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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung enthaltend mindestens
eine biologisch wirksame Protease und mindestens eine biologisch
wirksame Glucosidase, wobei die Proteasen und die Glucosidasen in
einem Aktivitätsverhältnis von
1.000 000 U:1 U bis 1 U:1000000 U vorliegen. Die vorliegende Erfindung
betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser enzymhaltigen
Zusammensetzung und Verfahren zur Entfernung von Karies. Die Erfindung
betrifft auch die Verwendung von enzymhaltigen Zusammensetzungen
zur Herstellung eines Behandlungsmittels zur Entfernung von Karies.
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Karies,
auch Zahnfäule
genannt, ist eine der häufigsten
Erkrankungen des Menschen. Karies ist eine bakterielle Schädigung des
Zahnes, die bis zum Zahnausfall führen kann. Zähne werden äußerlich
von einer Hülle
von hartem Zahnschmelz geschützt,
der das weichere Dentin umgibt welches wiederum die sogenannte Pulpa
umschließt.
Der Zahnschmelz selbst besteht aus ca. 95% anorganischen Substanzen,
insbesondere Hydroxylapatit, und ca. 5% organischen Substanzen sowie
Wasser. Dentin ist weicher als Zahnschmelz und besteht aus etwa
65% anorganischen Substanzen (vorwiegend Hydroxylapatit), etwa 20%
organischen Substanzen (vorwiegend Kollagen und Polysaccharide)
und etwa 15% Wasser. Die Pulpa stellt ein Gefäß-Nervenbündel mit Blut- und Lymphgefäßen dar.
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Eine
Karieserkrankung beginnt häufig
mit der Bildung von Plaque und dem sich aus Plaque entwickelnden
Zahnstein. Plaque sind weißliche
Zahnbeläge,
haupt sächlich
bestehend aus einer schwer abwischbaren Bakterien enthaltenden Eiweiß- und Polysaccharid-haltigen
Masse. Als „Plaque” wird die
Gesamtheit der auf der Zahnoberfläche angesiedelten Mikroorganismen
und ihrer organischen Matrix bezeichnet. Aus Plaque heraus kann
sich Karies und der für
das Zahnfleisch so schädliche
Zahnstein entwickeln, wobei Zahnstein aus verkalkter Plaque besteht.
Zahnstein kann auch durch sorgfältiges
Putzen nicht von der Zahnoberfläche
entfernt werden.
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Karies
entsteht nun in mehreren Schritten durch die bakterielle Vergärung von
Kohlenhydraten, insbesondere durch die bakterielle Vergärung von
Zucker zu Säuren.
Während
Bakterien hauptsächlich
die organischen Bestandteile, wie am Zahn haften gebliebene Speisereste,
angreifen, lösen
die im Rahmen der bakteriellen Vergärung entstehenden Säuren zunächst den
harten Zahnschmelz auf.
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Wird
der Zahnschmelz durch die bakterieninduzierte Säureeinwirkung porös und weich,
können
Nahrungsreste und Bakterien auch Zugang zu der unter dem Zahnschmelz
liegenden Dentinschicht gelangen und diese mit Karies infizieren.
Eine Karieserkrankung an der Dentinschicht zieht dabei häufig eine
Entzündung der
unter dem Dentin liegenden Pulpa nach sich. Eine Entzündung der
Pulpa ist äußerst schmerzhaft
und kann den Erkrankten in eine gesundheitsbedrohliche Situation
bringen, wenn die Entzündung
nicht schnell behandelt wird.
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Der
Bereich der stärksten
Schmelzauflösung
wird Kariesläsion
genannt. Eine Kariesläsion
besteht in der Regel aus einer Vielzahl unterschiedlicher Substanzen,
die teilweise bakteriellen Ursprungs sind und teilweise aus dem
Speichel sowie aus Nahrungsresten stammen.
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Körpereigene
Reparaturmaßnahmen
gegen die durch Karies verursachten Zahnschäden gibt es, im Gegensatz zu
Schäden
an sonstigem lebenden Körpergewebe, nicht.
Lediglich im Anfangsstadium der Karieserkrankung ist eine Ausheilung
durch Remineralisation der Zahnhartsubstanz möglich. In einem fortgeschrittenen
Stadium der Karieserkrankung muss eine Behandlung erfolgen, bei
der ein durch Karies geschädigter Zahnbereich
entfernt wird. Der durch die Entfernung des kranken Zahngewebes
entstandene Hohlraum wird Kavität
genannt. Ab einer bestimmten Größe einer
Kavität
wird nach der Entfernung des kranken Zahngewebes die Kavität in der
Regel mit einer künstlichen
Zahnfüllung
aufgefüllt.
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Die
Entfernung der durch Karies verursachten Zahnschäden erfolgt in der Regel durch
Ausbohren des kariösen
Zahngewebes mit einem Dentalbohrer. Je nach Indikation und Technik
werden Bohrgeschwindigkeiten bis zu 400.000 Umdrehungen pro Minute
erreicht. Als Bohrer dienen Hartmetall- oder Diamant-Instrumente. Da beim
Bohren eine große
Hitzeentwicklung stattfindet und die abgetragenen Zahnsubstanzen
die Behandlungsstelle verunreinigen, ist zur Kühlung und Reinigung der Kavität meistens
ein Wasser-Luft-Gemisch erforderlich.
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Diese
Behandlungsmethode zur Entfernung von Karies unter Verwendung eines
Dentalbohrers weist aber mehrere Nachteile auf.
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Ein
schwerwiegender Nachteil besteht beispielsweise darin, dass diese
Behandlungsmethode in der Regel mit erheblichen Schmerzen für den Patientenverbunden
ist. Als Bohrschmerz werden vom Patienten vor allen Dingen die feinen
Vibrationen der rotierenden Bohrinstrumente an dem in vielen Fällen entzündeten Zahnbereich
empfunden. Hinzu kommt ein als sehr unangenehm empfundenes pfeifendes
Bohrgeräusch.
Daher warten viele Patienten oft zu lange, bevor sie den mit Karies
befallenen geschädigten
Zahn behandeln lassen.
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Ein
weiterer Nachteil dieser Behandlungsmethode besteht darin, dass
beim Bohren gesunde Zahnsubstanz in Mitleidenschaft gezogen und
abgetragen werden kann. Ein solcher Abtrag des gesunden Zahnmaterials
ist jedoch in der Regel unerwünscht.
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Nachteilig
am Ausbohren eines mit Karies infizierten Zahns ist weiterhin, dass
trotz Ausbohren des kariösen
Zahngewebes häufig
noch bakterielle Rückstände an der
geschädigten
Stelle verbleiben. Solche bakteriellen Rückstände verursachen oft schwere
Folgeschäden,
wie Zahnwurzelentzündungen,
deren Behandlung in häufig
weit schmerzhafter ist als die vorhergegangene Erstbehandlung.
