BR112019012771A2

BR112019012771A2 - polipeptídeo gh25 isolado, métodos para hidrolisar peptidoglicano em paredes celulares bacterianas, para aumentar a digestibilidade de peptidoglicanos em paredes ração animal, para produzir o polipeptídeo, para melhorar a saúde intestinal em um animal e para promover a eliminação de células de lactobacillus johnsonii mortas, aditivo de ração animal, ração animal, composição, polinucleotídeo, célula hospedeira recombinante, uso do polipeptídeo, e, aditivo zootécnico para uso em ração.

Info

Publication number: BR112019012771A2
Application number: BR112019012771A
Authority: BR
Inventors: Matthew Schnorr Kirk; Kobberoee Skov Lars; Thorup COHN Marianne; Klausen Mikkel; Li Ming; Bjarke Olsen Peter; Nymand-Grarup Soeren; Liu Ye
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2019-12-10
Also published as: AU2017380488A1; US11896034B2; AU2017380488A9; US10986850B2; US20210212343A1; US20190328005A1; CN110072996A; EP3559224A4; AU2017380488B2; EP3559224A1; AU2017380488A8; MX2019007233A; WO2018113743A1

Abstract

a presente invenção se refere a ração animal ou aditivos de ração animal que compreendem um ou mais polipeptídeos que têm atividade de lisozima. a invenção também se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima, polinucleotídeos que codificam os construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras dos polipeptídeos que compreendem os polinucleotídeos, assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Description

POLIPEPTÍDEO GH25 ISOLADO, MÉTODOS PARA HIDROLISAR PEPTIDOGLICANO EM PAREDES CELULARES BACTERIANAS, PARA AUMENTAR A DIGESTIBILIDADE DE PEPTIDOGLICANOS EM PAREDES RAÇÃO ANIMAL, PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, PARA MELHORAR A SAÚDE INTESTINAL EM UM ANIMAL E PARA PROMOVER A ELIMINAÇÃO DE CÉLULAS DE LACTOBACILLUS JOHNSONII MORTAS, ADITIVO DE RAÇÃO ANIMAL, RAÇÃO ANIMAL, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, USO DO POLIPEPTÍDEO, E, ADITIVO ZOOTÉCNICO PARA USO EM RAÇÃO

Referência a uma Listagem de Sequências [001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências na forma legível por computador, a qual está incorporada no presente documento a título de referência.

Campo da Invenção [002] A presente invenção se refere à ração animal ou aditivos de ração animal que compreendem um ou mais polipeptídeos que têm atividade de lisozima. A invenção também se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima, polinucleotídeos que codificam os construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras dos polipeptídeos que compreendem os polinucleotídeos, assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Antecedentes da Invenção [003] A lisozima é uma (9-glicosil hidrolase produzida como um mecanismo defensivo contra bactérias por muitos organismos. A enzima provoca a hidrólise de paredes celulares bacterianas por clivagem das ligações glicosídicas de peptidoglicano; uma molécula estrutural importante em bactérias. Após ter as suas paredes celulares enfraquecidas pela ação da lisozima, as células bacterianas lisam como um resultado de pressão osmótica desequilibrada.

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2/198 [004] A lisozima ocorre naturalmente em muitos organismos como vírus, plantas, insetos, pássaros, répteis e mamíferos. Nos mamíferos, a lisozima foi isolada de secreções nasais, saliva, lágrimas, conteúdo intestinal, urina e leite. A enzima cliva a ligação glicosídica entre o carbono número 1 do ácido A-acetilmurâmico e o carbono número 4 da A-acetil-D-glucosamina. In vivo, estes dois carboidratos estão polimerizados para formar o polissacarídeo da parede celular de muitos microrganismos.

[005] A lisozima foi classificada em cinco diferentes famílias de glicosídeo hidrolases (GH) (CAZy, www.cazy.org): lisozima da clara de ovo da galinha (GH22), lisozima da clara de ovo do ganso (GH23), lisozima do bacteriófago T4 (GH24), proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) e lisozimas de Chalaropsis (GH25). As lisozimas das famílias GH23 e GH24 são principalmente conhecidas de bacteriófagos e foram recentemente identificadas em fungos. Se descobriu que a família de lisozimas GH25 não está estruturalmente relacionada às outras famílias de lisozimas.

[006] A lisozima extraída de clara de ovo de galinha é o principal produto disponível no mercado comercial, mas não cliva o ácido N,6-Odiacetilmurâmico em, por exemplo, paredes celulares de Staphylococcus aureus e logo é incapaz de lisar este importante patógeno humano, entre outros (Masschalck B, Deckers D, Michiels CW (2002), Lytic and nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by lysozyme under atmospheric and high hydrostatic pressure, J Food Prot. 65(12):1.916 a 1.923).

[007] Os promotores do crescimento antimicrobiano (AGP) têm sido tradicionalmente usados para promoção do crescimento em animais e, provavelmente, funcionam impedindo infeções de baixo nível por patógenos, como Clostridium perfringens. No entanto, os AGP estão sendo cada vez mais proibidos em todo o mundo e, portanto, novas soluções para promover o crescimento dos animais, mas que não são AGP, são de interesse.

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3/198 [008] Os documentos n° WO2013/076253 e W02005/080559 divulgam lisozimas GH25 para uso em ração animal. Contudo, as referidas lisozimas não são altamente ativas na degradação da parede celular de Micrococcus lysodeikticus (um ensaio típico de atividade de lisozima) e seriam desejadas lisozimas mais ativas. O objeto da presente invenção é fornecer lisozimas novas e mais ativas que possam ser adequadas para a saúde animal.

Sumário da Invenção [009] A invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade da lisozima melhorada contra os peptidoglicanos encontrados nas paredes celulares de Micrococcus lysodeikticus. As lisozimas da invenção são todas lisozimas GH25 e todas têm capacidade melhorada para lisar as paredes celulares bacterianas de Micrococcus lysodeikticus, tomando-as, assim, adequadas para uso em ração animal para aperfeiçoar a saúde animal. As lisozimas da invenção têm uma atividade melhorada em comparação com a lisozima descrita no documento n° WO2013/076253 (que é aqui descrita como SEQ ID NO 39). Verificou-se, surpreendentemente, que um grande subconjunto de lisozimas GH25 tem, adicionalmente, atividade de lisozima contra Lactobacillus johnsonii. Lactobacillus johnsonii é uma importante bactéria da flora intestinal dos animais. Sem se ater a uma teoria particular, acredita-se que a remoção de células de Lactobacillus johnsonii mortas da flora intestinal, por meio de lises enzimáticas da parede celular bacteriana parcialmente degradada, seja um importante contribuinte para a saúde intestinal de um animal.

[0010] Um aspecto da invenção é dirigido a um polipeptídeo GH25 isolado que tem atividade de lisozima, selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

(b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade

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4/198

80% de identidade

80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6;

(c) um polipeptídeo que tem pelo menos de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9;

(d) um polipeptídeo que tem pelo menos de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12;

(e) um polipeptídeo que tem pelo menos de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 15;

(f) um polipeptídeo que tem pelo menos de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 18;

(g) um polipeptídeo que tem pelo menos de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 21;

(h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 24;

(i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 27;

(j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 30;

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 33;

(l) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: SEQ ID NO: 38;

(m) uma variante do polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 38, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 posições;

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5/198 (n) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal;

(o) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (p) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

[0011] Um aspecto adicional da invenção se refere a polipeptídeo GH25 isolado que tem atividade de lisozima selecionado do grupo que consiste em:

(b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6;

(c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9;

(d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12;

(f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 18;

(g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 21;

(1) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade de

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6/198 sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: SEQ ID NO: 38;

(n) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal;

(o) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (p) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

[0012] Uma forma de realização da invenção é dirigida aos polipeptídeos, conforme definido pela invenção, e que têm atividade de lisozima melhorada a) em comparação com a atividade de lisozima de lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL) ou b) em comparação com a atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39, conforme determinado pelo Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus.

[0013] Tipicamente, os polipeptídeos da invenção têm atividade de lisozima melhorada a) em comparação com a atividade de lisozima de lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL) e b) em comparação com a atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39, conforme determinado por qualquer

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7/198 um de i) Método para a Determinação da Atividade da Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus e ii) Método para a Determinação da Atividade da Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii.

[0014] Aspectos adicionais da invenção são dirigidos a um método para hidrolisar peptidoglicano em paredes celulares bacterianas que compreende tratar células bacterianas com um ou mais polipeptídeos GH25 da invenção e a um método para aumentar a digestibilidade de peptidoglicanos em ração animal com um ou mais polipeptídeos GH25 da invenção.

[0015] Um aspecto importante da invenção se refere a uma ração animal ou um aditivo de ração animal que compreende o polipeptídeo da invenção. De modo similar, a invenção é dirigida a um aditivo zootécnico para uso em ração para aves ou suíno, sendo que o referido aditivo compreende o polipeptídeo da invenção.

[0016] A invenção é adicionalmente dirigida a um método para melhorar a saúde intestinal em um animal que compreende reduzir a quantidade de células de Lactobacillus johnsonii mortas, ou detritos de parede celular das mesmas, no trato digestivo do referido animal, que compreende alimentar o animal com uma ração ou aditivo de ração. Em um aspecto separado, o polipeptídeo na ração ou aditivo de ração para reduzir a quantidade de células de Lactobacillus johnsonii mortas, ou detritos de parede celular das mesmas, no trato digestivo do referido animal, que compreende alimentar o animal com uma ração ou aditivo de ração que compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO 39.

[0017] A invenção pode ser adicionalmente definida como sendo

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8/198 dirigida a um método para promove a eliminação de células Lactobacillus johnsonii mortas, ou detritos de parede celular das mesmas, do trato digestivo de um animal que compreende alimentar o referido animal com uma fonte de um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO 39.

[0018] A invenção também se refere a um grânulo que compreende um ou mais polipeptídeos GH25 como descrito acima. A invenção se refere adicionalmente a um polipeptídeo isolado que tem atividade de lisozima como descrito nas reivindicações.

[0019] A invenção se refere adicionalmente a composições que compreendem o polipeptídeo da invenção, como aditivos de ração animal ou ração animal; uso do polipeptídeo da invenção em ração animal, em aditivos de ração animal, na preparação de uma composição para uso em ração animal, para melhorar um ou mais parâmetros de desempenho em um animal; e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos da invenção, células hospedeiras recombinantes e método para produzir o polipeptídeo da invenção.

Visão Geral da Listagem de Sequências [0020] SEQ ID NO: 1 é a sequência de DNA genômica de uma lisozima GH25 conforme isolado de Myceliophthorafergusii.

[0021] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 1.

[0022] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Myceliophthorafergusii.

[0023] SEQ ID NO: 4 é a sequência de cDNA de uma lisozima GH25 conforme isolado de Penicillium sp. 'qii'.

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9/198 [0024] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 4.

[0025] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Penicillium sp. 'qii'.

[0026] SEQ ID NO: 7 é a sequência de cDNA de uma lisozima GH25 conforme isolado de Paecilomyces sp. XZ2658.

[0027] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 7.

[0028] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Paecilomyces sp. XZ2658.

[0029] SEQ ID NO: 10 é a sequência de cDNA de uma lisozima GH25 conforme isolado de Paecilomyces sp. XZ2658.

[0030] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 10.

[0031] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Paecilomyces sp. XZ2658.

[0032] SEQ ID NO: 13 é a sequência de cDNA de uma lisozima GH25 conforme isolado de Mortierella alpina.

[0033] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 13.

[0034] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Mortierella alpina.

[0035] SEQ ID NO: 16 é a sequência de cDNA de uma lisozima GH25 conforme isolado de Purpureocillium lilacinum.

[0036] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 16.

[0037] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Purpureocillium lilacinum.

[0038] SEQ ID NO: 19 é a sequência de cDNA de uma lisozima

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GH25 conforme isolado de Onygena equina.

[0039] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 19.

[0040] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Onygena equina.

[0041] SEQ ID NO: 22 é a sequência de DNA genômico de uma lisozima GH25 conforme isolado de Lecanicillium sp. WMM742.

[0042] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 22.

[0043] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Lecanicillium sp. WMM742.

[0044] SEQ ID NO: 25 é a sequência de cDNA de uma lisozima GH25 conforme isolado de Penicillium atrovenetum.

[0045] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 25.

[0046] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Penicillium atrovenetum.

[0047] SEQ ID NO: 28 é a sequência de cDNA de uma lisozima GH25 conforme isolado de Malbranchea fiava.

[0048] SEQ ID NO: 29 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 28.

[0049] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Malbranchea fiava.

[0050] SEQ ID NO: 31 é a sequência de cDNA de uma lisozima GH25 conforme isolado de Engyodontium album.

[0051] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos conforme deduzido a partir da SEQ ID NO: 31.

[0052] SEQ ID NO: 33 é a sequência de aminoácidos da lisozima GH25 madura de Engyodontium album.

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[0053]

SEQ ID NO: 34 é a sequência de cDNA de uma lisozima

GH25 conforme isolado de Flammulina velutipes.

[0054]

SEQ ID NO: 35 é a sequência de aminoácidos conforme

deduzido a partir da SEQ ID NO: 34.

[0055]

SEQ ID NO: 36 é o DNA optimizado por códons da lisozima

GH25 conforme isolado de Flammulina velutipes.

[0056]

SEQ ID NO: 37 é a sequência de aminoácidos conforme

deduzido a partir da SEQ ID NO: 36.

[0057]

SEQ ID NO: 38 é a sequência de aminoácidos da lisozima

GH25 madura de Flammulina velutipes.

[0058]

SEQ ID NO: 39 é a sequência de aminoácidos madura de uma

lisozima GH25 do tipo selvagem de Acremonium alcalophilum conforme descrito no documento n° WO 2013/076253.

[0059]

SEQ ID NO: 40 é o motivo conservado

F[I/L/V] [A/S/K] [H/N/S]GGGW.

[0060]	SEQ ID NO: 41 é o motivo conservado DGXTLPG.
[0061]	SEQ ID NO: 42 é o motivo conservado WWX[Q/T]CTG.
[0062]	SEQ ID NO: 43 é o motivo conservado

F[I/L/V] [A/S] [H/N/S]GGGWS.

[0063]	SEQ ID NO: 44 é o iniciador direto WIN1054-F.
[0064]	SEQ ID NO: 45 é o iniciador reverso WIN1054-R.
[0065]	SEQ ID NO: 46 é o iniciador direto WIN1057-F.
[0066]	SEQ ID NO: 47 é o iniciador reverso WIN1057-R.
[0067]	SEQ ID NO: 48 é o iniciador direto WIN1058-F.
[0068]	SEQ ID NO: 49 é o iniciador reverso WIN1058-R.
[0069]	SEQ ID NO: 50 é o iniciador direto WIN1068-F.
[0070]	SEQ ID NO: 51 é o iniciador reverso WIN1068-R.
[0071]	SEQ ID NO: 52 é o iniciador direto C8VRQ-F.
[0072]	SEQ ID NO: 53 é o iniciador reverso C8VRQ-R.

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12/198 [0073] SEQ ID NO: 54 é o iniciador direto C8VRJ-F.

[0074] SEQ ID NO: 55 é o iniciador reverso C8VRJ-R.

[0075] SEQ ID NO: 56 é o iniciador direto C8VRZ-F.

[0076] SEQ ID NO: 57 é o iniciador reverso C8VRZ-R.

[0077] SEQ ID NO: 58 é o iniciador direto C8VRT-F.

[0078] SEQ ID NO: 59 é o iniciador reverso C8VRT-R.

[0079] SEQ ID NO: 60 é o iniciador direto C8VS8-F.

[0080] SEQ ID NO: 61 é o iniciador reverso C8VS8-R.

Breve Descrição da Figura [0081] A Figura 1 ilustra os resultados do Exemplo 17: Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii. A Figura mostra atividade de lisozima (OD405) em direção a peptidoglicano extraído de paredes celulares de L. johnsonii. A atividade de quatro concentrações diferentes para cada lisozima (0,63; 1,25, 2,5 e 5,0 pg/ml) é ilustrada na plotagem de barras. Cada medição de OD representa a diferença depois que a leitura original (de fundo) foi subtraída e representa a média de duas medições de OD.

Descrição Detalhada da Invenção [0082] O termo animal se refere a qualquer animal exceto seres humanos. Os exemplos de animais são animais monogástricos incluindo, porém sem limitação, porcos ou suínos (incluindo, porém, sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas); aves domésticas tais como perus, patos, codomas, galinha-de-angola, gansos, pombos (incluindo filhotes de pombo) e frangos (incluindo, porém, sem limitação, frangos para corte (referidos no presente documento como frangos de corte), pintos, galinhas poedeiras (referidas no presente documento como poedeiras); cavalos (incluindo, porém, sem limitação, sangue quente, sangue frio e sangue morno), crustáceos (incluindo, porém, sem limitação, camarões e pitus) e peixes (incluindo mas não se limitando a charuteiro, pirarucu, barbo, robalo,

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13/198 anchova, bocachico, goraz, peixe-gato, cachama, carpa, peixe-lobo, catla, chanos, savelino, ciclídeo, fogueteiro-galego, bacalhau, perca, dourada, calafate, enguia, caboz, peixe-dourado, gurami, garoupa, guapote, alabote, jamelão, labeo, lai, verdemã, cavalinha, peixe-leite, sargo, peixe-lama, tainha, pacu, pearlspot, peixe-rei, robalo, lúcio, pâmpano, ruivaca, salmão, sampa, picão, robalo-legitimo, panga, shiner, amoré, cabeça-de-cobra, lutjanídeo, falso robalo, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, peixe-doce, tenca, terror, tilápia, truta, atum, areeiro, corégono-branco, picão-verde e peixe-magro).

[0083] O termo ração animal se refere a qualquer composto, preparação ou mistura adequada para ou destinada à ingestão por um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende tipicamente concentrados, bem como vitaminas, minerais, enzimas, alimento direto microbiano, aminoácidos e/ou outros ingredientes da ração (como em uma pré-mistura), enquanto que a ração animal para os ruminantes compreende, em geral, forragem (incluindo alimento grosseiro e silagem) e pode ainda compreender concentrados, assim como vitaminas, minerais, enzimas de alimento direto microbiano, aminoácido e/ou outros ingredientes da ração (como em uma pré-mistura).

[0084] O termo atividade antimicrobiana é definida aqui como uma atividade que extermina ou inibe o crescimento de micro-organismos, como algas, archaea, bactérias, fungos e/ou protozoários. A atividade antimicrobiana pode ser, por exemplo, bactericida significando o extermínio de bactérias ou bacteriostática significando a prevenção do crescimento bacteriano. A atividade antimicrobiana pode incluir catálise da hidrólise de ligações 1,4-beta entre o ácido A-acetilmurâmico e resíduos de A-acetil-Dglucosamina em uma peptidoglicano e entre resíduos de A-acetil-Dglucosamina em quitodextrinas. A atividade antimicrobiana pode também incluir a ligação de lisozima à superfície do micro-organismo e inibição do seu crescimento. O efeito antimicrobiano pode também incluir o uso dos

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14/198 lisozimas da presente invenção para ativação de autolisinas bacterianas, como um imunoestimulante, por inibição ou redução de toxinas bacterianas e por um efeito de opsoninas.

[0085] O termo “ganho de peso” significa um aumento no peso vivo de um animal durante um determinado periodo de tempo, por exemplo, o aumento no peso do dia 1 ao dia 21.

[0086] O termo “cDNA” designa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, encadeada, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor do mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo encadeamento, antes de aparecer como mRNA encadeado maduro.

[0087] O termo sequência de codificação designa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. Os limites da sequência de codificação são geralmente determinados por um quadro de leitura aberto, que começa com um códon de iniciação, como ATG, GTG ou TTG, e termina com um códon de terminação, como TAA, TAG ou TGA. A sequência de codificação pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma combinação dos mesmos.

[0088] O termo concentrados significa ração com altas concentrações de proteína e energia, como farinha de peixe, melaço, oligossacarídeos, sorgo, sementes e grãos (completa ou preparada triturandose, moendo-se, etc. a partir de, por exemplo, milho, aveia, centeio, cevada, trigo), bagaço oleaginoso (por exemplo, a partir de semente de algodão, cártamo, girassol, soja (como farinha de soja), colza/canola, amendoim ou amêndoa), bagaço de palmiste, material derivado de levedura e grãos de destilação (como grãos de destilação úmidos (WDS) e grãos de destilação secos com solúveis (DDGS)).

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15/198 [0089] O termo “sequências de controle” designa sequências de ácidos nucleicos necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (isto é, do mesmo gene) ou estranha (isto é, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas sem limitação, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo-sinal e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação transcricionais e translacionais. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos, facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[0090] O “Fator de Eficácia de Produção Européia” é uma maneira de comparar o desempenho de animais. Essa figura única facilita a comparação de desempenho dentro e entre fazendas e pode ser usada para avaliar variáveis ambientais, climáticas e de gestão. O EPEF é calculado como [(habitabilidade (%) x peso vivo (kg)) / (idade em redução (dias) x FCR)] x 100, em que habitabilidade é a porcentagem de animais vivos em abate, peso vivo é o peso médio dos animais em abate, idade de redução é a idade dos animais em abate e FCR é a razão de conversão de ração em abate.

[0091] O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo, incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e segregação.

[0092] O termo “vetor de expressão” designa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que fornecem a sua expressão.

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16/198 [0093] FCR é uma medida de uma eficiência do animal em converter massa de ração em aumentos do resultado desejado. Animais criados para fins de produção de carne - como suíno, ave doméstica e peixe - o resultado é a massa ganha pelo animal. Especificamente, a FCR é calculada como o consumo de ração dividido pelo ganho de peso, em um período especificado. O melhoramento em FCR significa a redução do valor de FCR. Um melhoramento de FCR de 2% significa que a FCR foi reduzida em 2%.

[0094] O termo eficácia de ração significa a quantidade de ganho de peso por unidade de ração quando o animal é alimentado ad-libitum ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo. Por “eficiência de ração aumentada” se entende que o uso de uma composição de aditivo de reação de acordo com a presente invenção na ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de ingestão de ração em comparação com um animal alimentado sem que a referida composição de aditivo de ração esteja presente.

[0095] O termo forragem conforme definido no presente documento inclui também alimento grosseiro. A forragem é material vegetal fresco como feno e silagem de plantas de forragem, grama e outras plantas de forragem, laminária, grãos germinados e vegetais, ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de plantas forrageiras são Alfalfa (luzema), comichão, brássica (por exemplo, couve, colza (canola), couve-nabo (nabo-da-suécia), nabo), trevo (por exemplo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco), grama (por exemplo, grama das Bermudas, bromo, grama de aveia falsa, galho, grama da charneca, gramas do prado, grama do pomar, azevém, grama Timothy), milho (mais), milheto, cevada, aveia, centeio, sorgo, soja e trigo e legumes tais como beterrabas. Forragem inclui adicionalmente resíduos de cultura da produção de grãos (como restolho de mais; palha de trigo, cevada, aveia, centeio e outros grãos); resíduos de legumes e hortaliças como folhas de beterraba; resíduos de produção de oleaginosas como caules e

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17/198 folhas de soja, colza e outros legumes; e frações da refinação de grãos para consumo animal ou humano ou da produção de combustível ou outras indústrias.

[0096] O termo fragmento designa um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos ausentes no terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo ou domínio maduro; em que o fragmento tem atividade de lisozima.

