用，XET是一种推测在植物细胞壁延伸中起作用的细胞壁相关酶。因此木糖葡聚糖可能在壁松弛及由此产生的细胞膨胀中起重要作用(Fry等人，1992)。

许多双子叶植物的种子包含木糖葡聚糖作为主要的多糖贮藏后备。这种类型的木糖葡聚糖位于种子子叶细胞壁里面的巨大增厚部分中，它主要由葡萄糖、木糖和半乳糖组成(Rose等人，1996)。

在1943年，当树胶被发现可用作纸和纺织品浆料时，罗望子树酸豆(Tama rindus indica)的种子就成为树胶的商业来源。由于树胶的低成本及其优秀特性，在亚洲已广泛使用罗望子树木糖葡聚糖来对黄麻和棉进行上浆。罗望子树木糖葡聚糖食品应用包括用于糖果、果酱和果子冻中，并可做为冰淇琳和蛋黄酱中的稳定剂(Whistler等，1993)。

木糖葡聚糖酶活性不包括在由酶命名法提供的酶分类中(1992)。迄今为止，这一酶活性只被简单归于葡聚糖酶活性类，并常被认为与纤维素分解活性(EC 3.2.1.4)，即水解纤维素或纤维素衍生底物中β-1，4-糖苷键的活性相同，或至少是具纤维素分解活性的酶的一种次要活性。然而，真正的木糖葡聚糖酶是真正具木糖葡聚糖专一性的酶，它能催化木糖葡聚糖至木糖葡聚糖寡糖的水解作用，但无实质的纤维素分解活性，例如，水解常规使用的纤维素样底物CMC(羧甲基纤维素)、HE纤维素和Avicel(微晶纤维素)的活性。木糖葡聚糖酶裂解木糖葡聚糖骨架中的β-1，4-糖苷键。

Vincken等人描述了木糖葡聚糖酶活性(1997)，他从绿色木霉(与T.reesei相似)中鉴定出了三种不同内切葡聚糖酶，这三种酶都具有水解纤维素或CMC的高活性，并显示出EndoI(真正属于糖基水解酶家族5，参阅Henrissat，B.等人(1991，1993))基本上无(即很少有)水解木糖葡聚糖的活性，而EndoV(属于糖基水解酶家族7)和EndoIV(属于糖基水解酶家族12)均分别具有水解木糖葡聚糖和CMC的活性，并且活性水平相当。

国际专利申请文件WO 97/13862描述了两种来自EP-A 0 463 706所述黑曲霉N400的纤维素酶。通过与EMBL数据库中已知的同源纤维素酶比较，lac12序列归于家族12，而lac64的序列被测定属于家族5。这两种酶均具有纤维素酶和β-葡聚糖酶活性。它们对大麦β-葡聚糖具有最高活性，且它们均显示了良好的CMC活性和一些木糖葡聚糖酶活性。两种酶对CMC的最适pH为pH3.5，对大麦β-葡聚糖为pH5.5。

国际专利申请文件WO 94/14953公开了克隆自棘孢曲霉并表达于米曲霉中、具高木糖葡聚糖酶活性和很低的纤维素酶活性的木糖葡聚糖酶(EGII)。该EGII酶在pH2.5-6的范围内显示有木糖葡聚糖酶活性，最佳活性在pH3-4，它也属于糖基水解酶的家族12。

总之，直到目前为止，只在属于糖基水解酶家族7和12的真菌酶中发现有木糖葡聚糖酶活性，这些酶在酸性至近中性pH范围内展现该活性。

然而，许多重要的工艺，或者工业工艺或者使用工业生产试剂的工艺，是在碱性pH条件下操作的。因此，本发明的一个目的是提供在碱性pH时有高木糖葡聚糖酶活性，并对纤维素或纤维素衍生物基本无活性的真正木糖葡聚糖酶。

发明概述

发明者现已发现了在碱性范围内具有高木糖葡聚糖酶活性的酶，这些酶没有或只有很小的纤维素分解活性。

因此，本发明涉及含有木糖葡聚糖酶的酶制剂，该木糖葡聚糖酶在pH≥7的条件下具有至少50％的相对木糖葡聚糖酶活性，并优选对纤维素或纤维素衍生底物很小或无活性，如具有的最大木糖葡聚糖酶活性与对CMC或Avicel的最大活性比率至少为2∶1。

发明者还成功地克隆和表达了木糖葡聚糖酶，即本发明在进一步的方面涉及木糖葡聚糖酶，该酶是(a)由Bacillus agardhaerens，NCIMB 40482产生的多肽，或(b)含SEQ ID NO：4中第1-537位所示氨基酸序列的多肽，或(c)(a)或(b)所限定多肽的类似物，它们与所述多肽至少有70％同源性，或是通过一个或多个氨基酸的取代、删除或添加而衍生自所述多肽，或与针对纯化形式的该多肽产生的多克隆抗体具免疫反应性；另一方面涉及的木糖葡聚糖酶是(a)地衣芽孢杆菌，ATCC 14580产生的多肽，或(b)含SEQ ID NO：2中第30-261位所示氨基酸序列的多肽，或(c)(a)或(b)中所限定多肽的类似物，它们与所述多肽至少具70％的同源性，或是通过一个或多个氨基酸的取代、删除或添加而衍生自所述多肽，或与针对纯化形式的该多肽产生的多克隆抗体具免疫反应性；另一方面涉及编码具木糖葡聚糖酶活性的多肽的分离多核苷酸分子，它们选自(a)含SEQ ID NO：1中第88-783位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)编码的多肽与SEQ ID NO：2中第30-261位氨基酸残基序列至少具70％相同的多核苷酸分子；和(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列；本发明又涉及编码具木糖葡聚糖酶活性的多肽的分离多核苷酸分子，它们选自下组：(a)含SEQ ID NO：3中第1-1611位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)编码与SEQID NO：4第1-537位氨基酸残基的氨基酸序列至少70％相同的多肽的多核苷酸分子；及(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列。

在更深一步的方面，本发明提供了含有例如本发明之多核苷酸分子的DNA区段的表达载体；提供了含该DNA区段或表达载体的细胞；提供了具木糖葡聚糖酶活性的酶的生产方法，该方法包括在允许该酶产生的条件下培养上述细胞，并从培养物中回收该酶。

另一方面，本发明提供了具木糖葡聚糖酶活性的分离酶，其特征在于(i)无同源杂质，及(ii)该酶是用上述方法产生的。

本发明的新型酶可用于处理纤维素材料，尤其是含纤维素的纤维、纱线、机织或非机织织物。可在将纤维素材料加工成可备服装制造或织品制造的材料的过程中进行上述处理，例如，在脱浆工艺或精炼步骤中；或在这些织品或服装的工业或家常洗烫过程中进行处理。

因此，在进一步的方面，本发明涉及含有在碱性范围内具显著木糖葡聚糖酶活性的酶的洗涤剂组合物；还涉及本发明的酶在含纤维素之纤维、纱线、机织或非机织织品的处理中的用途。

本发明现已使将真正的酶促洗涤过程用于纤维素材料的制备中成为可能，例如使得在随后的染色操作中有适当反应。进一步地，预计含该新型酶的洗涤剂组合物能去除或漂白洗衣中出现的污物或色斑，特别是由含木糖葡聚糖食品、植物等产生的污迹或斑点。预计用含该新型酶的洗涤剂组合物进行处理能阻止某些污物与残留在纤维素材料上的木糖葡聚糖结合。

发明详述

在糖基水解酶10多个不同家族中均发现了纤维素酶。一些纤维素酶也呈现木糖葡聚糖酶活性。今天，这些纤维素酶可归于家族5、7和12。而底物专一性却不与家族直接相关：在一家族内主要的酶活性可以是纤维素酶或甘露聚糖酶(家族5)，或地衣多糖酶(lichinase)、β-1，3-葡聚糖酶或木糖葡聚糖转移酶活性(家族16)。迄今为止公布的对木糖葡聚糖的活性是其大部分或主要酶活性的唯一一种酶是公开于WO 94/14953中的棘孢曲霉EG II。如上所述，该活性还未收入正式的酶命名法中。

在本发明上下文中，术语“酶制剂”表示或者是来自单个物种微生物的常规酶发酵产品，可能已分离和纯化，这些制剂常含有许多不同的酶活性；或为单组分酶的混合物，优选使用常规重组技术而得自细菌或真菌物种的酶，它们已被发酵并可能已独立地分离和纯化，且它们可来源于不同的物种，优选真菌或细菌的物种；或是作为表达重组木糖葡聚糖酶之宿主细胞的微生物的发酵产品，但该微生物同时还产生作为其天然发酵产物的其它酶，如木糖葡聚糖酶、蛋白酶或纤维素酶，即由相应的天然微生物常规产生的酶复合物。

在优选的实施例中，与最适pH时的活性相比，木糖葡聚糖酶在pH7的相对活性至少50％，优选至少75％，更优选至少80％，特别是至少90％。

在另一优选实施例中，与最适pH时的活性相比，木糖葡聚糖酶在pH8时的相对活性至少有50％优选至少60％，更优选至少75％，尤其是至少90％。

在另一优选实施例中，与最适pH时的活性相比，木糖葡聚糖酶在pH9时的相对活性有至少10％，优选至少20％，更优选至少25％。

在另一优选实施例中，与最适pH时的活性相比，木糖葡聚糖酶在pH9.5时的相对活性至少有5％，优选至少10％，更优选至少15％。

在另一优选实施例中，与最适pH时的活性相比，木糖葡聚糖酶在pH10时的相对活性至少有5％。

在另一优选实施例中，与最适温度条件下的活性相比，木糖葡聚糖酶在50℃时具有的相对活性优选至少60％，更优选至少70％。

在又一优选实施例中，在温度60℃时，相对木糖葡聚糖酶活性至少是40％，优选至少50％；在温度70℃时，相对木糖葡聚糖酶活性至少是40％，优选至少45％，尤其是至少50％。

在一优选实施例中，木糖葡聚糖酶对纤维素或纤维素衍生底物具有很小的活性或无活性。测定纤维素酶活性(内切-β-1，4-葡聚糖酶活性，即EC 3.2.1.4)的常规底物是羧甲基纤维素(CMC)。测定纤维素酶或纤维二糖水解酶活性(EC 3.2.1.91)的另一种常规底物是Avicel，它是本领域熟练技术人员熟知的微晶纤维素。优选最大木糖葡聚糖酶活性与对CMC或Avicel的最大活性的比率至少为2∶1的酶，更优选至少为3∶1的酶，更优选至少为4∶1，更优选至少为5∶1，还更优选至少为8∶1，尤其是至少为10∶1。

本发明的木糖葡聚糖酶制剂可进一步包括选自以下酶中的一种或多种酶：蛋白酶、纤维素酶(内切-β-1，4-葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶(内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶)、脂酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶(ligninase)、支链淀粉酶、***聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonan acetyl esterase)、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalacturonase)、果胶分解酶、果胶酸酯分解酶(pectate lyase)、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶；或它们的混合物。在一个优选实施例中，制剂中一种或多种或所有酶是利用重组技术产生的，即该(诸)酶是单组分酶，它(它们)与其它酶混合以形成具所期望酶混合的酶制剂。

另一方面，本发明还涉及产生本发明酶制剂的方法，该方法包括在允许酶产生的条件下培养能产生木糖葡聚糖酶的微生物，并从培养物中回此酶。可利用常规发酵技术进行培养，如在摇瓶或发酵罐中振荡培养以确保在诱导木糖葡聚糖酶产生的生长培养基中有足够的通气量。生长培养基中可包括诸如蛋白胨、酵母提取物或酪蛋白氨基酸之类的常规氮源，减少量的诸如葡萄糖或蔗糖之类常规碳源，还有如木糖葡聚糖或谷糠(如小麦麸或米壳)之类复合植物底物的诱导剂。可用常规技术进行回收。如用离心或过滤方法分离生物质和上清液，回收上清液，或如果目的酶在胞内，就裂解细胞，可能还要如EP 0 406 314所述进一步纯化或如WO 97/15660所述进行结晶。

在本篇上下文中，术语“表达载体”指含目的多肽编码区段及与其可操作相连提供其转录的额外区段的线性或环状DNA分子。这些额外区段可能包括启动子和终止子序列，并可选择性地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号，等等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可包括二者的元件在内。本发明的表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作的表达载体，载体的选择常决定于它将引入的宿主细胞。因而，该载体可为自主复制型载体，即作为一染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒。或者，载体可以是这样一种形式，当将其引入宿主细胞时，可以整合入宿主细胞基因组中并与其整合入的染色体一起复制。

此处有关多肽或蛋白质表达时所用的术语“重组体表达”或“重组表达”是按本领域的标准定义限定的。蛋白质的重组表达通常是利用上文刚提到的表达载体进行的。

当用于多核苷酸分子时，术语“分离的”表示已脱离天然环境因而无其它外源或不希望有的编码序列的多核苷酸，它处于适用于基因工程蛋白质生产***的形式。这种分离分子是那些分离自其天然环境的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不合通常与它们相关的其它基因，但可以包括诸如启动子和终止子之类的天然5′和3′非翻译区。相关区域的鉴定对本领域常规技术人员将是明显的(见例如Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。术语“分离的多核苷酸”或者可称为“克隆的多核苷酸”。

当用于蛋白质/多肽时，术语“分离的”表明该蛋白质处于非其天然环境下的状态。在优选的形式中，该分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，尤其是无其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下文))。优选提供纯度高于40％的蛋白质，更优选提供纯度超过60％的蛋白质。

甚至更优选提供高度纯化形式的蛋白质，即用SDS-PAGE测定纯度高于80％，更优选纯度高于95％，还更优选纯度高于99％。

术语“分离的蛋白质/多肽”或者可称为“纯化的蛋白质/多肽”。

术语“同源杂质”意指来自最初得到本发明多肽的同源细胞的任何杂质(如除本发明多肽之外的其它多肽)。

此处所用与特定微生物来源相关的术语“获自”指由该特定来源产生的多核苷酸和/或多肽，或已***此来源的基因的细胞产生的多核苷酸和/或多肽。

当指DNA区段时，术语“可操作连接”表示该区段被连接在一起的方式使得它们所起作用与它们原预期目的一致，如转录起始于启动子，通过编码部分直到终止子。

术语“多核苷酸”表示以5′到3′末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，可分离自天然来源、体外合成或制备自天然和合成分子联合体。

术语“多核苷酸分子的互补物”是指与参照序列相比具互补碱基序列并反向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′与5′CCCGTGCAT3′互补。

术语“简并核苷酸序列”是指包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子包括不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码天冬氨酸)。

术语“启动子”表示基因的一部分，它所包括的DNA序列可用于结合RNA聚合酶并起始转录。启动子序列通常，但并非总是，存在于基因的5′非编码区。

术语“分泌信号序列”表示编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为更大多肽的一个组分，可指导该更大多肽穿过合成它的细胞的分泌途径。在通过分泌途径的时候，该更大的肽通常被裂解去除了分泌肽。

多核苷酸：

在本发明优选实施例中，本发明的分离多核苷酸在至少是中度严格条件下可与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3之相似大小区域或其互补序列杂交。