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Neben
der oben beschriebenen klassischen Therapie des Bohrens wurden in
den letzten Jahren zunehmend Zahnhartsubstanz schonende Behandlungsarten
beschrieben.
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In
der
WO 98/20838 wird
beispielsweise eine chemo-mechanische Methode zu einer wesentlich schmerzfreien
und bohrerfreien Entfernung von Karies offenbart. Zur Auflösung von
Karies wird das aggressive Oxidationsmittel Natriumhypochlorid in
Kombination mit Aminosäuren
verwendet. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass Natriumhypochlorid
als starkes Oxidationsmittel unspezifisch nicht nur mit kariösem Gewebe bzw.
Zahnbestandteilen, sondern auch mit gesunder Zahnsubstanz reagiert
und diese schädigt.
Weiterhin erlaubt dieses Verfahren nur das oberflächliche
Anlösen
und Aufweichen der kariösen
Bereiche. Sobald die oxidative Wirkung nachlässt, muss die Natrumhypochloridlösung erneuert
werden. Daher ist ein häufiges
Auftragen erforderlich.
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Die
klinische Erfahrung belegt, dass die beschriebene chemo-mechanische
Methode sehr zeitaufwendig und nicht immer erfolgreich ist, so dass
letztendlich doch auf einen Dentalbohrer zurückgegriffen werden muss.
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In
der
WO 96/07329 wird
ein Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von Karies und paradontitischen
Krankheiten beschrieben. Es wird vorgeschlagen, Keime in der Mundhöhle mit über gentechnische
Methoden gewonnenen Enzymen zu bekämpfen. Als geeignete Enzyme
werden Lysozym und Dextranase genannt. Als Ansatzpunkt zur Behandlung
und Vorbeugung von Zahnkaries soll mit den Enzymen Plaque abgebaut
werden. Die Behandlung von Karies selbst wird in der Druckschrift
nicht genannt.
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In ähnlicher
Weise beschreibt die
EP
0 824 910 A2 die Verwendung von bestimmten Enzymen zur
Behandlung von Plaque. Zur Entfernung von Karies sind die dort beschriebenen
enzymhaltigen Lösungen
jedoch nicht geeignet.
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In
der
WO 92/10165 wird
eine Zusammensetzung offenbart, die neben anderen Substanzen Proteasen
und Komplexierungsmittel für
Kalzium in einer bestimmten Menge beinhaltet, um Plaque auf Prothesen
zu entfernen. Im neutralen oder basischen Milieu arbeitende Proteasen
werden dabei bevorzugt. Die dort beschriebenen enzymhaltigen Lösungen besitzen
jedoch keine ausreichende Kariesauflösende Wirkung.
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Die
WO 97/38669 betrifft eine
Zusammensetzung zur Vermeidung der Bildung von Plaque bzw. zur Entfernung
von Plaque, welche die Glucosidasen Dextranase und Mutanase sowie
optional noch weitere Enzyme wie Proteasen beinhaltet. Es wird ausgeführt, dass
die verwendeten Enzyme alle im Bereich von pH 6 bis pH 8 arbeiten.
Die Zusammensetzung lässt
sich in Form von Zahnpaste, Zahnpulver oder einer Mundspülung anwenden.
Auch die hier beschriebenen enzymhaltigen Lösungen sind für eine Entfernung
von Karies nicht geeignet.
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In
der
WO 98/26807 wird
ein Verfahren zur Reinigung und Desinfektion von Oberflächen beispielsweise
Arbeitsflächen
aus Kunststoff oder Metall beschrieben, die von einem Biofilm überzogen
sind, wobei die verwendete Zusammensetzung Enzyme enthält. Die
dort beschriebenen Zusammensetzungen weisen allerdings ebenfalls
keine ausreichende Karies-auflösende
Wirkung auf.
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Die
Verwendung von Lysozym in Verbindung mit dem Komplexierungsmittel
EDTA (Ethylen-Diamino-Tetraacetic-Acid) zur vorbeugenden Behandlung
von Karies ist in der
US 4,355,022 beschrieben.
Auch hier ist eine Entfernung von Karies mit den dort beschriebenen
enzymhaltigen Lösungen
nicht möglich.
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Die
FR 2651433 , die
US 4,693,888 und die
DE OS 1944308 betreffen
Zusammensetzungen zur Zahnpflege und zur Vorbeugung von Karieserkrankungen.
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Es
bestand daher ein Bedürfnis
nach einer Zusammensetzung, mit der auf einfache und schmerzfreie Art
und Weise Karies in der täglichen
Praxis entfernt werden kann. Weiterhin bestand ein Bedürfnis nach
einer Zusammensetzung zur Entfernung von Karies, mit der das gesunde
und erhaltenswerte Zahnmaterial nicht oder nicht mehr als vermeidbar
angegriffen und beschädigt
wird. Darüber
hinaus bestand ein Bedürfnis
nach einer Zusammensetzung zur Entfernung von Karies, mit der sichergestellt
wird, dass nach der Behandlung zur Entfernung von Karies im wesentlichen
keine bakteriellen Rückstände verbleiben.
Es bestand darüber
hinaus ein Bedürfnis
nach einem Verfahren zur schmerzfreien und einfachen Behandlung
von Karies.
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Der
vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine Zusammensetzung
bereitzustellen, mit der eines oder mehrere der oben genannten Bedürfnisse
erfüllt
werden. Weiterhin lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde,
eine Behandlungsmethode zur Entfernung von Karies bereitzustellen,
mit der eines oder mehrere der oben genannten Bedürfnisse
erfüllt
werden.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist daher eine Zusammensetzung enthaltend
mindestens eine biologisch wirksame Protease und mindestens eine
biologisch wirksame Glucosidase wobei die Enzymaktivitätsverhältnisse
der Proteasen zu den Glucosidasen in der Zusammensetzung in einem
Bereich von 1.000.000:1 bis 1:1.000.000 liegen und die Gesamtenzymaktivität mehr als
2 U/ml beträgt.
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Eine
Enzymunit (abgekürzt
U) ist jeweils die Menge eines Enzyms, die benötigt wird, um bei Standardbedingungen
für das
jeweilige Enzym ein μMol
eines entsprechenden Enzymsubstrates pro Minute umzusetzen. Im Fall
von Proteinase K bezieht sich die Angabe U auf die Einheit mAnson.
Der Einfachheit halber wird die Abkürzung U im Rahmen des vorliegenden
Textes auch für
Proteinase K benutzt, wobei die Abkürzung U in diesem Fall für die Einheit
mAnson steht. Die Zahlenangaben der Enzymaktivitätsverhältnisse für die Enzymunits (U) gelten
im Fall des Enzyms Proteinase K daher auch für die ausschließlich für Proteinase
K verwendete Enzymeinheit mAnson.