[0097] Em um aspecto, o fragmento compreende pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 2, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 3, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 5, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 6, pelo menos 183 aminoácidos da SEQ ID NO: 8, pelo menos 183 aminoácidos da SEQ ID NO: 9, pelo menos 182 aminoácidos da SEQ ID NO: 11, pelo menos 182 aminoácidos da SEQ ID NO: 12, pelo menos 183 aminoácidos da SEQ ID NO: 14, pelo menos 183 aminoácidos da SEQ ID NO: 15, pelo menos 187 aminoácidos da SEQ ID NO: 17, pelo menos 187 aminoácidos da SEQ ID NO: 18, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 20, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 21, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 23, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 24, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 26, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 27, pelo menos 195 aminoácidos da SEQ ID NO: 29, pelo menos 195 aminoácidos da SEQ ID NO: 30, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 32, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 33, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 35, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 37 ou pelo menos 186 aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[0098] Em outro aspecto, o fragmento compreende pelo menos 92% do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 190 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 3, pelo

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18/198 menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 5, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 6, pelo menos 187 aminoácidos da SEQ ID NO: 8, pelo menos 187 aminoácidos da SEQ ID NO: 9, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 11, pelo menos 186 aminoácidos da SEQ ID NO: 12, pelo menos 187 aminoácidos da SEQ ID NO: 14, pelo menos 187 aminoácidos da SEQ ID NO: 15, pelo menos 191 aminoácidos da SEQ ID NO: 17, pelo menos 191 aminoácidos da SEQ ID NO: 18, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 20, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 21, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 23, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 24, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 26, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 27, pelo menos 199 aminoácidos da SEQ ID NO: 29, pelo menos 199 aminoácidos da SEQ ID NO: 30, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 32, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 33, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 35, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 37 ou pelo menos 190 aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[0099] Em outro aspecto, o fragmento compreende pelo menos 94% do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 194 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 3, pelo menos 203 aminoácidos da SEQ ID NO: 5, pelo menos 203 aminoácidos da SEQ ID NO: 6, pelo menos 191 aminoácidos da SEQ ID NO: 8, pelo menos 191 aminoácidos da SEQ ID NO: 9, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 11, pelo menos 190 aminoácidos da SEQ ID NO: 12, pelo menos 191 aminoácidos da SEQ ID NO: 14, pelo menos 191 aminoácidos da SEQ ID NO: 15, pelo menos 195 aminoácidos da SEQ ID NO: 17, pelo menos 195 aminoácidos da SEQ ID NO: 18, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 20, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 21, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 23, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 24, pelo menos 203 aminoácidos da SEQ ID NO: 26, pelo menos 203

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19/198 aminoácidos da SEQ ID NO: 27, pelo menos 203 aminoácidos da SEQ ID NO: 29, pelo menos 203 aminoácidos da SEQ ID NO: 30, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 32, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 33, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 35, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 37 ou pelo menos 194 aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[00100] Em outro aspecto, o fragmento compreende pelo menos 96% do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 198 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 3, pelo menos 207 aminoácidos da SEQ ID NO: 5, pelo menos 207 aminoácidos da SEQ ID NO: 6, pelo menos 195 aminoácidos da SEQ ID NO: 8, pelo menos 195 aminoácidos da SEQ ID NO: 9, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 11, pelo menos 194 aminoácidos da SEQ ID NO: 12, pelo menos 195 aminoácidos da SEQ ID NO: 14, pelo menos 195 aminoácidos da SEQ ID NO: 15, pelo menos 199 aminoácidos da SEQ ID NO: 17, pelo menos 199 aminoácidos da SEQ ID NO: 18, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 20, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 21, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 23, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 24, pelo menos 207 aminoácidos da SEQ ID NO: 26, pelo menos 207 aminoácidos da SEQ ID NO: 27, pelo menos 208 aminoácidos da SEQ ID NO: 29, pelo menos 208 aminoácidos da SEQ ID NO: 30, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 32, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 33, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 35, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 37 ou pelo menos 198 aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[00101] Em outro aspecto, o fragmento compreende pelo menos 98% do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 202 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, pelo menos 202 aminoácidos da SEQ ID NO: 3, pelo menos 211 aminoácidos da SEQ ID NO: 5, pelo menos 211 aminoácidos da

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20/198

SEQ ID NO: 6, pelo menos 199 aminoácidos da SEQ ID NO: 8, pelo menos 199 aminoácidos da SEQ ID NO: 9, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 11, pelo menos 198 aminoácidos da SEQ ID NO: 12, pelo menos 199 aminoácidos da SEQ ID NO: 14, pelo menos 199 aminoácidos da SEQ ID NO: 15, pelo menos 203 aminoácidos da SEQ ID NO: 17, pelo menos 203 aminoácidos da SEQ ID NO: 18, pelo menos 202 aminoácidos da SEQ ID NO: 20, pelo menos 202 aminoácidos da SEQ ID NO: 21, pelo menos 202 aminoácidos da SEQ ID NO: 23, pelo menos 202 aminoácidos da SEQ ID NO: 24, pelo menos 211 aminoácidos da SEQ ID NO: 26, pelo menos 211 aminoácidos da SEQ ID NO: 27, pelo menos 212 aminoácidos da SEQ ID NO: 29, pelo menos 212 aminoácidos da SEQ ID NO: 30, pelo menos 202 aminoácidos da SEQ ID NO: 32, pelo menos 202 aminoácidos da SEQ ID NO: 33, pelo menos 202 aminoácidos da SEQ ID NO: 35, pelo menos 202 aminoácidos da SEQ ID NO: 37 ou pelo menos 202 aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[00102] Em outro aspecto, o fragmento compreende pelo menos 99% do comprimento do polipeptideo maduro, como pelo menos 204 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, pelo menos 204 aminoácidos da SEQ ID NO: 3, pelo menos 213 aminoácidos da SEQ ID NO: 5, pelo menos 213 aminoácidos da SEQ ID NO: 6, pelo menos 201 aminoácidos da SEQ ID NO: 8, pelo menos 201 aminoácidos da SEQ ID NO: 9, pelo menos 200 aminoácidos da SEQ ID NO: 11, pelo menos 200 aminoácidos da SEQ ID NO: 12, pelo menos 201 aminoácidos da SEQ ID NO: 14, pelo menos 201 aminoácidos da SEQ ID NO: 15, pelo menos 205 aminoácidos da SEQ ID NO: 17, pelo menos 205 aminoácidos da SEQ ID NO: 18, pelo menos 204 aminoácidos da SEQ ID NO: 20, pelo menos 204 aminoácidos da SEQ ID NO: 21, pelo menos 204 aminoácidos da SEQ ID NO: 23, pelo menos 204 aminoácidos da SEQ ID NO: 24, pelo menos 213 aminoácidos da SEQ ID NO: 26, pelo menos 213 aminoácidos da SEQ ID NO: 27, pelo menos 214 aminoácidos da SEQ ID

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21/198

NO: 29, pelo menos 214 aminoácidos da SEQ ID NO: 30, pelo menos 204 aminoácidos da SEQ ID NO: 32, pelo menos 204 aminoácidos da SEQ ID NO: 33, pelo menos 204 aminoácidos da SEQ ID NO: 35, pelo menos 204 aminoácidos da SEQ ID NO: 37 ou pelo menos 204 aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[00103] O termo “polipeptídeo de fusão” é um polipeptídeo no qual um polipeptídeo está fundido no N-terminal ou C-terminal do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo que codifica outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências de codificação que codificam os polipeptídeos de modo que fiquem em quadro e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do mesmo promotor (ou promotores) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2.575 a 2.583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776 a 779). Um polipeptídeo de fusão pode compreender, adicionalmente, um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Mediante secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem, porém sem limitação, os sítios divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568 a 576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245 a 251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3.488 a 3.493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498 a 503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378 a 381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505 a 512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982 a 987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240 a 248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35 a 48.

[00104] O termo célula hospedeira significa qualquer tipo de célula

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22/198 que é suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[00105] O termo polipeptídeo híbrido significa um polipeptídeo que compreende domínios de dois ou mais polipeptídeos, por exemplo, um domínio de ligação de um polipeptídeo e um domínio catalítico de outro polipeptídeo. Os domínios podem ser fundidos no N-terminal ou no Cterminal.

[00106] O termo isolado significa uma substância em uma forma que não ocorre na natureza ou em um ambiente no qual a substância não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui, mas sem limitação, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com os quais é associada em natureza; (3) qualquer substância modificada manualmente em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada aumentando-se a quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais é naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância).

[00107] O termo “atividade da lisozima” significa a hidrólise das ligações 1,4-beta entre o ácido /V-acetilmurâmico e resíduos de /V-acetil-Dglucosamina em um peptidoglicano ou entre resíduos de /V-acetil-Dglucosamina em quitodextrinas, resultando em bacteriólise. A lisozima pertence à classe de enzimas EC 3.2.1.17. A atividade de lisozima é

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 36/223 / 198 tipicamente medida por determinação turbidimétrica, como as alterações em turbidez de uma suspensão de Micrococcus luteus ATCC 4698 induzidas pela ação lítica da lisozima. Em condições experimentais apropriadas, essas alterações são proporcionais à quantidade de lisozima no meio (c.f. INS 1105 do Compêndio Combinado de Especificações de Aditivos Alimentares da Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (www.fao.org)). Para o propósito da presente invenção, a atividade de lisozima é determinada de acordo com o ensaio de turbidez descrito no exemplo 1 (Método para a Determinação da Atividade de Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus). O polipeptídeo tem atividade de lisozima se mostrar atividade contra Micrococcus luteus ATCC 4698, e especificamente as lisozimas da invenção exibem atividade melhorada em comparação com a lisozima da técnica anterior da SEQ ID NO: 39 em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00108] Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, os polipeptídeos da presente invenção têm atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente <0,02 ou com a máxima preferência <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett. Em uma forma de realização, os polipeptídeos da presente invenção têm atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a atividade é determinada mediante a medição da diminuição em densidade óptica de uma solução de células de Micrococcus lysodeikticus ressuspensas, de preferência, células de Micrococcus luteus ATCC 4698.

[00109] O teste de Dunnett é descrito em Dunnett C. W. (1955.) A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a

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24/198 control, Journal of the American Statistical Association, 50:1.096 a 1.121. Em resumo, o teste de Dunnett compara um conjunto de meios contra o meio de um grupo de controle. Os LSD que o mesmo produz são entre os LSD de t de Student e Tukey-Kramer, devido ao fato de que são dimensionados para abster-se de um número intermediário de comparações. O software comercial, como JMP (SAS Institute Inc, Cary, NC 27513), pode ser usado para calcular teste de Dunnett.

[00110] O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

[00111] Em um aspecto, o polipeptídeo maduro são os aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 2 e os aminoácidos -18 a -1 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 3.

[00112] Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 5 e aminoácidos -17 a -1 da SEQ ID NO: 5 são um peptídeosinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 216 de SEQ ID NO: 6.

[00113] Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 8 e aminoácidos -19 a -1 da SEQ ID NO: 8 são um peptídeosinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 204 de SEQ ID NO: 9.

[00114] Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 11 e aminoácidos -19 a -1 da SEQ ID NO: 11 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 203 de SEQ ID NO: 12.

[00115] Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 14 e aminoácidos -16 a -1 da SEQ ID NO: 14 são um

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 38/223 / 198 peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptideo maduro é os aminoácidos 1 a 204 de SEQ ID NO: 15.

[00116] Em um aspecto, o polipeptideo maduro é aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 17 e aminoácidos -19 a -1 da SEQ ID NO: 17 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptideo maduro é os aminoácidos 1 a 208 de SEQ ID NO: 18.

[00117] Em um aspecto, o polipeptideo maduro é aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 20 e aminoácidos -18 a -1 da SEQ ID NO: 20 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptideo maduro é os aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 21.

[00118] Em um aspecto, o polipeptideo maduro é aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 23 e aminoácidos -19 a -1 da SEQ ID NO: 23 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptideo maduro é os aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 24.

[00119] Em um aspecto, o polipeptideo maduro é aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 26 e aminoácidos -15 a -1 da SEQ ID NO: 26 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptideo maduro é os aminoácidos 1 a

216 de SEQ ID NO: 27.

[00120] Em um aspecto, o polipeptideo maduro é aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 29 e aminoácidos -18 a -1 da SEQ ID NO: 29 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptideo maduro é os aminoácidos 1 a

217 de SEQ ID NO: 30.

[00121] Em um aspecto, o polipeptideo maduro é aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 32 e aminoácidos -20 a -1 da SEQ ID NO: 32 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptideo maduro é os aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 33.

[00122] Em um aspecto, o polipeptideo maduro é aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 35 e aminoácidos -17 a -1 da SEQ ID NO: 35 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptideo maduro é os aminoácidos 1 a

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207 de SEQ ID NO: 37.

[00123] Sabe-se na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. Também é conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos de modo diferente e, dessa forma, uma célula hospedeira que expressa um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, que tem um aminoácido Cterminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com uma outra célula hospedeira que expressa o mesmo polinucleotídeo.

[00124] O termo “sequência de codificação de polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro que tem atividade de lisozima.

[00125] O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiría, de outro modo, em natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[00126] O termo obtido ou obtenível a partir de significa que o polipeptídeo pode ser encontrado em um organismo a partir de uma classificação taxonômica específica. Em uma forma de realização, o polipeptídeo é obtido ou obtenível a partir do reino Fungi, em que o termo reino é a classificação taxonômica. Em uma forma de realização preferencial, o polipeptídeo é obtido ou obtenível a partir do filo Ascomycota, em que o termo filo é a classificação taxonômica. Em outra uma forma de realização preferencial, o polipeptídeo é obtido ou obtenível a partir do subfilo Pezizomycotina, em que o termo subfilo é a classificação taxonômica.

[00127] Se a classificação taxonômica de um polipeptídeo não for conhecida, essa pode ser facilmente determinada por um versado na técnica

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 40/223 / 198 através da realização de uma pesquisa BLASTP do polipeptídeo (usando, por exemplo, o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCIB) website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e comparando-o com os homólogos mais próximos. Um polipeptídeo desconhecido, que é um fragmento de um polipeptídeo conhecido é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica. Um polipeptídeo natural desconhecido ou variante artificial que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em até 10 posições é considerado como sendo originado das mesmas espécies taxonômicas que o polipeptídeo conhecido.

[00128] O termo “operacionalmente ligada” designa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência de codificação de um polinucleotídeo, de tal forma que a sequência de controle direciona a expressão da sequência de codificação.

[00129] O termo alimento grosseiro significa material vegetal seco com elevados níveis de fibra, como fibra, farelo, cascas de sementes e grãos e resíduos de cultura (como palha de milho, copra, palha, joio, resíduo de beterraba-sacarina).

[00130] A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[00131] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) conforme implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 41/223 / 198 de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento Número Total de Lacunas no Alinhamento) [00132] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) conforme implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), de preferência, versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue:

(Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento) [00133] O termo subsequência significa um polinucleotídeo que tem um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento que tem atividade de lisozima.

[00134] O termo “polipeptídeo substancialmente puro” significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1%, e no máximo 0,5% em peso de outro material de polipeptídeo com o qual está nativamente ou recombinantemente associado. Preferencialmente, o polipeptídeo é pelo menos 92% puro, por exemplo, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro, pelo menos 99,5% puro, e 100%

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29/198 puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

[00135] O termo variante significa um polipeptídeo que tem atividade de lisozima que compreende uma alteração, ou seja, uma substituição, inserção e/ou deleção, de um ou mais (vários) resíduos de aminoácidos em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de 1, 2, ou 3 aminoácidos adjacentes ao e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando a posição.

[00136] Para os fins da presente invenção, a nomenclatura [E/Q] significa que o aminoácido nessa posição pode ser um ácido glutâmico (Glu, E) ou uma glutamina (Gin, Q). Da mesma forma, a nomenclatura [V/G/A/I] significa que o aminoácido nessa posição pode ser uma valina (Vai, V), glicina (Gly, G), alanina (Ala, A) ou isoleucina (He, I), e assim por diante para outras combinações como descrito aqui. A não ser que de outro modo limitado adicionalmente, o aminoácido X é definido tal que possa ser qualquer um dos 20 aminoácidos naturais.

[00137] Métodos de hidrólise de peptidoglicano em paredes celulares bacterianas [00138] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para hidrolisar peptidoglicano em paredes celulares bacterianas que compreende tratar células bacterianas com um ou mais polipeptídeos GH25 que têm atividade de lisozima, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

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30/198 (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

(b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6;

(c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9;

(d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12;

(e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 15;

(f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 18;

(g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 21;

(h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 24;

(i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 27;

(j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 30;

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31/198 (k) um polipeptideo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 33;

(l) um polipeptideo que tem pelo menos 83%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 38;

(m) uma variante do polipeptideo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 38, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 posições;

(n) um polipeptideo que compreende o polipeptideo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal;

(o) um polipeptideo que compreende o polipeptideo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (p) um fragmento do polipeptideo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% do comprimento do polipeptideo maduro.

[00139] Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo

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WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 43).

[00140] Em uma forma de realização, o polipeptideo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 33 ou aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 38.

[00141] Em uma forma de realização preferencial, o polipeptideo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente <0,02 ou com a máxima preferência <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett. Em uma forma de realização, os polipeptídeos da presente invenção têm atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a atividade é determinada mediante a medição da diminuição em densidade óptica de uma solução de células de Micrococcus lysodeikticus ressuspensas, de preferência, células de Micrococcus luteus ATCC 4698, de preferência, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00142] Em uma forma de realização, os polipeptídeos da presente invenção têm atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a atividade é determinada mediante a medição da diminuição em densidade óptica de uma solução de células de Micrococcus lysodeikticus ressuspensas, de preferência, células de Micrococcus luteus ATCC 4698, em que a atividade de lisozima é

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33/198 determinada conforme exposto a seguir: a enzima lisozima foi diluída até uma concentração de 50 mg de proteína de enzima/1 em água desionizada; 180 μΐ de tampão (tampão de ácido cítrico 0,1 M - hidrogenofosfato dissódico 0,2 M pH 4) e 20 μΐ da amostra de lisozima diluída foram adicionados e mantidos frios (5 °C); 20 μΐ do substrato (10 mg de células/ml de Micrococcus lysodeikticus ATCC 4698 em água desionizada) foram adicionados a cada poço; absorvância em 450 nm foi iniciada durante 1 hora a 37 °C; a atividade de lisozima foi determinada como Δ absorvância em 450 nm (valor inicial valor final) de cada poço após 1 hora.

[00143] Grânulos que compreendem polipeptídeos que têm atividade de lisozima [00144] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um grânulo que compreende um ou mais polipeptídeos GH25 que têm atividade de lisozima, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que tem pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

(f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo

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34/198 menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 18;

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 33;

(l) um polipeptídeo que tem pelo menos 83%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 38;

(n) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a),

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35/198 (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal;

[00145] Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 43).

[00146] Em uma forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 33 ou aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 38.

[00147] Em uma forma de realização preferencial, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente <0,02 ou com

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36/198 a máxima preferência <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett. Em uma forma de realização, os polipeptídeos da presente invenção têm atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a atividade é determinada mediante a medição da diminuição em densidade óptica de uma solução de células de Micrococcus lysodeikticus ressuspensas, de preferência, células de Micrococcus luteus ATCC 4698, de preferência, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00148] Em uma forma de realização, os polipeptídeos da presente invenção têm atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a atividade é determinada mediante a medição da diminuição em densidade óptica de uma solução de células de Micrococcus lysodeikticus ressuspensas, de preferência, células de Micrococcus luteus ATCC 4698, em que a atividade de lisozima é determinada conforme exposto a seguir: a enzima lisozima foi diluída até uma concentração de 50 mg de proteína de enzima/1 em água desionizada; 180 pl de tampão (tampão de ácido cítrico 0,1 M - hidrogenofosfato dissódico 0,2 M pH 4) e 20 μΐ da amostra de lisozima diluída foram adicionados e mantidos frios (5 °C); 20 μΐ do substrato (10 mg de células/ml de Micrococcus lysodeikticus ATCC 4698 em água desionizada) foram adicionados a cada poço; absorvância em 450 nm foi iniciada durante 1 hora a 37 °C; a atividade de lisozima foi determinada como Δ absorvância em 450 nm (valor inicial valor final) de cada poço após 1 hora.

[00149] Em uma forma de realização do segundo aspecto, o grânulo compreende um ou mais agentes de formulação (como aqueles descritos no presente documento), preferencialmente, um agente de formulação selecionado dentre a lista que consiste em glicerol, etilenoglicol, 1, 2propilenoglicol ou 1, 3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de sódio, sulfato de magnésio,

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37/198 tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, caulim e celulose, preferencialmente, selecionado dentre a lista que consiste em 1, 2-propilenoglicol, 1, 3propilenoglicol, sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, caulim e carbonato de cálcio.

[00150] Em uma forma de realização adicional, para qualquer parte do segundo aspecto, o grânulo compreende uma partícula de núcleo e um ou mais revestimentos. Em uma forma de realização preferencial, o revestimento compreende sal e/ou cera e/ou farinha.

[00151] Em uma forma de realização, o grânulo compreende uma ou mais enzimas adicionais. A uma ou mais enzimas adicionais são preferencialmente selecionadas do grupo que consiste em fitase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, protease, fosfolipase Al, fosfolipase A2, lisofosfolipase, fosfolipase C, fosfolipase D, amilase, lisozima, arabinofuranosidase, beta-xilosidase, acetil xilana esterase, feruloíl esterase, celulase, celobioidrolases, beta-glucosidase, pululanase, e betaglucanase ou qualquer combinação das mesmas.

[00152] Em uma forma de realização, o grânulo compreende um ou mais probióticos. O um ou mais probióticos são preferencialmente selecionados do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cercus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium sp., Camobacterium sp., Clostridium butyricum, Clostridium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Megasphaera elsdenii, Megasphaera sp., Pediococsus acidilactici, Pediococcus sp., Propionibacterium thoenii,

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Propionibacterium sp. e Streptococcus sp. ou qualquer combinação dos mesmos.

[00153] Polipeptídeos Que têm Atividade de Lisozima [00154] Em um aspecto adicional, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 33 ou aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 38.

[00155] Em um terceiro aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 20 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[00156] Em uma continuação do terceiro aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 20 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

[00157] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 de pelo menos 90% e em que o polipeptídeo

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 52/223

39/198 tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 de pelo menos 95% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00158] Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 2. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 3. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3. Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[00159] Em uma continuação do terceiro aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 53/223

40/198 codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00160] Em uma forma de realização do terceiro aspecto, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00161] Em uma continuação do terceiro aspecto, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 3 que tem atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 3 não é maior que 20, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 3 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou

10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 3 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 54/223

41/198 substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 3 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[00162] Em uma forma de realização do terceiro aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00163] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o enovelamento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1 a 30 aminoácidos; pequenas extensões terminais amino- ou carboxila, tais como um resíduo de metionina aminoterminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20 a 25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00164] Exemplos de substituições consecutivas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que, em geral, não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val,

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 55/223

42/198

Ala/Glu e Asp/Gly. Outros exemplos de substituições conservantes são G por A; A por G, S; V por I, L, A, T, S; I por V, L, M; L por I, Μ, V; M por L, I, V; P por A, S, N; F por Y, W, Η; Y por F, W, H; W por Y, F, H; R por K, E, D; K por R, E, D; H por Q, N, S; D por N, E, K, R, Q; E por Q, D, K, R, N; S por T, A; T por S, V, A; C por S, T, A; N por D, Q, H, S; Q por E, N, Η, K, R.

[00165] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1.081 a 1.085). Nesta última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de lisozima para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Consultar também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4.699 a 4.708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Consultar, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306 a 312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899 a 904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59 a 64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[00166] O documento n° WO 2013/076253 revelou que resíduos de aminoácidos D95 e E97 da SEQ ID NO: 8 do documento n° WO 2013/076253 são resíduos catalíticos. SEQ ID NO: 8 do documento n° WO 2013/076253 corresponde a SEQ ID NO: 39 do presente pedido. Uma seção do alinhamento das lisozimas da presente invenção com SEQ ID NO: 8 do documento n° WO 2013/076253 é dada abaixo. Esse alinhamento pode ser

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 56/223 / 198 usado para determinar a posição dos aminoácidos catalíticos para as lisozimas reivindicadas. Em uma forma de realização, nenhuma alteração é feita para um aminoácido que corresponde a E97 e D95 mediante o uso da SEQ ID NO:

para a numeração.

Número de aminoácido da SEQ ID NO: 8 do documento n° WO 2013/07625 3

<c> oo

OO

OO oo

OO

o

σ>

<N

CD

σ>

UD

<c>

S1

OO

100

o

102

CD O

O

UD O

106

SEQ ID NO: 3

D

G

I

T

L

P

G

M

L

D

L

E

A

Υ

N

A

G

E

c

w

SEQ ID NO: 6

D

G

I

T

L

P

G

M

L

D

I

E

Y

N

P

s

G

s

Γ

c

Y

SEQ ID NO: 9

D

G

I

T

L

P

G

M

I

D

L

E

Y

N

P

s

G

A

Γ

c

Y

SEQ ID NO: 12

D

G

R

T

L

P

G

A

L

D

L

E

A

G

-

c

s

SEQ ID NO: 15

D

G

I

T

L

P

G

A

L

D

L

E

A

G

-

c

s

SEQ ID NO: 18

D

G

I

T

L

P

G

M

L

D

M

E

Y

Q

s

A

c

G

SEQ ID NO: 21

D

G

K

T

L

P

G

A

V

D

L

E

Y

G

P

N

G

s

Γ

c

W

SEQ ID NO: 24

D

G

I

T

L

P

G

M

L

D

L

E

Y

G

P

N

G

N

Γ

c

Y

SEQ ID NO: 27

D

G

K

T

L

P

G

M

L

D

I

E

Y

N

P

s

G

A

Γ

c

Y

SEQ ID NO: 30

D

G

I

T

L

P

G

M

L

D

I

E

s

N

P

Y

G

A

Q

c

Y

SEQ ID NO: 33

D

G

I

T

L

P

G

M

L

D

M

E

Y

N

P

N

G

s

A

c

Y

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 57/223

44/198

SEQ ID NO: 38

D

G

I

T

L

P

G

A

L

D

I

E

Y

N

P

s

G

A

Γ

C

Y

SEQ ID NO: 8 of WO2013/07 6253

D

G

I

T

L

P

G

A

L

D

I

E

Y

N

P

N

G

A

Γ

C

Y

[00167] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos de um procedimento de triagem relevante, como aqueles divulgados por ReidhaarOlson e Sauer, 1988, Science 241: 53 a 57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2.152 a 2.156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10.832 a 10.837; patente n° U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese sítio-dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00168] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de triagem automatizados, de elevada capacidade, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893 a 896). As moléculas de DNA submetidas a mutagênese que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas com o uso de métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptideo.

[00169] Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 58/223 / 198

WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptideo pode ser um polipeptideo híbrido ou um polipeptideo de fusão. [00170] Em um quarto aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 5. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 32 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,

14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos do polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 5.

[00171] Em uma continuação do quarto aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 32 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos do polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 6.

[00172] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 de pelo menos 85% e em que o polipeptideo tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 59/223

46/198 atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 de pelo menos 90% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 de pelo menos 95% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00173] Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 5. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 6. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6. Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[00174] Em uma continuação do quarto aspecto, a invenção se refere a

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 60/223 / 198 um polipeptídeo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4 de pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00175] Em uma forma de realização do quarto aspecto, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00176] Em uma continuação do quarto aspecto, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 6 que tem atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 6 não é maior que 32, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 6 não é maior que 10, por

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 61/223 / 198 exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 6 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 6 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00177] Em uma forma de realização do quarto aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00178] Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido ou um polipeptídeo de fusão.

[00179] Em um quinto aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 91%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo madura da SEQ ID NO: 8. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 18 aminoácidos,

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49/198 por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 8.

[00180] Em uma continuação do quinto aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 91%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 9. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 18 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9.