具体地说，本发明的多核苷酸在至少是中度严格条件下、优选如下详述的高度严格条件下可与下述变性双链DNA探针杂交：包含SEQ IDNO：3中所示的全长序列或含SEQ ID NO：1第88-783位所示全长序列的探针，或含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：1至少长为约100个碱基对亚序列的任何探针。测定中度或高度严格条件下核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交情况的合适实验条件包括将含有需杂交之DNA片段或RNA的滤膜预浸泡于5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)10分钟，并于5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理鲑精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交该滤膜，然后在含10ng/ml随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)，分析生物化学(Anal.Biochem.)132：6-13)、³²P-dCTP标记的(比活性高于1×10⁹cpm/μg)探针的同样溶液中约45℃杂交12小时。滤膜随后在2×SSC、0.5％SDS中洗两次，每次30分钟，洗涤温度至少60℃(中度严格条件)，更优选至少65℃(中/高度严格条件)，还更优选至少70℃(高度严格条件)，更优选至少75℃(极高严格条件)。

用X-射线胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针能杂交上的分子。

如前面所提到的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。可用本领域已知方法从基因库或DNA文库中克隆编码目的基因的DNA和RNA。

随后用例如杂交或PCR方法鉴定和分离编码本发明具内切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸。

本发明进一步提供了来自不同细菌菌株的多肽和多核苷酸对应物(直向同系物(ortholog)或共生同系物(paralog))。特别感兴趣的是来自革兰氏阳性嗜碱菌株，包括芽孢杆菌属菌株的木糖葡聚糖酶多肽。

将本发明提供的信息和组合物与常规克隆技术相结合可克隆本发明具木糖葡聚糖酶活性的多肽的物种同系物。例如，本发明的DNA序列可用来自表达该蛋白质的细胞类型的染色体DNA进行克隆。可用按此处公开序列设计的探针通过探测RNA印迹鉴别DNA的合适来源。随后从阳性细胞系的染色体DNA制备文库。编码具木糖葡聚糖酶活性之多肽的本发明DNA序列可随后用各种方法分离，诸如用按本说明书和权利要求书中公开序列设计的探针进行探测，或用基于公开序列的一套或多套简并探针进行探测。本发明的DNA序列也可采用聚合酶链式反应或PCR(Mullis，美国专利号4,683,202)，用设计自本文公开序列的引物进行克隆。在另外的方法中，可用DNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对木糖葡聚糖酶的抗体(单克隆或多克隆抗体)检测目的DNA的表达，该木糖葡聚糖酶克隆自地衣芽孢杆菌、ATCC 14580或B.agaradhaerens，NCIMB 40482，按材料和方法及实施例5、6和7中所述方法表达和纯化；或者可通过涉及有木糖葡聚糖酶活性的多肽的活性测定检测目的DNA的表达。

多肽：

SEQ ID NO：4的序列及SEQ ID NO：2中氨基酸第30-261位的序列分别是催化活性结构域的成熟木糖葡聚糖酶序列。本发明还提供与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽基本同源的木糖葡聚糖酶多肽及其物种同系物(直向同系物或共生同系物)。此处所用的术语“基本同源”表示多肽与SEQ ID NO：4中或SEQ ID NO：2的氨基酸第30-261位的序列或者它们的直向同系物或共生同系物的序列相同达75％，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％的多肽。这些多肽将更优选与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：2的氨基酸第226490位或它的直向同系物或共生同系物所示序列至少具95％相同的多肽，最优选具98％或更大相同的多肽。序列相同百分率是用常规方法，通过本领域已知的计算机程序进行测定的，诸如GCG程序包(WisconsinPackage的程序手册，第8版，1994年8月，遗传计算机组，575 ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA 53711)提供的GAP，该程序包公开于Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-453，在此全文引用作为参考。GAP与以下设置一起用于多肽序列比较：缺刻产生罚分3.0及缺刻延伸罚分0.1。

通过相似方法测定多核苷酸分子的序列相同，将带以下设置的GAP用于DNA序列比对：缺口产生罚分5.0及缺口延伸罚分0.3。

基本同源的蛋白质和多肽其特征在于具有一个或多个氨基酸取代、删除或添加。这些改变优选影响较小的变换，即保守氨基酸取代(见表2)及其它不会严重影响蛋白质或多肽的折叠和活性的取代；小的删除，通常是1-约30个氨基酸的小删除；及小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基，长达约20-25个残基的小连接肽，或便于纯化的小延伸(亲和标记)，如多组氨酸束、蛋白A(Nilsson等，EMBOJ.4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法，198：3，1991)。通常参阅，Ford等人，蛋白质表达和纯化2：95-107，1991，在此引用作为参考)。编码亲和标记的DNA可从产品供应商处购买到(如，PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)。

然而，即便上述优选的变化是影响较小的改变，这些改变也可以是影响较大的改变，如将长达300个氨基酸或更长的较大多肽作为氨基或羧基端延伸融合到具木糖葡聚糖酶活性的本发明多肽上。

表1

保守氨基酸取代

碱性氨基酸：精氨酸

赖氨酸

组氨酸

酸性氨基酸：谷氨酸

天冬氨酸

极性氨基酸：谷氨酰胺

天冬酰胺

疏水性氨基酸：亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸

芳香族氨基酸：苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸

小氨基酸：甘氨酸

丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

除20种基本氨基酸之外，也可用非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代本发明多肽的氨基酸残基。也可用有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸及非天然氨基酸取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”已在蛋白质合成后被修饰，且/或在它们侧链上有不同于标准氨基酸侧链的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，或优选地购买得到，包括六氢吡啶羧酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、及3，3-二甲基脯氨酸。

本发明之木糖葡聚糖酶多肽中的必需氨基酸可按本领域已知步骤进行鉴别，如定位诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085，1989)。在后一技术中，在分子的每个残基位置处引入单个丙氨酸突变，检测所产生的突变分子的生物学活性(即木糖葡聚糖酶活性)以鉴别对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也可参阅，Hilton等，生物化学杂志271：4699-4708，1996。酶的活性位点或其它生物学相互作用也可通过对用诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记之类技术测定的结构的物理分析连同假定接触位点氨基酸的突变进行测定。参阅，例如，de Vos等人，科学255：306-312，1992；Smith等人，分子生物学杂志224：899-904，1992；Wlodaver等人，FEBS Lett.309：59-64，1992。必需氨基酸的位置也可从涉及本发明多肽的多肽同源性分析中推断。

可用已知的诱变、重组和/或重排方法及随后的相关筛选步骤进行多个氨基酸取代和检测，这些方法例如有Reidhaar-Olson和Sauer(科学241：53-57，1988)、Bowie和Sauer(美国国家科学院院报86：2152-2156，1989)、WO 95/17413或WO 95/22625所公开的技术。简要地说，这些作者公开了使多肽中两个或多个位置同时随机化，或进行不同突变的重组/重排(WO95/17413，WO95/22625)，随后从功能上选择多肽，然后将诱变多肽测序以测定每个位置可允许取代的范围。其它可用的方法包括噬菌体展示(如Lowman等，生物化学30：10832-10837，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO出版物WO 92/06204)和定位诱变(Derbyshire等，基因46：145，1986；Ner等，DNA 7：127，1988)。

上面公开的诱变/重排方法可与大容量、自动筛选方法结合，以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。编码活性多肽的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收，并用现代设备迅速测序。这些方法可快速测定目的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并可用于未知结构的多肽。

利用上述方法，本领域普通技术人员能鉴定和/或制备与SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：2之30-261位残基基本同源并保留野生型蛋白质之木糖葡聚糖活性的各种多肽。

除含催化结构域的酶核心外，本发明的木糖葡聚糖酶还可包含纤维素结合结构域(CBD)，该纤维素结合结合域和该酶的酶核心(催化活性结构域)可操作连接。纤维素结合结构域(CBD)可作为所编码之酶的内在部分存在，或者可将另一来源的CBD引入木糖葡聚糖酶中，从而产生酶杂合体。在本文中，术语“纤维素结合结构域”应按Peter Tomme等人[《不溶性碳水化合物的酶促降解》一书中，“纤维素结合结构域：分类和特性”，John N.Saddler和Michael H.Penner(编)，ACSSymposium Series，No.618，1996]的定义理解。这一定义将120种以上的纤维素结合结构域归为10个家族(I-X)，并证实在诸如纤维素酶、木糖聚酶、甘露聚糖酶、***呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和壳多糖酶之类的多种酶中有CBD。在藻类如红藻Porphyra purpurea中也已找到了作为非水解性多糖结合蛋白质的CBD，参阅Tomme等人，出处同前。然而，大部分CBD是来自纤维素酶和木糖聚酶，CBD可存在于蛋白质的N和C末端或在其内部。参阅如WO90/00609和WO95/16782，本领域已知有酶杂合体的形式，通过将含有纤维素结合结构域的编码DNA至少一个片段、及通过或不通过连接子与之相连的木糖葡聚糖酶编码DNA序列的DNA构建体转化宿主细胞，并培养此宿主细胞以表达融合基因，可制备酶杂合体。酶杂合体可用以下公式描述：

CBD-MR-X

其中CBD是相应于至少为纤维素结合结构域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区域；MR是中间区域(连接子)，可以是一个键，或一个短的连接基团，优选约2-100个碳原子长的，更优选2-40个碳原子长；MR或者优选约2-100个氨基酸长，更优选2-40个氨基酸长；而X是本发明多核苷酸分子所编码多肽的N-末端或C-末端区域。

木糖葡聚糖底物

除了上述关于木糖葡聚糖的说明外，还应提到来自Megazyme，澳大利亚提供的罗望子树种子的木糖葡聚糖具有复杂的分支结构，含比率为45∶36∶16∶3的葡萄糖、木糖、半乳糖和***糖。因此，可以肯定地认为对这一木糖葡聚糖显示催化活性的酶对不同来源(被子植物或裸子植物)的其它木糖葡聚糖结构也有催化活性。

洗涤工业中的用途

在洗涤和穿着过程中，染色织物或服装上的染料通常会从织物上溢出，这使得织物看起来比较陈旧和褪色。除去织物表面上的纤维可部分恢复织物的原色和外观。本文所用的术语“颜色澄清”是指通过多次洗涤循环而部分恢复织物或服装的原色。

术语“去小球”指除去织物表面上的小球。

术语“浸泡液”是指可在进行常规洗涤过程之前浸泡衣物的水溶液。浸泡液可含有洗涤或洗衣过程中常规使用的一种或多种成分。

术语“洗涤液”指在其中洗涤衣物的水溶液，这种衣物洗涤通常是手工进行或在洗衣机中进行的化学和机械混合作用。洗涤液通常是粉状或液态洗涤剂组合物的水溶液。

术语“漂洗液”指习惯上在衣物洗涤之后立即泡入或在其中处理以漂洗衣物(即基本上除去衣物上的洗涤剂溶液)的水溶液。漂洗液中可含有织物调理或软化组合物。

可用本发明方法处理的衣物可以是常规的可洗涤衣物。优选衣物的主要部分是由棉花、棉混纺纱或者天然或人工纤维素(如来源于含木聚糖之纤维素纤维，如来自纸浆)或其混合物制成的已缝制或未缝制的织物，包括针织物、机织物、粗斜纹布、纱线和毛巾布。混合物的例子是棉或人造丝/粘胶丝与一种或多种配对材料的混合物，所述配对材料例如是羊毛，合成纤维(如聚酰胺纤维，丙烯酸纤维，聚酯纤维，聚乙烯醇纤维，聚氯乙烯纤维，聚偏二氯乙烯纤维，聚氨基甲酸乙酯纤维，聚脲纤维，芳族聚酰胺纤维)，和含纤维素的纤维(如人造丝/粘胶丝，苎麻，***，亚麻/亚麻布，黄麻，醋酸纤维素纤维，lyocell)。

洗涤剂的公开内容和实例

本发明的洗涤剂组合物中含有表面活性剂体系，其中表面活性剂可以选自非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂和/或阳离子表面活性剂和/或两性表面活性剂和/或两性离子表面活性剂和/或半极性表面活性剂。

表面活性剂一般以0.1-60％重量的量存在。

优选将表面活性剂配制成与组合物中存在的酶组分相容。在液体或凝胶组合物中，最优选以这样的方式配制表面活性剂，致使它促进或至少是不降低这些组合物中的任何酶的稳定性。

根据本发明使用的优选体系包括本文中所述的作为表面活性剂的一种或多种非离子和/或阴离子表面活性剂。

烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯缩合物适合用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂，聚氧乙烯缩合物是优选的。这些化合物包括具有含约6-14个碳原子，优选约8-14个碳原子直链或支链构型之烷基的烷基酚与烯化氧的缩合产物。在优选的实施方案中，环氧乙烷存在的量等于每摩尔烷基酚约2-25摩尔，更优选约3-15摩尔的环氧乙烷。这类市售的非离子表面活性剂包括：由GAFCorporation销售的Igepal^TM CO-630；和均由Rohm & Haas Company销售的Triton^TM X-45、X-114、X-100和X-102。这些表面活性剂通常被称之为烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。

伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合物适合用作本发明的非离子表面活性剂。该脂族醇的烷基链可以是直链或支链的、伯或仲的，并且通常含有约8-22个碳原子。优选的是具有含约8-20个碳原子，更优选约10-18个碳原子烷基的醇与每摩尔醇约2-10摩尔环氧乙烷的缩合产物。所述的缩合产物中每摩尔醇有约2-7摩尔的环氧乙烷，最优选2-5摩尔的环氧乙烷。可从市场上购得的这类非离子表面活性剂的例子包括：由Union Carbide Corporation销售的Tergitol^TM 15-S-9(C₁₁-C₁₅直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)和Tergitol^TM 24-L-6 NMW(C₁₂-C₁₄伯醇与6摩尔环氧乙烷的窄分子量分布的缩合产物)；和由Shell Chemical Company销售的Neodol^TM45-9(C₁₄-C₁₅直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、Neodol^TM 23-3(C₁₂-C₁₃直链醇与3.0摩尔环氧乙烷的缩合产物)、Neodol^TM 45-7(C₁₄-C₁₅直链醇与7摩尔环氧乙烷的缩合产物)、Neodol^TM 45-5(C₁₄-C₁₅直链醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)；由Procter & GambleCompany销售的Kyro^TM EOB(C₁₃-C₁₅醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)；和由Hoechst销售的Genapol LA050(C₁₂-C₁₄醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)。这些产物的HLB的优选范围是8-11，最优选8-10。

也可用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是在US4565647中公开的烷基多糖，该多糖具有含约6-30，优选约10-16个碳原子的疏水基团和含约1.3-10，优选约1.3-3，最优选约1.3-2.7个糖单元的多糖如多糖苷亲水基团。可以使用任何含有5或6个碳原子的还原糖，例如，可以用葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分代替葡萄糖基部分(任选地，在2-，3-，4-等位连接疏水基团从而得到对应于葡萄糖苷或半乳糖苷的葡萄糖或半乳糖)。该糖间键可以在，例如，附加糖单元的1位和前一糖单元的2-，3-，4-，和/或6-位之间。