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Die
Gesamtenzymaktivität
in [U/ml] bezieht sich im vorliegenden Fall sowohl auf flüssige als
auch auf pastöse
oder trockene Produkte, die beispielsweise ausschließlich aus
einem Enzymgemisch und gegebenenfalls einem oder mehreren ebenfalls
trockenen Zusatzstoffen bestehen.
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Die
im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Enzyme können grundsätzlich aus
Pflanzen, Tieren oder aus Pilzen, sowie aus Bakterien oder Hefen
gewonnen werden. Sie können
auch biotechnologisch hergestellt worden sein. Geeignet sind Enzyme,
die aus Tieren, Bakterien oder Hefen gewonnen wurden, beispielsweise
Enzyme, die aus Schwein oder Huhn gewonnen wurden. Ebenfalls geeignet
sind weiterhin Enzyme, die aus den Hefegattungen Streptomyces oder
Penicillium oder aus den Bakteriengattungen Clostridium, Aspergillus
oder Triotirachium gewonnen wurden. Bevorzugt werden Enzyme, die
aus Streptomyces griseus, Clostridium hostolyticum, Aspergillus
nidulans, Penicillium species oder Triotirachium album gewonnen
wurden.
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Unter
den Begriff „Proteasen” fallen
im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Enzyme, die Proteine proteolytisch
verändern
können.
Eine Protease bindet ihr Substrat, also das jeweilige Protein, spezifisch
an einer Peptidbindung der Aminoseitenketten. Die Peptidbindungen
der Aminoseitenketten des Substrates werden von den Proteasen vom
N-Terminus in Richtung C-Terminus gespalten.
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Die
erfindungsgemäß eingesetzten
Proteasen dienen dazu, die Zersetzung von Proteinbestandteilen, die
in einer Kariesläsion
vorhanden sein können,
zu katalysieren. Grundsätzlich
sind dafür
alle Proteasen geeignet, die eine proteolytische Peptiddegradierung
katalysieren. Es eignen sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung
jedoch besonders alle diejenigen Proteasen, die in der Lage sind,
die Zersetzung von Kollagenfasern, wie sie beispielsweise im Zahnmaterial
vorkommen, zu katalysieren oder wenigstens die eine Änderung der
Struktur der Kollagenfasern derart zu katalysieren, dass die Kollagenfasern
nach der Proteasereaktion ein besseres Löslichkeitsverhalten zeigen.
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Erfindungsgemäß eingesetzte
Proteasen sind beispielsweise Peptidasen, Peptidylpeptidasen, Dipeptidasen,
Dipeptidylpeptidasen, Oligopeptidasen, Proteinasen, Endopeptidasen,
Exopeptidasen.
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Eine
Klassifizierung von erfindungsgemäß geeigneten Proteasen kann
auch hinsichtlich der an der proteolytischen Katalyse beteiligten
Aminosäuren
oder Cofaktoren erfolgen. So können
im Rahmen der vorliegenden Erfindung grundsätzlich alle Proteaseklassen
wie Serinproteasen, Matrixmetalloproteasen, Aspartatproteasen und
Cysteinproteasen verwendet werden. Grundsätzlich sollen die in der Zusammensetzung
enthaltenden Proteasen unter Bedingungen eingesetzt werden, die
es den jeweiligen Proteasen ermöglichen,
die Degradation der in einer Kariesläsion befindlichen Proteinbestandteile
zu katalysieren.
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Eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann grundsätzlich
nur eine Protease enthalten, sie kann aber ebenso gut zwei oder
mehr unterschiedliche Proteasen beinhalten.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
eine Zusammensetzung beispielsweise eine Protease. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
enthält
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
ungefähr
1 bis 10 unterschiedliche Proteasen, vorzugsweise etwas 1 bis 6,
weiter bevorzugt etwa 1 bis 4 und weiter bevorzugt 2 bis 3 und weiter
bevorzugt 2 unterschiedliche Proteasen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
eine Zusammensetzung mindestens zwei Proteasen. Im Rahmen einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
beispielsweise Kollagenase und Pronase, im Rahmen einer weiteren Ausführungsform
enthält
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
beispielsweise Kollagenase und Proteinase K.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
enthält
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung,
drei Proteasen, nämlich
Kollagenase, Pronase und Proteinase K. Bevorzugt wird der Einsatz
von Kollagenase aus Clostridium hostolyticum und Pronase aus Streptomyces
griseus und Proteinase K aus Triotirachium album. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
enthält
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
nur eine Protease, vorzugsweise eine Aspartatprotease, wobei Pepsin
bevorzugt wird, insbesondere Pepsin aus Schwein.
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Als
im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbare Glucosidasen kommen
prinzipiell alle solche in Betracht, die in der Lage sind, Polysaccharidstrukturen
innerhalb einer Kariesläsion
aufzuspalten und zu zersetzen. Dabei katalysieren die Glucosidasen
die hydrolytische Spaltung glykosidischer Bindungen der in einer Kariesläsion befindlichen
Polysaccharidstrukturen.
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Der
katalytische Mechanismus der Glucosidasen funktioniert nur, wenn
die jeweilige Glucosidase spezifisch an das Substrat gebunden ist.
So katalysiert beispielsweise die Glucosidase Lysozym die Hydrolyse
von β-1,4-Bindungen
zwischen N-Acetylmuraminsäure und
N-Acetyl-D-glucosamin in Polysaccharidstrukturen. Die Glucosidase α-Amylase
katalysiert dagegen die Hydrolyse von α-1,4-Bindungen zwischen zwei
D-Glucoseeinheiten in Polysaccharidstrukturen. Die Glucosidase Dextranase
katalysiert die Hydrolyse von α-1,6-Bindungen
in Dextran. Dextran ist ein Polysaccharid, das insbesondere in Bakterienzellwänden und
extrazellulären
Strukturen vorkommt.
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In
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
können
grundsätzlich
alle Typen von Glucosidasen einzeln oder in Kombination mit anderen
Glucosidasen enthalten sein, beispielsweise α-Glucosidasen oder β-Glucosidasen
oder retentive Glucosidasen oder invertierende Glucosidasen.
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Eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann grundsätzlich
beispielsweise nur eine Glucosidase enthalten, sie kann aber ebenso
gut zwei oder mehr unterschiedliche Glucosidasen beinhalten. Gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
eine Zusammensetzung beispielsweise eine Glucosidase. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
enthält
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
1 bis etwa 10 unterschiedliche Glucosidasen, beispielsweise etwa
1 bis etwa 6 oder etwa 1 bis 4 oder 2 bis 3, beispielsweise 2 unterschiedliche
Glucosidasen.