[00181] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 9 de pelo menos 91% e em que o polipeptídeo tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 9 de pelo menos 95% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00182] Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 8. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9;

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50/198 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 9. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 9. Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[00183] Em uma continuação do quinto aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 91%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00184] Em uma forma de realização do quinto aspecto, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00185] Em uma continuação do quinto aspecto, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 9 que tem atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer

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51/198 combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 9 não é maior que 18, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 9 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 9 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 9 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00186] Em uma forma de realização do quinto aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00187] Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS

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52/198 (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 43). Em uma forma de realização, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido ou um polipeptídeo de fusão.

[00188] Em um sexto aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 11. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 11.

[00189] Em uma continuação do sexto aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 12.

[00190] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de

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53/198 sequência com SEQ ID NO: 12 de pelo menos 80% e em que o polipeptídeo tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 12 de pelo menos 85% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 12 de pelo menos 90% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 12 de pelo menos 95% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00191] Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 11. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12;

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54/198 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 12. Em outra forma de realização, o polipeptideo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 12. Em uma forma de realização, o polipeptideo foi isolado.

[00192] Em uma continuação do sexto aspecto, a invenção se refere a um polipeptideo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 10 de pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptideo foi isolado.

[00193] Em uma forma de realização do sexto aspecto, o polipeptideo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00194] Em uma continuação do sexto aspecto, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 12 que têm atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de

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55/198 aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 12 não é maior que 40, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 12 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 12 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 12 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00195] Em uma forma de realização do sexto aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00196] Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo

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WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 43). Em uma forma de realização, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido ou um polipeptídeo de fusão.

[00197] Em um sétimo aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 86%, por exemplo, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 14. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 28 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 14.

[00198] Em uma continuação do sétimo aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 86%, por exemplo, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 15. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 28 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 15.

[00199] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de

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57/198 sequência com SEQ ID NO: 15 de pelo menos 86% e em que o polipeptídeo tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 15 de pelo menos 90% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 15 de pelo menos 95% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00200] Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 14. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 14. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos

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96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 15. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 15. Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[00201] Em uma continuação do sétimo aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 13 de pelo menos 86%, por exemplo, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00202] Em uma forma de realização do sétimo aspecto, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00203] Em uma continuação do sétimo aspecto, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 15 que têm atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 15 não é maior que 28, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,

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7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 15 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 15 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 15 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00204] Em uma forma de realização do sétimo aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00205] Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 43). Em uma forma de realização, o polipeptídeo pode ser um

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60/198 polipeptídeo híbrido ou um polipeptídeo de fusão.

[00206] Em um oitavo aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 20. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 20.

[00207] Em uma continuação do oitavo aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 21.

[00208] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 21 de pelo menos 80% e em que o polipeptídeo tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO:

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39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 21 de pelo menos 85% e em que o polipeptideo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 21 de pelo menos 90% e em que o polipeptideo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 21 de pelo menos 95% e em que o polipeptideo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00209] Em uma forma de realização, o polipeptideo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20. Em outra forma de realização, o polipeptideo compreende o ou consiste no polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 20. Em outra forma de realização, o polipeptideo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 20. Em uma forma de realização, o polipeptideo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem

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62/198 atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 21. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 21. Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[00210] Em uma continuação do oitavo aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 de pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00211] Em uma forma de realização do oitavo aspecto, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00212] Em uma continuação do oitavo aspecto, a invenção se relaciona com variantes de SEQ ID NO: 21 que têm atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 76/223 / 198 deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 21 não é maior que 40, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 21 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 21 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 21 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00213] Em uma forma de realização do oitavo aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00214] Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo

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WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 43). Em uma forma de realização, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido ou um polipeptídeo de fusão.

[00215] Em um nono aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 23. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 23.

[00216] Em uma continuação do nono aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 24.

[00217] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 24 de pelo menos 80% e em que o polipeptídeo

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 78/223 / 198 tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 24 de pelo menos 85% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 24 de pelo menos 90% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 24 de pelo menos 95% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00218] Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 23. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 23. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e um marcador

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66/198 de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 24. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 24. Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[00219] Em uma continuação do nono aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 22 de pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00220] Em uma forma de realização do nono aspecto, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00221] Em uma continuação do nono aspecto, a invenção se relaciona com variantes de SEQ ID NO: 24 que têm atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 80/223 / 198 qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 24 não é maior que 40, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 24 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 24 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 24 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00222] Em uma forma de realização do nono aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00223] Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo

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[00224] Em um décimo aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 87%, por exemplo, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 26. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 28 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 26.

[00225] Em uma continuação do décimo aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 87%, por exemplo, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 27. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 28 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 27.

[00226] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 27 de pelo menos 87% e em que o polipeptídeo

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69/198 tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 27 de pelo menos 90% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 27 de pelo menos 95% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00227] Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 26. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 26. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento

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70/198 da SEQ ID NO: 27. Em outra forma de realização, o polipeptideo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 27. Em uma forma de realização, o polipeptideo foi isolado.

[00228] Em uma continuação do décimo aspecto, a invenção se refere a um polipeptideo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 25 de pelo menos 87%, por exemplo, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptideo foi isolado.

[00229] Em uma forma de realização do décimo aspecto, o polipeptideo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00230] Em uma continuação do décimo aspecto, a invenção se relaciona com variantes de SEQ ID NO: 27 que têm atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 27 não é maior que 28, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28. Em uma forma de realização, o número de

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71/198 posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 27 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 27 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 27 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00231] Em uma forma de realização do décimo aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00232] Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 43). Em uma forma de realização, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido ou um polipeptídeo de fusão.

[00233] Em um décimo primeiro aspecto, a invenção se refere a

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72/198 polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 29. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 29.

[00234] Em uma continuação do décimo primeiro aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 30. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 30.

[00235] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 30 de pelo menos 80% e em que o polipeptideo tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID

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NO: 30 de pelo menos 85% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 30 de pelo menos 90% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 30 de pelo menos 95% e em que o polipeptídeo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00236] Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 29. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 29. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos

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96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 30. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 30. Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[00237] Em uma continuação do décimo primeiro aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 28 de pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00238] Em uma forma de realização do décimo primeiro aspecto, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00239] Em uma continuação do décimo primeiro aspecto, a invenção se relaciona com variantes de SEQ ID NO: 30 que têm atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 30 não é maior que 40,

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 88/223 / 198 por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 30 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 30 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 30 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00240] Em uma forma de realização do décimo primeiro aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00241] Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS

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76/198 (SEQ ID NO: 43). Em uma forma de realização, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido ou um polipeptídeo de fusão.

[00242] Em um décimo segundo aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 32. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 32.

[00243] Em uma continuação do décimo segundo aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 33. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 40 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39 ou 40 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 33.

[00244] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 33 de pelo menos 80% e em que o polipeptídeo tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 90/223 / 198 menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 33 de pelo menos 85% e em que o polipeptideo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 33 de pelo menos 90% e em que o polipeptideo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 33 de pelo menos 95% e em que o polipeptideo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00245] Em uma forma de realização, o polipeptideo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32. Em outra forma de realização, o polipeptideo compreende o ou consiste no polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 32. Em outra forma de realização, o polipeptideo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 32. Em uma forma de realização, o polipeptideo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma extensão N-terminal e/ou

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C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 33. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 33. Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[00246] Em uma continuação do décimo segundo aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que tem atividade de lisozima codificada por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 31 de pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00247] Em uma forma de realização do décimo segundo aspecto, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00248] Em uma continuação do décimo segundo aspecto, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 33 que têm atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que

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79/198 compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 33 não é maior que 40, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 33 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 33 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 33 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00249] Em uma forma de realização do décimo segundo aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00250] Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS

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80/198 (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptídeo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 43). Em uma forma de realização, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido ou um polipeptídeo de fusão.

[00251] Em um décimo terceiro aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 35. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 35 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34 ou 35 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 35.

[00252] Em uma continuação do décimo terceiro aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 37. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 35 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34 ou 35 aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 37.

[00253] Em uma continuação do décimo terceiro aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm pelo menos

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83%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38. Em uma forma de realização, os polipeptídeos se diferem em até 35 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34 ou 35 aminoácidos da SEQ ID NO: 38.

[00254] Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 38 de pelo menos 83% e em que o polipeptideo tem pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 38 de pelo menos 85% e em que o polipeptideo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 38 de pelo menos 90% e em que o polipeptideo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos 175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39. Em uma forma de realização, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de lisozima e que têm uma identidade de sequência com SEQ ID NO: 38 de pelo menos 95% e em que o polipeptideo tem pelo menos pelo menos 150%, como pelo menos

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175%, pelo menos 200%, pelo menos 225%, pelo menos 250%, pelo menos 275%, pelo menos 300%, pelo menos 350% ou pelo menos 400% da atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39.

[00255] Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 35. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 35. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 37. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 37. Em uma forma de realização, o polipeptídeo preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento da SEQ ID NO: 38. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 38. Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[00256] Em uma continuação do décimo terceiro aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que tem atividade de lisozima codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 34 de pelo menos 83%,

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83/198 por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[00257] Em uma forma de realização do décimo terceiro aspecto, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00258] Em uma continuação do décimo terceiro aspecto, a invenção se relaciona com variantes de SEQ ID NO: 38 que têm atividade de lisozima que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 38 não é maior que 35, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35. Em uma forma de realização, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 38 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra forma de realização, o número de substituições e/ou deleções e/ou inserções na SEQ ID NO: 38 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4,

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5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 38 não é maior que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os exemplos de mudanças de aminoácidos e substituições conservativas são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00259] Em uma forma de realização do décimo terceiro aspecto, a variante tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00260] Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW[S/T] (SEQ ID NO: 40) e/ou o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e/ou o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 40), o motivo DGXTLPG (SEQ ID NO: 41) e o motivo WWX[Q/T]CTG (SEQ ID NO: 42). Em uma forma de realização, o polipeptideo GH25 compreende o motivo F[I/L/V][A/S][H/N/S]GGGWS (SEQ ID NO: 43). Em uma forma de realização, o polipeptideo pode ser um polipeptideo híbrido ou um polipeptideo de fusão.

[00261 ] Atividade de lisozima [00262] Os polipeptídeos da invenção têm atividade de lisozima. Os polipeptídeos da invenção têm atividade de lisozima melhorada, conforme medido por métodos convencionais, em comparação com a lisozima da clara de ovo de galinha. Adicionalmente, conforme mostrado nos Exemplos, os polipeptídeos da invenção têm atividade de lisozima melhorada em comparação com uma lisozima ativa conhecida, a lisozima da SEQ ID NO 39.

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Consequentemente, uma forma de realização da invenção se refere aos polipeptídeos da invenção em que o polipeptídeo tem atividade de lisozima melhorada a) em comparação com a atividade de lisozima da lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL) ou b) em comparação com a atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39 conforme determinado pelo Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus (o Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus é descrito em detalhes no Exemplo 1 e os resultados comparativos são mostrados no Exemplo 16).

[00263] Uma forma de realização adicional se refere a um polipeptídeo da invenção que tem atividade de lisozima melhorada a) em comparação com a atividade de lisozima da lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL) ou b) em comparação com a atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39, conforme determinado por qualquer um de i) Método para a Determinação da Atividade da Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus e ii) Método para a Determinação da Atividade da Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii. Conforme pode ser visto nos Exemplos, a atividade de lisozima da lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL) aumenta a medição de densidade óptica (OD) em 405 nm em uma média de 0,180 a uma concentração de 5 mg de proteína de enzima/1 no Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus. Com o uso da SEQ ID NO 39 conhecida, constatou-se que a atividade de lisozima da SEQ ID NO 39 aumenta as medições de densidade óptica (OD) em 405 nm em uma média de 0,186 a uma concentração de 5 mg de proteína de enzima/1 no Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus.

[00264] Uma medição alternativa da atividade de lisozima é o método terminal de redução conforme realizado de acordo com o Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii. Em uma forma de realização da invenção, o polipeptídeo da invenção tem uma

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86/198 atividade de lisozima contra Lactobacillus johnsonii em 5 ppm que aumenta a medição de densidade óptica (OD) em 405 nm de pelo menos 0,20, conforme determinado pelo Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii.

[00265] Fontes de Polipeptídeos Que Têm Atividade de Lisozima [00266] Um polipeptídeo que tem atividade de lisozima da presente invenção pode ser obtido a partir de micro-organismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de”, como usado aqui em conexão com uma dada fonte, deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[00267] Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo que tem atividade de lisozima de um fungo da classe Sordariomycetes, como da ordem Hypocreales, ou da família Clavicipitaceae, ou do gênero Paecilomyces ou da espécie Paecilomyces sp. XZ2658.

[00268] Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo que tem atividade de lisozima de um fungo da classe Eurotiomycetes, como da ordem Onygenales, ou do gênero Malbranchea, ou da espécie Malbranchea fiava.

[00269] Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo que tem atividade de lisozima de um fungo do filo Ascomycota, como do gênero Engyodontium ou da espécie Engyodontium album.

[00270] Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo que tem atividade de lisozima de um fungo da classe Agaricomycetes, como da ordem Agaricales ou do gênero Flammulina ou da espécie Flammulina velutipes

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KACC42780.

[00271] Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo que tem atividade de lisozima de um fungo da classe Eurotiomycetes, como da ordem Eurotiales ou da família Aspergillaceae ou do gênero Penicillium ou da espécie Penicillium sp. 'qii' ou Penicillium atrovenetum.

[00272] Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo que tem atividade de lisozima de um fungo da classe Eurotiomycetes, como da ordem Onygenales ou da família Onygenaceae ou do gênero Onygena ou da espécie Onygena equina.

[00273] Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo que tem atividade de lisozima de um fungo da classe Sordariomycetes, como da ordem Hypocreales ou da família Cordycipitaceae ou do gênero Lecanicillium ou da espécie Lecanicillium sp. WMM742.

[00274] Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo que tem atividade de lisozima de um fungo do subfilo Mortierellomycotina, como da ordem Mortierellales ou da família Mortierellaceae ou do gênero Mortierella ou da espécie Mortierella alpina.

[00275] Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo que tem atividade de lisozima de um fungo da classe Sordariomycetes, como da ordem Sordariales ou da família Chaetomiaceae ou do gênero Myceliophthora ou da espécie Myceliophthora fergusii.

[00276] Será entendido que, para a espécie supracitada, a invenção abrange tanto os estados perfeito quanto imperfeito, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome de

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88/198 espécie pelo qual são conhecidos. Aqueles versados na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes adequados.

[00277] As cepas dessas espécies são prontamente acessíveis para o público em diversas coletas de cultura, como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[00278] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de micro-organismos e DNA diretamente de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser depois obtido por meio da triagem de modo similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com a sonda (ou sondas), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado com o uso de técnicas que são conhecidas por aqueles versados na técnica (consultar, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[00279] Polinucleotídeos [00280] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo da presente invenção, como descrito no presente documento. Em uma forma de realização, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente invenção foi isolado.

[00281] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos de DNA

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89/198 genômico pode ser efetuada, por exemplo, usando-se a reação em cadeia da polimerase bem conhecida (PCR) ou triagem de anticorpo de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com recursos estruturais compartilhados. Consultar, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Trichophaea ou uma cepa Trichoderma, ou um organismo relacionado e, assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécies da região de codificação do polipeptideo do polinucleotídeo.

[00282] A modificação de um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo da presente invenção pode ser necessária para sintetizar polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptideo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptideo se refere a formas do polipeptideo não ocorrendo naturalmente.

[00283] Construtos de Ácido Nucleico [00284] A presente invenção também se refere a construtos de ácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[00285] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer a expressão do polipeptideo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando os métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

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90/198 [00286] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[00287] Os exemplos de promotores adequados para o direcionamento da transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos a partir do gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene de levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene crylIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97 a 107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301 a 315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da beta-lactamase procariótica (VillaKamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 3.727 a 3.731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 21 a 25). Os promotores adicionais são descritos em Useful proteins from recombinant bacteria em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74 a 94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados no documento n° WO 99/43835.

[00288] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição das construções de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da

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91/198 acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácidos de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos. Outros promotores são descritos na Patente n° U.S. 6.011.147.

[00289] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína

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92/198 (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfogliceratocinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423 a 488.

[00290] A sequência de controle também pode ser um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.

[00291] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[00292] Os terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxisporum, betaglucosidase de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei.

[00293] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992,

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[00294] A sequência de controle também pode ser uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência de codificação de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00295] Os exemplos de regiões estabilizantes de mRNA adequadas são obtidas a partir de um gene crylIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3.465 a 3.471).

[00296] A sequência de controle também pode ser um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado à terminação 5' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer líder que seja funcional pode ser usado na célula hospedeira.

[00297] Os líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes de amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00298] Os líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[00299] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada à terminação 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional pode ser usada na célula hospedeira.

[00300] As sequências de poliadenilação para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para antranilato sintase de

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Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, e protease semelhante à tripsina Fusarium oxysporum.

[00301] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5.983 a 5.990.

[00302] A sequência de controle também pode ser uma região de codificação de peptídeo-sinal que codifica um peptídeo-sinal ligado à terminação N de um polipeptídeo e que direciona o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência de codificação de polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência de codificação de peptídeo-sinal naturalmente ligada em quadro de leitura de tradução com o segmento da sequência de codificação que codifica o polipeptídeo. Altemativamente, a extremidade 5' da sequência de codificação pode conter uma sequência de codificação de peptídeo-sinal que é estranha à sequência de codificação. Uma sequência de codificação de peptídeo-sinal estranha pode ser necessária quando a sequência de codificação não contém naturalmente uma sequência de codificação de peptídeo-sinal. Alternativamente, uma sequência de codificação de peptídeo-sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência de codificação do peptídeo-sinal natural de modo a intensificar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de codificação do peptídeo-sinal que direcione o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira pode ser usado.

[00303] Sequências de codificação do peptídeo-sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências de codificação do peptídeosinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 108/223 / 198 sinal adicionais são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109 a 137.

[00304] Sequências de codificação de peptídeo-sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências de codificação de peptídeo-sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00305] Os peptídeos-sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de codificação de peptídeosinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[00306] A sequência de controle também pode ser uma sequência de codificação de pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado na terminação N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do própeptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência de codificação de própeptídeo pode ser obtida a partir dos genes de protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), laccase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[00307] Quando ambas as sequências de peptídeo-sinal e pró-peptídeo estão presentes, a sequência do pró-peptídeo está posicionada junto ao Nterminal de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo-sinal está posicionada junto ao N-terminal da sequência do pró-peptídeo.

[00308] Também pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula

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96/198 hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. As sequências reguladoras em sistemas procarióticos incluem os sistemas operacionais lac, tac, e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 pode ser usado. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae, o promotor de celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, e o promotor de celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei. Outros exemplos de sequências reguladoras são aqueles que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, essas sequências reguladoras incluem o gene di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de mealotioneína que são amplificados com metais pesados. Nesses casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptideo estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.

[00309] Vetores de Expressão [00310] A presente invenção também se refere a vetores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricionais e translacionais. As várias sequências de nucleotideos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o polipeptideo em tais sítios. Altemativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico que compreende o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência de codificação está localizada no vetor para que a sequência de codificação seja ligada operacionalmente com as sequências de controle apropriadas para a

Petição 870190056969, de 19/06/2019, pág. 110/223 / 198 expressão.

[00311] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa resultar em expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00312] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação que é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o cromossomo (ou cromossomos) no qual foi integrado. Adicionalmente pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon.

[00313] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[00314] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos, tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura incluem, porém sem limitação, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3.

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Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, porém sem limitação, adeA (fosforribosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintase), amdS (acetamidase), argB (omitina carbamorltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. São preferidos para uso na célula Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus. Os genes adeA, adeB, amdS, hph, e pyrG são preferenciais para uso em uma célula de Trichoderma.

[00315] O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável dual como descrito no documento sob o n° WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável duplo é um sistema de marcador selecionável duplo hph-tk.

[00316] O vetor contém, preferencialmente, um elemento (ou elementos) que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[00317] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização (ou localizações) precisa no cromossomo (ou cromossomos). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização específica, os elementos de integração devem conter uma quantidade suficiente de ácidos nucleicos, como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência em relação à

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99/198 sequência-alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que é homóloga com a sequência-alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00318] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00319] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli e pUBUO, pE194, pTA1060 e pAMBl que permitem a replicação em Bacillus.

[00320] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 microns, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00321] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMAI e ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61 a 67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9.163 a 9.175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados no documento n² WO 00/24883.

[00322] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para

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100/198 aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e, deste modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00323] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos por um versado na técnica (consultar, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[00324] Células Hospedeiras [00325] A presente invenção também se refere a células hospedeiras recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor que compreende um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

[00326] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo é heterólogo à célula hospedeira recombinante.

[00327] Em algumas formas de realização, pelo menos uma das uma ou mais sequências de controle é heteróloga para o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

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101/198 [00328] Em algumas formas de realização, a célula hospedeira recombinante compreende pelo menos duas cópias, por exemplo, três, quatro ou cinco, do polinucleotídeo da presente invenção.

[00329] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procariota ou um eucariota.

[00330] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias gram-positivas incluem, porém sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias gram-negativas incluem, porém sem limitação, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[00331] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus que inclui, porém sem limitação, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[00332] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus que inclui, porém sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00333] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces que inclui, porém sem limitação, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[00334] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (consultar, por exemplo, Chang e

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Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: Illa 115), transformação de células competentes (consultar, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823 a 829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209 a 221), eletroporação (consultar, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742 a 751) ou conjugação (consultar, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, J. Bacteriol. 169: 5.271 a 5.278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (consultar, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557 a 580) ou eletroporação (consultar, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6.127 a 6.145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (consultar, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praga) 49: 399 a 405), conjugação (consultar, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3.583 a 3.585) ou transdução (consultar, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 6.289 a 6.294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (consultar, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391 a 397) ou conjugação (consultar, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51 a 57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (consultar, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1.295 a 1.297), transformação de protoplastos (consultar, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189 a 207), eletroporação (consultar, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3.800 a 3.804) ou conjugação (consultar, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409 a 436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

[00335] A célula hospedeira também pode ser um eucariota, como uma célula de mamífero, inseto, vegetal ou fúngica.

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103 / 198 [00336] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos”, conforme usado no presente documento, incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota, assim como os fungos Oomycota e todos os fungos mitospóricos (conforme definido por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8^aedição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[00337] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, conforme usado no presente documento, inclui levedura ascosporógena (Endomicetales), levedura basidiosporógena e a levedura que pertence ao Fungi Imperfecti (Blastomicetos). Uma vez que a classificação de leveduras pode variar no futuro, para os propósitos da presente invenção, a levedura será definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium N° de Série 9, 1980).

[00338] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica.

[00339] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definidos por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente distinguidos por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contrapartida, o crescimento vegetativo por leveduras, tais como

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Saccharomyces cerevisiae, é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[00340] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

[00341] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma

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105 / 198 longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[00342] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Os procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos no documento n° EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1.470 a 1.474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1.419 a 1.422. Os métodos adequados para a transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147 a 156, e no documento n° WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, páginas 182 a 187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1.920.

[00343] Métodos de Produção [00344] A presente invenção também se refere a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção que compreende (a) cultivar uma célula, que na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto, a célula é uma célula de Paecilomyces sp. XZ2658. Em um aspecto, a célula é uma célula de Malbranchea fiava. Em um aspecto, a célula é uma célula de Engyodontium album. Em um aspecto, a célula é uma célula de Flammulina velutipes KACC42780. Em um aspecto, a célula é uma célula de Penicillium sp. 'qii'. Em um aspecto, a célula é uma célula de Penicillium atrovenetum. Em um aspecto, a célula é uma célula de Onygena equina. Em um aspecto, a célula é uma célula de Lecanicillium sp. WMM742. Em um aspecto, a célula é uma célula de Mortierella alpina. Em um aspecto, a célula é uma célula de

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Myceliophthorafergusii.

[00345] A presente invenção também se refere a métodos para produzir um polipeptideo da presente invenção que compreende (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptideo; e, opcionalmente, (b) recuperar o polipeptideo.

[00346] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptideo com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em frasco agitado ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais, em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptideo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se ο polipeptideo for secretado para o meio nutriente, o polipeptideo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptideo não for secretado pode ser recuperado de lisados celulares.

[00347] O polipeptideo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas sem limitação, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzima para se determinar a atividade do polipeptideo.

[00348] O polipeptideo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptideo pode ser recuperado a partir do meio de fermentação por procedimentos convencionais incluindo,

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107 / 198 porém sem limitação, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, evaporação ou precipitação. Em um aspecto é recuperado um caldo de fermentação que compreende o polipeptídeo.

[00349] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (consulte, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem polipeptídeos substancialmente puros.

[00350] Plantas [00351] A presente invenção também se refere a plantas isoladas, por exemplo, uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta que compreende um polinucleotídeo da presente invenção, de modo a expressar e produzir um polipeptídeo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo ou domínio pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Altemativamente, a planta ou parte de planta que contém o polipeptídeo ou domínio pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, para melhorar o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

[00352] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocots são gramíneas, como poa (capim do campo, Poa), forragem, como Festuca, Lolium, grama temperada, como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, massambala e mais (milho).

[00353] Exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba-sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas

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108/198 (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza, e o organismo modelo relacionado de perto Arabidopsis thcdiana.

[00354] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais que compreendem essas partes, por exemplo, epiderme, mesofilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas.

[00355] Compartimentos específicos de células de plantas, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, também são considerados uma parte de planta.

[00356] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a descendência de tais plantas, partes de plantas e células de plantas.

[00357] A planta transgênica ou célula de planta que expressa o polipeptideo ou domínio pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00358] A presente invenção também se refere a métodos para produzir um polipeptideo ou domínio da presente invenção que compreende (a) cultivar uma planta ou célula de planta transgênica que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptideo ou domínio sob condições conducentes à produção do polipeptideo ou domínio; e (b) recuperar o polipeptideo ou domínio.