优选的烷基多糖苷具有下式：

R²O(C_nH_2nO)_t(糖基)_x

其中R²选自：烷基、烷基苯基、羟基烷基、羟基烷基苯基、和其混合物，其中烷基含有约10-18，优选约12-14个碳原子；n是2或3，优选2；t是0-约10，优选0；x是约1.3-10，优选约1.3-3，最优选约1.3-2.7。该糖基优选是从葡萄糖衍生的。为了制备这些化合物，先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后与葡萄糖或葡萄糖源反应，从而形成葡糖苷(在1-位连接)。然后另外的糖基单元在其1-位置与前面的糖基单元2-，3-，4-，和/或6-位置，优选主要在2-位之间连接。

环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水基之间的缩合产物也适合用作本发明的附加非离子表面活性剂体系。这些化合物的疏水部分的分子量优选为约1500-1800并显示出水不溶性。将聚氧乙烯部分加成到该疏水部分会增加整个分子的水溶性，在聚氧乙烯含量不超过该缩合产物总重量的约50％(相当于与多达约40摩尔的环氧乙烷缩合)时，仍能保持该产品的液体性质。这类化合物的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售的Pluronic^TM表面活性剂。

也适合用作本发明非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂是环氧乙烷与从环氧丙烷和乙二胺反应得到的产物的缩合产物。这些产物的疏水部分由乙二胺和过量环氧丙烷的反应产物组成，并且分子量一般是约2500-3000。该疏水部分与环氧乙烷缩合，缩合程度为该缩合产物含有约40-80％重量的聚氧乙烯并且分子量为约5000-11000。这类非离子表面活性剂的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售的Tetronic^TM化合物。

优选用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是：烷基酚的聚氧乙烯缩合物、伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖、和其混合物。最优选的是具有3-15个乙氧基的C₈-C₁₄烷基酚乙氧基化物和具有2-10个乙氧基的C₈-C₁₈(优选平均为C₁₀)醇乙氧基化物、和其混合物。

非常优选的非离子表面活性剂是下式的多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂：

其中R¹是H，或R¹是C_1-4烃基、2-羟基乙基、2-羟基丙基或其混合物，R²是C_5-31烃基，Z是具有直链烃基链、至少3个羟基直接连接到该链上的多羟基烃基，或其烷氧基化的衍生物。优选地，R¹是甲基，R²是直链C_11-15烷基或C_16-18烷基或链烯基链，例如椰油烷基，或其混合物，Z是在还原性胺化反应中从还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖衍生的。

非常优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化的硫酸盐表面活性剂。其例子是式RO(A)_mSO₃M的水溶性盐或酸，其中R是未取代的C₁₀-C₂₄烷基或具有C₁₀-C₂₄烷基部分的羟基烷基，优选C₁₂-C₂₀烷基或羟基烷基，更优选C₁₂-C₁₈烷基或羟基烷基，A是乙氧基或丙氧基单元，m大于0，一般为约0.5-6，更优选约0.5-3，M是H或阳离子，该阳离子可以是：例如金属阳离子(如钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代铵阳离子。本文也涵盖烷基乙氧基化硫酸盐以及烷基丙氧基化硫酸盐。取代铵阳离子的具体例子包括：甲基、二甲基、三甲基铵阳离子和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子和从烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些阳离子等。举例说明的表面活性剂是：C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(1.0)M)、C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(2.25)M)、C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(3.0)M)、C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(4.0)M)，其中M方便地选自钠和钾。

适用的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，包括按照“The Journal of the American Oil Chemists Society”，52(1975)，pp.323-329用气态SO₃磺化的C₈-C₂₀羧酸(即脂肪酸)的直链酯。合适的原料包括从牛脂、棕榈油等衍生的天然脂类物质。

优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂(尤其是用于洗衣用途的)包括下面结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂：

其中R³是C₈-C₂₀烃基，优选烷基，或其组合，R⁴是C₁-C₆烃基，优选烷基，或其组合，M是与烷基酯磺酸根形成水溶性盐的阳离子。合适的成盐阳离子包括金属阳离子(如钠、钾和锂)和取代或未取代的铵阳离子(例如单乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。优选地，R³是C₁₀-C₁₆烷基，R⁴是甲基、乙基或异丙基。特别优选的是甲基酯磺酸盐，其中R³是C₁₀-C₁₆烷基。

其它合适的阴离子表面活性剂包括：烷基硫酸盐表面活性剂，它们是式ROSO₃M的水溶性盐或酸，其中R优选是C₁₀-C₂₄烃基，优选具有C₁₀-C₂₀烷基部分的烷基或羟基烷基，更优选C₁₂-C₁₈烷基或羟基烷基，M是H或阳离子，例如碱金属阳离子(如钠、钾、锂)，或铵或取代铵(如甲基、二甲基和三甲基铵阳离子，和季铵阳离子例如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子，和从烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺和其混合物衍生的季铵阳离子)等。一般地，对于较低的洗涤温度(例如低于约50℃)，C₁₂-C₁₆烷基链是优选的，而对于较高的洗涤温度(例如高于约50℃)，C₁₆-C₁₈烷基链是优选的。

其它对洗涤目的有用的阴离子表面活性剂也可以包括在本发明的洗衣洗涤剂组合物中。它们可以包括：皂的盐(包括，例如钠、钾、铵、和取代的铵如单、二和三乙醇胺盐)、C₈-C₂₂伯或仲烷烃磺酸盐、C₈-C₂₄烯烃磺酸盐、通过碱土金属柠檬酸盐热解产物的磺化制备的磺化多羧酸(例如，如在英国专利说明书号1082179中所述的)、C₈-C₂₄烷基聚二醇醚硫酸盐(含有多达10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂肪酰基甘油磺酸盐、脂肪油基甘油硫酸盐、烷基酚氧乙烯醚硫酸盐、石蜡烃磺酸盐、烷基磷酸盐、羟乙磺酸盐如酰基羟乙磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸的单酯(特别是饱和和不饱和C₁₂-C₁₈单酯)和磺基琥珀酸的二酯(特别是饱和和不饱和C₆-C₁₂二酯)、酰基肌氨酸盐、烷基多糖的硫酸盐例如烷基多葡糖苷(下面所述的非离子型非硫酸化的化合物)的硫酸盐、支链伯烷基硫酸盐、和烷基多乙氧基羧酸盐例如那些式RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂COO^-M⁺的盐，其中R是C₈-C₂₂烷基，k是1-10的整数，M是形成水溶性盐的阳离子。树脂酸及氢化的树脂酸也是合适的，例如松香酸、氢化松香酸，以及存在于或衍生于松浆油的树脂酸和氢化树脂酸。

烷基苯磺酸盐是非常优选的。特别优选的是线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中该烷基优选含有10-18个碳原子。

其它例子描述于“Surface Active Agents and Detergents”(Vol.I and II，Schwartz，Perry and Berch)中。各种这样的表面活性剂也一般性地公开于US3929678中(第23栏58行-第29栏23行，该文献引入本文作为参考)。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约1-40％，优选约3-20％重量的上述阴离子表面活性剂。

本发明的洗衣洗涤剂组合物也可以含有阳离子、两性、两性离子和半极性表面活性剂，以及上文中并未述及的非离子和/或阴离子表面活性剂。

适用于本发明洗衣洗涤剂组合物中的阳离子洗涤表面活性剂是具有一个长链烃基的那些表面活性剂。这样的阳离子表面活性剂的例子包括铵表面活性剂例如烷基三甲基铵卤化物，和具有下式的那些表面活性剂：

[R²(OR³)_y][R⁴(OR³)_y]₂R⁵N⁺X^-

其中R²是在烷基链中具有约8-18个碳原子的烷基或烷基苄基，每个R³选自：-CH₂CH₂-、-CH₂CH(CH₃)-、-CH₂CH(CH₂OH)-、-CH₂CH₂CH₂-、和其混合物；每个R⁴选自：C₁-C₄烷基、C₁-C₄羟基烷基、由两个R⁴连接在一起形成的苄基环结构、-CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH(其中R⁶是己糖或分子量低于约1000的己糖聚合物，并且当y不是0时是氢)；R⁵与R⁴所述相同或是烷基链，其中R²+R⁵的总碳原子数不大于约18；每个y是0-约10，且该y值的和是0至约15；X是任何相容的阴离子。

非常优选的阳离子表面活性剂是具有下式的、在本发明组合物中有用的水溶性季铵盐化合物：

R₁R₂R₃R₄N⁺X^-(i)

其中R₁是C₈-C₁₆烷基，每个R₂、R₃和R₄各自独立地是C₁-C₄烷基、C₁-C₄羟基烷基、苄基和-(C₂H₄O)_xH(其中x的值为2-5)，X是阴离子。R₂、R₃、R₄中不多于1个是苄基。

R₁的优选烷基链长度是C₁₂-C₁₅，当该烷基是从椰油或棕榈仁脂衍生的链长度的混合物，或是通过烯烃合成或OXO醇合成而合成衍生的时尤为如此。

用于R₂、R₃和R₄的优选基团是甲基和羟基乙基，阴离子X可以选自：卤素离子、甲基硫酸根、醋酸根和磷酸根离子。

用于本文中的合适的式(I)季铵化合物的例子是：

氯化或溴化椰油基三甲基铵；

氯化或溴化椰油基甲基二羟基乙基铵；

氯化癸基三乙基铵；

氯化或溴化癸基二甲基羟基乙基铵；

氯化或溴化C_12-15二甲基羟基乙基铵；

氯化或溴化椰油基二甲基羟基乙基铵；

甲基硫酸肉豆蔻基三甲基铵；

氯化或溴化月桂基二甲基苄基铵；

氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)4铵；

胆碱酯(式(i)的化合物，其中R₁是烷基，R₂、R₃、R₄是甲基)。

二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。

其它在本文中有用的阳离子表面活性剂也描述于US4228044和EP000224中。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约0.2-25％，优选约1-8％重量的上述阳离子表面活性剂。

两性表面活性剂也适用于本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些表面活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的脂族衍生物，或杂环仲或叔胺的脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链或支链的。其中1个脂族取代基含有至少约8个碳原子，一般约8-18个碳原子，并且至少一个脂族取代基含有阴离子型水增溶性基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根。见US3929678(第19栏18-35行)的两性表面活性剂的例子。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约0.2-15％重量，优选约1-10％重量的上述两性表面活性剂。

两性离子表面活性剂也适用于本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些表面活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的衍生物，杂环的仲或叔胺的衍生物，或者季铵、季鏻或叔锍化合物的衍生物。见US3929678(第19栏38行-22栏48行)的两性离子表面活性剂的例子。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约0.2-15％重量，优选约1-10％重量的上述两性离子表面活性剂。

半极性非离子表面活性剂是一特殊类型的非离子表面活性剂，它们包括：含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的2个部分的水溶性氧化胺；含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的2个部分的水溶性氧化膦；和含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和1个选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的部分的水溶性亚砜。

半极性非离子表面活性剂包括具有下式的氧化胺表面活性剂：

其中R³是含有约8-22个碳原子的烷基、羟基烷基、或烷基苯基，或其混合物；R⁴是含有约2-3个碳原子的亚烷基或羟基亚烷基或其混合物；x是0-约3；每个R⁵是含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基，或含有约1-3个氧乙烯基团的多氧乙烯基。R⁵基团可以彼此连接，例如通过氧或氮原子，从而形成环结构。

特别地，这些氧化胺表面活性剂包括氧化C₁₀-C₁₈烷基二甲基胺和氧化C₈-C₁₂烷氧基乙基二羟基乙基胺。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约0.2-15％重量，优选约1-10％重量的上述半极性非离子表面活性剂。

助洗剂体系

本发明的组合物还可含有助洗剂体系。任何常规助洗剂体系都适用于本文中，其包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸盐和脂肪酸、诸如乙二胺四乙酸盐的材料、金属离子螯合剂例如氨基多膦酸盐特别是乙二胺四亚甲基膦酸和二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。尽管由于明显的环境原因并不优选，但本文中也可以使用磷酸盐助洗剂。

合适的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合的硅铝酸盐材料，更具体地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。

另一种合适的无机助洗剂材料是层状硅酸盐例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠(Na₂Si₂O₅)组成的结晶层状硅酸盐。

合适的含有1个羧基的多羧酸盐包括：乳酸、乙醇酸和其醚衍生物的水溶性盐，如在比利时专利号831368、821369和821370中所公开的。含有2个羧基的多羧酸盐包括：琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基)二乙酸、马来酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富马酸的水溶性盐，以及在德国专利2446686和2446687及US3935257中所述的醚羧酸盐，和在比利时专利号840623中所述的亚硫酰基羧酸盐。含有3个羧基的多羧酸盐具体地包括水溶性柠檬酸盐、乌头酸盐(aconitrate)和柠康酸盐以及琥珀酸盐衍生物，例如，在英国专利号1379241中所述的羧基甲氧基琥珀酸盐，在荷兰申请7205873中所述的乳氧琥珀酸盐(lactoxysuccinate)，和氧多羧酸盐材料例如在英国专利号1387447中所述的2-氧杂-1，1，3-丙三羧酸盐。

含有4个羧基的多羧酸盐包括：在英国专利号1261829中公开的氧联二琥珀酸盐、1，1，2，2-乙四羧酸盐、1，1，3，3-丙四羧酸盐和1，1，2，3-丙四羧酸盐。含有磺基取代基的多羧酸盐包括：在英国专利号1398421和1398422和US3936448中公开的磺基琥珀酸盐衍生物、和在英国专利号1082179中所述的磺化的热解柠檬酸盐，而英国专利号1439000中公开了含有膦取代基的多羧酸盐。

脂环和杂环多羧酸盐包括：环戊烷-顺，顺，顺-四羧酸盐、环戊二烯五羧酸盐(cyclopentadienide pentacarboxylate)、2，3，4，5-四氢呋喃-顺，顺，顺-四羧酸盐、2，5-四氢呋喃-顺-二羧酸盐、2，2，5，5-四氢呋喃-四羧酸盐、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸盐和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸盐包括：苯六甲酸、1，2，4，5，-苯四酸和在英国专利号1425343中公开的苯二甲酸衍生物。

在上面的多羧酸盐中，优选的多羧酸盐是每分子含有最多达3个羧基的羟基羧酸盐，更具体地是柠檬酸盐。

用于本发明组合物中的优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂例如沸石A或层状硅酸盐(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸盐螯合剂例如柠檬酸。

包括在本发明洗涤剂组合物中的合适的螯合剂包括：乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵盐，或其混合物。优选的EDDS化合物是游离酸形式的和其钠或镁盐。这样的优选EDDS钠盐的例子包括Na₂EDDS和Na₄EDDS。这样的优选EDDS镁盐的例子包括MgEDDS和Mg₂EDDS。镁盐是最优选包括在本发明组合物中的。

优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂例如沸石A和水溶性羧酸盐螯合剂例如柠檬酸的混合物。

可以形成用于粒状组合物的助洗剂体系中一部分的其它助洗剂材料包括：无机材料例如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐，和有机材料例如有机膦酸盐、氨基多亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐。