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Im
Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden mindestens 2 verschiedene Glucosidasen
in einer Zusammensetzung eingesetzt. Bevorzugte Glucosidasen sind
Lysozym, α-Amylase
oder Dextranase oder ein Gemisch aus zwei oder mehr davon. Ebenfalls
geeignet ist der gemeinsame Einsatz von Lysozym und Dextranase.
Bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Einsatz
von mindestens zwei verschiedenen Glucosidasen, insbesondere Lysozym
aus Hühnereiweiß, α-Amylase aus
Aspergillus nidulans und Dextranase aus Penicillium species.
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Eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung
zeichnet sich durch eine bestimmte Relation der Aktivität der Proteasen
zur Aktivität
der Glucosidasen aus. Grundsätzlich
liegen in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
die Enzymaktivitätsverhältnisse
der Proteasen zu den Glucosidasen in einem Bereich von 1.000.000:1
bis 1:1.000.000 vor.
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Die
oben genannten Aktivitätsverhältnisse
beziehen sich dabei immer auf die jeweiligen Standardbedingungen
für das
entsprechende Enzym. Dabei gelten folgende Standardbedingungen:
Pronase: | 1
Unit entspricht dem Umsatz von 25 μg Tyrosin pro Minute bei 40°C und pH
7,5 wenn man Casein als Substrat benutzt. |
Collagenase: | 1
Unit entspricht dem Umsatz von 1 mmol L-Leucin in 5 h bei 37°C und pH
7,5 wenn man Collagen als Substrat benutzt. |
Pepsin: | 1
Unit entspricht einem Delta E von 0,01 bei A280 nm pro Minute 37°C von umgesetztem Hämoglobin
mit TCA. |
Lysozym: | 1
Unit produziert eine Aktivität
von 0,001 pro Minute bei pH 6,24 und 25°C. Als Substrat werden M. lysodeikticus
Zellen im Messvolumen von 2,6 ml benutzt. |
Dextranase: | 1
Unit entspricht dem Umsatz von 1 μmol
Isomaltose pro Minute bei 37°C
und pH 6,0 wenn man Dextran als Substrat benutzt. |
α-Amylase: | 1
Unit entspricht dem Umsatz von 1 mg Maltose in 3 Minuten bei 20°C und pH
6,9 wenn man Stärke
als Substrat benutzt. |
ProteinaseK: | 1
Anson Unit entspricht 1 μmol
Folin positive Aminosäuren
bei pH 7,5 und 35°C
wenn man Hämoglobin
als Substrat benutzt. |
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Erfindungsgemäß geeignet
sind beispielsweise Verhältnisse
der Aktivität
von Proteasen zu der Aktivität
von Glucosidasen von etwa 10000:1 bis 1:1.000.000 oder von etwa
100:1 bis 1:1.000.000 oder von etwa 1:1 bis 1:1.000.000 oder Verhältnisse
von etwa 1:10 bis 1:100.000 oder etwa 1:100 bis 1:100.000. Besonders geeignet
sind beispielsweise Verhältnisse
von etwa 1:1000 bis 1:100.000, weiter bevorzugt werden Verhältnisse
von etwa 1:3000 bis 1:30.000. Bevorzugt werden beispielsweise Verhältnisse
von etwa 1:100 bis 1:500.
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Die
oben genannten Aktivitätsverhältnisse
beziehen sich dabei ausdrücklich
auf die für
das jeweilige Enzym geltenden Standardbedingungen.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus sowohl eine Zusammensetzung
enthaltend eine Glucosidase und eine Protease oder enthaltend eine
Glucosidase und mindestens zwei und mehr Proteasen oder enthaltend
mindestens zwei oder mehr Glucosidasen und eine Protease oder enthaltend
mindestens zwei oder mehr Glucosidasen und zwei oder mehr Proteasen.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
enthält
beispielsweise etwa 1 bis etwa 10 Glucosidasen und etwa 1 bis etwa
10 Proteasen, bevorzugt etwa 6 Glucosidasen und etwa 1 bis etwa
10 Proteasen und weiter bevorzugt etwa 4 Glucosidasen und etwa 1
bis etwa 10 Proteasen, weiter bevorzugt etwa 2 Glucosidasen etwa
1 bis etwa 10 Proteasen, oder etwa 6 Glucosidasen und etwa 6 Proteasen
oder etwa 6 Glucosidasen und etwa 4 Proteasen oder etwa 6 Glucosidasen
und etwa 2 Proteasen und weiter bevorzugt etwa 4 Glucosidasen und
etwa 6 Proteasen oder 4 Glucosidasen und etwa Proteasen oder 4 Glucosidasen
und etwa 2 Proteasen und weiter bevorzugt etwa 2 Glucosidasen etwa
2 Proteasen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
die Proteasen Proteinase K und Collagenase in Verbindung mit den
Glucosidasen Lysozym und Dextranase.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch eine Lösung enthaltend eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
und mindestens ein Lösungsmittel.
Grundsätzlich
können
alle Lösungsmittel
als Bestandteil in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten
sein, in denen sich Enzyme lösen
lassen, ohne zu denaturieren. Als Lösungsmittel können alle
wässrigen
und organischen Lösungsmittel
eingesetzt werden, welche die Aktivität der Enzyme nicht soweit beeinträchtigen,
dass deren erfindungsgemäßer Einsatz
unmöglich gemacht
wird.
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Als
Lösungsmittel
geeignet sind beispielsweise Wasser, lineare, verzweigte oder cyclische,
gesättigte oder
ungesättigte
Alkohole mit 2 bis etwa 10 C-Atomen sowie Ketone, Ester, Carbonsäuren und
Gemische aus zwei oder mehr der genannten Lösemitteltypen.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung können beispielsweise Dialkylketone
oder Alkohole oder niedrigviskose polymerisierbare Substanzen wie
Hydroxyethylmethacrylat oder (2,3-Epoxypropyl)-methacrylat sowie
Mischungen davon als Lösungsmittel
verwendet werden. Besonders bevorzugte alkoholische Lösungsmittel
sind Methanol, Ethanol, Isopropanol und Propanol. Weitere geeignete
or ganische Lösungsmittel
sind Glycerin, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Aceton, Methylethylketon,
Cyclohexanol, Toluol, Methylenchlorid, Chloroform, Alkane und Essigsäurealkylester,
insbesondere Essigsäureethylester.