[00359] Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células [00360] A presente invenção também se refere a uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células que compreende um polipeptideo da presente invenção. O produto de caldo de fermentação compreende, adicionalmente, ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene que codifica o polipeptideo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptideo de interesse), detritos celulares,

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109/198 biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas formas de realização, a composição é um caldo integral de células mortas contendo ácido orgânico (ou ácidos), células mortas e/ou detritos celulares e meio de cultura.

[00361] O termo “caldo de fermentação”, conforme usado no presente documento, se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que passa por nenhuma ou mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, os caldos de fermentação são produzidos quando culturas microbianas são cultivadas até a saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteína (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção no meio de cultura de célula. O caldo de fermentação pode conter tanto teores não fracionados quanto fracionados dos materiais de fermentação derivados no fim da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação é não fracionado e compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) serem removidas, por exemplo, por centrifugação. Em algumas formas de realização, o caldo de fermentação contém o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[00362] Em uma forma de realização, a formulação de caldo de fermentação e as composições celulares compreendem um primeiro componente de ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico de 1 a 5 carbonos e/ou um sal do mesmo e um segundo componente de ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico de 6 ou mais carbonos e/ou um sal do mesmo. Em algumas formas de realização, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do mesmo, ou uma mistura de dois ou mais dos supracitados e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um

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110/198 sal do mesmo, ou uma mistura de dois ou mais dos supracitados.

[00363] Em um aspecto, a composição contém um ácido orgânico (ou ácidos), e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em algumas formas de realização, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos de um caldo integral de células mortas para fornecer uma composição que esteja isenta destes componentes.

[00364] As formulações de caldo de fermentação ou composições de células podem compreender ainda um agente conservante e/ou antimicrobiano (por exemplo, bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio, e outros conhecidos na técnica.

[00365] A composição ou caldo integral de células mortas pode conter os teores não fracionados dos materiais de fermentação derivados no fim da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) serem cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas formas de realização, o caldo integral ou composição de células mortas contém o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas formas de realização, as células microbianas presentes na composição ou caldo integral de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[00366] Um caldo integral ou composição de células como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima insolúvel (ou enzimas). Em algumas formas de realização, os componentes insolúveis podem ser removidos para fornecerem uma composição líquida clarificada.

[00367] As formulações de caldo integral e composições de células da

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111/198 presente invenção podem ser produzidas por um método descrito no documento sob o n° WO 90/15861 ou WO 2010/096673.

[00368] Composições de Enzima [00369] A presente invenção também se refere a composições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas no polipeptídeo da invenção. O termo enriquecida indica que a atividade de lisozima da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1, como pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 2,0, pelo menos 3,0, pelo menos 4,0, pelo menos 5,0, pelo menos 10.

[00370] Em uma forma de realização preferida, a composição compreende uma ou mais lisozimas selecionadas da lista que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 38.

[00371] Em uma forma de realização, a composição compreende o polipeptídeo da invenção e um ou mais agentes de formulação, conforme descrito abaixo.

[00372] As composições podem ainda compreender múltiplas atividades enzimáticas, como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas adicionais selecionadas do grupo consistindo em fitase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, protease, fosfolipase Al, fosfolipase A2, lisofosfolipase, fosfolipase C, fosfolipase D, amilase, lisozima, arabinofuranosidase, beta-xilosidase, acetil xilana esterase, feruloíl esterase, celulase, celobioidrolases, beta-glucosidase, pululanase, e beta-glucanase ou qualquer combinação das mesmas.

[00373] As composições podem compreender adicionalmente um ou mais probióticos. Em uma forma de realização, o probiótico é selecionado do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus

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112/198 amyloliquefaciens, Bacillus cercus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium sp., Carnobacterium sp., Clostridium butyricum, Clostridium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Megasphaera elsdenii, Megasphaera sp., Pediococsus acidilactici, Pediococcus sp., Propionibacterium thoenii, Propionibacterium sp. e Streptococcus sp. ou qualquer combinação dos mesmos.

[00374] Em uma forma de realização, a composição compreende um ou mais agentes de formulação conforme revelado no presente documento, de preferência, um ou mais dos compostos selecionados dentre a lista que consiste em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, caulim e celulose.

[00375] Em uma forma de realização, a composição compreende um ou mais componentes selecionados da lista que consiste em vitaminas, minerais e aminoácidos.

[00376] Formulação [00377] A enzima da invenção pode ser formulada como um líquido ou um sólido. Para uma formulação líquida, o agente de formulação pode compreender um poliol (como, por exemplo, glicerol, etilenoglicol ou propilenoglicol), um sal (como, por exemplo, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio) ou um açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, dextrina, glicose, sacarose e sorbitol). Assim, em uma forma de realização, a composição é uma composição líquida que compreende o

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113/198 polipeptídeo da invenção e um ou mais agentes de formulação selecionados da lista que consiste em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol, 1,3propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, dextrina, glicose, sacarose e sorbitol. A formulação líquida pode ser aspergida na ração após ter sido peletizada ou pode ser adicionada à água potável dada aos animais.

[00378] Para uma formulação sólida, a formulação pode ser, por exemplo, como um grânulo, pó secado por aspersão ou aglomerado (por exemplo, conforme revelado no documento n° W02000/70034). O agente de formulação pode compreender um sal (sais orgânicos ou inorgânicos de zinco, sódio, potássio ou cálcio como, por exemplo, acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol).

[00379] Em uma forma de realização, a composição é uma composição sólida, como uma composição seca por aspersão, que compreende a lisozima da invenção e um ou mais agentes de formulação selecionados da lista que consiste em cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose. Em uma forma de realização preferencial, o agente de formulação é selecionado dentre um ou mais dos compostos a seguir: sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, sulfato de magnésio e carbonato de cálcio.

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114/198 [00380] A presente invenção também se refere a grânulos/partículas de enzima que compreendem a lisozima da invenção opcionalmente combinada com uma ou mais enzimas adicionais. O grânulo é composto por um núcleo e, opcionalmente, um ou mais revestimentos (camadas externas) que circundam o núcleo.

[00381] Tipicamente, o tamanho do grânulo/partícula, medido como diâmetro esférico equivalente (tamanho médio de partícula baseado em volume), do grânulo é 20 a 2.000 pm, particularmente, 50 a 1.500 pm, 100 a 1.500 pm ou 250 a 1.200 pm.

[00382] O núcleo pode ser preparado por granulação de uma mescla dos ingredientes, por exemplo, por um método que compreende técnicas de granulação, como cristalização, precipitação, revestimento de tambor, revestimento de leito fluido, aglomeração de leito fluido, atomização rotatória, extrusão, perolação, esferonização, métodos de redução de tamanho, granulação de tambor e/ou granulação de alto cisalhamento.

[00383] Métodos para preparar o código podem ser encontrados em Handbook of Powder Technology; Particle size enlargement by C. E. Capes; Volume 1; 1980; Elsevier. Os métodos de preparação incluem tecnologias de formulação de ração e grânulo, por exemplo:

a) produtos secados por aspersão, em que uma solução que contém enzima líquida é atomizada em uma torre de secagem por aspersão para formar gotículas pequenas que, durante o seu trajeto, a torre de secagem se seca para formar um material particulado que contém enzima;

b) produtos em camada, em que a enzima é revestida como uma camada em tomo de uma partícula de núcleo inerte pré-formada, em que uma solução que contém enzima é atomizada, tipicamente em um aparelho de leito fluido em que as partículas de núcleo pré-formadas são fluidizadas, e a solução que contém enzima adere às partículas de núcleo e secam para deixar uma camada de enzima seca na superfície da partícula de núcleo. As

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115/198 partículas de um tamanho desejado podem ser obtidas dessa maneira se uma partícula de núcleo útil do tamanho desejado puder ser encontrada. Esse tipo de produto é descrito, por exemplo, no documento n° WO 97/23606;

c) partículas de núcleo absorvidas, em que em vez de revestir a enzima como uma camada em tomo do núcleo, a enzima é absorvida em e/ou na superfície do núcleo. Tal processo é descrito no documento n° WO 97/39116.

d) produtos de extrusão ou peletizados, em que uma pasta que contém enzima é pressionada em péletes ou é extrudada sob pressão através de uma abertura pequena e cortada em partículas que são subsequentemente secas. Tais partículas têm normalmente um tamanho considerável devido ao fato de que o material em que a abertura de extrusão é feita (normalmente uma placa com orifícios) define um limite na queda de pressão permissível sobre a abertura de extrusão. Adicionalmente, as pressões de extrusão muito altas durante o uso de uma abertura pequena aumentam a geração de calor na pasta de enzima, que é nociva à enzima;

e) produtos perolizados, em que um pó que contém enzima é suspenso em cera fundida e a suspensão é aspergida, por exemplo, através de um atomizador de disco giratório, em uma câmara de resfriamento, em que as gotículas solidificam rapidamente (Michael S. Showell (editor); Powdered detergents', Surfactant Science Series; 1998; volume 71; páginas 140 a 142; Marcel Dekker). O produto obtido é um em que a enzima é uniformemente distribuída ao longo de um material inerte em vez de ser concentrada em sua superfície. Adicionalmente, os documentos n° US 4.016.040 e US 4.713.245 são documentos que se referem a essa técnica;

f) produtos de granulação de misturador, em que um líquido é adicionado a uma composição de pó seco de, por exemplo, componentes de granulação convencionais, em que a enzima é introduzida por meio do líquido ou do pó ou ambos. O líquido e o pó são misturados e, visto que a

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116/198 umidificação do líquido é absorvida no pó seco, os componentes do pó seco começarão a aderir e aglomerar e as partículas se acumularão, formando granulados que compreendem a enzima. Tal processo é descrito no documento n° US 4.106.991 e nos documentos relacionados n° EP 170360, EP 304332, EP 304331, WO 90/09440 e WO 90/09428. Em um produto particular desse processo em que vários misturadores de alto cisalhamento podem ser usados como granuladores, os granulados que consistem em enzima, como enzima, cargas e aglutinantes etc. são misturados com fibras de celulose para reforçar as partículas para gerar o chamado granulado T. As partículas reforçadas, mais robustas, liberam menos poeira enzimática.

g) redução de tamanho, em que os núcleos são produzidos por moagem ou trituração de partículas maiores, péletes, tabletes, briquetes, etc. que contêm a enzima. A fração de partícula de núcleo desejada é obtida peneirando-se o produto moído ou triturado. As partículas dimensionadas de modo excessivo ou moderado podem ser recicladas. A redução de tamanho é descrita em (Martin Rhodes (editor); Principles of Powder Technology; 1990; Capítulo 10; John Wiley & Sons);

h) granulação de leito fluido, que envolve suspender particulados em uma corrente de ar e aspergir um líquido nas partículas fluidizadas por meio de bocais. As partículas acertadas por gotículas de aspersão se tomam úmidas e se tomam pegajosas. As partículas pegajosas colidem com outras partículas e aderem às mesmas e formam um grânulo;

i) os núcleos podem ser submetidos à secagem, como em um secador de leito fluido. Outros métodos conhecidos para secar grânulos na indústria de ração ou detergente podem ser usados pelo versado na técnica. A secagem ocorre preferencialmente em uma temperatura de produto de 25 a 90 °C. Para algumas enzimas, é importante que os núcleos que compreendem a enzima contenham uma baixa quantidade de água antes de revestimento. Se as enzimas sensíveis à água são revestidas antes de água excessiva ser removida,

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117/198 as mesmas serão retidas no núcleo e podem afetar a atividade da enzima negativamente. Após a secagem, os núcleos contêm preferencialmente 0,1 a 10% p/p de água.

[00384] O núcleo pode incluir materiais adicionais, como cargas, materiais de fibra (celulose ou fibras sintéticas), agentes estabilizadores, agentes solubilizantes, agentes de suspensão, agentes de regulagem de viscosidade, esferas de luz, plastificantes, sais, lubrificantes e fragrâncias.

[00385] O núcleo pode incluir um aglutinante, como polímero sintético, cera, gordura ou carboidrato.

[00386] O núcleo pode incluir um sal de um cátion multivalente, um agente redutor, um antioxidante, um catalisador de decomposição de peróxido e/ou um componente de tampão ácido, tipicamente como uma mescla homogênea.

[00387] Em uma forma de realização, o núcleo compreende um material selecionado do grupo que consiste em sais (como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), moléculas orgânicas pequenas, amido, farinha, celulose e minerais e minerais de argila (também conhecidos como filossilicatos de alumínio hidratado). Em uma forma de realização, o núcleo compreende um mineral de argila, como caulinita ou caulim.

[00388] O núcleo pode incluir uma partícula inerte com a enzima

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118/198 absorvida no mesmo, ou aplicada na superfície, por exemplo, por revestimento de leito fluidizado.

[00389] O núcleo pode ter um diâmetro de 20 a 2.000 pm, particularmente, 50 a 1.500 pm, 100 a 1.500 pm ou 250 a 1.200 pm.

[00390] O núcleo pode ser circundado por pelo menos um revestimento, por exemplo, para melhorar a estabilidade de armazenamento, para reduzir a formação de poeira durante manipulação, ou para colorir o grânulo. O revestimento opcional (ou revestimentos opcionais) pode incluir um sal e/ou cera e/ou revestimento de farinha, ou outros materiais de revestimento adequados.

[00391] O revestimento pode ser aplicado em uma quantidade de pelo menos 0,1% em peso do núcleo, por exemplo, pelo menos 0,5%, 1% ou 5%. A quantidade pode ser no máximo 100%, 70%, 50%, 40% ou 30%.

[00392] O revestimento tem, de preferência, pelo menos 0,1 pm de espessura, particularmente, pelo menos 0,5 pm, pelo menos 1 pm ou pelo menos 5 pm. Em algumas formas de realização, a espessura do revestimento está abaixo de 100 pm, como abaixo de 60 pm, ou abaixo de 40 pm.

[00393] O revestimento deve encapsular a unidade de núcleo formando uma camada substancialmente contínua. Uma camada substancialmente contínua é entendida como um revestimento que tem poucos ou nenhum orifício, de modo que uma unidade de núcleo seja encapsulada ou envolvida com poucas ou nenhuma área envolvida. A camada ou o revestimento deve ser, em particular, homogêneo em espessura.

[00394] O revestimento pode conter adicionalmente outros materiais conforme conhecido na técnica, por exemplo, cargas, agentes antipegajosidade, pigmentos, tintas, plastificantes e/ou aglutinantes, como dióxido de titânio, caulim, carbonato de cálcio ou talco.

[00395] Um revestimento de sal pode compreender pelo menos 60% em peso de um sal, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo

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119/198 menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em peso.

[00396] O sal pode ser adicionado a partir de uma solução de sal, em que o sal é completamente dissolvido ou a partir de uma suspensão de sal em que as partículas finas são menores do que 50 pm, como menores do que 10 pm ou menores do que 5 pm.

[00397] O revestimento de sal pode compreender um único sal ou uma mistura de dois ou mais sais. O sal pode ser solúvel em água, em particular, que tem uma solubilidade pelo menos 0,1 g em 100 g de água a 20 °C, preferencialmente pelo menos 0,5 g por 100 g de água, por exemplo, pelo menos 1 g por 100 g de água, por exemplo, pelo menos 5 g por 100 g de água. [00398] O sal pode ser um sal inorgânico, por exemplo, sais de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples (menos do que 10 átomos de carbono, por exemplo, 6 ou menos átomos de carbono), como citrato, malonato ou acetato. Os exemplos de cátions nesses sais são íons de metal alcalino ou metal alcalinoterroso, o íon de amônio ou íons metálicos da primeira série de transição, tal como sódio, potássio, magnésio, cálcio, zinco ou alumínio. Exemplos de ânions incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, sulfito, bissulfito, tiossulfato, fosfato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, hipofosfito, pirofosfato de dihidrogênio, tetraborato, borato, carbonato, bicarbonato, metassilicato, citrato, malato, maleato, malonato, succinato, sorbato, lactato, formato, acetato, butirato, propionato, benzoato, tartrato, ascorbato ou gluconato. Em particular, podem ser usados sais de metal alcalino ou metal alcalinoterroso de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples, tais como citrato, malonato ou acetato.

[00399] O sal no revestimento pode ter uma umidade constante a 20 °C acima de 60%, particularmente acima de 70%, acima de 80% ou acima de 85%, ou pode ser outra forma de hidrato de tal sal (por exemplo, anidrato). O

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120/198 revestimento de sal pode ser conforme descrito nos documentos n° WO1997/05245, WO1998/54980, WO1998/55599, W02000/70034,

W02006/034710, W02008/017661, W02008/017659, W02000/020569, W02001/004279, WO1997/05245, W02000/01793, W02003/059086, W02003/059087, W02007/031483, W02007/031485, W02007/044968, WO2013/192043, WO2014/014647 e WO2015/197719 ou revestimento polimérico conforme descrito no documento n° WO 2001/00042.

[00400] Os exemplos específicos de sais adequados são NaCl (CH20°C = 76%), Na₂CO₃ (CH20°C=92%), NaNO₃ (CH20°C=73%), Na₂HPO₄(CH20°C=95%), Na₃PO₄ (CH25°C=92%), NH₄C1 (CH20°C = 79,5%), (NH₄)₂HPO₄ (CH20°C = 93,0%), NH₄H₂PO₄ (CH20°C = 93,1%), (NH₄)₂SO₄(CH20°C=81,l%), KC1 (CH20°C=85%), K₂HPO₄ (CH20°C=92%), KH₂PO₄(CH20°C=96,5%), KNO₃ (CH20°C=93,5%), Na₂SO₄ (CH20°C=93%), K₂SO₄(CH20°C=98%), KHSO₄ (CH20°C=86%), MgSO₄ (CH20°C=90%), ZnSO₄(CH20°C=90%) e citrato de sódio (CH25°C=86%). Outros exemplos incluem NaH2PO4, (NH4)H2PO4, CuSO4, Mg(NO3)2, acetato de magnésio, acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco e sorbato de zinco.

[00401] O sal pode estar em forma anidra ou pode ser um sal hidratado, isto é, um hidrato de sal cristalino com água (ou águas) ligada de cristalização, tal como descrito no documento WO 99/32595. Os exemplos específicos incluem sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄), sulfato de magnésio anidro (MgSO₄), sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO₄.7H₂O), zinco sulfato hepta-hidratado (ZnSO₄.7H₂O), fosfato de sódio dibásico heptahidratado (Na₂HPO₄.7H₂O), nitrato de magnésio hexa-hidratado

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121/198 (Mg(NO3)2(6H₂O)), citrato de sódio di-hidratado e acetato de magnésio tetrahidratado.

[00402] De preferência, o sal é aplicado como uma solução do sal, por exemplo, com o uso de um leito fluidizado.

[00403] Um revestimento de cera pode compreender pelo menos 60% em peso de uma cera, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em peso.

[00404] Os exemplos específicos de ceras são polietileno glicóis; polipropilenos; cera de Carnaúba; cera de Candelilla; cera de abelhas; óleo vegetal hidrogenado ou sebo animal, como polietileno glicol (PEG), metil hidroxi-propil celulose (MHPC), álcool polivinílico (PVA), sebo bovino hidrogenado, óleo de palma hidrogenado, sementes de algodão hidrogenadas e/ou óleo de soja hidrogenado; álcoois de ácido graxo; monoglicerídeos e/ou diglicerídeos, como estearato de glicerila, em que estearato é uma mistura de ácido esteárico e palmítico; cera microcristalina; parafinas; e ácidos graxos, como ácidos graxos de cadeia longa linear hidrogenada e derivados dos mesmos. Uma cera preferida é óleo de palma ou óleo de palma hidrogenado.

[00405] O grânulo pode compreender um núcleo que compreende a lisozima da invenção, um ou mais revestimentos de sal e um ou mais revestimentos de cera. Os exemplos de grânulos de enzima com múltiplos revestimentos são mostrados nos documentos n° WO1993/07263, WO1997/23606 e WO2016/149636.

[00406] Os granulados de não polvilhamento podem ser produzidos, por exemplo, conforme revelado nas Patentes n° U.S. 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Os materiais de revestimento podem ser materiais de revestimento cerosos e materiais de revestimento de formação de filme. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol,

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PEG) com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxilados que têm de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e monoe di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados no documento n° GB 1483591.

[00407] O granulado pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais. Cada enzima estará, então, presente em mais grânulos, o que garante distribuição mais uniforme das enzimas, e também reduz a segregação física de enzimas diferentes devido a tamanhos de partícula diferentes. Os métodos para produzir cogranulados de múltiplas enzimas são revelados na revelação de ip.com IPCOM000200739D.

[00408] Um outro exemplo de formulação de enzimas pelo uso de cogranulados é revelado no documento n° WO 2013/188331.

[00409] A presente invenção também se refere a enzimas protegidas preparadas de acordo com o método revelado no documento n° EP 238.216.

[00410] Assim, em um outro aspecto, a presente invenção fornece um grânulo que compreende:

(a) um núcleo que compreende uma lisozima de acordo com a invenção e (b) um revestimento que consiste em uma ou mais camadas que circundam o núcleo.

Em uma forma de realização, o revestimento compreende um revestimento de sal, conforme descrito no presente documento. Em uma forma de realização, o revestimento compreende um revestimento com cera, conforme descrito no presente documento. Em uma forma de realização, o revestimento compreende um revestimento de sal seguido por um revestimento de cera, conforme descrito no presente documento.

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123 / 198 [00411] Aditivos de Ração Animal [00412] A presente invenção também se refere a aditivos de ração animal que compreende uma ou mais variantes de lisozimas da invenção. Dessa forma, em uma forma de realização, a invenção se refere a um aditivo de ração animal que compreende um ou mais polipeptídeos GH25 que têm atividade de lisozima, em que o polipeptideo é selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptideo que tem pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 3;

(b) um polipeptideo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 6;

(c) um polipeptideo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 9;

(d) um polipeptideo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 12;

(e) um polipeptideo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 15;

(f) um polipeptideo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 18;

(g) um polipeptideo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 21;

(h) um polipeptideo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência

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124/198 com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 24;

(n) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal;

(o) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (p) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) que tem atividade de lisozima e que tem pelo

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125 / 198 menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

[00413] Em uma forma de realização, o um ou mais polipeptídeos GH25 compreendem o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW (SEQ ID NO: 40).

[00414] Em uma forma de realização, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 204 de SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 203 de SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 204 de SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 de SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 216 de SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 217 de SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 33 ou aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 38.

[00415] Em uma forma de realização preferencial, o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00416] Em uma forma de realização, o aditivo de ração animal compreende um ou mais agentes de formulação, preferencialmente conforme descrito acima no presente documento.

[00417] Em uma forma de realização, o aditivo de ração animal compreende uma ou mais enzimas adicionais, preferencialmente conforme descrito abaixo no presente documento.

[00418] Em uma forma de realização, o aditivo de ração animal compreende um ou mais probióticos, preferencialmente conforme descrito abaixo no presente documento.

[00419] Em uma forma de realização, o aditivo de ração animal

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126/198 compreende uma ou mais vitaminas, preferencialmente conforme descrito abaixo no presente documento.

[00420] Em uma forma de realização, o aditivo de ração animal compreende um ou mais minerais, preferencialmente conforme descrito abaixo no presente documento.

[00421] Em uma forma de realização, o aditivo de ração animal compreende um ou mais aminoácidos, preferencialmente conforme descrito abaixo no presente documento.

[00422] Em uma forma de realização, o aditivo de ração animal compreende um ou mais prebióticos, preferencialmente conforme descrito abaixo no presente documento.

[00423] Em uma forma de realização, o aditivo de ração animal compreende um ou mais ácidos orgânicos, preferencialmente conforme descrito abaixo no presente documento.

[00424] Em uma forma de realização, o aditivo de ração animal compreende um ou mais fitogênicos, preferencialmente conforme descrito abaixo no presente documento.

[00425] Ração Animal [00426] A presente invenção também se refere a composições de ração animal que compreende uma ou mais variantes de lisozimas da invenção. Em uma forma de realização, a invenção se refere a uma ração animal que compreende o grânulo conforme descrito no presente documento e o material à base de planta. Em uma forma de realização, a invenção se refere a uma ração animal que compreende o aditivo de ração animal conforme aqui descrito e o material à base de planta.

[00427] As composições ou dietas de rações animais têm um teor de proteína relativamente elevado. As dietas de aves domésticas e porcos podem ser caracterizadas como indicado na Tabela B do documento n° WO 01/58275, colunas 2 a 3. As dietas de peixes podem ser caracterizadas como

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127 / 198 indicado na coluna 4 desta Tabela B. Além do mais, tais dietas de peixes têm um teor de gordura em bruto de 200 a 310 g/kg.

[00428] Uma composição de ração animal, de acordo com a invenção, tem um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e, ademais, compreende pelo menos uma lisozima conforme aqui reivindicado.

[00429] Adicional ou alternativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção tem um teor de energia metabolizável de 10 a 30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1 a 200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1 a 200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1 a 100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1 a 150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5 a 50 g/kg.

[00430] Em formas de realização particulares, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina está dentro de qualquer uma das gamas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B do documento n° WO 01/58275 (R. 2-5).

[00431] A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, isto é, proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14^a edição, Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

[00432] A energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC Nutrient requirements in swine, nona edição revista 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., páginas 2 a 6, e o European Table of Energy Values for Poultry Feedstuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN, 90-71463-12-5.

[00433] O teor na dieta de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em

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128/198 dietas animais completas é calculado com base em tabelas de ração tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN, 90-72839-13-7.

[00434] Em uma forma de realização específica, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína vegetal, conforme definido acima.

[00435] A composição de ração animal da invenção também pode conter proteína animal, tal como Farinha de Carne e Ossos, Farinha de penas e/ou Farinha de Peixe, tipicamente em uma quantidade de 0 a 25%. A composição de ração animal da invenção também pode compreender Grãos Secos Destilados com Solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0 a 30%.