其它合适的水溶性有机盐是均聚和共聚的酸或其盐，其中该聚羧酸包括两两之间被不多于2个碳原子分开的至少两个羧基。

这类聚合物公开于GB-A-1596756中。这样的盐的例子是MW 2000-5000的聚丙烯酸盐和其与马来酸酐的共聚物，这样的共聚物具有20000-70000，特别是约40000的分子量。

洗涤助洗剂盐的量通常为组合物重量的5-80％。用于液体洗涤剂的助洗剂的优选量是5-30％。

酶

除了本发明的酶制剂外，优选洗涤剂组合物还含有提供清洗性能和/或织物护理益处的其它酶。

这样的酶包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。

蛋白酶：可以使用任何适用于碱性溶液的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的。微生物来源是优选的。包括化学或基因改性的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶，尤其是从芽孢杆菌衍生的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06270中)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO 89/06279中的镰孢属蛋白酶。

优选的市售蛋白酶包括：由Novo Nordisk A/S(Denmark)以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase销售的那些，由Genencor International以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、和Purafect OXP销售的那些，和由SolvayEnzymes以商品名Opticlean和Optimase销售的那些。按组合物重量计，可以以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将蛋白酶掺入到本发明的组合物中。

脂肪酶：可以使用任何适用于碱性溶液的脂肪酶。合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因工程改性的突变体。

有用的脂肪酶的例子包括 Humicola lanuginosa脂肪酶，例如描述于EP 258068和EP305216中的， Rhizomucor miehei脂肪酶，例如描述于EP 238023中的，假丝酵母属脂肪酶例如 C.antarctica脂肪酶，例如描述于EP214761中的 C.antarctica脂肪酶A或B，假单胞菌属脂肪酶例如描述于EP 218272中的产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌脂肪酶、例如描述于EP 331376中的洋葱假单胞菌脂肪酶、例如公开于GB1372034中的司徒茨氏假单胞菌脂肪酶，荧光假单胞菌脂肪酶，芽孢杆菌脂肪酶例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophsica acta 1131，253-260)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌脂肪酶(WO 91/16422)。

此外，很多克隆的脂肪酶也是有用的，包括Yamaguchi等在1991年《基因》103，61-67上描述的沙门氏柏干酪青霉脂肪酶、白地霉脂肪酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化学杂志，106，383-388)，和各种根霉属脂肪酶例如德列马根霉脂肪酶(Hass，M.J.等，(1991)，Gene 109，117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，Biosci.Biotech.Biochem.56，716-719)和米根霉脂肪酶。

其它类型的脂类分解酶，如角质酶也是有用的，例如WO88/09867所述来自门多萨假单胞菌的角质酶，来自Fusarium solani pisi的角质酶(如WO90/09446所述)。

特别合适的脂肪酶是下面这些脂肪酶：例如M1 Lipase^TM、Lumafast^TM和Lipomax^TM(Genecor)，Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(NovoNordisk A/S)，和Lipase P“Amano”(Amano Pharmacetical Co.Ltd.)。

按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将脂肪酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

淀粉酶：可以使用适用于碱性溶液的任何淀粉酶(α和/或β)。合适的淀粉酶包括细菌和真菌来源的那些。包括化学或基因工程改性的突变体。淀粉酶包括：例如，在GB1296839中详细描述的从地衣芽孢杆菌的特定菌株得到的α-淀粉酶。市售的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(从Novo Nordisk A/S得到)和Rapidase^TM和Maxamyl P^TM(从Genencor得到)。

按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将淀粉酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

纤维素酶：可以使用适用于碱性溶液的任何纤维素酶。合适的纤维素酶包括细菌和真菌来源的那些。包括化学或基因工程改性的突变体。合适的纤维素酶公开于US4435307(其中公开了从 Humicola insolens生产的真菌纤维素酶)，WO96/34108和WO96/34092(其中公开了来自芽孢杆菌的细菌嗜碱性纤维素酶BCE103)，WO94/21801、US5,475,101和US5,419,778(其中公开了木霉的EGIII纤维素酶)中。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是描述于欧洲专利申请0495257中的纤维素酶。市售的纤维素酶包括从一株 Humicola insolens生产的Celluzyme^TM和Carezyme^TM(Novo Nordisk A/S)，KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)，以及Puradax^TM(Genecor International)。

按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将纤维素酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

过氧化物酶/氧化酶：过氧化物酶与过氧化氢或其源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)一起使用。氧化酶与氧一起使用。两种类型的酶均可用于“溶液漂白”，即在洗涤液中一起洗涤，优选与例如WO 94/12621和WO 95/01426中所述的增强剂一起洗涤所述织物时，防止染料从染色织物转移到另一织物上。合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因工程改性的突变体。

按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将过氧化物酶和/或氧化酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

在本文中包括上述酶的混合物，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纤维素酶的混合物。

按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将本发明的酶或掺入到洗涤剂组合物中的其它任何酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

漂白剂

可以包括在本发明洗涤剂组合物中的附加的任选组分包括漂白剂，例如粒径为400-800微米的PB1、PB4和过碳酸盐。这些漂白剂组分可以包括一种或多种氧漂白剂，并且根据所选择的漂白剂，可包括一种或多种漂白活化剂。当存在氧漂白化合物时，其存在的量一般是约1-25％。通常，在非液体配方例如粒状洗涤剂中，漂白化合物是任选加入的组分。

用于本文中的漂白剂组分可以是任何在洗涤剂组合物中有用的漂白剂，包括氧漂白剂以及本领域已知的其它漂白剂。

适合于本发明的漂白剂可以是活化的或未活化的漂白剂。

一类可以使用的氧漂白剂包括过羧酸漂白剂和其盐。这类试剂的合适的例子包括：单过氧邻苯二甲酸镁六水合物，间氯过苯甲酸、4-壬氨基-4-氧代过氧丁酸和双过氧十二烷双酸的镁盐。这样的漂白剂公开于US4483781、US740446、EP0133354和US4412934中。非常优选的漂白剂也包括如在US4634551所述的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。

另一类可以使用的漂白剂包括卤素漂白剂。例如，次卤酸盐漂白剂的例子包括三氯异氰脲酸，以及二氯异氰脲酸的钠和钾盐，和N-氯代和N-溴代烷烃磺基酰胺。这样的材料通常以最终产品重量的0.5-10％、优选1-5％的量加入。

可以将过氧化氢释放剂与漂白活化剂一起使用，该漂白活化剂是：例如四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS，描述于US4412934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐(ISONOBS，描述于EP120591中)或五乙酰基葡萄糖(PAG)；将它们过水解后能形成过氧酸作为活性漂白物质，导致改进的漂白作用。另外，非常合适的是这些漂白活化剂：C₈(6-辛酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐、C₉(6-壬酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐和C₁₀(6-癸酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐或其混合物。还合适的活化剂是酰化的柠檬酸酯，例如在欧洲专利申请号91870207.7所公开的。

可用于本发明清洗组合物中的有用的漂白剂，包括过氧酸和含有漂白活化剂和过氧漂白化合物的漂白体系描述于专利申请USSN08/136626中。

通过在洗涤和/或漂洗过程的开始或期间加入能够生成过氧化氢的酶体系(即酶和其底物)，也可以存在过氧化氢。这样的酶体系公开于欧洲专利申请EP0537381中。

除了氧漂白剂以外的漂白剂也是本领域已知的，并且可以在本文中使用。特别重要的一类非氧漂白剂包括光活化漂白剂，例如磺化的锌和/或铝酞菁。这些材料可以在洗涤期间沉积在被洗物上。当存在氧时用光照射，例如通过将衣服挂出在日光中干燥时，该磺化的锌酞菁被活化，结果该被洗物被漂白。优选的锌酞菁和光活化漂白方法描述于US4033718中。洗涤剂组合物一般含有约0.025-1.25％重量的磺化锌酞菁。

漂白剂也可以包括锰催化剂。锰催化剂可以是例如在“低温漂白的有效锰催化剂(Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching)”，自然369，1994，pp.637-639中所述的一种化合物。

抑泡剂

另一个任选的组分是抑泡剂，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷通常可以用烷基化的聚硅氧烷材料来表示，而硅石一般以细分散形式使用，例如二氧化硅气凝胶和干凝胶和各种类型的疏水二氧化硅。这些材料可以作为颗粒加入，其中抑泡剂有利地可释放地掺入到水溶性或水分散性的、基本上无表面活性的洗涤剂不可渗透的载体中。另外，可以将抑泡剂溶解或分散在液体载体中并通过喷雾在一种或多种其它组分上来涂覆。

优选的硅氧烷抑泡剂公开于US3933672中。其它特别有用的抑泡剂是德国专利申请DTOS2646126中所述的自乳化硅氧烷抑泡剂。这样的化合物的例子是可从Dow Corning购得的DC-544，它是硅氧烷-二元醇共聚物。特别优选的抑泡剂是含有硅油和2-烷基-链烷醇混合物的抑泡剂体系。合适的2-烷基-链烷醇是以商品名Isofol 12 R购得的2-丁基-辛醇。

这样的抑泡剂体系公开于欧洲专利申请EP0593841中。

特别优选的硅氧烷泡沫控制剂描述于欧洲专利申请92201649.8中。所述的组合物可以含有硅氧烷/硅石混合物以及熏制的无孔硅石例如Aerosil^R。

按组合物重量计，通常以0.001-2％，优选0.01-1％的量使用上述的抑泡剂。

其它组分

可以在洗涤剂组合物中使用的其它组分有例如污垢悬浮剂、污垢除去剂、荧光增白剂、磨料、杀菌剂、变色抑制剂、着色剂和/或包覆或未包覆的香料。

特别合适的包覆材料是由多糖基质和多羟基化合物组成的水溶性胶囊，如在GB 1464616中所述的。

其它合适的水溶性包覆材料包括从取代二羧酸的未凝胶化淀粉酸酯衍生的糊精，例如在US3455838中所述的。这些酸酯糊精优选是从诸如蜡质玉米、蜡质高粱、西米、木薯和马铃薯的淀粉制备的。所述的包覆材料的合适例子包括由National Starch制造的N-Lok。该N-Lok包覆材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖组成。该淀粉是通过加上单官能取代基例如辛烯基琥珀酸酐改性的。

适合于本文中的防再污染剂和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，和均聚或共聚的聚羧酸或其盐。这类聚合物包括上述作为助洗剂提到的聚丙烯酸盐和马来酸酐-丙烯酸共聚物，以及马来酸酐与乙烯、甲基乙烯醚或甲基丙烯酸的共聚物，其中马来酸酐至少构成共聚物的20％摩尔。按组合物重量计，这些材料通常以组合物重量的0.5-10％，更优选0.75-8％，最优选1-6％的量使用。

优选的荧光增白剂是阴离子性的，其例子是：4，4’-双-(2-双乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠盐、4，4’-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4’，4”-双-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸一钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(4-苯基-2，1，3-***-2-基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、2(芪基--4”-(萘并-1’，2’：4，5)-1，2，3-***-2”-磺酸钠和4，4’-双-(2-磺基苯乙烯基)联苯。

其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特别是分子量为1000-10000，更具体是2000-8000和最优选是约4000的那些。以0.20-5％重量，更优选0.25-2.5％重量的量使用这些聚合物材料。这些聚合物和上述均聚或共聚的聚羧酸盐对于存在过渡金属杂质时改进白度维持性，织物灰分沉积和对粘土、蛋白质性和可氧化性污垢的清洗性能是重要的。

在本发明组合物中有用的污垢除去剂是对苯二甲酸与乙二醇和/或丙二醇单元各种排列的常规共聚物或三元共聚物。这样的聚合物的例子公开于US4116885和US4711730及EP0272033中。根据EP0272033特别优选的聚合物具有下式：

(CH₃(PEG)₄₃)_0.75(POH)_0.25[(T-PO)_2.8(T-PEG)_0.4]T(POH)_0.25((PEG)₄₃CH₃)_0.75

其中PEG是-(OC₂H₄)O-，PO是(OC₃H₆O)，T是(pOOC₆H₄CO)。

还非常有用的是作为二甲基对苯二甲酸酯、二甲基磺基间苯二酸酯、乙二醇和1，2-丙二醇无规共聚物的改性聚酯，该端基主要由磺基苯甲酸酯组成，还有一小部分是乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯。目的是“主要”得到在两端由磺基苯甲酸基团封端的聚合物，本文中是绝大多数本文所述共聚物是由磺基苯甲酸基团封端的。然而，某些共聚物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯组成，其“次要”地由这样的物质组成。

本文中选择的聚酯含有约46％重量的二甲基对苯二甲酸，约16％重量的1，2-丙二醇，约10％重量的乙二醇，约13％重量的二甲基磺基苯甲酸和约15％重量的磺基间苯二酸，并且其分子量为约3000。该聚酯和其制备方法详细地叙述于EP311342中。

柔软剂

可以将织物柔软剂加入到本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些试剂在类型上可以是无机或有机的。无机柔软剂的例子是在GB-A-1400898和US5019292中公开的绿土粘土。有机的织物柔软剂包括如在GB-A-1514276和EP 0011340中公开的水不溶性叔胺，其与单C₁₂-C₁₄季胺盐的混合物(公开于EP-B 0026528中)，和如在EP 0242919中所公开的二长链酰胺。织物柔软剂体系的其它有用有机组分包括高分子量的聚氧乙烯材料，如在EP 0299575和0313146中所公开的。

绿土粘土的含量一般在5-15％重量的范围，更优选8-12％重量，作为干混合组分材料加入到配方的其余部分中。以0.5-5％重量，一般1-3％重量的量加入有机织物柔软剂，例如水不溶性叔胺或二长链酰胺材料，而以0.1-2％重量，一般0.15-1.5％重量的量加入高分子量聚氧乙烯材料和水溶性阳离子材料。尽管在某些情况下作为干混颗粒加入它们可以更方便，但一般将这些材料加到该组合物的喷雾干燥组分上，或者作为熔融的液体将它们喷雾到组合物的其它固体组分上。

聚合染料转移抑制剂

按照本发明的洗涤剂组合物还包括0.001-10％重量，优选0.01-2％重量，更优选0.05-1％重量的聚合染料转移抑制剂。一般将所述的聚合染料转移抑制剂加入到洗涤剂组合物中以便抑制染料从有色织物转移到与其一起洗涤的织物上。在染料于洗涤中附着到其它物品上之前，这些聚合物会络合或吸附从染色织物洗涤下来的短效染料。

特别合适的聚合染料转移抑制剂是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。

加入这样的聚合物也增强了本发明酶的性能。

本发明的洗涤剂组合物可以是液体、膏状、凝胶、条状或粒状形式。

可以按例如US4106991和US4661452(两者均是Novo Industri A/S的专利)中所公开的生产无尘的颗粒，并且该颗粒可以任选地用本领域已知的方法涂覆。蜡质涂覆材料的例子是平均分子量为1000-20000的聚(氧乙烯)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中该醇含有12-20个碳原子并且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-及三-甘油酯。在GB1483591中给出了适合于流化床技术涂覆的成膜涂覆材料的例子。