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Grundsätzlich ist
es möglich,
die oben genannten Lösemittel
jeweils alleine oder als Gemisch aus zwei oder mehr beliebigen Lösemitteln
einzusetzen, sofern die Lösemittelgemische
die Enzymaktivität
nicht soweit beeinträchtigen,
dass das angestrebte Ziel nicht erreicht werden kann. Im Rahmen
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden jedoch Lösemittelgemische eingesetzt,
die Wasser als Bestandteil enthalten, insbesondere wässrigalkoholische
Lösemittelgemische.
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Die
Viskosität
der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
sofern sie Lösemittel
enthalten, kann im wesentlichen innerhalb beliebiger Bereiche, von
dünnflüssig bis
pastös,
liegen. Häufig
hat es sich bewährt, wenn
die Zusammensetzungen eine ausreichend niedrige Viskosität aufweisen
um innerhalb einer zu behandelnden Kariesläsion auch in nicht einfach
zugängliche
Bereiche zu fließen.
Es kann jedoch auch vorteilhaft sein, beispielsweise wenn die Kariesläsion an
einem seitlichen Bereich des Zahns liegt, wenn die erfindungsgemäße lösemittelhaltige
Zusammensetzung eine höhere
Viskosität
aufweist, beispielsweise gelartig vorliegt, damit die Zusammensetzung
nicht zu schnell abfließt.
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Die
Viskositätsbereiche
der erfindungsgemäßen Lösung liegen
beispielsweise in einem Bereich von etwa 0,5 mPa·s bis etwa 100 Pa·s bei
+25°C oder
beispielsweise in einem Bereich von etwa 5 mPa·s bis etwa 50 Pa·s bei
+25°C.
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Als
im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbare Verdickungsmittel
können
grundsätzlich
alle dem Fachmann bekannten Mittel zur Einstellung der gewünschten
Viskosität
einer Lösung
eingesetzt werden, sofern sie den gewünschten Einsatzzweck nicht
oder nur unwesentlich nachteilig beeinflussen. Geeignete Verdickungsmittel
sind beispielsweise Stärke,
Polyvinylpyrrolidon, Hydroxyethylpropylcellulose, Hydroxybutylmethylcellulose,
Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxyethylcellulose Natriumcarboxymethylcellulose
und anorganische Verdickungsmittel wie Kieselgele oder Schichtsilikate
sowie Mischungen aus zwei oder mehr der genannten Verdickungsmittel.
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Die
erfindungsgemäßen Enzymlösungen können beispielsweise
Gesamtenzymaktivitäten
von etwa 2 U bis etwa 1.000.000 U pro ml Lösung enthalten. Die Untergrenze
beträgt
dabei beispielsweise etwa 3, 5, 7 oder 10 U/ml, wobei sich der erfindungsgemäße Effekt
bei einer Untergrenze für
die Gesamtenzymaktivität
von etwa 20 oder etwa 25 oder etwa 30 oder etwa 40 oder etwa 45
oder etwa 50 U/ml Lösung
in der Regel deutlich verbessert.
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Vorzugsweise
enthalten erfindungsgemäße Enzymlösungen etwa
60 U bis etwa 600.000 U/ml Lösungsmittel,
beispielsweise etwa 100 U bis etwa 400.000 U/ml Lösungsmittel
oder etwa 300 bis etwa 300.000 U/ml Lösungsmittel oder etwa 500 U
bis etwa 200.000 U/ml Lösungsmittel
oder etwa 700 bis etwa 150.000 U/ml Lösungsmittel oder etwa 1000
bis etwa 100.000 U/ml Lösungsmittel
oder etwa 5000 bis etwa 50.000 U/ml Lösungsmittel. Die genannten
Untergrenzen der einzelnen Bereiche sind im Rahmen des vorliegenden
Textes darüber
hinaus mit jeder der oben genannten Bereichsgrenzen kombinierbar,
sofern die Vorteilhafte Wirkung einer erfindungsgemäßen Enzymlösung innerhalb
eines solchen Bereichs besonders ausgeprägt auftritt.
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Die
einzelnen Enzyme liegen dabei beispielsweise in den Verhältnissen
1 U Proteasen:1 U Glucosidasen bis 1 U Proteasen:1.000.000 U Glucosidasen
oder Verhältnisse
von etwa 1 U Proteasen:10 U Glucosidasen bis 1 U Proteasen:100.000
U Glucosidasen oder etwa 1 U Proteasen:100 U Glucosidasen bis 1
U Proteasen:100.000 U Glucosidasen, jeweils bezogen auf die für das jeweilige
Enzym geltenden Standardbedingungen. Besonders geeignet sind beispielsweise
Verhältnisse
von etwa 1 U Proteasen:1000 U Glucosidasen bis 1 U Proteasen:100.000
U Glucosidasen, weiter bevorzugt werden Verhältnisse von etwa 1 U Proteasen:3000
U Glucosidasen bis 1 U Proteasen:30.000 U Glucosidasen.
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Die
Gesamtproteaseaktivität
liegt dabei beispielsweise in einem Bereich von etwa 1 U/ml Lösungsmittel
bis etwa 100.000 U/ml Lösungsmittel,
bevorzugt in einem Bereich von etwa 5 U bis etwa 10.000 U/ml Lösungsmittel
oder in einem Bereich von etwa 50 U bis etwa 1000 U/ml Lösungsmittel.
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Eine
im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Zusammensetzung enthaltend
eine Enzymkombination aus zwei Proteasen weist beispielsweise folgende
Enzymaktivitäten
auf Kollagenase in einem Bereich von 1 bis 5.000 U/ml Lösungsmittel,
beispielsweise 1 bis 1.000 U/ml Lösungsmittel oder beispielsweise 1
bis 5 U/ml Lösungsmittel
und Proteinase K in einem Bereich von 10 bis 300 mAnson/ml Lösungsmittel,
bevorzugt 20 bis 100 mAnson/ml Lösungsmittel
und besonders bevorzugt 20 bis 50 mAnson/ml Lösungsmittel. Ähnliche
Konzentrationen und Verhältnisse
gelten auch für
den gemeinsamen Einsatz von Kollegenase mit einer anderen Protease
als Proteinase K.
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Grundsätzlich liegt
die Gesamtglucosidaseaktivität
in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
in einem Bereich von größer 1 U/ml.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Gesamtglucosidaseaktivität im Bereich
von etwa 1 U bis etwa 1.000.000 U/ml Lösungsmittel liegen, bevorzugt
wird eine Gesamtglu cosidaseaktivität von etwa 10 U bis etwa 500.000
U/ml Lösungsmittel,
beispielsweise eine Konzentration von etwa 50 U bis etwa 300.000
U/ml Lösungsmittel
oder eine Konzentration von etwa 1000 U bis etwa 200.000 U/ml Lösungsmittel
oder eine Konzentration von etwa 10.000 U bis etwa 100.000 U/ml
Lösungsmittel.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung weist eine Zusammensetzung enthaltend
eine Enzymkombination aus zwei Glucosidasen beispielsweise folgende
Konzentrationen auf:
- – Lysozym in einem Bereich
von 5.000 bis 200.000 U/ml Lösungsmittel,
bevorzugt 10.000 bis 150.000 U/ml Lösungsmittel weiter bevorzugt
70.000 bis 100.000 U/ml Lösungsmittel
und
- – Dextranase
in einem Bereich von 10 bis 1.000 U/ml Lösungsmittel, bevorzugt 50 bis
500 u/ml Lösungsmittel
und weiter bevorzugt 90 bis 250 U/ml Lösungsmittel Dextranase.