[00436] Em formas de realização ainda particulares adicionais, a composição de ração animal da invenção contém mais a 0 a 80%; e/ou massambala a 0 a 80%; e/ou trigo a 0 a 70%; e/ou cevada a 0 a 70%; e/ou aveias a 0 a 30%; e/ou farelo de soja a 0 a 40%; e/ou farelo de peixe a 0 a 25%; e/ou farelo de carne e ossos a 0 a 25%; e/ou soro de leite coalhado a 0 a 20%.

[00437] A ração animal pode compreender proteínas vegetais. Em formas de realização particulares, o teor de proteínas das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% (p/p). As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteínas vegetais, como legumes e cereais, por exemplo materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, como farinha de soja, farinha de tremoço, farinha de colza, e combinações dos mesmos.

[00438] Em uma forma de realização particular, a fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão. Em outra forma de realização particular, a

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129/198 fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba-sacarina, espinafre ou quinoa. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são colza, e couve. Em outra forma de realização particular, a soja é uma fonte de proteínas vegetais preferencial. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são cereais como cevada, trigo, centeio, aveia, mais (milho), arroz e massambala. [00439] As dietas animais podem, por exemplo, ser fabricadas como ração esmagada (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os gêneros alimentares são misturados e quantidades suficientes de vitaminais e minerais essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzimas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração esmagada, uma formulação de enzimas sólida ou líquida pode ser adicionada antes de ou durante a etapa de mistura dos ingredientes. Para ração peletizada, a preparação de lisozima/enzimas (líquida ou sólida) pode ser também adicionada antes de ou durante a etapa de ingredientes da ração. Tipicamente, uma preparação de lisozima/enzima líquida compreende a lisozima da invenção opcionalmente com um poliol, como glicerol, etilenoglicol ou propilenoglicol, e é adicionada após a etapa de peletização, como aspergindo-se a formulação líquida nos péletes. A enzima também pode ser incorporada em um aditivo ou pré-mistura de ração.

[00440] Altemativamente, a lisozima pode ser preparada congelandose uma mistura de solução de enzima líquida com um agente de volume como farinha de soja moída e, então, liofilizando-se a mistura.

[00441] A concentração de enzima final na dieta está na faixa de 0,01 a 200 mg de proteína de enzima por kg de dieta, preferencialmente entre 0,05 a 100 mg/kg de dieta, mais preferencialmente 0,1 a 50 mg, até mais preferencialmente 0,2 a 20 mg de proteína de enzima por kg de dieta animal.

[00442] Está presentemente contemplado que a enzima seja

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130/198 administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (gamas de dosagem): 0,01 a 200; 0,05 a 100; 0,1 a 50; 0,2 a 20; 0,1 a 1; 0,2 a 2; 0,5 a 5; ou 1 a 10; sendo que todas essas gamas estão em mg de proteína de lisozima por kg de ração (ppm).

[00443] Para determinar mg de proteína de lisozima por kg de ração, a lisozima é purificada da composição de ração, e a atividade específica da lisozima purificada é determinada com o uso de um ensaio relevante (vide sob atividade de lisozima). A atividade de lisozima da composição de ração como tal também é determinada com o uso do mesmo ensaio, e com base nessas duas determinações, a dosagem em mg de proteína de lisozima por kg de ração é calculada.

[00444] Em uma forma de realização específica, o aditivo de ração animal da invenção se destina a ser incluído (ou prescrito como tendo que ser incluído) em dietas ou rações animais em níveis de 0,01 a 10,0%; mais particularmente, 0,05 a 5,0%; ou 0,2 a 1,0% (% significando g de aditivo por 100 g de ração). Isto é assim em particular para pré-misturas.

[00445] Os mesmos princípios se aplicam para determinar a mg de proteína de lisozima em aditivos de ração. Logicamente, se uma amostra estiver disponível a partir da lisozima usada para preparar o aditivo de ração ou a ração, a atividade específica é determinada a partir dessa amostra (sem necessidade de purificar a lisozima a partir da composição de ração ou do aditivo).

[00446] Assim, em um aspecto adicional, a presente invenção também se refere a uma ração animal que compreende uma ou mais lisozimas da invenção e material à base de plantas. Em um outro aspecto, a presente invenção também se refere a uma ração animal que compreende o aditivo de ração animal da invenção (conforme aqui descrito) e o material à base de planta.

[00447] Assim, em uma forma de realização, a invenção se refere a um

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131/198 aditivo de ração animal que compreende material à base de planta e um ou mais polipeptídeos GH25 que têm atividade de lisozima, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

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132/198 (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, como pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 30;

[00448] Em uma forma de realização, o um ou mais polipeptídeos GH25 compreendem o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW (SEQ ID NO: 40).

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133/198 [00449] Em uma forma de realização, o polipeptideo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 204 de SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 203 de SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 204 de SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 de SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 216 de SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 217 de SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 33 ou aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 38.

[00450] Em uma forma de realização preferencial, o polipeptideo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente, <0,02 ou com a máxima preferência, <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett, em que a atividade de lisozima é determinada conforme descrito no exemplo 1.

[00451] Em uma forma de realização, o material à base de planta é selecionado a partir do grupo que consiste em legumes, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, mais, milho, massambala, gramíneas, milheto, milhetopérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-terário, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, vagem, feijão largo (feijãofava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma forma processada da mesma (como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer combinação dos mesmos.

[00452] Em uma forma de realização adicional, a ração animal foi peletizada.

[0045 3] Enzimas Adicionais [00454] Em outra forma de realização, as composições descritas aqui incluem opcionalmente uma ou mais enzimas. As enzimas podem ser

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134/198 classificadas com base no manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992, consultar também o site ENZYME na internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME é um repositório de informação em relação à nomenclatura de enzimas. E principalmente baseado nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, e descreve cada tipo de enzima caracterizada para qual um número de EC (Comissão de Enzima) foi fornecido (Bairoch A. The ΕΝΖΥΜΕ database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Esta nomenclatura de Enzimas IUBMB é baseada na sua especificidade quanto ao substrato e ocasionalmente no seu mecanismo molecular; uma tal classificação não reflete as características estruturais destas enzimas.

[00455] Uma outra classificação de certas enzimas de glicosídeo hidrolase, como endoglucanase, xilanase, galactanase, mananase, dextranase, lisozima e galactosidase, é descrita em Henrissat et al, The carbohydrateactive enzymes database (CAZy) em 2013, Nucl. Acids Res. (1 de janeiro de 2014) 42 (Dl): D490-D495; consultar também www.cazy.org.

[00456] Assim, a composição da invenção também pode compreender pelo menos uma outra enzima selecionada do grupo que compreende fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4); fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase, tal como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55); betaxilosidase (EC 3.2.1.37); acetil xilana esterase (EC 3.1.1.72); feruloil esterase (EC 3.1.1.73); celulase (EC 3.2.1.4); celobioidrolases (EC 3.2.1.91); betaglucosidase (EC 3.2.1.21); pululanase (EC 3.2.1.41), alfa-manosidase (EC 3.2.1.24), mananase (EC 3.2.1.25) e beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6), ou qualquer mistura das mesmas.

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135/198 [00457] Em uma forma de realização específica, a composição da invenção compreende uma fitase (EC 3.1.3,8 ou 3.1.3.26). Exemplos de fitases comercialmente disponíveis incluem Bio-Feed™ Phytase (Novozymes), Ronozyme® P, Ronozyme® NP e Ronozyme® HiPhos (DSM Nutritional Products), Natuphos™ (BASF), Natuphos™ E (BASF), Finase® e Quantum® Blue (AB Enzymes), OptiPhos® (Huvepharma), AveMix® Phytase (Aveve Biochem), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) e Axtra® PHY (DuPont). Outras fitases preferenciais incluem aquelas descritas, por exemplo, nos documentos n° WO 98/28408, WO 00/43503, e WO 03/066847. [00458] Em uma forma de realização específica, a composição da invenção compreende uma xilanase (EC 3,2.1.8). Exemplos de xilanases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® WX (DSM Nutritional Products), Econase® XT e Barley (AB Vista), Xylathin® (Verenium), Hostazym® X (Huvepharma), Axtra® XB (Xilanase/beta-glucanase, DuPont) e Axtra® XAP (Xilanase/amilase/protease, DuPont), AveMix® XG 10 (xilanase/glucanase) e AveMix® 02 CS (xilanase/glucanase/pectinase, Aveve Biochem), e Naturgrain (BASF).

[00459] Em uma forma de realização específica, a composição da invenção compreende uma protease (EC 3.4). Os exemplos de proteases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products).

[00460] Em uma forma de realização particular, a composição da invenção compreende uma alfa-amilase (EC 3.2.1.1). Os exemplos de alfaamilases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® A e RONOZYME® RumiStar™ (DSM Nutritional Products).

[00461] Em uma forma de realização, a composição da invenção compreende um produto de enzima multicomponentes, como FRA® Octazyme (Framelco), Ronozyme® G2, Ronozyme® VP e Ronozyme® MultiGrain (DSM Nutritional Products), Rovabio® Excel ou Rovabio®

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Advance (Adisseo).

[00462] Eubióticos [00463] Os eubióticos são compostos que são projetados para fornecer um equilíbrio saudável da microflora no trato gastrointestinal. Os eubióticos abrangem vários aditivos de ração diferentes, como probióticos, prebióticos, fitogênicos (óleos essenciais) e ácidos orgânicos, que são descritos em mais detalhes abaixo.

[00464] Probióticos [00465] Em uma forma de realização, a composição de ração animal compreende adicionalmente um ou mais probióticos adicionais. Em uma forma de realização particular, a composição de ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer combinação dos mesmos.

[00466] Em uma forma de realização preferencial, a composição de ração animal compreende, ainda, uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp.

[00467] Em uma forma de realização mais preferencial, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente uma

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137/198 bactéria de uma ou mais das cepas a seguir de Bacillus subtilis: 3A-P4 (PTA6506), 15A-P4 (PTA-6507), 22C-P1 (PTA-6508), 2084 (NRRL B-500130), LSSA01 (NRRL-B-50104), BS27 (NRRL B-501 05), BS 18 (NRRL B50633), BS 278 (NRRL B-50634), DSM 29870, DSM 29871, DSM 32315, NRRL B-50136, NRRL B-50605, NRRL B-50606, NRRL B-50622 e PTA7547.

[00468] Em uma forma de realização mais preferencial, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das cepas a seguir de Bacillus pumilus: NRRL B50016, ATCC 700385, NRRL B-50885 ou NRRL B-50886.

[00469] Em uma forma de realização mais preferencial, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das cepas a seguir de Bacillus lichenformis: NRRL B 50015, NRRL B-50621 ou NRRL B-50623.

[00470] Em uma forma de realização mais preferencial, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das cepas a seguir de Bacillus amyloliquefaciens: DSM 29869, DSM 29869, NRRL B 50607, PTA-7543, PTA-7549, NRRL B50349, NRRL B-50606, NRRL B-50013, NRRL B-50151, NRRL B-50141, NRRL B-50147 ou NRRL B-50888.

[00471] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição de ração animal está entre 1x10⁴ e 1x10¹⁴ CFU/kg de matéria seca, preferencialmente entre IxlO⁶ e 1x10¹² CFU/kg de matéria seca e mais preferencialmente entre 1x10⁷ e IxlO¹¹ CFU/kg de matéria seca. Em uma forma de realização mais preferencial, a contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição de ração animal está entre IxlO⁸ e IxlO¹⁰CFU/kg de matéria seca.

[00472] A contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração animal está entre IxlO⁵ e IxlO¹⁵ CFU/animal/dia,

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138/198 preferencialmente entre IxlO⁷ e IxlO¹³ CFU/animal/dia, e mais preferencialmente entre IxlO⁸ e IxlO¹² CFU/animal/dia. Em uma forma de realização mais preferencial, a contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração animal está entre IxlO⁹ e IxlO¹¹CFU/animal/dia.

[00473] Em outra forma de realização, a uma ou mais estirpes bacterianas estão presentes na forma de um esporo estável.

[00474] Exemplos de produtos comerciais são Cylactin® (DSM

Nutritional Products), Alterion (Adisseo), Enviva PRO (DuPont Animal Nutrition), Syncra® (enzima misturada + probiótico, DuPont Animal Nutrition), Ecobiol® e Fecinor® (Norel/Evonik) e GutCare® PY1 (Evonik). [00475] Prebióticos [00476] Os prebióticos são substâncias que induzem o crescimento ou atividade de micro-organismos (por exemplo, bactérias e fungos) que contribuem para o bem-estar de seu hospedeiro. Os prebióticos são tipicamente compostos de fibra não digeríveis que passam não digeridos através da parte superior do trato gastrointestinal e estimulam o crescimento ou atividade de bactérias vantajosas que colonizam o intestino grosso atuando-se como substrato para os mesmos. Normalmente, os prebióticos aumentam o número ou atividade de bifidobactérias e bactérias de ácido láctico no trato GI.

[00477] Os derivados de levedura (leveduras totais desativadas ou paredes de célula de levedura) também podem ser considerados como prebióticos. Os mesmos compreendem adicionalmente mananooligossacarídeos, beta-glucanos de levedura ou teores de proteína e são normalmente derivados da parede de célula da levedura, Saccharomyces cerevisiae.

[00478] Os exemplos de produtos de levedura são Yang® e Agrimos (Lallemand Animal Nutrition).

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139/198 [00479] Fitogênicos [00480] Os fitogênicos são um grupo de promotores de crescimento natural ou promotores de crescimento não antibiótico usados como aditivos de ração, derivados de ervas, temperos ou outras plantas. Os fitogênicos podem ser substâncias únicas preparadas a partir de óleos essenciais/extratos, óleos essenciais/extratos, plantas únicas e mistura de plantas (produtos herbáceos) ou mistura de óleos essenciais/extratos/plantas (produtos especializados).

[00481] Os exemplos de fitogênicos são alecrim, sálvia, orégano, tomilho, cravo e erva-limão. Os exemplos de óleos essenciais são timol, eugenol, metacresol, vanilina, salicilato, resorcina, guajacol, gingerol, óleo de lavanda, iononas, irone, eucaliptol, mentol, óleo de hortelã-pimenta, alfapineno; limoneno, anetol, linalol, di-hidrojasmonato de metila, carvacrol, ácido propiônico/propionato, ácido acético/acetato, ácido butírico/butirato, óleo de alecrim, óleo de cravo, geraniol, terpineol, citronelol, salicilato de amila e/ou benzila, cinamaldeído, polifenol de planta (tanino), extrato de açafrão e cúrcuma.

[00482] Exemplos de produtos comerciais são Crina® (DSM Nutritional Products); Cinergy™, Biacid™, ProHacidTM Classic e ProHacidTM Advance™ (todos Promivi/Cargill) e Envivo EO (DuPont Animal Nutrition).

[00483] Ácidos Orgânicos [00484] Os ácidos orgânicos (C1-C7) são amplamente distribuídos na natureza como constituintes normais de tecidos vegetais ou animais. Os mesmos também são formados através de fermentação microbiana de carboidratos principalmente no intestino grosso. Os mesmos são frequentemente usados na produção de suínos e produção de aves como uma substituição de promotores de crescimento antibiótico visto que os mesmos têm um efeito preventivo nos problemas intestinais, como enterite necrótica em galinhas e infecção por Escherichia coli em porcos jovens. Os ácidos

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140/198 orgânicos podem ser vendidos como monocomponentes ou misturas de tipicamente 2 ou 3 ácidos orgânicos diferentes. Exemplos de ácidos orgânicos são ácido propiônico, ácido fórmico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido sórbico, ácido málico, ácido acético, ácido fumárico, ácido benzoico, ácido butírico e ácido tartárico ou seu sal (tipicamente sal de sódio ou potássio, como diformato de potássio ou butirato de sódio). Exemplos de produtos comerciais são VevoVitall® (DSM Nutritional Products), Amasil®, Luprisil®, Lupro-Grain®, Lupro-Cid®, Lupro-Mix® (BASF), n-Butyric Acid AF (OXEA) e Adimix Precision (Nutriad).

[00485] Pré-mistura [00486] A incorporação da composição de aditivos de ração conforme exemplificado no presente documento acima a rações animais, por exemplo, rações de aves, é executada na prática com o uso de um concentrado ou uma pré-mistura. Uma pré-mistura designa uma mistura preferencialmente uniforme de um ou mais microingredientes com diluente e/ou carreador. As pré-misturas são usadas para facilitar a dispersão uniforme de microingredientes em uma mistura maior. Uma pré-mistura de acordo com a invenção pode ser adicionada a ingredientes de ração ou à água potável, como sólidos (por exemplo, como pó solúvel em água) ou líquidos.

[00487] Aminoácidos [00488] A composição da invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aminoácidos. Exemplos de aminoácidos que são usados em ração animal são lisina, alanina, beta-alanina, treonina, metionina e triptofano. [00489] Vitaminas e Minerais [00490] Em uma outra forma de realização, a ração animal pode incluir uma ou mais vitaminas, como uma ou mais vitaminas solúveis em água e/ou uma ou mais vitaminas solúveis em água. Em outra forma de realização, a ração animal pode incluir, opcionalmente, um ou mais minerais, como um ou mais minerais vestigiais e/ou um ou mais macrominerais

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141/198 [00491] Normalmente, as vitaminas solúveis em gordura e água, bem como os minerais vestigiais, formam parte de uma denominada pré-mistura destinada à adição à ração, embora os macrominerais sejam normalmente adicionados separadamente à ração.

[00492] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em gordura incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.

[00493] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina C, vitamina B12, biotina e colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-Dpantotenato.

[00494] Exemplos não limitantes de minerais vestigiais incluem boro, cobalto, cloreto, crômio, cobre, flúor, iodo, ferro, manganês, molibdênio, iodo, selênio e zinco.

[00495] Exemplos não limitantes de macrominerais incluem cálcio, magnésio, fósforo, potássio e sódio.

[00496] Os requisitos nutricionais destes componentes (exemplificados com aves domésticas e leitões/porcos) são listados na Tabela A do documento n° WO 01/58275. Requisito nutricional significa que esses componentes devem ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.

[00497] Em alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A do documento n° WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um de, um ou mais do que, um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze, ou até todos os quinze, componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual está incluído no aditivo da invenção em uma tal quantidade de modo a fornecer uma concentração na ração dentro da faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da Tabela A.

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142/198 [00498] Em uma forma de realização ainda adicional, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos uma das vitaminas abaixo, preferencialmente para fornecer uma concentração em ração dentro das faixas especificadas na Tabela 1 abaixo (para dietas de leitões, e dietas de frangos de corte, respectivamente).

Tabela 1: Recomendações típicas de vitaminas

Vitamina	Dieta de leitões	Dieta de frangos de corte
Vitamina A	10.000 a 15.000 lU/kg de ração	8 a 12.500 lU/kg de ração
Vitamina D3	1.800 a 2.000 lU/kg de ração	3.000 a 5.000 lU/kg de ração
Vitamina E	60 a 100 mg/kg de ração	150 a 240 mg/kg de ração
Vitamina K3	2 a 4 mg/kg de ração	2 a 4 mg/kg de ração
Vitamina B1	2 a 4 mg/kg de ração	2 a 3 mg/kg de ração
Vitamina B2	6 a 10 mg/kg de ração	7 a 9 mg/kg de ração
Vitamina B6	4 a 8 mg/kg de ração	3 a 6 mg/kg de ração
Vitamina B12	0,03 a 0,05 mg/kg de ração	0,015 a 0,04 mg/kg de ração
Niacina (Vitamina B3)	30 a 50 mg/kg de ração	50 a 80 mg/kg de ração
Ácido pantotênico	20 a 40 mg/kg de ração	10 a 18 mg/kg de ração
Ácido fólico	1 a 2 mg/kg de ração	1 a 2 mg/kg de ração
Biotina	0,15 a 0,4 mg/kg de ração	0,15 a 0,3 mg/kg de ração
Cloreto de colina	200 a 400 mg/kg de ração	300 a 600 mg/kg de ração

[00499] Outros ingredientes de ração [00500] A composição da invenção pode compreender adicionalmente agentes corantes, estabilizantes, aditivos de melhoramento do crescimento e compostos de aroma/aromatizantes, ácidos graxos polinsaturados (PUFA); espécies geradoras de oxigênio reativo, antioxidantes, peptídeos antimicrobianos, polipeptídeos antifúngicos e compostos de gerenciamento de micotoxina.

[00501] Exemplos de agentes corantes são carotenoides como betacaroteno, astaxantina e luteína.

[00502] Exemplos de compostos de aroma/aromatizantes são creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodeca-lactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, ftalídeo de propilideno, ftalídeo de butilideno, capsaicina e tanina.

[00503] Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP) são CAP 18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina, e Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000),

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Plectasinas, e Estatinas, incluindo os compostos e os polipeptídeos divulgados no documento n° WO 03/044049 e WO 03/048148, bem como variantes ou fragmentos dos acima que retenham atividade antimicrobiana.

[00504] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFP) são os peptídeos de Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, bem como suas variantes e fragmentos que retenham atividade antifúngica, como divulgado no documento n° WO 94/01459 e WO 02/090384.

[00505] Exemplos de ácidos graxos poli-insaturados são ácidos graxos poli-insaturados Cl8, C20 e C22, como ácido araquidônico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentaenoico e ácido gama-linoleico.

[00506] Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são produtos químicos como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

[00507] Antioxidantes podem ser usados para limitar o número de espécies reativas de oxigênio que podem ser geradas de modo que o nível de espécies reativas de oxigênio esteja em equilíbrio com os antioxidantes.

[00508] Micotoxinas, como desoxinivalenol, aflatoxina, zearalenona e fumonisina, podem ser encontradas na ração animal e podem resultar em desempenho animal negativo ou doença. Compostos que podem gerenciar os níveis de micotoxina, como por meio da desativação da micotoxina ou por meio da ligação da micotoxina, podem ser adicionados à ração para atenuar esses efeitos negativos. Os exemplos de compostos de gerenciamento de micotoxina são Vitafix®, Vitafix Ultra (Nuscience), Mycofix®, Mycofix® Secure, FUMzyme®, Biomin® BBSH, Biomin® MTV (Biomin), Mold-Nil®, Toxy-Nil® e Unike® Plus (Nutriad).

[00509] Uso em Ração Animal [00510] Uma lisozima da invenção pode também ser usada em ração animal, em que o termo animal se refere a todos os animais exceto seres humanos. Exemplos de animais que são animais monogástricos, por exemplo,

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144/198 porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas); aves domésticas (incluindo, mas não limitando a aves domésticas, perus, patos, codomiz, pintada, ganso, pombo, pombinho, galinha, frango, mergulhão, franga e pintos); peixes (incluindo, mas sem limitação, charuteiro, pirarucu, barbo, robalo, anchova, bocachico, goraz, peixe-gato, cachama, carpa, peixe-lobo, catla, chanos, savelino, ciclídeo, fogueteiro-galego, bacalhau, perca, dourado, calafate, enguia, caboz, peixedourado, gurami, garoupa, guapote, alabote, jamelão, labeo, lai, verdemã, cavalinha, peixe-leite, sargo, peixe-lama, tainha, pacu, pearlspot, peixe-rei, robalo, lúcio, pâmpano, ruivaca, salmão, sampa, picão, robalo-legítimo, panga, shiner, amoré, cabeça-de-cobra, lutjanídeo, falso robalo, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, peixe-doce, tenca, terror, tilápia, truta, atum, areeiro, corégono-branco, picão-verde e peixe-magro); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e gambás).

[00511] No uso de acordo com a invenção, as lisozimas podem ser alimentadas ao animal antes do, após o, ou simultaneamente com o regime alimentar. Esta última é preferencial.

[00512] Em uma forma de realização particular, a lisozima, na forma na qual é adicionada à ração, ou quando estando incluída em um aditivo de ração, está bem definida. Bem definida significa que a preparação de lisozima é pelo menos 50% pura como determinado por Cromatografia de exclusão por tamanhos (consultar Exemplo 12 do documento n° WO 01/58275). Em outras formas de realização particulares, a preparação de lisozima é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, ou pelo menos 95% pura como determinado por esse método.

[00513] Uma preparação de lisozima bem definida é vantajosa. Por exemplo, é muito mais fácil dosar corretamente à ração uma lisozima que é essencialmente livre de interferir ou contaminar outras lisozimas. O termo dosar corretamente se refere em particular ao objetivo de se obterem

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145 / 198 resultados consistentes e constantes, e à capacidade de otimizar a dosagem com base no efeito desejado.

[00514] Para o uso em ração animal, no entanto, a lisozima não necessita de ser pura; essa pode, por exemplo, incluir outras enzimas, em cujo caso deveria ser denominada uma preparação de lisozima.

[00515] A preparação de lisozima pode ser (a) adicionada diretamente à ração, ou (b) pode ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias tais como aditivos ou pré-misturas de ração que são subsequentemente adicionadas à ração (ou usadas em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima se refere à pureza da preparação de lisozima original, seja usada de acordo com (a) ou (b) acima.

[00516] A lisozima da presente invenção também pode ser usada no tratamento de enterite necrótica e/ou Clostridium perfringens.

[00517] Usos [00518] Métodos para melhorar Desempenho Animal [00519] Em uma forma de realização, a presente invenção também se refere a um método para melhorar o desempenho de um animal que compreende administrar ao animal a ração animal ou aditivo da ração animal da invenção.

[00520] Em uma forma de realização preferida, o método para melhorar o desempenho de um animal compreende administrar ao animal a ração animal ou aditivo da ração animal que compreende a lisozima selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 38.