本发明的粒状组合物也可以是“致密形式”的，即它们具有比常规的粒状洗涤剂相对高的密度，即550-950g/l；在这样的情况下，本发明的粒状洗涤剂组合物将含有比常规颗粒洗涤剂更少量的“无机填料盐”；一般的填料盐是碱土金属的硫酸盐和氯化物，一般是硫酸钠；“致密”的洗涤剂一般包括不多于10％的填料盐。本发明的液体组合物也可以是“浓缩形式”的，在这样的情况下，本发明的液体洗涤剂组合物将比常规的液体洗涤剂含有较低量的水。按组合物重量计，浓缩的液体洗涤剂的水含量一般低于30％，更优选低于20％，最优选低于10％。

例如，可以将本发明的组合物配制为手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于脏织物预处理的组合物，漂洗加入的织物柔软剂组合物，和用于普通家庭硬表面清洗操作和洗碗碟操作的组合物。

下面的实例旨在举例说明本发明的组合物，而不对本发明范围作任何限制。

在洗涤剂组合物中，缩写组分符号具有下面的意义：

LAS : 直链C₁₂烷基苯磺酸钠

TAS : 牛脂烷基硫酸钠

XYAS ：C_1X-C_1Y烷基硫酸钠

SS ：式2-丁基辛酸的仲皂表面活性剂

25EY ：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C₁₂-C₁₅

的直链伯醇

45EY ：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C₁₄-C₁₅

的直链伯醇

XYEZS ：每摩尔与平均Z摩尔环氧乙烷缩合的C_1X-C_1Y

烷基硫酸钠

非离子：由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404销售

的、平均乙氧基化程度为3.8和平均丙氧基化

程度为4.5的C₁₃-C₁₅混合乙氧基化/丙氧基化

脂肪醇

CFAA ：C₁₂-C₁₄烷基N-甲基葡糖酰胺

TFAA ：C₁₆-C₁₈烷基N-甲基葡糖酰胺

硅酸盐：无定型硅酸钠(SiO₂∶Na₂O比＝2.0)

NaSKS-6 ：式d-Na₂Si₂O₅的结晶层状硅酸盐

碳酸盐：无水碳酸钠

磷酸盐：三磷酸钠

MA/AA ：1∶4的马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约

80000

聚丙烯酸：BASF GmbH以商品名PA30销售的平均分子量为

酯约8000的聚丙烯酸酯均聚物

沸石A ：式Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂.27H₂O的水合硅铝酸钠，主

要粒径为1-10微米

柠檬酸盐：柠檬酸三钠二水合物

柠檬酸：柠檬酸

过硼酸盐：无水过硼酸钠一水合物漂白剂，经验式为

NaBO₂.H₂O₂

PB4 ：无水过硼酸钠四水合物

过碳酸盐：经验式为2Na₂CO₃.3H₂O₂的无水过碳酸钠漂白剂

TAED ：四乙酰基乙二胺

CMC ：羧甲基纤维素钠

DETPMP ：由Monsanto以商品名Dequest 2060销售的二

乙三胺五(亚甲基膦酸)

PVP ：聚乙烯吡咯烷酮聚合物

EDDS ：钠盐形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]异构

体

抑泡剂：25％熔点为50℃的石蜡，17％的疏水性二氧化

硅，58％的石蜡油

颗粒抑泡：颗粒形式的12％硅氧烷/二氧化硅，18％的硬

剂脂醇，70％的淀粉

硫酸盐：无水硫酸钠

HMWPEO ：高分子量聚氧乙烯

TAE 25 ：牛脂醇乙氧基化物(25)

洗涤剂实施例I

可以按如下所示制备本发明粒状织物清洗组合物：

线性C₁₂烷基苯磺酸钠 6.5

硫酸钠 15.0

沸石A 26.0

次氮基三醋酸钠 5.0

本发明的酶 0.1

PVP 0.5

TAED 3.0

硼酸 4.0

过硼酸盐 18.0

苯酚磺酸盐 0.1

次要组份至100

洗涤剂实施例II

可以按如下所示制备本发明的致密粒状织物清洗组合物(密度800g/l)：

45AS 8.0

25E3S 2.0

25E5 3.0

25E3 3.0

TFAA 2.5

沸石A 17.0

NaSKS-6 12.0

柠檬酸 3.0

碳酸盐 7.0

MA/AA 5.0

CMC 0.4

本发明的酶 0.1

TAED 6.0

过碳酸盐 22.0

EDDS 0.3

粒状抑泡剂 3.5

水/次要组份至100％

洗涤剂实施例III

按如下所示制备在洗涤彩色织物中特别有用的本发明粒状织物清洗组合物：

LAS 10.7 -

TAS 2.4 -

TFAA - 4.0

45AS 3.1 10.0

45E7 4.0 -

25E3S - 3.0

68E11 1.8 -

25E5 - 8.0

柠檬酸盐 15.0 7.0

碳酸盐 - 10

柠檬酸 2.5 3.0

沸石A 32.1 25.0

NaSKS-6 - 9.0

MA/AA 5.0 5.0

DETPMP 0.2 0.8

本发明的酶 0.10 0.05

硅酸盐 2.5 -

硫酸盐 5.2 3.0

PVP 0.5 -

聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物 - 0.2

/乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷

酮的共聚物

过硼酸盐 1.0 -

苯酚磺酸盐 0.2 -

水/次要组份至 100％

洗涤剂实施例IV

可按如下所示制备本发明的提供具有“通过洗涤进行软化”的能力的粒状织物清洗组合物：

45AS - 10.0

LAS 7.6 -

68AS 1.3 -

45E7 4.0 -

25E3 - 5.0

氯化椰油烷基二甲基羟乙基铵 1.4 1.0

柠檬酸盐 5.0 3.0

NaSKS-6 - 11.0

沸石A 15.0 15.0

MA/AA 4.0 4.0

DETPMP 0.4 0.4

过硼酸盐 15.0 -

过碳酸盐 - 15.0

TAED 5.0 5.0

绿土粘土 10.0 10.0

HMWPEO - 0.1

本发明的酶 0.10 0.05

硅酸盐 3.0 5.0

碳酸盐 10.0 10.0

粒状抑泡剂 1.0 4.0

CMC 0.2 0.1

水/次要组份至 100％

洗涤剂实施例V

可按如下制备本发明的重垢液体织物清洗组合物：

I II

酸形式的LAS - 25.0

柠檬酸 5.0 2.0

酸形式的25AS 8.0 -

酸形式的25AE2S 3.0 -

25AE7 8.0 -

CFAA 5 -

DETPMP 1.0 1.0

脂肪酸 8 -

油酸 - 1.0

乙醇 4.0 6.0

丙二醇 2.0 6.0

本发明的酶 0.10 0.05

氯化椰油烷基二甲基羟乙基铵 - 3.0

绿土粘土 - 5.0

PVP 2.0 -

水/次要组份至 100％

在纺织业和纤维素纤维加工业中的用途

本文中，术语“纤维素材料”意指由棉花、棉混纺纱或者天然或人工纤维素(如来源于含木聚糖之纤维素纤维，如来自木浆)或其混合物制成的纤维、已缝制或未缝制的织物，包括针织物、机织物、粗斜纹布、纱线和毛巾布。混合物的例子是棉或人造丝/粘胶丝与一种或多种配对材料的混合物，所述配对材料例如是羊毛，合成纤维(如聚酰胺纤维，丙烯酸纤维，聚酯纤维，聚乙烯醇纤维，聚氯乙烯纤维，聚偏二氯乙烯纤维，聚氨基甲酸乙酯纤维，聚脲纤维，芳族聚酰胺纤维)，和含纤维素的纤维(如人造丝/粘胶丝，苎麻，***，亚麻/亚麻布，黄麻，醋酸纤维素纤维，lyocell)。

本发明的制备可用于纤维素纤维加工业中，以预处理或浸解处理***、亚麻或亚麻布的纤维。

纺织工业中，将纤维素材料例如棉纤维处理成适于制衣的材料的方法包括几个步骤：将纤维纺成纱线，将纱线编织成机织织物或针织织物以及后续的准备、染色和整理操作。机织织物是通过在一系列经线之间编织纬线来构造的；纱线可以是两种不同的类型。针织织物是由一根连续长的纱线形成联锁线圈网而构造的。纤维素纤维也可以用于非机织织物。

准备工序使纺织品在染色操作中能够产生合适的反应。准备工序中的各小步骤包括脱浆(对于机织产品)、精练和漂白。工业上也采用精练/漂白合并的一步加工法。尽管准备工序通常是在织物水平进行的；然而，也可以在纤维或纱线阶段进行精练、漂白和染色操作。

对于平幅或绳状的形式，处理过程可以通过处理液流间歇或连续地同织物接触。连续操作通常使用饱和器，在这里，以每份重量的织物大约等量的化学品，将化学品施加到织物上，接着是在其中将发生化学反应的加热了的停留室。然后洗涤区为织物在下面的处理步骤做准备。间歇操作通常在一个处理浴中进行，在这里织物与大约相当于其重量8-15倍的化学品浴进行接触。经过一段时间的反应后，排出化学品，水洗织物并施加下一种化学品。不连续的浸轧-堆放回苏工序包括一个饱和器，在此处，以每份重量的织物大约等重量的化学品浴，对织物进行处理，接着停留一段时间，其中对于冷浸轧-堆放回苏工序，该停留时间可以进行一天或多天。

机织产品是纺织织物结构的主要形式。机织过程需要对经线“上浆”以使其免受摩擦。由于可得性和价钱，淀粉、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素、蜡和丙烯酸系粘合剂是使用的上浆化学物的典型实例。浆料必须在机织过程之后作为制备机织产品的第一步除掉。将上了浆的绳状或平幅形式的织物同含有退浆剂的处理液体接触。使用的退浆剂取决于要除掉的浆料的类型。对于PVA浆料，常常采用热水或者氧化型处理方法。对棉织物最通用的上浆剂是基于淀粉的上浆剂。因此最经常的是，机织棉织物通过热水、水解淀粉的α-淀粉酶和湿润剂或表面活性剂的混合物退浆。使纤维素材料在退浆化学品中保持足够长的“持续阶段”以完成退浆。持续阶段取决于处理方案的类型和温度，可以在15分钟到2小时，或者有时候可达数0日。通常，在饱和器浴中使用退浆化学物，该饱和器浴通常大约15℃到55℃。然后将织物放置在例如能提供足够热量、通常为大约55℃到100℃的J型箱之类设备中，以提高退浆剂的活性。在持续阶段结束后，将化学品、包括除下来的浆料从织物上洗掉。

为了确保有高白度或良好的可湿性以及染色性，浆料和使用的其他化学物必须完全去掉。通常认为，有效的退浆对于下面的准备工序-精练和漂白是至关重要的。

精练工序将棉中天然存在的大量非纤维素化合物去掉。除了天然的非纤维素杂质之外，精练可以去掉污垢、污渍以及制备过程中的残留物，例如纺丝、络筒或浆纱润滑剂。精练工序使用氢氧化钠或相关的苛性剂，例如碳酸钠、氢氧化钾或它们的混合物。通常，该工序中加入一种碱性稳定的表面活性剂，以提高疏水性化合物的溶解性，和/或防止它们再沉积到织物上。该工序通常在80-100℃的高温下，使用精练剂的强碱性溶液例如pH13-14。由于化学品处理的非特异性性能，化学品不但处理杂质而且处理纤维素自身，导致织物强度或其他理想织物性能受到损害。纤维素织物的柔软性是残留的天然棉蜡的函数。高温强碱性精练方法的非特异性性能不能区别所需的天然棉润滑剂和制备中加入的润滑剂。并且，由于来自于这些方法的高碱性废水，常规的精练方法会产生环境问题。精练阶段为织物在漂白中能达到最佳响应做准备。不恰当地精练的织物将在后续的漂白阶段中需要更高水平的漂白化学品。

漂白工序将天然棉色素脱色，并且去掉在轧花、梳棉或精练中没有完全去掉的任何残留天然木质棉杂质组分。目前使用的主要方法是碱性过氧化氢漂白。许多情况下，尤其是不需要非常高的白度时，可以将漂白与精练结合起来。

预计可以将本发明的木糖葡聚糖酶或者木糖葡聚糖酶制剂与其它一些酶活性结合起来，在大约50-80℃温度下，大约pH7-11的环境中，进行精练处理步骤，这样可代替或者补充高苛性剂的作用。材料和方法：

菌株：

分别含编码木糖葡聚糖酶之本发明DNA序列的地衣芽孢杆菌ATCC14580和Bacillus agardhaerens，NCIMB 40482。

其它菌株：

大肠杆菌菌株：制备E.coli SJ2细胞(Diderichsen等，1990)按产品说明书用BIO-RAD的Gene Pulser^TM电穿孔仪通过电穿孔法转化。

枯草芽孢杆菌PL 1885。(Diderichsen等，(1990))。

枯草芽孢杆菌PL 2306。该菌株是带断裂apr和npr基因的枯草芽孢杆菌DN 1885，(Diderichsen等，(1990))这种断裂发生于已知枯草芽孢杆菌纤维素酶基因的转录单位内，产生了纤维素酶阴性细胞。

枯草芽孢杆菌PL 2316。该菌株是带断裂apr和npr基因的枯草芽孢杆菌DN 1885(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990)编码来自短芽孢杆菌的外切酶--α-乙酰乳酸脱酸酶的aldB的克隆。细菌学杂志，172，4315-4321)，该断裂发生于已知枯草芽孢杆菌木聚糖酶基因的转录单元内，产生了木聚糖酶阴性细胞。基本上如A.L.Sonenshein等人(1993)所述进行这种基因破坏。

按Yasbin等人(1975)所述方法制备和转化感受态细胞。

质粒

pSJ1678(参阅WO 94/19454)。

pMOL 944。该质粒是pUB110的衍生物，基本上包含使该质粒能在枯草芽孢杆菌内增殖的元件、卡那霉素抗性基因，并有克隆自地衣芽孢杆菌ATCC 14580的amyL基因的强启动子和信号肽。该信号肽包含一个SacII位点，使其便于克隆与信号肽融合的蛋白质成熟部分的编码DNA。这就导致前蛋白质的表达，该蛋白质被导向细胞外部。

该质粒用普通基因工程方法构建而成，简述如下。

pMOL944的构建：

用单切点酶NciI消化pUB110质粒(Mckenzie，T.等人，1986)。将扩增自质粒pDN1981(Jorgensen等人，1990)上之amyL启动子的PCR片段用Nci I消化，并***Nci I消化的pUB110中，产生了质粒pSJ2624。

所用的两个PCR引物具以下序列：

#LWN5494 5′-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC -3′

#LWN5495 5′-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAA

TGAGGCAGCAAGAAGAT -3′

引物#LMN5494向质粒中***了一个Not I位点。

质粒pSJ2624随后用Sac I和Not I消化，且用Sac I和Not I消化扩增自pDN1981上的amyL启动子的新PCR片段，将该DNA片段***Sac I-Not I消化的pSJ2624，从而产生质粒pSJ2670。