-
Da
ein Hauptproteinbestandteil einer Kariesläsion das Protein Kollagen ist,
werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Lösungen bevorzugt,
die allein oder gemeinsam mit einer oder mehreren anderen Proteasen
dazu in der Lage sind, Kollagen zu degradieren.
-
Im
Rahmen einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform beinhaltet eine
erfindungsgemäße Lösung zur
Degradierung strukturell intakten Kollagens mindestens zwei Proteasen.
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Der
gemeinsame Einsatz von beispielsweise Kollagenase und einer weiteren
Protease wie Proteinase K wirkt sich beim Abbau von strukturell
nativem Kollagen vorteilhaft aus. Der Abbau von nativem Kollagen
wird durch das Enzym Kollagenase eingeleitet. Das bedeutet, dass
Kollagenase die Tertiärstruktur
des Kollagens so verändert,
dass danach auch die Sekundärstruktur
von anderen Proteasen angegriffen werden kann. Kollagenase allein
kann jedoch Kollagen nicht vollständig degradieren. Proteasen
wie Proteinase K oder Pronase können
dagegen ohne die vorhergehende Reaktion von Kollagen mit Kollagenase
strukturell intaktes Kollagen nicht degradieren. Zum effizienten
Abbau von Kollagen wirkt sich daher eine Kombination aus Kollagenase
und anderen Proteasen vorteilhaft aus.
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Auswahl und die Konzentrationen
der Proteasen und Glucosidasen so gewählt, dass die Proteasen die
Glucosidasen innerhalb der Nutzungsdauer nicht proteolytisch inaktivieren.
-
Je
höher die
Mineralisation des Substrates ist, desto mehr erschwert sich der
Zugang einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
an das Dentin-Kollagen. Dies hat zur Folge, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung
nur dort aktiv und degradierend wirkt, wo die Zahnsubstanz geschädigt ist.
Bereiche mit gesunder Zahnsubstanz werden nicht von der enzymhaltigen
Zusammensetzung angegriffen. Die Wirkung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung,
enthaltend eine Kombination aus Proteasen und Glucosidasen wie vorstehend
beschrieben, zur Verwendung bei einer Kariesbehandlung wird durch
den Anteil an mineralischer Substanz im Zahn reguliert. Im Rahmen
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Proteasen und Glucosidasen eingesetzt,
die bakterizid wirken, beispielsweise indem sie Bestandteile der
Bakterienzellwände
degradieren.
-
Eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung,
kann darüber
hinaus mindestens einen Puffer oder eine zusammen mit einer zweiten
Verbindung als Puffer wirkende Verbindung enthalten. Der in einer
erfindungsgemäßen Zusammensetzung
enthaltende Puffer dient dazu, den pH-Wert in einer erfindungsgemäßen Lösung, enthaltend
ein erfindungsgemäßes Enzymgemisch,
auf den für
die jeweilige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung gewünschten
Wert einzustellen bzw. eine Änderung
des pH-Werts über
einen definierten Zeitraum zu verhindern und die entsprechende Lösung zu
stabilisieren.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung sind als Puffer grundsätzlich alle üblichen
Puffer, beispielsweise Phosphatpuffer, Carbonatpuffer, Acetatpuffer,
Citratpuffer Tris-Puffer, Glycylglycinpuffer oder Glycinpuffer geeignet.
Dabei werden Natriumphosphatpuffer, Natriumhydrogenphosphatpuffer,
Natriumdihydrogenphosphatpuffer, Kaliumphosphatpuffer, Kaliumhydrogenphosphatpuffer,
Kaliumdihydrogenphosphatpuffer oder Pyrophosphatpuffer bevorzugt.
Ebenfalls geeignet sind Natriumcarbonatpuffer, Kaliumcarbonatpuffer,
Natriumhydrogencarbonatpuffer oder Kaliumhydrogencarbonatpuffer.
Besonders bevorzugt enthalten erfindungsgemäße Zusammensetzungen Phosphatpuffer
bzw. deren Bestandteile. Ein besonders bevorzugter Phosphatpuffer ist
ein Natriumdihydrogenphosphatpuffer.
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Die
Pufferkonzentration einer ein Lösungsmittel
enthaltenden erfindungsgemäßen Lösung kann
im Bereich von bis zu 100 Mol pro Liter liegen. Die Konzentration
Mol pro Liter bezieht sich auf den Säureanteil in der Lösung. Bevorzugt
wird ein Bereich von etwa 0,001 bis etwa 10 Mol pro Liter. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
eine enzymhaltige Lösung
einen Puffer im Bereich von ca. 0,001 Liter bis ca. 5 Mol pro Liter.
Bevorzugt wird der Bereich von ca. 0,01 bis ca. 3 Mol pro Liter
und weiter bevorzugt der Bereich von ca. 0,02 bis ca. 1,0 Mol pro
Liter. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
eine enzymhaltige Lösung
einen Puffer in einem Bereich von ca. 0,03 bis ca. 10 Mol pro Liter,
weiter bevorzugt in einem Bereich von ca. 0,05 bis ca. 5 Mol pro
Liter und weiter bevorzugt ca. 0,08 bis 1 Mol pro Liter.
-
Eine
ein erfindungsgemäßes Enzymgemisch
enthaltende Lösung
kann grundsätzlich
einen pH-Bereich von etwa 1 bis etwa 10 aufweisen.
-
Im
Rahmen einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung liegt der pH-Wert einer erfindungsgemäßen enzymhaltigen
Lösung
im Bereich von etwa pH 5 bis etwa pH 10 insbesondere von etwa pH 6
bis etwa pH 9, insbesondere von etwa pH 7 oder von etwa pH 1 bis
etwa pH 4.