[00521] Em uma forma de realização, a presente invenção também se refere ao uso da ração animal ou um aditivo de ração animal da invenção para melhorar o desempenho de um animal. Em uma forma de realização, a invenção se refere ao uso de uma ou mais lisozimas da invenção para

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146/198 melhorar o desempenho de um animal.

[00522] Em uma forma de realização, melhorar o desempenho de um animal significa que existe um aumento no ganho de peso corporal. Em outra forma de realização, melhorar o desempenho de um animal significa que existe uma taxa de conversão de ração melhorada. Em outra forma de realização, melhorar o desempenho de um animal significa que existe um aumento da eficiência da ração. Em outra forma de realização, melhorar o desempenho de um animal significa que existe um aumento no ganho de peso corporal e/ou uma taxa de conversão da ração melhorada e/ou um aumento da eficiência da ração.

[00523] Em uma forma de realização, a ração animal compreende o material à base de planta selecionado a partir do grupo que consiste em legumes, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, mais, milho, massambala, gramíneas, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-terário, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, vagem, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma forma processada da mesma (como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer combinação dos mesmos.

[00524] Métodos para Preparar uma Ração Animal [00525] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para preparar uma ração animal que compreende adicionar uma ou mais lisozimas da presente invenção a um ou mais ingredientes de ração animal. Os ingredientes da ração animal incluem, mas não estão limitados a concentrados (como aqui definidos), forragem (como aqui definido), enzimas, probióticos, vitaminas, minerais e aminoácidos.

[00526] Em uma forma de realização preferida, o método para preparar uma ração animal compreende misturar material à base de plantas com a

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147 / 198 lisozima selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:

6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID

NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 38.

[00527] Em uma forma de realização, o material à base de planta é selecionado a partir do grupo que consiste em legumes, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, mais, milho, massambala, gramíneas, milheto, milhetopérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-terário, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, vagem, feijão largo (feijãofava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma forma processada da mesma (como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer combinação dos mesmos.

[00528] Formas de realização da invenção [00529] Aqui segue uma lista de formas de realização preferenciais da invenção.

[00530] 1. Um método para hidrolisar peptidoglicano em paredes celulares bacterianas que compreende tratar células bacterianas com um ou mais polipeptídeos GH25 que têm atividade de lisozima, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

(e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 15;

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148/198 (f) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 18;

(g) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 21;

(h) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 24;

(i) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 27;

(j) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 30;

(k) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 33;

(l) um polipeptideo que tem pelo menos 83% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: SEQ ID NO: 38;

(o) um polipeptideo que compreende o polipeptideo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (p) um fragmento do polipeptideo de (a), (b), (c), (d), (e), (f),

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149/198

90% de identidade

85% de identidade

85% de identidade (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

[00531] 2. O método do item 1, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que tem pelo menos de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

(b) um polipeptídeo que tem pelo menos de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6;

(h) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 24;

(i) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 27;

(j) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 30;

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 33; e (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: SEQ ID NO: 38.

[00532] 3. O método do item 1, em que o polipeptídeo é selecionado

85% de identidade

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150/198 do grupo que consiste em:

(h) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 24;

(i) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 27;

(j) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 30;

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 33; e (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: SEQ ID NO: 38.

[00533] 4. O método do item 1, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade

90%

90% de identidade de identidade de identidade de identidade de identidade de identidade de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

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151/198

95% de identidade

95% de identidade (b) um polipeptídeo que tem pelo menos de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6;

(h) um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 24;

(i) um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 27;

(j) um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 30;

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 33;

(l) um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: SEQ ID NO: 38; e (m) uma variante do polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 38, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4,

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152/198

5, 6, 7, 8, 9 ou 10 posições;

[00534] 5. O método de qualquer um dos itens 1 a 4, em que o polipeptideo compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW (SEQ ID NO: 40).

[00535] 6. O método de qualquer um dos itens 1 a 5, em que o polipeptideo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 217 de SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 33 ou aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 38.

[00536] 7. O método de qualquer um dos itens 1 a 6, em que o polipeptideo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente <0,02 ou com a máxima preferência <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett.

[00537] 8. O método de qualquer um dos itens 1 a 6, em que a atividade de lisozima é determinada mediante a medição da diminuição em densidade óptica de uma solução de células de Micrococcus lysodeikticus ressuspensas, de preferência, células de Micrococcus luteus ATCC 4698.

[00538] 9. Um grânulo que compreende um ou mais polipeptídeos

GH25 que têm atividade de lisozima, em que o polipeptideo é selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptideo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 3;

(b) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade

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153/198

80% de identidade

80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6;

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154/198 (n) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal;

[00539] 10. O grânulo do item 9, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

(b) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6;

(c) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9;

(d) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12;

(e) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 15;

(f) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 18;

(g) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 21;

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155/198

90% de identidade

90% de identidade (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 30;

[00540] 11.0 grânulo do item 9, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de

90% de identidade

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156/198

95% de identidade

95% de identidade sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 33; e (1) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: SEQ ID NO: 38.

[00541] 12. O grânulo do item 9, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 33; e (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: SEQ ID NO: 38; e

95% de identidade

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157/198 (m)uma variante do polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 38, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 posições;

13. O grânulo de qualquer um dos itens 9 a 12, em que o polipeptídeo compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW (SEQ ID NO: 40).

[00542] 14. O grânulo de qualquer um dos itens 9 a 13, em que o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 203 de SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 204 de SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 de SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 216 de SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 217 de SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 33 ou aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 38.

[00543] 15. O grânulo de qualquer um dos itens 9 a 14, em que o polipeptídeo tem atividade de lisozima significativamente melhorada em comparação com a atividade da SEQ ID NO: 39, em que a significância é <0,05, de preferência, <0,04, mais preferencialmente, <0,03, ainda preferencialmente <0,02 ou com a máxima preferência <0,01 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett.

[00544] 16. O grânulo do item 15, em que a atividade de lisozima é determinada mediante a medição da diminuição em densidade óptica de uma solução de células de Micrococcus lysodeikticus ressuspensas, de preferência,

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158/198 células de Micrococcus luteus ATCC 4698.

[00545] 17. O grânulo de qualquer um dos itens 9 a 16, em que o grânulo compreende um ou mais agentes de formulação.

[00546] 18. O grânulo do item 17, em que o agente de formulação é selecionado da lista que consiste em glicerol, etilenoglicol, 1,2propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, caulim e celulose, de preferência, selecionado da lista que consiste em 1,2-propilenoglicol, 1,3-propilenoglicol, sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, caulim e carbonato de cálcio.

[00547] 19. O grânulo de qualquer um dos itens 9 a 18, em que o grânulo compreende uma partícula de núcleo e um ou mais revestimentos.

[00548] 20. O grânulo do item 19, em que o revestimento compreende sal e/ou cera e/ou farinha.

[00549] 21. O grânulo de qualquer um dos itens 9 a 20, em que compreende, ainda, uma ou mais enzimas adicionais.

[00550] 22. O grânulo do item 21, em que a uma ou mais enzimas adicionais são selecionadas do grupo que consiste em fitase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, protease, fosfolipase Al, fosfolipase A2, lisofosfolipase, fosfolipase C, fosfolipase D, amilase, lisozima, arabinofuranosidase, beta-xilosidase, acetil xilana esterase, feruloíl esterase, celulase, celobioidrolases, beta-glucosidase, pululanase, e betaglucanase ou qualquer combinação das mesmas.

[00551] 23. O grânulo de qualquer um dos itens 9 a 22, que compreende adicionalmente um ou mais probióticos.

[00552] 24. O grânulo do item 23, em que o um ou mais probióticos são selecionados do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Bacillus

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159/198 licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cercus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium sp., Camobacterium sp., Clostridium butyricum, Clostridium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Megasphaera elsdenii, Megasphaera sp., Pediococsus acidilactici, Pediococcus sp., Propionibacterium thoenii, Propionibacterium sp. e Streptococcus sp. ou qualquer combinação dos mesmos.

[00553] 25. Um polipeptideo isolado que tem atividade de lisozima, selecionado do grupo que consiste em:

(b) um polipeptideo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 6;

(c) um polipeptideo que tem pelo menos 91% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 9;

(d) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 12;

(e) um polipeptideo que tem pelo menos 86% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 15;

(f) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 21;

(g) um polipeptideo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 24;

(h) um polipeptideo que tem pelo menos 87% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 27;

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160/198 (i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 30;

(j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 33;

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 38;

(l) uma variante do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 posições;

(m) uma variante do polipeptídeo da SEQ ID NO: 6, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, ou 32;

(n) uma variante do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 posições;

(o) uma variante do polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 33, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,

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161/198

35, 36, 37, 38, 39 ou 40 posições;

(p) uma variante do polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 27, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 posições;

(q) uma variante do polipeptídeo da SEQ ID NO: 38, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 posições;

(r) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1), (m), (n), (o), (p) ou (q) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal;

(s) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1), (m), (n), (o), (p) ou (q) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (t) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1), (m), (n), (o), (p) ou (q) que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

[00554] 26. O polipeptídeo do item 25, em que o polipeptídeo compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW (SEQ ID NO: 40).

[00555] 27. O polipeptídeo de qualquer um dos itens 25 a 26, em que o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 203 de SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 204 de

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SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 de SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 216 de SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 217 de SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO: 33 ou aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 38.

[00556] 28. O polipeptideo de qualquer um dos itens 25 a 27, em que a significância é <0,05 conforme determinado com o uso do teste de Dunnett.

[00557] 29. O polipeptideo de qualquer um dos itens 25 a 28, em que a atividade é determinada mediante a medição da diminuição em densidade óptica de uma solução de células de Micrococcus lysodeikticus ressuspensas.

[00558] 30. Uma composição que compreende o polipeptideo de qualquer um dos itens 25 a 29.

[00559] 31. A composição do item 30 que compreende adicionalmente um ou mais agentes de formulação.

[00560] 32. A composição do item 32, em que o agente de formulação compreende um ou mais dos compostos a seguir: glicerol, etileno glicol, 1, 2propileno glicol ou 1, 3-propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, caulim e celulose.

[00561] 33. Um aditivo de ração animal que compreende a lisozima como divulgado em qualquer um dos itens 1 a 8, o grânulo de qualquer um dos itens 9 a 24, o polipeptideo de qualquer um dos itens 25 a 29 ou a composição de qualquer um dos itens 30 a 32.

[00562] 34. O aditivo de ração para animal do item 33 que compreende adicionalmente um ou mais componentes selecionados dentre a lista que consiste em:

uma ou mais vitaminas;

um ou mais minerais;

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163/198 um ou mais aminoácidos;

um ou mais prebióticos;

um ou mais ácidos orgânicos; e um ou mais outros ingredientes de ração.

[00563] 35. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 33 a

34, que compreende adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais.

[00564] 36. O aditivo de ração animal do item 35, em que a uma ou mais enzimas adicionais são selecionadas do grupo que consiste em fitase, lisozima, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, protease, fosfolipase Al, fosfolipase A2, lisofosfolipase, fosfolipase C, fosfolipase D, amilase, lisozima, arabinofuranosidase, beta-xilosidase, acetil xilana esterase, ferulorl esterase, celulase, celobioidrolases, beta-glucosidase, pululanase, e beta-glucanase ou qualquer combinação das mesmas.

[00565] 37. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 33 a

36, que compreende adicionalmente um ou mais probióticos.

[00566] 38. O aditivo de ração animal do item 37, em que o um ou mais probióticos são selecionados do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cercus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium sp., Camobacterium sp., Clostridium butyricum, Clostridium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Megasphaera elsdenii, Megasphaera sp., Pediococsus acidilactici, Pediococcus sp., Propionibacterium thoenii, Propionibacterium sp. e Streptococcus sp. ou qualquer combinação dos mesmos.

[00567] 39. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 33 a

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38, que compreende adicionalmente um ou mais fitogênicos.

[00568] 40. O aditivo de ração animal do item 39, em que o fitogênico é selecionado do grupo que consiste em alecrim, sálvia, orégano, tomilho, cravo, erva-limão, óleos essenciais, timol, eugenol, metacresol, vanilina, salicilato, resorcina, guajacol, gingerol, óleo de lavanda, iononas, irone, eucaliptol, mentol, óleo de hortelã-pimenta, alfa-pineno; limoneno, anetol, linalol, di-hidrojasmonato de metila, carvacrol, ácido propiônico/propionato, ácido acético/acetato, ácido butírico/butirato, óleo de alecrim, óleo de cravo, geraniol, terpineol, citronelol, salicilato de amila e/ou benzila, cinamaldeído, polifenol de planta (tanino), extrato de açafrão e cúrcuma ou qualquer combinação destes.

[00569] 41. Uma ração animal que compreende lisozima, como divulgado em qualquer um dos itens 1 a 8, grânulo de qualquer um dos itens 9 a 24, polipeptídeo de qualquer dos itens 25 a 29, composição de qualquer um dos itens 30 a 32 ou aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 33 a 40 e material à base de planta.

[00570] 42. A ração animal do item 41, em que o material à base de planta é selecionado a partir do grupo que consiste em legumes, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, mais, milho, massambala, gramíneas, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijãoterário, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, vagem, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma forma processada da mesma (como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer combinação dos mesmos.

[00571] 43. Uma ração animal peletizada que compreende lisozima, como divulgado em qualquer um dos itens 1 a 8, grânulo de qualquer um dos itens 9 a 24, polipeptídeo de qualquer dos itens 25 a 29, composição de qualquer um dos itens 30 a 32 ou aditivo de ração animal de qualquer um dos

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165 / 198 itens 33 a 40 e material à base de planta.

[00572] 44. A ração animal peletizada do item 43, em que o material à base de planta é selecionado a partir do grupo que consiste em legumes, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, mais, milho, massambala, gramíneas, milheto, milheto-pérola, milheto/artazZ, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-terário, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, vagem, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma forma processada da mesma (como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer combinação dos mesmos.

[00573] 45. Um método para melhorar um ou mais parâmetros de desempenho de um animal que compreende administrar a um ou mais animais a lisozima, como divulgado em qualquer um dos itens 1 a 8, o grânulo de qualquer um dos itens de 9 a 24, o polipeptídeo de qualquer um dos itens 25 a 29, a composição de qualquer um dos itens 30 a 32, o aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 33 a 40, a ração animal de qualquer dos itens 41a 42 ou a ração animal peletizada de qualquer um dos itens 43 a 44.

[00574] 46. O método do item 45, em que o aperfeiçoamento do desempenho de um animal significa ganho de peso corporal aperfeiçoado, Fator de Eficiência de Produção Europeu aperfeiçoado (EPEF) e/ou FCR melhorado.

[00575] 47. Um método para preparar uma ração animal que compreende misturar a lisozima, como divulgado em qualquer um dos itens 1 a 8, grânulo de qualquer um dos itens 9 a 24, polipeptídeo de qualquer dos itens 25 a 29, composição de qualquer um dos itens 30 a 32 ou aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 33 a 40 com material à base de planta.

[00576] 48. O método do item 47, em que o material à base de planta é selecionado a partir do grupo que consiste em legumes, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, mais, milho, massambala, gramíneas, milheto, milheto

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166/198 pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-terário, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, vagem, feijão largo (feijãofava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma forma processada da mesma (como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer combinação dos mesmos.

[00577] 49. Um método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal que compreende adicionar à ração a lisozima como divulgado em qualquer um dos itens 1 a 8, o grânulo de qualquer um dos itens 9 a 24, o polipeptídeo de qualquer dos itens 25 a 29, a composição de qualquer um dos itens 30 a 32 ou o aditivo de ração animal de qualquer dos itens 33 a 40.

[00578] 50. O método do item 49, em que a ração é selecionada a partir do grupo que consiste em legumes, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, mais, milho, massambala, gramíneas, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-terário, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, vagem, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma forma processada da mesma (como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer combinação dos mesmos.

[00579] 51. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos itens 25 a 29.

[00580] 52. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo do item 51 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[00581] 53. Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo do item 51 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo.

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167/198 [00582] 54. Um método para produzir o polipeptídeo de qualquer um dos itens 25 a 29 que compreende:

(a) cultivo de uma célula, que na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[00583] 55. Um método para produzir o polipeptídeo de qualquer um dos itens 25 a 29 que compreende:

(a) cultivar uma célula hospedeira do item 53 sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[00584] 56. Uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos itens 25 a 29.

[00585] 57. Uma formulação de caldo total ou composição de cultura celular que compreende um polipeptídeo de qualquer um dos itens 25 a 29.

[00586] 58. Uso da lisozima como divulgado em qualquer um dos itens 1 a 8, o grânulo de qualquer um dos itens 9 a 24, o polipeptídeo de qualquer dos itens 25 a 29, a composição de qualquer um dos itens 30 a 32 ou o aditivo para ração animal de qualquer dos itens 33 a 40:

em ração animal;

em aditivos de ração animal;

na preparação de uma composição para uso em ração animal; para melhorar o valor nutricional de uma ração animal; e/ou para melhorar um ou mais parâmetros de desempenho em um animal.

[00587] 59. Um polipeptídeo GH25 isolado que tem atividade de lisozima selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade

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80% de identidade

80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

(o) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a),

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169/198 (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (p) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

[00588] 60. O polipeptídeo, de acordo com a invenção, que tem atividade de lisozima melhorada a) em comparação com a atividade de lisozima da lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL) ou b) em comparação com a atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39, conforme determinado pelo Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus.

[00589] 61. O polipeptídeo, de acordo com a invenção, que tem atividade de lisozima melhorada a) em comparação com a atividade de lisozima da lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL) e b) em comparação com a atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39, conforme determinado por qualquer um de i) Método para a Determinação da Atividade da Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus e ii) Método para a Determinação da Atividade da Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii.

[00590] 62. Um aditivo zootécnico para uso em ração para aves ou suíno, em que o referido aditivo compreende o polipeptídeo, conforme definido pela invenção.

[00591] 63. Um método para melhorar a saúde intestinal em um animal que compreende reduzir a quantidade de células de Lactobacillus johnsonii mortas, ou detritos de parede celular das mesmas, no trato digestivo do referido animal, que compreende alimentar o animal com uma ração ou aditivo de ração que compreende um polipeptídeo, conforme definido pela invenção.

[00592] 64. Um método para melhorar a saúde intestinal em um animal que compreende reduzir a quantidade de células de Lactobacillus johnsonii

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170/198 mortas, ou detritos de parede celular das mesmas, no trato digestivo do referido animal, que compreende alimentar o animal com uma ração ou aditivo de ração que compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO 39.

[00593] 65. Um método para promover a eliminação de células de

Lactobacillus johnsonii mortas, ou detritos de parede celular das mesmas, do trato digestivo de um animal que compreende alimentar o referido animal com uma fonte de um polipeptídeo, conforme definido pela invenção.

[00594] 66. Método para promover a eliminação de células de

Lactobacillus johnsonii mortas do trato digestivo de um animal que compreende alimentar o referido animal com uma fonte de um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO 39.

[00595] 67. O método, de acordo com qualquer uma das formas de realização, em que o polipeptídeo tem uma atividade de lisozima contra Lactobacillus johnsonii em 5 ppm que aumenta a medição de densidade óptica (OD) em 405 nm de pelo menos 0,20 conforme determinado pelo Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii.

[00596] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitação do escopo da invenção.

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Exemplos [00597] Cepas [00598] A cepa de Escherichia coli Top-10 foi adquirida junto à Invitrogen (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e foi usada para propagar os vetores de expressão que codificam os polipeptídeos de lisozima.

[00599] A cepa MT3568 de Aspergillus oryzae foi usada para expressão heteróloga das sequências de codificação de polipeptideo de lisozima. A. oryzae MT3568 é um derivado do gene destruído amdS (acetamidase) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restabelecida por desagregação do gene da acetamidase (amdS) de A. oryzae com o gene pyrG.

[00600] Aspergillus niger MBinll8 é divulgado no documento n° WO 2004/090155.

[00601] A cepa fúngica NN000308 foi adquirida junto à Centraalbureau voor Schimmelcultures com nome de CBS 174.70. A cepa NN000308 foi identificada como Myceliophthora fergusii (anteriormente identificada como Thielavia thermophila, —sinônimo Corynascus íherniophilus), com base tanto em características morfológicas como em sequência de rDNA de ITS.

[00602] A cepa fúngica NN044232 foi isolada de amostras de solo coletadas na China, em 1998, pelo método da placa de diluição com meio PD A, pH 7, 25 °C. Foi então purificada por transferência de um único conídio para uma placa de agar PD A. A cepa NN044232 foi identificada como Penicillium sp. 'qiicom base tanto nas características morfológicas como na sequência de rDNA de ITS.

[00603] A cepa fúngica NN058101 foi isolada de amostras de solo coletadas da Província de Guizhou, China, em 2014, pelo método da placa de diluição com meio PDA, pH 3, 25 °C. Foi então purificada por transferência de um único conídio para uma placa de agar PDA. A cepa NN058101 foi

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172/198 identificada como Paecilomyces sp. XZ2658, com base tanto nas características morfológicas como na sequência de rDNA de ITS.

[00604] De acordo com Yokoyama et at, IFO Res Commun 14, 118 a 142, 1989, a cepa Mortierella alpine foi isolada de solos na região autônoma de Xinjiang Uighur, China em ou antes de 1989.

[00605] A cepa Purpureocillium lilacinum NN070261 foi isolada de uma amostra de solo dos Estados Unidos e inoculada em uma placa de PDA e incubada por 8 dias a 26 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 3 dias a 26 °C com agitação a 100 rpm.

[00606] A cepa Onygena equina NN056731 foi isolada de Gotland, Suécia. A cepa foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 18 dias a 20 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 18 dias a 20 °C com agitação a 100 rpm.

[00607] A cepa fúngica NN054002 foi isolada de amostras de solo coletadas do Tibete, China, em 2011, pelo método da placa de diluição com meio PDA, 10 °C. Foi então purificada por transferência de um único conídio para uma placa de agar PDA. A cepa NN054002 foi identificada como Lecanicillium sp., com base tanto nas características morfológicas como na sequência de rDNA de ITS.

[00608] A cepa Penicillium atrovenetum NN056836 foi adquirida junto à Universidade Técnica da Dinamarca. A cepa foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 5 dias a 26 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 2 dias a 26 °C com agitação a 100 rpm.

[00609] A cepa Malbranchea fiava CBS 132.77 foi adquirida no Centro

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173/198 de Biodiversidade Fúngica CBS-KNAW, e inoculada em uma placa de PDA e incubada por 14 dias a 26 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 20 dias a 26 °C com agitação a 100 rpm.

[00610] A cepa Engyodontium album NN042720 foi isolada na Dinamarca. A cepa foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 5 dias a 26 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 5 dias a 26 °C com agitação a 100 rpm.

[00611] Meios e Soluções [00612] O meio DAP4C-1 foi composto de 0,5 g de extrato de levedura, 10 g de maltose, 20 g de dextrose, 11 g de sulfato de magnésio heptaidratado, 1 g de fosfato de dipotássio, 2 g de ácido cítrico monoidratado, 5,2 g de fosfato de potássio tribásico monoidratado, 1 ml de Dowfax 63N10 (agente antiespumante), 2,5 g de carbonato de cálcio, suplementado com 1 ml de solução de metais KU6, e água desionizada até 1.000 ml.

[00613] A solução de metal KU6 foi composta de 6,8 g de ZnCl₂, 2,5 g de CuSO₄.5H₂O, 0,13 g de NiCl₂, 13,9 g de FeSO₄.7H₂O, 8,45 g de MnSO₄.H₂O, 3 g de CóHgOy.I-bO, e água desionizada até 1.000 ml.

[00614] O meio YP de glicose a 2% foi composto de 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona, 20 g de glicose e água desionizada até 1.000 ml.

[00615] As placas LB foram compostas de 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de ágar Bacto, e água desionizada até 1.000 ml.

[00616] O meio LB foi composto de 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, e água desionizada até 1.000 ml. [00617] As placas de Sacarose-T COVE foram compostas de 342 g de sacarose, 20 g de pó de ágar, 20 ml de solução de sais COVE, e água

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174/198 desionizada até 1.000 ml. O meio foi esterilizado por autoclavagem a 0,1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8^a Edição, Revisão A, 1998). O meio foi resfriado até 60 °C e foram adicionados acetamida a 10 mM, Triton X-100 (50 μ1/500 ml).

[00618] Os tubos N-Ágar COVE foram compostos de 218 g de Sorbitol, 10 g de Dextrose, 2,02 g de KNO3, 25 g de Agar, 50 ml de solução de sais Cove, e água desionizada até 1.000 ml.

[00619] A solução de sais COVE foi composta de 26 g de MgSO₄-7H2O, 26 g de KC1, 26 g de KH2PO4, 50 ml de solução de metais vestigiais COVE, e água desionizada até 1.000 ml.

[00620] A solução de metais vestigiais COVE foi composta de 0,04 g de Na₂B₄O₇· IOH2O, 0,4 g de CuSO₄-5H₂O, 1,2 g de FeSO₄-7H₂O, 0,7g de MnSO₄ H2O, 0,8g de Na2MoO₄-2H2O, 10 g de ZnSO₄-7H2O e água deionizada até 1.000 ml.

[00621] O meio YPM continha extrato de Levedura a 1%, Peptona a 2% e Maltose a 2%.

[00622] Exemplo 1: Determinação de atividade de lisozima contra Micrococcus lysodeikticus [00623] A atividade de lisozima foi determinada mediante a medição da diminuição (queda) em absorvância/densidade óptica de uma solução de Micrococcus lysodeikticus ATTC No. 4698 suspensa (Sigma-Aldrich M3770) medida em um leitor de microplacas (Tecan Infinite M200) em 450 nm. A concentração de enzima nos poços de placa foi de 5 mg de proteína/1.