该克隆步骤导致用方向相反的同一启动子替换了原amyL启动子。用于PCR扩增的两个引物具以下序列：

#LWN5938 5′-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATG

AGGCAGCAAGAAGAT -3′

#LWN5939 5′-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC -3′

质粒pSJ2670用限制酶Pst I和Bcl I消化，将扩增自编码碱性淀粉酶SP722(国际专利申请公布号WO 95/26397，在此引用作为参考)的克隆DNA序列的PCR片段用Pst I和Bcl I消化后***消化后的pSJ2670中，产生了质粒pMOL944。用于PCR扩增的引物具以下序列：

#LWN7864 5′-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3′

#LWN7901 5′-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3′

引物#LMN7901向质粒中***了一个SacII位点。

培养基：

TY(如Ausubel，F.M.等人，1995中所述)。

LB琼脂(如Ausubel，F.M.等人，1995中所述)。

LBPG是补充有0.5％葡萄糖和0.05M磷酸钾，pH7.0的LB琼脂。

将AZCL-木糖葡聚糖加入LBPG-琼脂至终浓度0.5％。AZCL-木糖葡聚糖来自Megazyme，澳大利亚。

BPX培养基描述于EP 0 506 780(WO 91/09129)中。

培养基A：每瓶含有：30g麸皮，45ml的以下溶液：10grofec(Roquette 101-0441)、10g硝酸铵(Merck1187)、10g磷酸二氢钾(Merck 4873)、40g Solcafloc(Dicacel，可获得自Dicalite-Europe-Nord，9000 Gent，比利时)、0.75g七水硫酸镁(Merck 5886)、15g碳酸钙，加自来水至1000ml，pH调至6.5。121℃高压蒸汽灭菌40分钟。

培养基B：30g大豆粉、15g maltodex 01(Roquette101-7845)、5g蛋白胨(Difco 0118)、0.2ml pluronic(PE-6100，101-3068)，加去离子水至1000ml。每500ml带2挡板的锥形瓶中分装100ml。121℃高压蒸汽灭菌40分钟。

培养基C：15g麸皮、5g右旋糖、6.7g细菌用酵母含氮碱，加去离子水至1000ml。每500ml带两挡板的锥形瓶中分装100ml培养基。121℃高压蒸汽灭菌40分钟。

培养基D：20％蔗糖、5％大豆片和1％磷酸钠。

培养基E：5g酵母提取物、10g蛋白胨、3g硫酸铵、3g磷酸氢二钾、2g磷酸二氢钾、1gCMC、10g麦芽糖糊精、30g麸皮，加去离子水至1000ml，调pH至7.0。在每个500ml的带两挡板的锥形瓶中分装100ml培养基。121℃高压蒸汽灭菌40分钟。

发酵步骤：

在下述生长条件下培养真菌菌株于摇瓶中：

培养基：A、B或C(见培养基表)

温度：26℃

RPM：A，静止

B和C，125-200

温育时间：A，6-30天

B和C，2-21天

细菌在含培养基D或E的摇瓶中于30℃、250rpm培养3-4天。

木糖葡聚糖酶测定(XGU)：

用来自Megazyme，澳大利亚的AZCL木糖葡聚糖作底物检测木糖葡聚糖酶活性。

将含0.2％该蓝色底物的溶液通过搅拌悬浮于0.1M，pH7.5的磷酸盐缓冲液中。溶液在搅拌状态下分装至1.5ml微量离心管(每管0.75ml)，加入50μl酶溶液，并在Eppendorp Thermomixer 5436型中于40℃、1200rpm温育20分钟。温育后通过14,000rpm离心4分钟将有色溶液从固体中分离出来，并在600nm检测上清吸光度。

一个XGU单位被定义为在1cm比色杯中于600nm的吸光度为0.24的酶量。

等电聚焦：

等电聚焦是按制造商的说明书在pH3.5-9.5的预制安福灵PAG板(Pharmacia，Sweden)中进行的。样品使用双份，并在电泳后将胶分成两半。将水中含1％琼脂糖和0.4％AZCL木糖葡聚糖的上层灌到其中半块胶上，将含AZCL HE纤维素的相似上层灌到另半块胶上。30℃温育2-16小时。通过蓝色区鉴定酶活性。

普通分子生物学方法：

用分子生物学的标准方法完成DNA操作和转化(Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等人(编)，《分子生物学最新方法》。John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编)“用于芽孢杆菌的分子生物学方法”。John Wiley和Sons，1990)。

按供应商的说明书使用供DNA操作的酶。

以下实施例阐明了本发明。

实施例1

筛选产生碱性木糖葡聚糖酶的微生物

将要筛选的微生物培养于如材料和方法部分所述的液体培养基中。离心后检测培养物上清中木糖葡聚糖酶和纤维素酶活性。使用了如下检测法：含0.08M pH7或pH9的Britton-Robinson缓冲液中的1％琼脂糖的琼脂糖平板，其中还分别包含0.2％的AZCL木糖葡聚糖和0.2％的AZCLHE纤维素，将10ml样品加入琼脂糖平板上直径4mm的孔中，30℃保温2-16小时。通过蓝色晕圈的出现鉴定酶活性。

对AZCL木糖葡聚糖有良好活性而对AZCL HE纤维素无或低活性的培养液如材料和方法部分所述用等电聚焦(IEF)进一步检测。发现材料和方法部分所列的微生物产生一种对AZCL木糖葡聚糖有活性的酶，可通过等电聚焦将其与对AZCL HE纤维素有活性的成分分开。当筛选木糖葡聚糖酶活性时还发现有纤维素酶活性，则测定是否两种活性来自同一种酶。这一测定通过用按电荷或等电点分离蛋白质的IEF等电聚焦方法分离酶而完成。分离后用覆盖技术再次鉴定不同的酶活性。将样品放入两个平行的孔中：一个为木糖葡聚糖染色而另一个为AZCL HE纤维素染色。如果同一泳道具两种活性，则它是纤维素酶，如果只有一个泳道具木糖葡聚糖酶活性而无纤维素酶活性，则它是木糖葡聚糖酶，可通过纯化或克隆进一步鉴定。

实施例2

地衣芽孢杆菌木糖葡聚糖酶(XG)的生产

本实施例阐述了生产地衣芽孢杆菌木糖葡聚糖酶的方法。

用底物PS 1(20％蔗糖和5％大豆薄片和1％磷酸钠)在30℃将地衣芽孢杆菌ATCC 14580于摇瓶中以250rpm振荡培养4天。用氢氧化钠将培养液(共10升)调至pH7.5，然后在室温搅拌条件下用50ml阳离子絮凝剂处理，并随后加入470ml 0.1％阴离子絮凝剂处理。用Sorval RC3B通过10,000rpm离心30分钟分离絮凝材料。用F号Whatman玻璃滤器过滤上清液。共获得9升上清液，活性为10XGU/ml。

液体用截留分子量10KDa的膜在filtron上浓缩至1.5升。

可用交联于Sepharose上的杆菌肽通过亲和柱层析去除蛋白酶。然后用乙酸将未结合材料pH调至5.0，再上样到以20mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)调节的SP-Sepharose柱上。用0.5M氯化钠梯度将XG活性的部分从柱上洗脱下来。合并含XG活性的级分，并用截留分子量8KDa的GR 81 polysulfon膜在Amicon小槽上进行浓缩。

用0.1M pH6.0的乙酸钠缓冲液平衡的Superdex 200柱将含363XGU/ml的浓缩液进行大小层析。洗脱下表观分子量26KDa的纯XG1，它在SDS-PAGE胶上显示26KDa的单一条带。比活性测定为221XGU/A.280。

实施例3

地衣芽孢杆菌木糖葡聚糖酶的鉴定

在SDS-PAGE电泳和该26KDa蛋白质的电印迹之后获得如实施例2所产生之酶的氨基酸序列。氨基酸序列列于所附的SEQ ID NO：2中。

该氨基酸显示出与目前归为内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)的家族12糖基水解酶具最高度的同源性：与家族12的胡萝卜软腐欧文氏菌β-1，4-葡聚糖水解酶(celS-P16630 Swissprot)具65％同源性。

因此，本发明进一步涉及具有SEQ ID NO：2所列氨基酸序列或氨基酸序列与此至少70％同源、优选至少75％，同源更优选至少80％同源、更优选至少85％同源、还更优选至少90％同源，尤其是至少95％同源的酶。

用Megazyme AZCL木糖葡聚糖分析所得地衣芽孢杆菌木糖葡聚糖酶的木糖葡聚糖酶活性，用AZCL HE纤维素分析其内切葡聚糖酶活性。将同等量的纯化酶用于木糖葡聚糖底物上时蓝颜色的相对释放量是用于HE纤维素上时的40倍。在专利申请WO 94/14953所述的酸性棘孢曲霉木糖葡聚糖酶(EG II)中得到了同样的结果，该酶对HE纤维素也显示有2％的相对活性。

最适温度

来自Megazyme的AZCL木糖葡聚糖被用于测定最适温度。与实施例2的木糖葡聚糖酶在不同的温度温育20分钟后在600nm处测定蓝色释放量，从而测定不同温度下的活性。在60℃释放了颜色的主要部分，但在70℃仍可获得50％的相对活性。

pH活性分布图

为了得到实际pH活性分布图，用pKa值在实际pH的1.0范围之内的缓冲液进行活性测定。使用了以下缓冲液体系：pH4-5.5的乙酸钠，pH6的Mes缓冲液(Sigma)，pH6.5-7.5的Mops缓冲液(Sigma)，pH8-8.5的巴比妥盐，pH9-10.5的甘氨酸。

于平行处理的管中温育后检测pH值。40℃温育20分钟。最终底物浓度是1.33克木糖葡聚糖/升。这是K_M值(见下面pH7.5的稳态)。如稳态动力学所述测定还原性末端的形成，从而测定活性。

pH	％相对活性
pH	％相对活性	4.13	7
4.59	32	4.13	7
4.59	32	5.05	83
5.54	100	5.05	83
5.54	100	6.00	97
6.49	84	6.00	97
6.49	84	6.99	96
7.52	90	6.99	96
7.52	90	7.99	61
8.49	45	7.99	61
8.49	45	9.02	27
9.41	14	9.02	27
9.41	14	9.90	5

实施例4

比较实施例：对可溶性木糖葡聚糖和CMC的稳态动力学

已有对木糖葡聚糖的活性测定方法。

底物是来自罗望子树种子的木糖葡聚糖(淀粉状蛋白)(该底物可购自Megazyme)。缓冲液是pH7.5的0.1M磷酸钠。

底物制备成含量为5g/升缓冲液的母液。混合后用磁力搅拌器加热至获得清亮溶液。溶液随后冷却至40℃并保持于40℃的温控水浴中。

将0.5ml的稀释酶溶液预热10分钟并与1.0ml底物混合，再温育20分钟。

用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)，按照Lever(1972)的方法稍作改动(即除1.5gPHBAH之外，还用5g酒石酸钾钠)测定还原糖的形成。用葡萄糖作参照测定还原基团。

检测两种已知纤维素酶(内切-β-1，4-葡聚糖酶)对来自罗望子树种子的木糖葡聚糖的表观催化特性：

a.公开于WO 95/24471中的来自Humicola insolens的EG I(分类属于糖基水解酶家族7)。

b.公开于美国专利号5,475,101的来自木霉的EG III(分类属于糖基水解酶家族12)。

所有的酶均纯化至在SDS-PAGE上呈单一条带的高均一性，用摩尔消光系数计算酶浓度。对0.25-3.3g/l的不同浓度底物进行测定。按计算机软件Grafit和假定的Michelis Menten动力学进行动力学测定。

结果

本发明的酶：地衣芽孢杆菌木糖葡聚糖酶1分子量(MW)为26KDa。以摩尔吸收值78,000为基础，通过氨基酸分析测定，在pH7.5时对木糖葡聚糖的Kcat是16.5秒-1(标准误差0.6)，Km是1.1g/l(标准误差0.1)。用CMC做底物时不能检测出Kcat，但在3秒-1以下。最大木糖葡聚糖酶活性与对CMC最大活性的比率至少为5∶1。

a.对照EG I，来自Humicola insolens的碱性纤维素酶，分子量50KDa，摩尔消光系数66310。pH7.5时对木糖葡聚糖的Kcat为19秒^-1(标准误差0.7)，Km为0.7g/l(标准误差0.08)。对CMC的Kact为86秒^-1(标准误差5)。最大木糖葡聚糖酶活性与对CMC最大活性的比率为2∶9。

b.对照EGIII，来自木霉属的酸性纤维素酶，分子量24KDa，摩尔消光系数71930。pH7.5时对木糖葡聚糖的Kcat为16秒^-1(标准误差1.7)，Km为0.5g/l(标准误差0.15)。对CMC的Kcat是18秒^-1(标准误差0.6)。最大木糖葡聚糖酶活性与对CMC的最大活性的比率为8∶9。

实施例5

地衣芽孢杆菌木糖葡聚糖酶基因的克隆和表达

基因组DNA制备：

地衣芽孢杆菌菌株ATCC 14580在液体TY培养基中增殖。于300rpm，30℃温育16小时后，收获细胞，用Pitcher等人(1989)所述方法分离基因组DNA。

基因组文库构建：

用限制酶Sau3A部分消化基因组DNA，在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，按大小进行分级分离。通过在DEAE-纤维素纸上电泳分离大小2-10kb的片段(Dretzen等，(1981))。

将分离的DNA片段连接到BamHI消化的pSJ 1678质粒DNA上，用该连接混和物转化大肠杆菌SJ2。

阳性克隆的鉴定：

如上述方法构建于大肠杆菌中的DNA文库在含0.5％AZCL-木糖葡聚糖(Megazyme)和9μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上进行筛选，并于37℃温育过夜。表达水解活性的克隆显示蓝色扩散晕圈。将阳性克隆接种于含0.5％AZCL-木糖葡聚糖(Megazyme)的LB琼脂平板上。用Qiagen质粒旋转制备柱从1ml过夜培养液中分离该克隆的质粒(细胞37℃培养于含9μg/ml氯霉素的TY中，摇速250rpm)。通过所克隆的Sau3A DNA片段的DNA测序将这些克隆之一(PL2949)进行进一步鉴定。

使用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin-Elmer，USA)、荧光标记终止物和适当的寡核苷酸作为引物，通过DNA测序鉴定该DNA。

按Devereux等人(1980)所述方法完成序列数据的分析。编码成熟蛋白质的序列见SEQ ID NO：1所示(信号肽加上成熟部分；成熟部分相应于第88-783位。)。衍生蛋白质序列见SEQ ID NO：2所示，成熟蛋白质相应于SEQ ID NO：2的第30-261位。)