-
Der
Einsatz der auf im Rahmen der oben genannten Werte eingestellten
Proteasemischungen ist dann vorteilhaft, wenn die Proteine in der
Kariesläsion
aufgrund einer starken Demineralisierung innerhalb der Kariesläsion leicht
zugänglich
sind. Wenn eine solche Lösung
jedoch auf mineralisches Material stößt, unterbleibt der proteolytische
Abbau. Dadurch wird auch eine Limitierung der Wirkung durch eine
Limitierung der Substratverfügbarkeit
erreicht. Vorteilhaft wirkt sich dabei aus, dass daher im wesentlichen
nur infiziertes Dentin und stärker
demineralisiertes Dentin entfernt wird, gesundes, mineralisiertes
Dentin wird dagegen nicht oder nur unwesentlich angegriffen. Die
beschriebenen Lösungen
bei einem pH-Wert von etwa 5 bis etwa 10 sind daher sehr schonend
für das
gesunde Zahnmaterial.
-
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen
können
noch weitere Hilfsstoffe wie Komplexierungsmittel, Enzymsubstrate
oder Enzymeffektoren beinhalten. Enzy meffektoren beinhalten im Rahmen
der vorliegenden Erfindung sowohl Enzymaktivatoren als auch Enzyminhibitoren.
-
Komplexierungsmittel
dienen im Rahmen der vorliegenden Erfindung dazu, den Zugang zur
Kariesläsion
durch unterstützenden
Abbau des Hydroxylapatits zu erleichtern. Die Komplexierungsmittel
können
auch dazu beitragen, Zellwände
der Bakterien aufzubrechen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
bevorzugte Komplexierungmittel sind diejenigen, die mit 2-wertigen
Metallionen stabile Komplexe bilden. Beispielsweise sind als Komplexierungsmittel
EDTA (Ethylene-Diamino-Tetraacetic-Acid), EGTA, (Ethylene-Glycol-diaminoethyl-Tetraacetic-Acid),
Citronensäure
oder Salicysäure
geeignet. Am meisten bevorzugt wird der Komplexbildner EDTA (Ethylen-Diamino-Tetraacetic-Acid).
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung können einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
noch weitere Substanzen zugesetzt werden, welche die Funktionsfähigkeit
der Enzyme optimieren können.
Solche Enzymaktivierende oder inhibierenden Substanzen umfassen
Diethylbarbitursäure,
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), Glycin, Glycylglycin, N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure (ACES),
N-(2-Acetamido)-imino-diacetat (ADA), N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethan-sulfonsäure (BES),
N,N-Bis-(2-hydroxy-ethyl)glycin
(BICINE), 2,2-Bis(hydroxyethyl)-iminotris(hydroxymethyl)methan (BIS-TRIS),
2-(Cyclohexyl-amino)ethan-sulfonsäure (CHES), 2-[4-(2-Hydroxyethyl-1-piperazin)]-ethansulfonsäure (HEPES), 3-[4-(2-Hydroxyethyl-1-piperazinyl)]-propansulfonsäure (HEPPS),
2-Morpholino-ethansulfonsäure
(MES), 3-Morpholino-propansulfonsäure (MOPS), Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES),
N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-2-aminoethansulfonsäure (TES),
N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-glycin (TRICINE), Säuren wie
Schwefelsäure,
schweflige Säure,
Phosphorsäure,
Salz säure,
Essigsäure,
Salpetersäure,
Basen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Ammoniak,
Calciumhydroxid, Magnesiumoxid, Salze wie Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat,
Magnesiumnitrat, Calciumchlorid, Calciumsulfat, Calciumnitrat, Eisen(III)-chlorid,
Eisen(II)-chlorid, Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Natriumphosphate, Kaliumphosphate, Coenzyme und Vitamine.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Herstellung einer enzymhaltigen Zusammensetzung wie sie im Rahmen
der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, dadurch gekennzeichnet,
dass eine geeignete Auswahl an Enzymen in einem geeigneten Verhältnis der
jeweiligen Enzymaktivitäten
miteinander vermischt wird.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Herstellung einer enzymhaltigen Zusammensetzung wie sie im Rahmen
der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, dadurch gekennzeichnet,
dass eine geeigneten Enzymmischung mit gegebenenfalls geeigneten
Hilfsstoffen und gegebenenfalls mit einem oder mehreren geeigneten
Lösungsmitteln
versetzt wird.
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Bei
einem erfindungsgemäßes Herstellungsverfahren
kann grundsätzlich
auf alle dem Fachmann bekannten Verfahrenstechniken zur Behandlung
von Enzymen bei der Herstellung und Lagerung zurückgegriffen werden. Beispielsweise
kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung
unter Verwendung von Chromatographietechniken, Gefriertrocknung,
Sprühtrocknung,
Granulierung, Zentrifugation, Präzipitation,
Kristallisation oder Ultra- oder Nanofiltration erfolgen.
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Außerdem können auch
alle dem Fachmann bekannten Produktionshilfsstoffe für eine Verbesserung der
Lagerstabilität
eingesetzt werden.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren
zur Entfernung einer Karies bei dem eine enzymhaltige Zusammensetzung
wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde,
auf den Karies aufweisenden Zahnbereich aufgebracht wird.
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Bei
der Auswahl der geeigneten Behandlungslösung, insbesondere der geeigneten
Enzyme in der Lösung
für die
Behandlung zur Entfernung von Karies muss beispielsweise berücksichtigt
werden, um welche Art von Karies es sich im Einzelfall handelt.
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Grundsätzlich wird
zwischen unterschiedlichen Arten von Karies differenziert. So lässt sich
Karies beispielsweise in eingebrochene Kariesläsionen mit ungehindertem Zugang
zum Dentin, Kariesläsionen
bei denen kariöses
Dentin noch mit Schmelz überdeckt
ist, Schmelzkaries, Zahnhalskaries und Wurzelkaries einteilen.
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Wenn
die mit Karies befallene Stelle mit einer dicken Schmelzschicht
oder einer alten Füllung
umgeben ist und daher für
die Behandlungs-Zusammensetzung nicht zugänglich ist, kann der Schmelzdeckel
oder die alte Füllung
mit einem schnell drehenden Bohrer entfernt werden. Wenn die Schmelzabdeckung
jedoch beispielsweise aufgrund einer fortgeschrittenen Karieserkrankung,
perforiert ist, kann diese auch ohne den Einsatz eines Dentalbohrers,
mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
in Kombination mit mechanischer Unterstützung durchdrungen werden.
Denkbare mechanische Werkzeuge zur Unterstützung der Durchdringung perforierter
Schmelzabdeckungen umfassen eine Microbrush mit Kunststoff oder
Metallbürstchen, Handstücke mit
Metallspitze, Handstücke
mit Löffel,
Handstücke
mit Kugelkopf und andere in der Zahnarztpraxis üblicherweise vorhandene zahnärztlich
verwendete Werkzeuge. Diese Werkzeuge dienen dazu, die erfindungsgemäße Lösung auf
der zu behandelnden Stelle zu verteilen und einzumassieren, der
Ablösung
von erweichtem kariösen
Dentin und zum taktilen Ertasten harter Dentin- und Schmelzoberflächen.