[00624] Preparação de substrato de Micrococcus lysodeikticus [00625] Antes do uso, as células foram suspensas em água desionizada até uma concentração de 10 mg de células/ml e a absorvância/densidade ótica (OD) a 450 nm foi medida. A suspensão de células foi, então, ajustada de modo que a concentração de célula no ensaio de turbidez (180 μΐ de tampão + 20 μΐ de amostra + 20 μΐ de substrato) se iguale a uma OD450 = 1,0. A

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175 / 198 suspensão de células foi, então, armazenada à temperatura ambiente antes do uso. As células suspensas foram usadas no espaço de 3 horas.

[00626] Preparação de tampão de ácido cítrico - fosfato pH 4 [00627] 61,45 ml de ácido cítrico 0,1 M foram misturados com 38,55 ml de hidrogenofosfato dissódico 0,2 M e o pH foi ajustado com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio até pH 4.

[00628] Medição da atividade antimicrobiana da lisozima no ensaio de turbidez [00629] A amostra de lisozima a ser medida foi diluída a uma concentração de 50 mg de proteína de enzima/1 em água desionizada, e mantida no gel até o uso. Em uma placa de microtitulação de 96 poços (Nunc) 180 μΐ de tampão de ácido cítrico - fosfato pH 4 e 20 μΐ da amostra de lisozima diluída foram adicionados e mantidos frios (5 °C). Para iniciar a medição de atividade, 20 μΐ do substrato (Micrococcus lysodeikticus) foram adicionados a cada poço, e a medição cinética de absorvância em 450 nm foi iniciada durante 1 hora a 37 °C em um leitor de microplacas. A absorvância medida a 450 nm foi monitorada para cada poço e ao longo do tempo uma queda na absorvância foi observada se a lisozima tiver atividade de lisozima.

[00630] Após a incubação, a atividade de lisozima contra Micrococcus lysodeikticus foi determinada como Δ absorvância em 450 nm (valor inicial valor final) de cada poço após 1 hora. A significância foi calculada com o uso do teste de Dunnett com nível p de teste de controle 0,05 em pacote de software estatístico JMP® versão 12.1.0 da SAS Institute Inc. SEQ ID NO: 39 foi incluída em todas as execuções experimentais e em comparação com novos candidatos dentro de cada execução para evitar influência de variação de dia para dia.

[00631] Exemplo 2: Extração de DNA genômico de cepas de Myceliophthora fergusii e Lecanicillium sp.

[00632] A cepa de Myceliophthora fergusii foi inoculada em uma placa

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PDA e incubada durante 3 dias a 45 °C no escuro. Vários discos de micélioPDA foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 4 dias a 45 °C com agitação a 160 rpm.

[00633] A cepa Penicillium sp. 'qii' NN044232 foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 5 dias a 25 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 4 dias a 25 °C com agitação a 100 rpm.

[00634] A cepa Paecilomyces sp. XZ2658 NN058101 foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 5 dias a 25 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 5 dias a 25 °C com agitação a 100 rpm.

[00635] A cepa Purpureocillium lilacinum NN070261 foi isolada de uma amostra de solo dos Estados Unidos e inoculada em uma placa de PDA e incubada por 8 dias a 26 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 3 dias a 26 °C com agitação a 100 rpm.

[00636] A cepa Onygena equina NN056731 foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 18 dias a 20 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 18 dias a 20 °C com agitação a 100 rpm.

[00637] Lecanicillium sp. WMM742 foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 7 dias a 15 °C no escuro. Vários discos de micélio-PDA foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml contendo 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 5 dias a 20 °C com agitação a 160

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177/198 rpm.

[00638] A cepa Penicillium atrovenetum NN056836 foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 5 dias a 26 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 2 dias a 26 °C com agitação a 100 rpm.

[00639] A cepa Malbranchea fiava NN070411 foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 14 dias a 26 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 20 dias a 26 °C com agitação a 100 rpm.

[00640] A cepa Engyodontium album NN042720 foi inoculada em uma placa PDA e incubada durante 5 dias a 26 °C no escuro. Micélios e esporos da placa foram inoculados em frascos de agitação de 500 ml que contêm 100 ml de meio YPG. Os frascos foram incubados durante 5 dias a 26 °C com agitação a 100 rpm.

[00641] Os micélios foram coletados por filtração através de MIRACLOTH® (Calbiochem, La Jolla, Calif., EUA) e congelados em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram moídos, por um almofariz e um pilão, até um pó fino, e o DNA genômico foi isolado usando um kit DNEASY® Plant Maxi (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha).

[00642] Exemplo 3: Sequenciamento, montagem e anotação de genoma de Myceliophthora fergusii (SEQ ID NO: 1).

[00643] A amostra de DNA genômico extraída de Myceliophthora fergusii para Beijing Genome Institute (BGI, Shenzhen, China) para sequenciamento de genoma com o uso de um sistema ILLUMINA® GA2 (Illumina, Inc., San Diego, CA, EUA). As leituras em bruto foram montadas em BGI com o uso do programa SOAPdenovo (Li et al., 2010, Genome Research 20(2): 265 a 272). As sequências montadas foram analisadas usando

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178/198 métodos de bioinformática padrão para identificação de genes e previsão da função. GenelD (Parra et al., 2000, Genome Research 10(4):511 a 515) foi usado para previsão de gene. Biastail versão 2.2.10 (Altschul et al., 1990, Mol. Biol. 215 (3): 403 a 410, National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Md., USA) e HMMER versão 2.1.1 (National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Md., EUA) foram usados para prever a função com base em homologia estrutural. O polipeptídeo de lisozima da família GH25, GH25_Myfer, foi identificado diretamente por análise dos resultados de Blast. O programa Agene (Munch e Krogh, 2006, BMC Bioinformatics 7:263) e programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1 a 6) foram usados para identificar códons de iniciação. O programa SignalP foi adicionalmente usado para prever peptídeos-sinal. Pepstats (Rice et al., 2000, Trends Genet. 16(6): 276 a 277) foi usado para prever ponto isoelétrico de proteínas, e peso molecular das sequências de aminoácidos deduzidas.

[00644] Exemplo 4: Sequenciamento, montagem e anotação de genoma de Penicillium sp. 'qii' (SEQ ID NO: 4), Paecilomyces sp. XZ2658 (SEQ ID NO: 7 e 10), Purpureocillium lilacinum (SEQ ID NO: 16), Onygena equina (SEQ ID NO: 19), Penicillium atrovenetum (SEQ ID NO: 25), Malbranchea fiava (SEQ ID NO: 28) e Engyodontium album (SEQ ID NO: 31).

[00645] As amostras de DNA genômico extraídas de Penicillium sp. 'qii', Paecilomyces sp. XZ2658, Purpureocillium lilacinum, Onygena equina, Penicillium atrovenetum, Malbranchea fiava e Engyodontium album foram sequenciadas por genoma com uso de um sistema ILLUMINA® HiSeq 2000 (Illumina, Inc., San Diego, CA, EUA).

[00646] As leituras em bruto de Penicillium sp. 'qii', Paecilomyces sp. XZ2658, Penicillium atrovenetum e Malbranchea fiava foram montadas com o uso do programa Spades (Anton Bankevich et al., 2012, Journal of

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Computational Biology, 19(5): 455 a 477). As leituras em bruto de Purpureocillium lilacinum, Onygena equina, e Engyodontium album foram montadas com o uso do programa Idba (Peng Yu et al., 2010, Research in Computational Molecular Biology. 6044:426 a 440. Springer Berlin Heidelberg). As sequências montadas foram analisadas usando métodos de bioinformática padrão para identificação de genes e previsão da função. A versão fúngica de GeneMark-ES (Ter-Hovhannisyan V et al., 2008, Genome Research 18 (12): 1979-1990) foi usado para previsão de genes. Biastail versão 2.2.10 (Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology. 215(3): 403 a 410, ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gOv/blast/executables/release/2.2.10/) e HMMER versão 2.1.1 (National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD, EUA) foram usados para prever a função com base na homologia estrutural. Os polipeptídeos da lisozima da família GH25 foram identificados diretamente por análise dos resultados de Blast. O programa Agene (Munch e Krogh, 2006, BMC Bioinformatics 7: 263) e programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1 a 6) foram usados para identificar códons de iniciação. O programa SignalP foi adicionalmente usado para prever peptídeos-sinal. Pepstats (Rice et al., 2000, Trends in Genetics. 16(6): 276-277) foi usado para prever os pontos isoelétricos e pesos moleculares.

[00647] Exemplo 5: Sequenciamento, montagem e anotação de genoma de Mortierella alpina (SEQ ID NO: 13).

[00648] O DNA genômico de Mortierella alpina foi sequenciado em Fasteris (Plan-les-Ouates, Suíça) com o uso de um sistema ILLUMINA® HiSeq 2000 (Illumina, Inc., San Diego, CA, EUA). As leituras montadas recebidas de Fasteris foram analisadas com o uso de métodos de bioinformática padrão para identificação de gene e previsão de função. A versão fúngica de GeneMark-ES (Ter-Hovhannisyan V et al., 2008, Genome Research 18(12): 1.979 a 1.990) foi usada para previsão de genes. Biastail

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180/198 versão 2.2.10 (Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology. 215(3): 403 a 410, ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gOv/blast/executables/release/2.2.10/) e HMMER versão 2.1.1 (National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD, EUA) foram usados para prever a função com base na homologia estrutural. O polipeptídeo de lisozima da família GH25 foi identificado diretamente por análise dos resultados de Blast. O programa Agene (Munch e Krogh, 2006, BMC Bioinformatics 7: 263) e programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1 a 6) foram usados para identificar códons de iniciação. O programa SignalP foi adicionalmente usado para prever peptídeos-sinal. Pepstats (Rice et al., 2000, Trends in Genetics. 16(6): 276 a 277) foi usado para prever o ponto isoelétrico e peso molecular.

[00649] Exemplo 6: Sequenciamento, montagem e anotação de genoma de Lecanicillium sp (SEQ ID NO: 22).

[00650] As amostras de DNA genômico extraídas de Lecanicillium sp. foram entregues a Fasteris (Suíça) para sequenciamento de genoma com o uso de um sistema ILLUMINA® HiSeq 2000 (Illumina, Inc., San Diego, CA, EUA). As leituras em bruto foram montadas na Novozymes da Dinamarca usando o programa Idba (Peng, Yu et al., 2010, Research in Computational Molecular Biology, 6044:426 a 440. Springer Berlin Heidelberg.). As sequências montadas foram analisadas usando métodos de bioinformática padrão para identificação de genes e previsão da função. A versão fúngica de GeneMark-ES (Ter-Hovhannisyan V et al., 2008, Genome Research 18 (12): 1.979 a 1.990) foi usada para previsão de genes. Biastail versão 2.2.10 (Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology, 215(3): 403 a 410, ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gOv/blast/executables/release/2.2.10/) e HMMER versão 2.1.1 (National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD, EUA) foram usados para prever a função com base na homologia estrutural. A lisozima da família GH25, GH25_Lecan2, foi identificada diretamente por

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181/198 análise dos resultados de Blast. O programa Agene (Munch e Krogh, 2006, BMC Bioinformatics 7:263) e programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering, 10: 1 a 6) foram usados para identificar códons de iniciação. O programa SignalP foi adicionalmente usado para prever peptídeos-sinal. Pepstats (Rice et al., 2000, Trends Genet, 16(6): 276 a 277) foi usado para prever os pontos isoelétricos e pesos moleculares.

[00651] Exemplo 7: Clonagem e expressão de lisozimas GH25 (SEQ ID NO: 1 e 22) [00652] Duas sequências do tipo selvagem de lisozima GH25 fúngica (SEQ ID NO: 1 e 22) foram clonadas a partir de Myceliophthora fergusii e Lecanicillium sp., respectivamente.

[00653] As lisozimas GH25 fúngicas foram clonadas em um vetor de expressão pCaHj505 de Aspergillus oryzae como descrito no documento n° WO2013029496. A transcrição da sequência de codificação da lisozima GH25 com o sinal de secreção nativo estava sob o controle de um promotor do gene de alfa-amilase de Aspergillus oryzae.

[00654] Os plasmídeos de expressão final foram transformados individualmente em um hospedeiro de expressão de Aspergillus oryzae. Os genes da lisozima GH25 foram integrados por recombinação homóloga no genoma das células hospedeiras de Aspergillus oryzae após transformação. Quatro transformantes de cada transformação foram selecionados da placa de agar com meio seletivo e inoculados em 3 ml de meio YPM em uma placa de 24 poços e incubados a 30 °C, 150 rpm. Após 3 dias de incubação, 20 μΐ de sobrenadante de cada transformante foram analisados em Gel de Bis-Tris a 4 a 12% NuPAGE Novex com MES de acordo com as instruções do fabricante. O gel resultante foi manchado com Instant Blue. Os perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram que ambos os genes foram expressos com 1 banda de proteína detectada em 25 KD. As cepas de Aspergillus oryzae recombinantes com a banda de proteína mais forte foi selecionada para cultura em frasco de

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182/198 agitação e foi inoculada em inclinação feita em meio inclinado e incubou-se a 37 °C durante 6 a 7 dias. Quando as cepas foram bem cultivadas até estarem totalmente esporuladas, foram inoculadas em frascos de agitação de 2 1, que contêm, cada um, 400 ml de YPM e 5 a 6 frascos para cada cepa. Os frascos foram agitados a 80 rpm, 30 °C. As culturas foram colhidas no dia 3 e filtradas com o uso de uma Membrana DURAPORE de 0,45 gm e foram purificadas como descrito nos Exemplos 13 e 14, respectivamente.

[00655] Exemplo 8: Amplificação por PCR e clonagem InFusion de sequências de codificação da lisozima de SEQ ID NO: 4, 7, 10 e 13 [00656] Clonagem com base em BamHI-Xhol a partir de Penicillium sp. 'qii' (SEQ ID NO: 4), Paecilomyces sp. XZ2658 (SEQ ID NO: 7), Aspergillus sp. nov. XZ2609 (SEQ ID NO: 10) e Mortierella alpine (SEQ ID NO: 13).

[00657] Os iniciadores de PCR direto e inverso mostrados na tabela 2 foram usados para gerar um cassete de clonagem flanqueada EcoRI-Xhol a partir do DNA genômico preparado acima para as seguintes amostras:

Tabela 2: Iniciadores de PCR

Iniciador*	Iniciador SEQ ID NO:	Iniciador para lisozima SEQ ID NO:	Sequência
WIN1054-F	44	4	5'- ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGACTACGG GTGTC
WIN1054-R	45	4	5'- CCCTCTAGATCTCGAGTTAAGAACCCTTGGCAA AG
WIN1057-F	46	7	5'- ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGTCTGTTGC TGTCT
WIN1057-R	47	7	5'- CCCTCTAGATCTCGAGCTAAGAAGCATTCGCAA TGC
WIN1058-F	48	10	5'- ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGCTCACGA GTGTG
WIN1058-R	49	10	5'- CCCTCTAGATCTCGAGTTACGAACCTCTAGCAA GC
WIN1068-F	50	13	5'- ACACAACTGGGGATCCACCATGATCAGGGCAG TTGCT

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WIN1068-R

5'CCCTCTAGATCTCGAGTCAGGAACCTTTAGCGA A *-F - iniciador direto; -R - iniciador reverso [00658] As letras a negrito representam a sequência codificante. A sequência sublinhada é homóloga com os locais de inserção de pDaulO9.

[00659] A reação de PCR (25 μΐ) foi composta de 12,5 μΐ de Mistura 2X IPROOF™ HF Master, 0,5 μΐ de iniciador direto apropriado (100 μΜ), 0,5 μΐ de iniciador reverso apropriado (100 μΜ), 0,5 μΐ de genômico (100 ng/μΐ) e 11 μΐ de água desionizada. A reação de PCR foi incubada em um Ciclador Térmico DYAD® Dual-Block (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, MA, EUA) programado para 1 ciclo a 98 °C durante 30 segundos; 30 ciclos cada um a 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 10 segundos, e 72 °C durante 60 segundos; e 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos. As amostras foram resfriadas até 10 °C antes de remoção e processamento adicional.

[00660] Cinco μΐ da reação de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1 % usando tampão TAE onde foi observada uma banda de DNA de tamanho apropriado. No caso de WIN 1054, por exemplo, foi observada uma banda de aproximadamente 700 pares de bases. As reações de PCR restantes foram purificadas usando um Conjunto de Purificação de DNA e Banda de Gel ILLUSTRA™ GFX™ PCR de acordo com as instruções do fabricante.

[00661] Os fragmentos foram depois clonados em pDaulO9 digerido com BamHI e Xhol usando um Kit de Clonagem IN-FUSION™ resultando nos plasmídeos que contêm os insertos. A clonagem dos insertos de PCR de lisozima GH25 em pDaulO9 digerido com BamHI-Xhol resultou na transcrição dos genes clonados sob o controle de um promotor duplo de NA2tpi. NA2-tpi é um promotor modificado do gene codificando a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido do gene codificando a triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans. Os plasmídeos isolados foram sequenciados com

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184/198 iniciadores de vetor de modo a determinar um clone de expressão de plasmídeo representativo que estivesse isento de erros de PCR.

[00662] Exemplo 9: Amplificação por PCR e clonagem InFusion de sequências de codificação da lisozima de SEQ ID NO: 16, 19, 25, 28 e 31 [00663] Com base nas sequências de genes de lisozima identificadas por mineração de genoma em Onygena equina, Purpureocillium lilacinum, Penicillium atrovenetum, Malbranchea fiava e Engyodontium album, os iniciadores de clonagem InFusion foram projetados e ordenados (Sigma Aldrich, Darmstadt, Alemanha) (consultar lista na Tabela 3 abaixo).

Tabela 3: Iniciadores de clonagem InFusion

Iniciador*	Iniciador SEQ ID NO:	Iniciador para lisozima SEQ ID NO:	Sequência
C8VRQ-F	52	16	ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGTTCGCAT CCGTCGCC
C8VRQ-R	53	16	AGATCTCGAGAAGCTTAACCGGCGTTGGCAAT CTTCTT
C8VRJ-F	54	19	ACACAACTGGGGATCCACCATGTTGAAAACA ATTATCTATACCACCCTTGCC
C8VRJ-R	55	19	AGATCTCGAGAAGCTTAGCCCTTTGCAAATCG TTGCAATCC
C8VRZ-F	56	25	ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGATCACT GCCTTCCCGCT
C8VRZ-R	57	25	AGATCTCGAGAAGCTTAAGCACCCTTGGCGAA GGTCT
C8VRT-F	58	28	ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGCTGTCTC TCCTCCTTATTGTTGC
C8VRT-R	59	28	AGATCTCGAGAAGCTTAACCTAGGGCCATTCT CTTCAACCC
C8VS8-F	60	31	ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGTCTTTTG GTGTTATTGCTACCGG
C8VS8-R	61	31	AGATCTCGAGAAGCTTAGCCTCTGGCGATTCT CTGAAGC

*-F - iniciador direto; -R - iniciador reverso [00664] As amplificações de PCR de SEQ ID NO: 16, 19, 25, 28 e 31 que codificam polipeptídeos de lisozima foram realizadas com o uso de DNA polimerase de alta fidelidade de Phusion (New England Biolabs, BioNordika Denmark A/S, Herlev, Dinamarca) em uma reação de volume de 50 μΐ. As misturas de reação de PCR consistiram em 10 μΐ de tampão de reação Phusion HF (5x); 1 μΐ de mistura de nucleotideos de PCR (10 mM); 2 μΐ de iniciadores diretos de clonagem (2,5 mM); 2 μΐ de iniciadores reversos de

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185/198 clonagem (2,5 mM); 1 μΐ de DNA Polimerase de Alta-Fidelidade de Phusion n° M0530L (2.000 U/ml); e água de grau de PCR até 50 pl. As reações de PCR foram incubadas em um termociclador TI00 (Biorad, Hercules, Califórnia, EUA) com o uso do seguinte programa: desnaturação inicial de 2 min a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 s a 98 °C, 2 min a 72 °C e terminando com um alongamento final de 10 min a 72 °C. Os amplicons de PCR foram purificados usando o kit de sistema de esferas AMPure XP (Agencourt, Beverly, Massachusetts, EUA) adaptado em um manipulador Biomek FXp Liquid (Beckman Coulter, Brea, Califórnia, EUA).

[00665] A clonagem InFusion foi feita com o uso do kit de sistema de clonagem InFusion HD Plus EcoDry (Takara, Kusatsu, Japão) no vetor de expressão pDAulO9 (WO 2005042735) previamente digerido com as enzimas de restrição BamHI e HindIII e seguindo as instruções do fabricante seguinte. [00666] Um volume de 2,5 μΐ das misturas de ligação diluídas cinco vezes foi usado para transformar células quimicamente competentes TOP 10 de E. coli (consultar capítulo das cepas) (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Três colônias foram selecionadas em placas ágar LB contendo 100 pg de ampicilina por ml e cultivadas durante a noite em 3 ml de meio LB suplementado com 100 pg de ampicilina por ml. O DNA plasmídico foi purificado usando um kit Qiagen Spin Miniprep (Cat. 27106) (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

[00667] As sequências de lisozima clonadas por InFusion foram escrutinadas quanto a erros pelo sequenciamento do DNA de Sanger.

[00668] Os iniciadores de oligonucleotídeos direto e inverso, mostrados a seguir, foram concebidos para amplificar por PCR o quadro de leitura aberto GH25 a partir das amostras de DNA genômico. Foi usado um Conjunto de Clonagem IN-FUSION™ (Clontech, Mountain View, CA, EUA) para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pDaulO9 (WO 2005/042735).

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186/198 [00669] Exemplo 10: Amplificação por PCR e clonagem de sequência de codificação de lisozima SEQ ID NO: 34 [00670] A sequência genômica SEQ ID NO: 34 contém sete introns e oito exons. A fim de facilitar a expressão em Aspergillus oryzae, uma versão sem intron do gene que foi otimizado por códon foi criada (sequência SEQ ID NO: 36). O gene sintético SEQ ID NO: 36 foi ordenado a partir de GeneArt (Thermofisher Scientific) como um quadro de leitura aberto flanqueado BamHI-HindIII e clonado diretamente no vetor pDaulO9 conforme descrito no Exemplo 8.

[00671] Exemplo 11: Expressão de lisozimas GH25 em Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 4,7, 10, 13 e 36) [00672] Protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 foram preparados de acordo com o documento n° WO 95/002043. Cem μΐ de protoplastos foram misturados com 1 a 3 qg de um dos seguintes vetores de expressão de Aspergillus: SEQ ID NO: 4, 7, 10, 13 ou 36.

[00673] Seis ul contendo cerca de 3,0 qg de DNA total foram usados para a transformação. O DNA foi gentilmente adicionado a 100 ql de protoplastos de A. oryzae MT3568 e 250 ql de PEG 4000 a 60% (n° de catálogo Sigma-Aldrich 95904). O PEG 4000 a 60% (P/V) foi preparado da seguinte maneira: Pó de PEG 4000 foi dissolvido em H₂O duplamente destilada e depois aquecido durante 10-20 segundos em um forno de microondas a 800 watt até estar dissolvido. A solução dissolvida foi resfriada até à temperatura ambiente e depois ajustada com solução de CaCl₂ e solução de Tris-HCl (pH 7,5) para uma concentração final de 10 mM de cada uma. Após adição da solução de PEG 4000 a 60%, o tubo foi gentilmente misturado e incubado a 37 °C durante 30 minutos. A mistura foi adicionada a 6 ml de ágar top com acetamida a 10 mM e plaqueada em placas de COVE-sorbitol com acetamida a 10 mM.

[00674] As placas foram incubadas a 37 °C durante 3 ou mais dias e

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187/198 depois movidas para 26 °C durante dois dias. Os esporos de 4 a 8 colônias individuais foram escolhidos primeiramente por imersão de um alfineto de imersão branco de 10 μΐ (Nunc A/S, Dinamarca) em uma solução de TWEEN® 80 a 0,1 %, contato da colônia esporulante na placa de seleção, e re-estriamento com o alfinete em placas frescas de COVE sorbitol contendo acetamida a 10 mM. Após 5 dias a 26 °C, esporos das colônias re-estriadas foram usados para inocular uma placa funda com 96 poços (NUNC, n° de catálogo 260251, Thermoscientific, EUA). Os poços da placa profunda continham 500 ul de ou meio YP + glicose a 2% ou meio DAP4C. A placa inoculada foi selada com fita permeável a gás (89009-656, VWR.com). As placas foram incubadas estacionárias a 30 °C durante 5 dias. A expressão foi verificada por análise de 20 ul de fluido de cultura coletado em SDS-PAGE usando um gel de Bis-Tris a 10% NUPAGE® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e coloração de azul de Coomassie. Um transformante para cada experiência de transformação foi selecionado para trabalho adicional.

[00675] Os esporos de cada transformante designado foram inoculados em meio YP + glicose a 2 % e meio DAP-4C-1 (100 ml em frasco de agitação Erlenmeyer de 500 ml com chicanas). As culturas foram incubadas a 26 °C e 150 rpm, 3 dias e se necessário 4 dias. Um gel de SDS foi usado como acima para testar a quantidade de proteína.

[00676] Após incubação durante 4 a 7 dias a 37 °C, os esporos de quatro transformantes foram inoculados em 0,2 ml de YP + 2% de glicose ou meio DAP4C-1 em placas de microtitulação com 96 poços. Após 4 dias de cultura a 30 °C, os caldos de cultura foram analisados por SDS-PAGE para identificar os transformantes que produzem a maior quantidade de enzimas lisozima.

[00677] Os caldos de cultura para SEQ ID NO: 4, 7, 10, 13 e 36 foram purificados conforme descrito no Exemplo 15.