在枯草芽孢杆菌中亚克隆和表达地衣芽孢杆菌木糖葡聚糖酶基因：

本发明的木糖葡聚糖酶的DNA编码序列用以下两寡核苷酸组成的PCR引物对进行PCR扩增：

木糖葡聚糖酶上游.Pst I

5′-GCCTCATT CTGCAGCAGCGGCGGCTTCGTCATCAAACCCGTCGG-3′

木糖葡聚糖酶下游.Not I

5′-GCTGCATCGGCATC GCGGCCGCGGCAATACGTAAGGATGGTATCG -3′

限制酶切位点Pst I和Not I以下划线标出。

用按如上所述分离自地衣芽孢杆菌的染色体DNA在按制造说明书用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)进行的PCR反应中做模板。PCR反应在含各200μM dNTP、2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，USA)和各100pmol引物的PCR缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.3，50mM氯化钾、1.5mM氯化镁、0.01％(W/V)明胶)中进行。

用DNA热循环仪(Landgraf，德国)完成PCR反应。94℃温育1分钟后继以30个PCR循环，每个循环为94℃变性30秒、60℃退火1分钟、72℃延伸2分钟。扩增产物的5μl等分试样在0.7％的琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)上进行电泳分析。显示有约0.8kb的DNA片段存在，表明基因部分得到正确的扩增。

PCR片段的亚克隆：

按制造商说明书用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，USA)纯化上述产生的PCR产物之45μl等分试样。纯化的DNA洗脱于50μlpH8.5的10mM Tris-HCl中。用Pst I和Not I消化5μg pMOL944和25μl纯化的PCR片段，在0.8％的低熔点琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶上进行电泳，将相关片段从胶上切下，按制造商说明书用QIA快速凝胶抽提试剂盒(Qiagen，USA)进行纯化。随后将分离的PCR DNA片段连接到经Pst I-Not I消化并纯化的pMOL944上。用0.5μg每种DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液(BoehringerMannheim，德国)16℃过夜完成连接。

连接混合物被用于转化感受态枯草芽孢杆菌PL 2316。将转化细胞铺于含10μg/ml卡那霉素的LBPG琼脂平板上。37℃温育18小时后平板上可见菌落。通过从过夜培养液中分离质粒DNA分析几个克隆。

将一个这样的阳性克隆在如上所述的琼脂平板上再划线多次，该克隆被称为PL 2954。将克隆PL 2954在含10μg/ml卡那霉素的TY培养基中37℃培养过夜，第二天按制造商为枯草芽孢杆菌质粒制备推荐的方法，用Qiaprep Spin质粒小量制备试剂盒#27106从1ml细胞中分离质粒。将此DNA进行DNA测序，显示有相应于SEQ ID NO：1中第88-783位置所示木糖葡聚糖酶成熟部分的DNA序列。

地衣芽孢杆菌木糖葡聚糖酶的表达和纯化：

在500ml带两档板的锥形瓶里将PL 2954于含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培养基中37℃，300rpm培养5天。

实施例6

B.agaradhaerens木糖葡聚糖酶基因的克隆和表达

基因组DNA制备：

在WO 94/01532所述液体培养基中增殖B.agaradhaerens菌株NCIMB 40482。30℃，300rpm培养16小时后，收获细胞，用Pitcher等(1989)所述方法分离基因组DNA。

基因组文库构建：

用限制性酶Sau3A部分消化基因组DNA，并在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳进行大小分级分离。通过电泳到DEAE-纤维素膜上分离大小为2-7kb之间的片段[Dretzen，G.，Bellard，M.，Sassone-Corsi，P.(1981)，从琼脂糖和丙烯酰胺凝胶上回收DNA片段的可靠方法。分析生物化学，112，295-298]。

将分离的DNA片段连接于BamHI消化的pSJ1678质粒上，并用连接混合物转化大肠杆菌SJ2。

将细胞铺于含0.1％CMC(羧甲基纤维素钠，Aqualon，法国)和9μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，并于37℃保温过夜。

阳性克隆的鉴定：

在含0.1％CMC羧甲基纤维素钠，Aqualon，法国)和9μg/ml氯霉素并37℃保温过夜的LB琼脂平板上筛选上述构建于大肠杆菌中的DNA文库。随后将转化子影印到同类型平板上，并将这些新平板于37℃温育8小时或过夜。

用1mg/ml刚果红(SIGMA，美国)将原平板染色。用适度绕圈振荡持续染色半小时，之后用1M NaCl将平板洗2次，每次15分钟。

在纤维素酶阳性克隆处出现浅黄色晕圈，从复制平板上挑出这些纤维素酶阳性克隆，并再划线于含0.1％CMC和9μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，37℃保温过夜。

一个这样的克隆(MB110)通过克隆的Sau3A DNA片段的DNA测序进一步鉴定。

用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin-Elmer，美国)、荧光标记终止物和作为引物的适当寡核苷酸，通过引物步行法进行的DNA测序鉴定该DNA。

按Devereux等人(1984)所述完成序列数据的分析。以下实施例亚克隆的编码成熟蛋白质的序列见SEQ ID NO：1所示。衍生的蛋白质序列见SEQ ID NO：2所示。

枯草芽孢杆菌中木糖葡聚糖酶的亚克隆和表达：

用下面两寡核苷酸组成的PCR引物对将本发明木糖葡聚糖编码DNA序列进行PCR扩增：

木糖葡聚糖酶.上游.Sac II

5′-CAT TCT GCA G CC GCG GCA GAA GAT GTC ACT TCG TCA CAG -3′

木糖葡聚糖酶.下游.Not I

5′-GTT GAG AAA A GC GGC CGC CAC TTC TAA AGT TCT AAA GCA CG -3′

限制性酶切位点Sac II和Not I用下划线标出。

将上述分离自B.agaradherans的染色体DNA在按制造商说明书用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)进行的PCR反应中用作模板。该PCR反应在含各200μM dNTP、2.5U AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，美国)和各100pmol引物的PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁，0.01％(W/V)明胶)中进行。

用DNA热循环仪(Landgraf，德国)完成该PCR反应。94℃保温1分钟后继以30个PCR循环，每个循环包括94℃变性30秒、60℃退火1分钟、72℃延伸2分钟。在0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)上电泳分析扩增产物之5μl等分试样。大小1.6kb的DNA片段的存在表明该基因部分得到正确扩增。PCR片段的亚克隆：

按厂商说明书用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)纯化上述产生的PCR产物之45μl等分试样。将纯化的DNA洗脱于50μl 10mMTris-HCl中，pH8.5中。用Sac II和Not I消化5μg pMOL 944和25μl纯化PCR片段，在0.8％低熔点琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶中切下相关片段，按厂商说明书用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen，美国)进行纯化。然后将分离的PCR DNA片段连接于经Sac II-Not I消化和纯化的pMOL 944中。用各0.5μg的DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)16℃过夜完成连接。

用连接混合物转化感受态枯草芽孢杆菌PL 2306。将转化细胞铺于LBPG-10μg/ml卡那霉素-0.1％AZCL-木糖葡聚糖-琼脂平板上。37℃保温18小时后，阳性表达所克隆的木糖葡聚糖酶的细胞是由蓝色晕圈围绕的菌落。将一个这样的阳性克隆在上述琼脂平板上重划线多次，这个克隆被称为MB563。克隆MB 563在含10μg/ml卡那霉素的TY中37℃培养过夜，第二天按厂商推荐之枯草芽孢杆菌质粒制备方法用Qiaprep Spin质粒小量制备试剂盒#27106从1ml细胞中分离质粒。B.agaradhaerens木糖葡聚糖酶的表达和纯化：

在500ml带两档板的锥形瓶里将MB 563于含10μg/ml卡那霉素之25×200ml BPX培养基中37℃，300rpm培养5天。

实施例7

B.agaradhaerens木糖葡聚糖酶的鉴定：

纯化和鉴定：

收集7000ml带有如实施例6所述表达之克隆MB 563的芽孢杆菌摇瓶培养液。发酵培养基用NaOH调至pH7.5，并用阳离子絮凝剂C521(10％溶液)和0.1％阴离子剂A130溶液进行絮凝沉淀：在室温搅拌条件下往7000ml发酵培养基中同时加入168mlC521(10％)和335mlA130。用Sorval RC 3B 10000rpm离心30分钟分离絮凝物质。用F号Whatman玻璃滤膜澄清上清液。共获含227，500XGU单位的清亮溶液6500ml。

将2500ml清亮溶液加样于以pH7.0的50mM Tris缓冲液平衡的1000ml Q-Sepharose柱中。用氯化钠梯度洗脱结合的酶。

用带有截留值6KDa之膜的Amicon超滤器浓缩部分纯化产品。共获得70000XGU单位和2.5g酶蛋白质。

纯品在SDS-PAGE中给出表观分子量61KDa的单一带。用摩尔消光系数123,040计算酶蛋白质浓度，它是基于由DNA序列推断的氨基酸组成的。

浓缩部分与40％山梨糖醇一起配制，并用于洗涤剂和纺织品应用中的酶试验。

免疫学方法：

用获自克隆MB 563的高度纯化B.agaradhaerens XEGl产生抗血清。

用兔子在DAKO进行免疫接种步骤。用与100μl佐剂混合的100μl纤维素酶(0.4mg蛋白质/ml)免疫每只兔子。每只兔子免疫15次，每次间隔1星期。收集兔子血清并从血清中纯化γ-球蛋白。

最适温度：

也用来自Megazyme的AZCL木糖葡聚糖测定最适温度。与B.agaradhaerens XEGl在不同温度一起温育20分钟后检测它的活性，并在600nm处测定兰色的释放量。在50℃释放了颜色的主要部分，但在60℃仍有20％的相对活性。

对可溶性木糖葡聚糖和CMC的稳态动力学：

按实施例4所述对木糖葡聚糖的活性的测定方法进行本发明B.agaradhaerens木糖葡聚糖酶的测定。底物被稀释至至少8种不同的浓度，其中4种浓度在表观Km以下(见下文)。

已发现B.agaradhaerens XEGl(内切-β-1，4-木糖葡聚糖酶)对来自罗望子树种子的木糖葡聚糖具以下表观催化特性：pH7.5时Kcat为183秒-1，而表观Km为0.05g/l。为了比较它对CMC(取代程度0.7，聚合度为200)的活性，用同样的稳态动力学方法在Km之下的8种不同底物浓度(每个浓度做双份)中测定，得到以下数据：Kcat为64秒^{- 1}，Km为2.2g/l，表明与羧甲基纤维素比较，此酶优选作用于木糖葡聚糖。

在pH10用甘氨酸缓冲液和木糖葡聚糖底物的碱性活性为90秒^-1的Kcat和0.08g/l的表观km，这表明该木糖葡聚糖酶具有很高的碱性活性。

用蓝色Megazyme AZCL木糖葡聚糖所做的pH活性分布图显示该酶在pH5.0-10.5之间有超过50％的相对活性

在用蓝色Megazyme底物的洗涤剂基质中得到以下数据。在含美国Tide洗涤剂粉1g/l的9German硬度水中，以在pH7.5缓冲液中时活性为参照，该酶有66％相对活性。用欧洲的条件，将Ariel粉溶于18German硬度水中至5g/l时得到的相对活性为86％。这些数据显示B.agaradhaerens XEGl很好地适用于洗涤剂基质中。

文献

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W.S.York等(1996)，碳水化合物研究，285：99-128。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：

(A)姓名：Novo Nordisk A/S

(B)街道：Novo Alle

(C)城市：Bagsvaerd

(E)国家：丹麦

(F)邮政编码(ZIP)：DK-2880

(G)电话：45 4444 8888

(H)传真：45 4449 3256

(ii)发明题目：碱性木糖葡聚糖酶

(iii)序列数：4

(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容机

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30

(EPO)

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：786个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)最初来源：

(A)生物：地衣芽孢杆菌ATCC14580

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GTGAAAAACA ACCATTTGCT AAAATCCATT CTGCTATGGG GTGCCGTATG CATCATAGTG 60

CTGGCAGGGC CGCTCTCAGC ATTTGCCGCT TCGTCATCAA ACCCGTCGGA TAAATTGTAT 120

TTTAAAAACA AAAAATACTA CATATTCAAC AATGTATGGG GAGCCGACCA GGTCAGCGGC 180

TGGTGGCAGA CCATTTATCA TAATAGTGAT TCAGATATGG GCTGGGTGTG GAATTGGCCG 240

AGCAATACAA GCACGGTAAA AGCTTATCCG TCGATCGTCA GCGGCTGGCA TTGGACTGAA 300

GGCTATACTG CCGGAAGCGG CTTCCCGACG CGATTGTCAG ATCAAAAAAA CATCAACACG 360

AAAGTCAGCT ATTCGATCAG CGCAAACGGC ACATACAATG CCGCATATGA CATTTGGCTC 420

CACAATACAA ACAAGGCGAG CTGGGATTCG GCTCCAACCG ATGAGATTAT GATCTGGCTC 480

AATAACACAA ACGCCGGACC TGCCGGTTCC TATGTCGAAA CTGTATCGAT TGGCGGGCAC 540

AGTTGGAAAG TATATAAAGG CTATATTGAT GCTGGAGGCG GCAAAGGGTG GAACGTGTTT 600

TCATTTATCA GAACAGCAAA CACCCAAAGT GCGAACCTGA ATATTCGGGA TTTCACGAAT 660

TATCTTGCCG ACTCCAAACA GTGGCTTTCC AAAACAAAGT ATGTCAGCAG TGTGGAATTC 720

GGTACTGAAG TTTTCGGAGG CACAGGACAA ATTAATATTT CCAATTGGGA CGTAACGGTC 780

CGCTGA 786

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：261个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Val Lys Asn Asn His Leu Leu Lys Ser Ile Leu Leu Trp Gly Ala Val

1 5 10 15

Cys Ile Ile Val Leu Ala Gly Pro Leu Ser Ala Phe Ala Ala Ser Ser

20 25 30

Ser Asn Pro Ser Asp Lys Leu Tyr Phe Lys Asn Lys Lys Tyr Tyr Ile

35 40 45

Phe Asn Asn Val Trp Gly Ala Asp Gln Val Ser Gly Trp Trp Gln Thr

50 55 60

Ile Tyr His Asn Ser Asp Ser Asp Met Gly Trp Val Trp Asn Trp Pro

65 70 75 80

Ser Asn Thr Ser Thr Val Lys Ala Tyr pro Ser Ile Val Ser Gly Trp

85 90 95

His Trp Thr Glu Gly Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Phe Pro Thr Arg Leu

100 105 110

Ser Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Lys Val Ser Tyr Ser Ile Ser Ala

115 120 125

Asn Gly Thr Tyr Asn Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu His Asn Thr Asn

130 135 140

Lys Ala Ser Trp Asp Ser Ala Pro Thr Asp Glu Ile Met Ile Trp Leu

145 150 155 160

Asn Asn Thr Asn Ala Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Val Glu Thr Val Ser

165 170 175

Ile Gly Gly His Ser Trp Lys Val Tyr Lys Gly Tyr Ile Asp Ala Gly

180 185 190

Gly Gly Lys Gly Trp Asn Val Phe Ser Phe Ile Arg Thr Ala Asn Thr

195 200 205

Gln Ser Ala Asn Leu Asn Ile Arg Asp Phe Thr Asn Tyr Leu Ala Asp

210 215 220

Ser Lys Gln Trp Leu Ser Lys Thr Lys Tyr Val Ser Ser Val Glu Phe

225 230 235 240

Gly Thr Glu Val Phe Gly Gly Thr Gly Gln Ile Asn Ile Ser Asn Trp

245 250 255

Asp Val Thr Val Arg

260

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1614个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)最初来源：