[00678] Exemplo 12: Preparação e expressão de protoplastos de

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Aspergillus (SEQ ID NO: 16, 19, 25, 28 e 31) [00679] Protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 foram preparados de acordo com o documento n° WO 95/002043. Cem μΐ de protoplastos foram misturados com 1 a 3 pg dos vetores de expressão de Aspergillus ou PCRs OE (para SEQ ID NO: 16, 19, 25, 28 e 31) e 250 pl de PEG 4000 a 60% (Applichem, Darmstadt, Alemanha) (polietilenoglicol, peso molecular 4.000), CaCP 10 mM e Tris-HCl 10 mM pH 7,5 e misturados suavemente. As misturas foram incubadas a 37 °C durante 30 minutos e os protoplastos foram espalhados sobre placas COVE para seleção. Após incubação durante 4 a 7 dias a 37 °C, os esporos de quatro transformantes foram inoculados em 0,2 ml de YP + 2% de glicose ou meio DAP4C-1 em placas de microtitulação com 96 poços. Após 4 dias de cultura a 30 °C, os caldos de cultura foram analisados por SDS-PAGE para identificar os transformantes que produzem a maior quantidade de enzimas lisozima.

[00680] Os esporos dos melhores transformantes para cada transformação foram espalhados em placas COVE contendo 0,01% de TRITON X-100 para isolar colônias únicas. O espalhamento foi repetido duas vezes no total em placas COVE contendo 10 mM de nitrato de sódio. Os esporos foram então inoculados em frascos de agitação de 500 ml contendo 100 ml de YP + 2% de glicose e incubados durante 4 dias a 30 °C com agitação a 100 rpm.

[00681] As cepas previamente selecionadas foram inoculadas em frascos de agitação de 250 ml com defletor contendo 100 a 150 ml de ácido láctico suplementado com DAP4C-1 e com fosfato de diamônio ou meio de glicose YP 2% e fermentado durante 4 dias a uma temperatura de 30 °C sob agitação de 150 rpm. Os caldos de cultura foram coletados por filtração usando um dispositivo de filtro de 0,2 pm.

[00682] Os caldos de cultura podem ser purificados conforme descrito no Exemplo 15.

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189/198 [00683] Exemplo 13: Purificação da lisozima GH25 de Myceliophthora fergusii (SEQ ID NO: 3) [00684] O sobrenadante de cultura foi primeiramente precipitado com sulfato de amônio (80% de saturação), depois dialisado com NaAc a 20 mM a pH 4,5. A solução foi filtrada com filtro de 0,45um e depois carregada em uma coluna Capto SP (GE Healthcare) equilibrada com NaAc 20 mM a pH 4,5. Um aumento de gradiente da concentração de NaCl foi aplicado como tampão de eluição de zero a 1 M, e depois as frações de eluição e fração de fluxo foram coletadas para detectar atividade de lisozima. As frações com atividade de lisozima foram analisadas por SDS-PAGE e, então, concentradas para avaliação adicional. A concentração de proteína foi determinada pelo kit de ensaio de proteína Qubit® (Invitrogen, cat Q33212).

[00685] Exemplo 14: Purificação da lisozima GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 (SEQ ID NO: 24) [00686] O sobrenadante de cultura foi primeiro precipitado com sulfato de amônio (80% de saturação), depois à precipitação foi adicionada água para ajustar a condutância para cerca de 160 mS/cm. A solução foi filtrada com filtro de 0,45 um e, então, carregada em uma coluna de Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada com NaAc 20 mM a pH 4,5 com adição de (NH4)2SO4 1,5 M. Uma diminuição de gradiente da concentração de (NH4)2SO4 foi aplicada como tampão de eluição de 1,8 M a zero e, então, as frações de eluição e fração de fluxo foram coletadas para detectar atividade de lisozima. As frações com atividade de lisozima foram analisadas por SDSPAGE, reunidas juntas e, então, concentradas. O tampão da amostra final foi modificado por NaAc 20 mM a pH 4,5 para avaliação adicional. A concentração de proteína foi determinada pelo kit de ensaio de proteína Qubit® (Invitrogen, n° de catálogo Q33212).

[00687] Exemplo 15: Purificação de lisozimas GH25 [00688] Procedimento Geral de Purificação

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190/198 [00689] O sobrenadante da fermentação com a lisozima foi filtrado através de um filtro topo Fast PES Bottle com um limite de exclusão de 0,22 gm. O pH foi ajustado para 4,5 com ácido acético a 10%. Após o ajuste de pH, a solução se tomou um pouco turva e isto foi removido por filtração através de um filtro top Fast PES Bottle com um limite de exclusão de 0,22 gm.

[00690] Após pré-tratamento, cerca de 650 ml da lisozima contendo solução foram purificados por cromatografia em SP Sepharose, aproximadamente 50 ml em uma coluna XK26, usando como tampão A acetato de Na a 50 mM pH 4,5, e como tampão B acetato de Na a 50 rnM + NaCl a 1 M pH 4,5. As frações da coluna foram agrupadas com base no cromatograma (absorção a 280 e 254 nm) e análise de SDS-PAGE. As frações agrupadas foram submetidas a mudança de tampão em acetato de Na a 50 mM, pH 5,5 e concentradas usando filtros Amicon spin com um limite de exclusão de 10 kDa.

[00691 ] Purificação de SEQ ID NO: 6, 9, 12 e 15 [00692] A biomassa do caldo de fermentação foi separada por centrifugação. A filtração da amostra foi então realizada por filtração de fluxo tangencial usando cartuchos de 0,2 g de fibra oca montados em um sistema QuixStand® e depois carregados em uma coluna hidrofóbica (TOYOPEARL® Phenyl-650M) equilibrada com HEPES 50 mM pH 8+ Sulfato de Amônio 1,5 M a pH 8,0. A diminuição gradual do gradiente da concentração de sulfato de amônio foi aplicada como tampão de eluição de 1,5 M a zero. As frações de pico de eluição reunidas, a lavagem e o fluxo foram coletados e analisados em gel de SDS. O pico com a banda de lisozima no gel foi então trocado por tampão HEPES 50 mM pH 8 e a concentração de proteína foi determinada por espectrofotômetro (Sistema de Espectroscopia UV-visível Agilent 8453).

[00693] O peso molecular foi estimado por SDS-PAGE e a pureza foi

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191/198 > 90 %.

[00694] Purificação de SEQ ID NO: 18, 21, 27, 30, 33 e 38 [00695] O sobrenadante da fermentação com a lisozima foi filtrado através de um filtro topo Fast PES Bottle com um limite de exclusão de 0,22 pm.

[00696] O pré-tratamento do caldo filtrado pode ser necessário se o nível de expressão for baixo e/ou a condutividade for alta (em geral> 10 S/m). O pré-tratamento pode ser realizado usando ultrafiltração em uma membrana de corte de 3 a 5 kDa, troca de tampão em uma coluna de filtração em gel G25 ou diálise. SEQ ID NO: 38 foi pré-tratada com o uso de uma coluna de filtração em gel G25 com o uso de acetato 50 mM pH 4,5, enquanto que as SEQ ID NO: 18e21 foram pré-tratadas em uma membrana de diálise (6 a 8 KDa) durante a noite em acetato 50 mM 4,5.

[00697] O pH foi ajustado para 4,5. Se a solução se tomou turva após o ajuste do pH, isto foi removido por filtração através de um filtro top Fast PES Bottle com um limite de exclusão de 0,22 pm. A solução que contém lisozima foi purificada por cromatografia em SP Sepharose, aproximadamente 50 ml em uma coluna XK26, usando como tampão A acetato de Na 50 mM pH 4,5, e como tampão B acetato de Na 50 mM + NaCl 1 M pH 4,5 e um gradiente 0 a 100% sob ca. 10CV. As frações da coluna foram agrupadas com base no cromatograma (absorção a 280 e 254 nm) e análise de SDS-PAGE.

[00698] O peso molecular foi estimado por SDS-PAGE e a pureza foi > 90 %.

[00699] Exemplo 16: Determinação de atividade de lisozima [00700] Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra

Micrococcus lysodeikticus.

[00701] A atividade de lisozima foi determinada mediante a medição da diminuição (queda) em absorvância/densidade óptica de uma solução de Micrococcus lysodeikticus ATTC No. 4698 suspensa (Sigma-Aldrich M3770)

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192/198 medida em um leitor de microplacas (Tecan Infinite M200) em 450 nm, conforme descrito no Exemplo 1, com o uso de uma concentração de enzima nos poços de placa de 5 mg de proteína/1. A significância foi calculada com o uso do teste de Dunnett com nível p de teste de controle 0,05 em pacote de software estatístico JMP® versão 12.1.0 da SAS Institute Inc. SEQ ID NO: 39 foi incluída em todas as execuções experimentais e em comparação com novos candidatos dentro de cada execução para evitar influência de variação de dia para dia.

[00702] Os resultados das lisozimas do pedido são apresentados nas Tabelas 4 a 9 abaixo.

Tabela 4: Oueda de OD da SEO ID NO	: 3
Lisozima	Queda de \OD média	Desvio padrão	Valor P
SEQ ID NO: 3	0,248	0,009	0,004
SEQ ID NO: 39	0,148	0,013	1,000

Tabela 5: Queda de OD da SEQ IP NO: 6, 9, 12 e 15

Lisozima	Queda de \OD média	Desvio padrão	Valor P
SEQ ID NO: 6	0,287	0,024	<0,001
SEQ ID NO: 9	0,263	0,007	0,005
SEQ ID NO: 12	0,257	0,013	0,008
SEQ ID NO: 15	0,253	0,040	0,013
SEQ ID NO: 39	0,183	0,010	1,000
Tabela 6: Oueda de OD da SEO ID NO	: 18e21
Lisozima	Queda de \OD média	Desvio padrão	Valor P
SEQ ID NO: 18	0,244	0,029	0,023
SEQ ID NO: 21	0,239	0,054	0,034
SEQ ID NO: 39	0,188	0,010	1,000

Tabela 7: Queda de QD da SEQ ID NO: 24

Lisozima	Queda de \OD média	Desvio padrão	Valor P
SEQ ID NO: 24	0,235	0,022	0,021
SEQ ID NO: 39	0,181	0,005	1,000
Tabela 8: Oueda de QD da SEQ ID NO: 27, 30 e 33
Lisozima	Queda de \OD média	Desvio padrão	Valor P
SEQ ID NO: 27	0,290	0,024	<0,001
SEQ ID NO: 30	0,281	0,037	<0,001
SEQ ID NO: 33	0,244	0,004	0,044
SEQ ID NO: 39	0,205	0,021	1,000
Tabela 9: Oueda de OD da SEO ID NO	: 38
Lisozima	Queda de \OD média	Desvio padrão	Valor P
SEQ ID NO: 38	0,264	0,026	0,030
SEQ ID NO: 39	0,216	0,039	1,000

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193/198 [00703] Os resultados mostram que todas as lisozimas da invenção têm atividade significativamente aumentada (p<0,05) em comparação com essa lisozima da técnica anterior, conforme determinado com o uso do método de queda de OD.

Tabela 10: Queda de OD média

Lisozima	Queda de \OD média
Média para lisozima de clara de ovo de galinha	0,180
Média para SEQ ID NO: 39	0,187

[00704] Exemplo 17: Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii.

[00705] Extração PGN:

Cultivo de Lactobacillus johnsonii:

Materiais • Caldo MRS, produto número BD 288130, pH 6,3 a 6,7.

• Placas de ágar MRS, BD 288130; Agar Oxoid LP0011; pH 6,3 a 6,7.

• 0,9% NaCl, Merck 106404, Cas N° 7647145 • frascos, fornecedor Merck 116387, frasco anaeróbio Anaerocult 2,5 1 • Anaerogênio 2,51, ThermoScientific, catálogo N° AN0025A

Lactobacillus johnsonii, DSM1O533

Procedimento [00706] L. johnsonii foi estriado a partir do estoque congelado em placa de ágar MRS e incubado sob condições anaeróbias por 2 dias, frasco anaeróbio com Anaerogênio 2,5 1, 30 °C. Algumas colônias foram inoculadas em 500 ml de caldo de MRS em frasco de 500 ml de tampa azul e colocadas em frasco anaeróbio com Anaerogênio 2,5 1 por 72 horas a 30 °C.

[00707] A cultura foi centrifugada (6.000 rpm, 10 minutos) e o sobrenadante foi retirado antes de outro ciclo de centrifugação ter sido realizado. O pélete foi lavado em 100 ml de NaCl a 0,9% e a suspensão foi

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194/198 bem misturada e centrifugada a 6.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi derramado e o procedimento de lavagem em NaCl a 0,9% foi repetido para um total de três lavagens. Aproximadamente 40 ml de NaCl a 0,9% foram adicionados ao pélete e a solução foi transferida para um tubo falcon de 50 ml. A solução foi centrifugada a 6.000 rpm durante 10 minutos e o sobrenadante foi decantado. O pélete foi armazenado a -18 °C até a extração do peptidoglicano ser conduzida.

[00708] Procedimento de extração:

Materiais • Protease de Streptomyces griseus, Sigma-Aldrich P5147,

CAS 9036-06-0 •PBS pH 7,3:

NaCl: 8 g, Sigma-Aldrich 31434, CAS 7647-14-5 KC1: 0,2 g, Sigma-Aldrich P9333, CAS 7447-40-7 KH₂PO₄: 0,24 g, Sigma-Aldrich P5655, CAS 7778-77-0 Na₂HPO₄. 2 H₂O: 1,44 g, Sigma-Aldrich 30412, CAS 1002824-7

Adicionar água Milli-Q a 1.000 ml • solução 1% Triton-X 100:

ml de Triton X100, Sigma-Aldrich X100, CAS 9002-93-1 Adicionar água Milli-Q a 100 ml • tampão carbonato de sódio 500 rnM, pH 9,3:

[00709] O carbonato de sódio 500 mM é feito a partir de 21 g de Na2CO3(Sigma-Aldrich S7795, CAS 497-19-8) em 500 ml de água MQ [00710] Bicarbonato de sódio 500 mM é produzido a partir de 72 g de NaHCCri (Sigma-Aldrich S6014, CAS 144-55-8) em 500 ml de água MW [00711] O tampão de pH 9.3 é produzido a partir de 320 ml de NaHCCri e 80 ml de Na2COs e ajustando-se 0 pH com HC1 [00712] · Solução de fenol com Tris HC1 10 mM, pH 8,0, EDTA 1

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195 / 198 mM, Sigma-Aldrich P4557, CAS 108-95-2 [00713] · Acetona, Sigma-Aldrich 32201-M, CAS 67-64-1 [00714] · Etanol, 96%, CCS Healthcare 1680643, CAS 64-17-5 [00715] Procedimento [00716] O material celular de L. johnsonii foi liofilizado. O material liofilizado (525 mg) foi suspenso em PBS (40 ml) em um tubo Falcon de 50 ml. A suspensão foi agitada durante 2 h a 700 rpm em um termoagitador à temperatura ambiente. Protease de Streptomyces griseus (55 mg) foi em seguida adicionada e a suspensão foi incubada 6 h a 37 °C, no termoagitador. A mesma foi então centrifugada 20 min a 1.900 g à temperatura ambiente e ο sobrenadante foi decantado. O pélete foi ressuspenso em Triton X-100 a 1% (40 ml) e agitado durante a noite a 37 °C. Após outra centrifugação e decantação, o sedimento foi ressuspenso em PBS (40 ml) e adicionou-se novamente protease (55 mg). A suspensão foi novamente incubada 6 h a 37 °C, centrifugada e decantada. O pélete foi ressuspenso em PBS (40 ml) e agitado durante a noite a 37 °C. Este procedimento de lavagem foi repetido uma vez mais com PBS (40 ml, 30 minutos de agitação), depois com etanol a 50%/água (40 ml, 30 min agitação). O pélete foi, então, dividido em dois tubos Falcon. A cada tubo adicionou-se solução de fenol (15 ml) pré-aquecida a 40 °C. As suspensões foram agitadas durante 10 min a 40 °C e depois adicionou-se etanol a 96% (25 ml a cada tubo), centrifugou-se e decantou-se. Os péletes foram adicionalmente lavados com acetona (40 ml em cada tubo) e etanol a 96% (40 ml em cada tubo), antes de serem liofilizados. A combinação dos péletes dos dois tubos rendeu 80 mg de peptidoglicano purificado como um pó branco.

[00717] Ensaio Terminal de Redução [00718] A lisozima foi diluída em tampão de diluição de fosfato (citrato 5 mM, K2HPO4 5 mM, 0,01% de TritonX-100, pH 5,0) a 50 pg/ml em tubos de polipropileno. A lisozima diluída foi adicionalmente diluída em uma

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196/198 placa de microtitulação de polipropileno de 96 poços através da preparação de uma série de diluição de 2 vezes até uma concentração de 6,25 qg/ml em tampão de diluição de fosfato (citrato 5 mM, K2HPO4 5 mM, 0,01% de TritonX-100, pH 5,0). Preparou-se uma solução estoque de 50 mg/ml de substrato de L. johnsonii em MillQ e diluiu-se em tampão fosfato (citrato 50 mM, K2HPO4 50 mM, pH 5,0) a 250 qg/ml. Em uma placa de poços profundos de polipropileno, 50 μΐ da diluição de lisozima foram misturados com 450 μΐ de solução de L. johnsonii e incubados a 40 °C com agitação (500 rpm ) por 45 min. Após a incubação, a placa de poços profundos foi centrifugada (3.200 rpm, 7 min) para sedimentar o material insolúvel e 100 μΐ do sobrenadante foram misturados com 50 μΐ de HC1 3,2 M em uma placa de PCR de 96 poços e incubados a 95 °C durante 80 min. Foram adicionados 50 μΐ de NaOH 3,5 M a cada poço da placa de PCR e 150 μΐ de cada amostra foram transferidos para uma nova placa PCR que contêm solução de 4hidroxibenzidrazida 75 μΐ/poço em tampão de tartarato de K-Na/NaOH (50 g/l de tartarato de K-Na + 20 g/l de NaOH). A placa foi incubada a 95 °C durante 10 minutos antes de 100 μΐ/amostra serem transferidos para uma placa de microtitulação de fundo plano transparente para medição de densidade óptica (OD) a 405 nm. As medições de OD foram realizadas em amostras diluídas três vezes (50 μΐ de amostra diluída em 100 μΐ em água Milli-Q). Os valores da medição de OD representam a diferença depois que a leitura original (de fundo) foi subtraída e representam a média de dois valores de medição de OD. Os resultados são mostrados na Tabela 11 e na Figura 1.

Tabela 11: Média de medições de DO4Q5 (corrigida em fundo) no Ensaio

Terminal de Rec	ução
Lisozima	Concentração de lisozima em μ ç/rnl
5	2,5	1,25	0,63
SEQ ID NO: 3	0,51	0,30	0,22	0,12
SEQ ID NO: 9	0,43	0,24	0,15	0,08
SEQ ID NO: 6	0,49	0,31	0,20	0,10
SEQ ID NO: 12	0,33	0,13	0,11	0,04
SEQ ID NO: 15	0,04	0,01	0,00	0,00
SEQ ID NO: 21	0,62	0,42	0,24	0,16
SEQ ID NO: 24	0,22	0,15	0,08	0,03

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SEQ ID NO: 27	0,05	0,02	0,01	0,00
SEQ ID NO: 30	0,20	0,12	0,06	0,03
SEQ ID NO: 33	0,86	0,55	0,37	0,32
SEQ ID NO: 18	0,32	0,18	0,14	0,11
SEQ ID NO: 38	0,34	0,24	0,14	0,14
SEQ ID NO: 39	0,88	0,73	0,46	0,31
HEWL	0,00	-0,01	0,00	-0,02

[00719] Exemplo 18: Ração animal e aditivos de ração animal que compreendem uma lisozima da invenção [00720] Aditivo de Ração Animal [00721] Uma formulação de uma lisozima da invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 38 ou 39) que contém 0,01 g a 10 g de proteína de enzima é adicionada à seguinte pré-mistura (por quilograma de pré-mistura):

5.000.000 IE	Vitamina A
1.000.000 IE	Vitamina D3
13.333	mg	Vitamina E
1.000		mg Vitamina K3
750	mg	Vitamina BI
2.500		mg Vitamina B2
1.500		mg Vitamina B6
7.666		mcg Vitamina B12
12.333	mg	Niacina
33.333	mcg	Biotina
300	mg	Ácido fólico
3.000		mg Ca-D-Pantotenato
1.666		mg Cu
16.666	mg	Fe
16.666	mg	Zn
23.333	mg	Mn
133	mg	Co
66	mg	I
66	mg	Se

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5,8

Cálcio

Sódio [00722] [00723]

Ração animal

Isso é um exemplo de uma ração animal (ração de frango de corte) que compreende o aditivo de ração animal conforme descrito acima:

62,55% de Mais

33,8% de Farelo de soja (50% de proteína bruta)

1,0% de Oleo de soja

0,2% de DL-Metionina

0,22% de DCP (fosfato dicálcico)

0,76% de CaCOs (carbonato de cálcio)

0,32% de Areia

0,15% de NaCl (cloreto de sódio) % da Pré-mistura acima [00724]

Os ingredientes são misturados, e a ração é peletizada na temperatura desejada, por exemplo, 60, 65, 75, 80, 85, 90 ou até mesmo 95 [00725]

A invenção descrita e reivindicada no presente documento não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas no presente documento ficarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações também são destinadas a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo GH25 isolado, caracterizado pelo fato de ter atividade de lisozima selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

(b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6;

(c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9;

(d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12;

(e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 15;

(f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 18;

(g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 21;

(h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24;

(i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 27;

(j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 30;

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 33;

(l) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 38;

(m) uma variante do polipeptídeo selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12,

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2/8

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 38, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 posições;

(n) um polipeptideo que compreende o polipeptideo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal;

(o) um polipeptideo que compreende o polipeptideo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal de entre 1 a 10 aminoácidos; e (p) um fragmento do polipeptideo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% do comprimento do polipeptideo maduro.

2. Polipeptideo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo é selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptideo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 3;

(b) um polipeptideo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 6;

(c) um polipeptideo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 9;

(d) um polipeptideo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 12;

(e) um polipeptideo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 15;

(f) um polipeptideo que tem pelo menos 90% de identidade

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3/8 de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 18;

(g) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 21;

(h) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24;

(i) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 27;

(j) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 30;

(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 33; e (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 38.

3. Polipeptídeo GH25 isolado, caracterizado pelo fato de que tem atividade de lisozima selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

(b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6;

(c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9;

(d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12;

(f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 18;

(g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 21;

(h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24;

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4/8 (k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 33;

(l) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 38;

(m) uma variante do polipeptídeo selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 38, em que a variante tem atividade de lisozima e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 posições;

(n) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal;

(o) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (p) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1) ou (m) que tem atividade de lisozima e que tem pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

4. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que tem atividade de lisozima melhorada a) em comparação com a atividade de lisozima da lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL) ou b) em comparação com a atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39, conforme determinado pelo Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus.
5. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que tem atividade de lisozima

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5/8 melhorada a) em comparação com a atividade de lisozima da lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL) e b) em comparação com a atividade de lisozima da SEQ ID NO: 39, conforme determinado por qualquer um de i) Método para a Determinação da Atividade da Lisozima Contra Micrococcus lysodeikticus e ii) Método para a Determinação da Atividade da Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii.
6. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende o motivo F[I/L/V][A/S/K][H/N/S]GGGW (SEQ ID NO: 40).
7. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pleo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 33 ou aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 38.
8. Método para hidrolisar peptidoglicano em paredes celulares bacterianas, caracterizado pelo fato de que compreende tratar células bacterianas com um ou mais polipeptídeos GH25 que têm atividade de lisozima, em que o polipeptídeo é como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Método para aumentar a digestibilidade de peptidoglicanos em ração animal, caracterizado pelo fato de que compreende o uso de um peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
10. Aditivo de ração animal, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
11. Aditivo de ração animal de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais

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6/8 componentes selecionados da lista que consiste em:

uma ou mais vitaminas;

um ou mais minerais;

um ou mais aminoácidos;

um ou mais prebióticos;

um ou mais ácidos orgânicos;

um ou mais outros ingredientes de ração;

uma ou mais enzimas adicionais;

um ou mais probióticos; e um ou mais fitogênicos.
12. Ração animal, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
13. Ração animal de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente material à base de planta.
14. Composição, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
15. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
16. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 15, ligada de maneira operacional a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo.
17. Método para produzir o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) cultivar uma célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 16, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

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7/8
18. Uso do polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser:

em ração animal;

em aditivos de ração animal;

na preparação de uma composição para uso em ração animal; e/ou para melhorar a saúde intestinal em um animal.
19. Aditivo zootécnico para uso em ração para aves ou suíno, sendo que o referido aditivo é caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
20. Método para melhorar a saúde intestinal em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende reduzir a quantidade de células de Lactobacillus johnsonii mortas, ou detritos de parede celular das mesmas, no trato digestivo do referido animal, que compreende alimentar o animal com uma ração ou aditivo de ração que compreende um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 7.
21. Método para melhorar a saúde intestinal em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende reduzir a quantidade de células de Lactobacillus johnsonii mortas, ou detritos de parede celular das mesmas, no trato digestivo do referido animal, que compreende alimentar o animal com uma ração ou aditivo de ração que compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO 39.
22. Método para promover a eliminação de células de Lactobacillus johnsonii mortas do trato digestivo, ou detritos de parede celular das mesmas de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende

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8/8 alimentar o referido animal com uma fonte de um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 7.
23. Método para promover a eliminação de células de Lactobacillus johnsonii mortas, ou detritos de parede celular das mesmas, do trato digestivo de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende alimentar o referido animal com uma fonte de um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO 39.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma atividade de lisozima contra Lactobacillus johnsonii em 5 ppm que aumenta a medição de densidade óptica (OD) em 405 nm de pelo menos 0,20, conforme determinado pelo Método para a Determinação de Atividade de Lisozima Contra Lactobacillus johnsonii.