(A)生物：Bacillus agardhaerens NCIMB 40482

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

GAAGATGTCA CTTCGTCACA GTTGGATATT CACTCCTATG TAGCTGACAT GCAGCCTGGC 60

TGGAATTTAG GAAATACGTT TGACGCTGTT GGAGATGATG AAACAGCGTG GGGGAATCCT 120

CGTGTAACAA GAGAGTTAAT AAAAACGATT GCTGATGAAG GGTATAAAAG CATTCGTATC 180

CCAGTGACAT GGCAAAATCA AATGGGTGGT TCTCCAGATT ATACGATAAA TGAAGATTAT 240

ATCAATCGGG TGGAGCAAGC GATAGATTGG GCGTTGGAGG AAGACTTATA TGTGATGTTA 300

AATGTGCATC ATGACTCATG GCTGTGGATG TATGATATGG AACATAACTA TGATGAGGTC 360

ATGGCAAGAT ATACAGCTAT TTGGGAACAA TTGTCGGAAA AATTCAAAAG CCACTCCCAT 420

AAGTTGATGT TTGAGAGTGT CAATGAGCCT AGGTTTACGC AGGAGTGGGG AGAGATTCAA 480

GAAAATCATC ATGCTTACTT AGAAGATTTA AATAAGACGT TCTATTATAT TGTCAGAGAG 540

TCAGGAGGCA ATAATGTGGA GCGCCCTTTA GTATTGCCTA CGATAGAAAC AGCCACGTCT 600

CAGGATTTAC TAGATCGCTT GTATCAAACA ATGGAAGACT TGGATGATCC TTATTTAATT 660

GCCACGGTGC ATTATTATGG CTTCTGGCCA TTTAGTGTCA ATATAGCAGG GTACACTCAT 720

TTTGAACAGG AAACACAACA AGATATTATA GACACCTTTG ACCGTGTTCA TAACACATTT 780

ACAGCGCGTG GTGTCCCAGT TGTATTAGGC GAATTCGGTT TGTTAGGCTT TGACAAAAGT 840

ACGGATGTGA TTCAGCAAGG GGAGAAATTA AAGTTTTTTG AGTTTCTCAT CCATCATCTC 900

AATGAACGTG ATATAACCCA TATGTTATGG GATAACGGCC AGCATTTTAA TCGAGAAACT 960

TATGCATGGT ATGATCAAGA ATTTCATGAC ATATTAAAAG CGAGTTGGGA GGGGCGTTCT 1020

GCTACAGCAG AGTCTAATTT GATTCATGTG AAGGACGGAA AGCCAATTAG AGATCAAGAT 1080

ATACAGCTTT ACTTAAACGG AAATGAGCTA ACAGCCTTAC AGGCAGGGGA GGAATCGCTT 1140

GTTCTAGGAG AGGATTATGA ACTAGCAGGA GGCGTATTAA CGCTAAAAGC GGACACCCTC 1200

ACAAGACTAA TTACCCCTGG TCAATTAGGA ACCAATGCAG TCATCACAGC ACAATTTAAT 1260

TCTGGAGCAG ACTGGCGTTT TCAATTACAG AATGTGGACG TGCCAACGGT CGAAAATACA 1320

GATGGCTCAA CATGGCATTT TGCGATCCCT ACCCATTTTA ATGGTGATAG TCTTGCGACG 1380

ATGGAAGCTG TTTATGCAAA CGGAGAATAT GCTGGGCCGC AAGATTGGAC GTCATTTAAA 1440

GAATTTGGCG AGGCGTTTTC TCCTAATTAC GCCACAGGGG AAATTATTAT ATCAGAAGCC 1500

TTCTTTAACG CGGTACGGGA TGATGATATC CATTTAACAT TTCATTTTTG GAGCGGAGAG 1560

ACGGTGGAAT ATACCTTACG TAAAAATGGC AATTATGTTC AAGGTAGACG GTAA 1614

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：537个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Glu Asp Val Thr Ser Ser Gln Leu Asp Ile His Ser Tyr Val Ala Asp

1 5 10 15

Met Gln Pro Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Phe Asp Ala Val Gly Asp

20 25 30

Asp Glu Thr Ala Trp Gly Asn Pro Arg Val Thr Arg GLu Leu Ile Lys

35 40 45

Thr Ile Ala Asp Glu Gly Tyr Lys Ser Ile Arg Ile Pro Val Thr Trp

50 55 60

Gln Asn Gln Met Gly Gly Ser Pro Asp Tyr Thr Ile Asn Glu Asp Tyr

65 70 75 80

Ile Asn Arg Val Glu Gln Ala Ile Asp Trp Ala Leu Glu Glu Asp Leu

85 90 95

Tyr Val Met Leu Asn Val His His Asp Ser Trp Leu Trp Met Tyr Asp

100 105 110

Met Glu His Asn Tyr Asp Glu Val Met Ala Arg Tyr Thr Ala Ile Trp

115 120 125

Glu Gln Leu Ser Glu Lys Phe Lys Ser His Ser His Lys Leu Met Phe

130 135 140

Glu Ser Val Asn Glu Pro Arg Phe Thr Gln Glu Trp Gly Glu Ile Gln

145 150 155 160

Glu Asn His His Ala Tyr Leu Glu Asp Leu Asn Lys Thr Phe Tyr Tyr

165 170 175

Ile Val Arg Glu Ser Gly Gly Asn Asr Val Glu Arg Pro Leu Val Leu

180 185 190

Pro Thr Ile Glu Thr Ala Thr Ser Gln Asp Leu Leu Asp Arg Leu Tyr

195 200 205

Gln Thr Met Glu Asp Leu Asp Asp Pro Tyr Leu Ile Ala Thr Val His

210 215 220

Tyr Tyr Gly Phe Trp Pro Phe Ser Val Asn Ile Ala Gly Tyr Thr His

225 230 235 240

Phe Glu Gln Glu Thr Gln Gln Asp Ile Ile Asp Thr Phe Asp Arg Val

245 250 255

His Asn Thr Phe Thr Ala Arg Gly Val Pro Val Val Leu Gly Glu Phe

260 265 270

Gly Leu Leu Gly Phe Asp Lys Ser Thr Asp Val Ile Gln Gln Gly Glu

275 280 285

Lys Leu Lys Phe Phe Glu Phe Leu Ile His His Leu Asn Glu Arg Asp

290 295 300

Ile Thr His Met Leu Trp Asp Asn Gly Gln His Phe Asn Arg Glu Thr

305 310 315 320

Tyr Ala Trp Tyr Asp Gln Glu Phe His Asp Ile Leu Lys Ala Ser Trp

325 330 335

Glu Gly Arg Ser Ala Thr Ala Glu Ser Asn Leu Ile His Val Lys Asp

340 345 350

Gly Lys Pro Ile Arg Asp Gln Asp Ile Gln Leu Tyr Leu Asn Gly Asn

355 360 365

Glu Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gly Glu Glu Ser Leu Val Leu Gly Glu

370 375 380

Asp Tyr Glu Leu Ala Gly Gly Val Leu Thr Leu Lys Ala Asp Thr Leu

385 390 395 400

Thr Arg Leu Ile Thr Pro Gly Gln Leu Gly Thr Asn Ala Val Ile Thr

405 410 415

Ala Gln Phe Asn Ser Gly Ala Asp Trp Arg Phe Gln Leu Gln Asn Val

420 425 430

Asp Val Pro Thr Val Glu Asn Thr Asp Gly Ser Thr Trp His Phe Ala

435 440 445

Ile Pro Thr His Phe Asn Gly Asp Ser Leu Ala Thr Met Glu Ala Val

450 455 460

Tyr Ala Asn Gly Glu Tyr Ala Gly Pro Gln Asp Trp Thr Ser Phe Lys

465 470 475 480

Glu Phe Gly Glu Ala Phe Ser Pro Asn Tyr Ala Thr Gly Glu Ile Ile

485 490 495

Ile Ser Glu Ala Phe Phe Asn Ala Val Arg Asp Asp Asp Ile His Leu

500 505 510

Thr Phe His Phe Trp Ser Gly Glu Thr Val Glu Tyr Thr Leu Arg Lys

515 520 525

Asn Gly Asn Tyr Val Gln Gly Arg Arg

530 535

Claims

1.一种分离的碱性木糖葡聚糖酶，其能裂解木糖葡聚糖骨架中β-1，4-糖苷键，其中所述碱性木糖葡聚糖酶选自

(a)由SEQ ID NO：2第30-261位氨基酸残基所示氨基酸序列组成的多肽分子；

(b)由SEQ ID NO：4第1-537位氨基酸残基所示氨基酸序列组成的多肽分子；和

(c)由与变性双链DNA探针在下述条件下可杂交的多核苷酸分子编码的多肽分子：将含要杂交之DNA片段或RNA的滤膜在5XSSC中预浸泡10分钟，在含5XSSC、5X Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性超声处理鲑精DNA的溶液中预杂交该膜，随后在含10ng/ml浓度的随机引发的32P-dCTP标记探针的同样溶液中于约45℃杂交12小时，然后在至少60℃的温度下用2XSSC、0.5％SDS洗涤滤膜两次，30分钟；所述DNA探针由编码a)或b)多肽分子的DNA序列组成。

2.权利要求1的木糖葡聚糖酶，其中pH7.5时测得的对来自罗望子树种子之木糖葡聚糖的Kcat与对羧甲基纤维素或微晶纤维素的Kcat的比率至少为2∶1。

3.按照权利要求2的木糖葡聚糖酶，其中所述比率至少为5∶1。

4.按照权利要求3的木糖葡聚糖酶，其中所述比率至少为10∶1。

5.按权利要求1的木糖葡聚糖酶，其对羧甲基纤维素或微晶纤维素无活性。

6.按照权利要求1的木糖葡聚糖酶，其由芽孢菌属的菌株产生。

7.按照权利要求6的木糖葡聚糖酶，它是由地衣芽孢杆菌或B.agaradhaerens产生的。

8.权利要求7的木糖葡聚糖酶，其由B.agradhaerens NCIMB 40482或地衣芽孢杆菌ATCC 14580产生。

9.按照权利要求1的木糖葡聚糖酶，它衍生自

a)通过一个或几个氨基酸的取代、删除或添加SEQ ID NO：4第1-537位残基所示氨基酸序列组成的多肽；或

b)通过一个或几个氨基酸的取代、删除、或添加SEQ ID NO：2第30-261位残基所示氨基酸序列组成的多肽。

10.按照权利要求1的木糖葡聚糖酶，它与针对纯化形式的所述多肽产生的多克隆抗体有免疫反应性。

11.按照权利要求1的木糖葡聚糖酶，它选自属于糖基水解酶家族5、7和12的木糖葡聚糖酶组。

12.一种分离的多核苷酸分子，其编码能裂解木糖葡聚糖骨架中β-1，4-糖苷键的碱性木糖葡聚糖酶，该多核苷酸分子选自下组：

(a)由SEQ ID NO：3第1-1611位核苷酸所示核苷酸序列组成的多核苷酸分子；

(b)由SEQ ID NO：1第88-783位核苷酸所示核苷酸序列组成的多核苷酸分子；

(c)(a)或(b)的简并性核苷酸序列；及

(d)与变性双链DNA探针在下述条件下可杂交的多核苷酸分子：将含要杂交之DNA片段或RNA的滤膜在5XSSC中预浸泡10分钟，在含5XSSC、5X Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性超声处理鲑精DNA的溶液中预杂交该膜，随后在含10ng/ml浓度的随机引发的32P-dCTP标记探针的同样溶液中于约45℃杂交12小时，然后在至少60℃的温度下用2XSSC、0.5％SDS洗涤滤膜两次，30分钟；所述DNA探针由SEQ ID NO：3第1-1611位所示序列或SEQ ID NO：1第88-783位所示序列组成。

13.按照权利要求12的分离的多核苷酸分子，其中该多核苷酸是DNA。

14.按照权利要求12的分离的多核苷酸分子，其中由所述核苷酸分子编码的碱性木糖葡聚糖酶显示在pH7.5时测得的对来自罗望子树种子的木糖葡聚糖的Kcat与对羧甲基纤维素或微晶纤维素的Kcat之比为至少2∶1。

15.按照权利要求12的分离的多核苷酸分子，其中由所述核苷酸分子编码的碱性木糖葡聚糖酶显示在pH7.5时测得的对来自罗望子树种子的木糖葡聚糖的Kcat与对羧甲基纤维素或微晶纤维素的Kcat之比为至少5∶1。

16.按照权利要求12的分离的多核苷酸分子，其中由所述核苷酸分子编码的碱性木糖葡聚糖酶显示在pH7.5时测得的对来自罗望子树种子的木糖葡聚糖的Kcat与对羧甲基纤维素或微晶纤维素的Kcat之比为至少10∶1。

17.一种含以下可操作连接在一起的元件的表达载体：

转录启动子；

选自下组的DNA区段：(a)编码在碱性条件下具木糖葡聚糖酶活性之多肽、并含SEQ ID NO：3第1-1611位核苷酸或SEQ ID NO：1第88-783位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子，

(b)与一种变性双链DNA探针在下述条件下可杂交上的多核苷酸分子：将含要杂交的DNA片段或RNA的滤膜在5XSSC中预浸泡10分钟，在含5XSSC、5X Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性超声处理鲑精DNA的溶液中预杂交该膜，随后在含10ng/ml浓度的随机引发的32P-dCTP标记探针的同样溶液中于约45℃杂交12小时；然后在至少60℃的温度下用2XSSC、0.5％SDS洗涤滤膜两次，30分钟；该DNA探针由SEQ ID NO：3第1-1611位或SEQ ID NO：1第88-783位所示序列组成，和

(c)(a)或(b)的简并性核苷酸序列；以及转录终止子。

18.导入了权利要求17的表达载体的培养细胞，其中所说细胞表达该DNA区段所编码的多肽。

19.在碱性条件下能裂解木糖葡聚糖骨架中β-1，4-糖苷键的多肽的制备方法，该方法包括培养导入了权利要求17的表达载体的细胞，所说的细胞由此表达该DNA区段所编码的多肽；及回收该多肽。

20.含有权利要求1的木糖葡聚糖酶多肽的酶制剂。

21.按照权利要求20的制剂，其中进一步包含一种或多种以下酶：蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸酯分解酶、木糖葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶分解酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶；或它们的混合物。

22.含权利要求20或21的酶制剂的洗涤剂组合物。

23.一种机器处理织物的方法，该方法包括在机器洗涤过程的洗涤循环中用含权利要求20或21之酶制剂处理织物。

24.权利要求20的酶制剂在纺织业中改善纤维素纤维、纱线、机织或非机织织物特性的用途。

25.按照权利要求24的用途，其中的酶制剂或木糖葡聚糖酶用于精炼工艺步骤中。

26.权利要求20之酶制剂在纤维素纤维加工业中浸解***、黄麻、亚麻或亚麻布等纤维的用途。