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Wenn
Zugang zum mit Karies infizierten Zahnbereich möglich ist, erfolgt die Behandlung üblicherweise,
indem zunächst
die kariösen
Zahnbereiche im Mund des Patienten identifiziert werden. Die Identifizierung kann
dabei nach die dem Zahnarzt bekannten Methoden erfolgen, beispielsweise
durch In-Augenscheinnahme,
Sondierung, Röntgen,
aber auch durch Anwendung diagnostischer Abformmassen. Die identifizierten
kariesbefallenen Zahnbereiche werden gegebenenfalls grob gesäubert, beispielsweise
mit einer Sonde oder einem Exkavator wobei gegebenenfalls auch Abrasionsmittel
zugesetzt werden können.
Anschließend
wird der zu behandelnde Zahnbereich abgespült und trocken geblasen.
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Nach
diesen Vorbereitungen folgt die Entfernung des Karies, indem auf
den vorbereiteten Zahnbereich die erfindungsgemäße enzymhaltige Lösung aufgebracht
wird.
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Die
zu behandelnde Stelle sowie die gegebenenfalls vorhandene Kavität sollte
immer vollständig
mit der erfindungsgemäßen Lösung bedeckt
bzw. gefüllt
sein. Ein geeignetes Auftragvolumen für die Behandlung eines mit
Karies befallenen Zahnbereichs beträgt beispielsweise ca. 100 μl. Allerdings
sollte das geeignete Auftragvolumen dem Einzelfall also der Größe der Kavität und der
Größe des mit
Karies infizierten Zahnbereichs angepasst werden. Geeignete Auftragsvolumina
liegen daher in einem Bereich von etwa 0,001 bis etwa 0,5 ml, vorzugsweise
in einem Bereich von 0,01 bis 0,3 ml und weiter bevorzugt in einem
Bereich von 0,02 bis 0,2 ml.
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Die
bevorzugte Einwirkzeit der erfindungsgemäßen enzymhaltigen Zusammensetzung
liegt in einem Bereich von etwa 10 sec. bis etwa ca. 5 min., wobei
je nach Größe der Kariesläsion die
Einwirkzeiten verkürzt oder
verlängert
werden können.
Die Einwirkzeit liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 15 sec. bis
etwa 3 min., beispielsweise im Bereich von etwa 15 sec. bis etwa
2 min. oder im Bereich von etwa 20 sec. bis 1 min.
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Während der
Einwirkzeit werden die kariösen
Bestandteile der Kariesläsion
zersetzt, und es bildet sich eine größere Kavität aus. Nach dem Ablauf der
Einwirkzeit wird der behandelte Zahnbereich abgespült und gegebenenfalls
trockengeblasen.
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Der
kariesauflösende
Behandlungsschritt erfolgt beispielsweise nach folgendem Schema.
Es wird ein geeignetes Auftragsvolumen der erfindungsgemäßen enzymhaltigen
Lösung
auf den zu behandelnden Zahnbereich aufgebracht, die Lösung wirkt
5 sec. bis etwa 5 min. ein, und anschließend wird der Zahnbereich beispielsweise
mit Wasser gespült.
Ein solcher Handlungsablauf wird nachfolgend als ein Inkubationsschritt
bezeichnet.
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Grundsätzlich erfolgt
der Inkubationsschritt so oft wie erforderlich, damit keine kariösen oder
bakteriellen Reste am behandelten Zahnbereich zurückbleiben.
Der Inkubationsschritt kann einmal erfolgen oder mehr als einmal,
beispielsweise 2 oder 3 mal oder noch häufiger wiederholt werden. In
den meisten Fällen
wird es jedoch nicht erforderlich sein, den Inkubationsschritt mehr
als 2 oder 3 mal zu wiederholen.
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Es
hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als besonders vorteilhaft
herausgestellt, wenn der Inkubationsschritt mit der erfindungsgemäße Zusammensetzung
zweimal hintereinander erfolgt. Die erfindungsgemäße Enzymlösung sollte
dabei jeweils für
etwa 10 bis etwa 30 sec., beispielsweise etwa 20 sec. auf den mit
Karies befallenen Zahnbereich einwirkt.
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Der
vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Entfernung
von Karies, bei der eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, insbesondere
eine mindestens ein Lösungsmittel
enthaltende erfindungsgemäße Zusammensetzung
auf einen kariösen
Zahnbereich aufgetragen wird.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Entfernung
von Karies, dadurch gekennzeichnet, dass es in zwei oder mehr Inkubationsschritten
durchgeführt
wird.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus ein Verfahren zur
Entfernung von Karies, bei dem in einem ersten und in einem oder
mehreren weiteren Schritten jeweils eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
auf den kariösen
Zahnbereich aufgebracht wird.
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Es
hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung herausgestellt, dass
es in bestimmten Situationen vorteilhaft sein kann, eine enzymhaltige
Behandlungslösung
einzusetzen, die auf einen pH-Wert eingestellt ist, bei dem Zahnschmelz
und Den tin angegriffen und gelöst
werden. Beispielsweise kann dies dann der Fall sein, wenn sich die
Kariesläsion
unterhalb einer perforierten aber nicht völlig zerstörten Zahnschmelzkappe befindet.
In solchen Fällen
lässt sich
durch eine sauer eingestellte enzymhaltige Behandlungslösung eine
bohrerfreie Entfernung der Schmelzkappe erreichen, wobei das in
einer solchen Lösung
enthaltene Enzym den Abbau der in der unter der Schmelzkappe liegenden
kariösen
Bereiche einleitet oder durchführt.
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Es
kann weiterhin vorteilhaft sein, wenn eine bereits mit einer enzymhaltigen
Zusammensetzung mit einem pH-Wert von 5 oder mehr behandelte Kariesläsion in
einem Zwischenschritt oder abschließend mit einer enzymhaltigen
Behandlungslösung
behandelt wird, die auf einen pH-Wert eingestellt ist, bei dem Zahnschmelz und
Dentin angegriffen und gelöst
werden. Durch die auflösende
Wirkung einer solchen sauren Lösung
auf Dentin und Schmelz wird eine Aufrauung der Innenflächen der
Kavität
erreicht, welche eine nachfolgende Füllungstherapie vorbereitet
und erleichtert.
-
Geeignete
Behandlungslösungen
weisen einen pH-Wert von weniger als etwa 4, insbesondere weniger
als etwa 3 auf. Geeignete pH-Werte liegen beispielsweise innerhalb
eines Bereichs von etwa 1 bis etwa 4, insbesondere etwa 1,2 bis
etwa 3 oder etwa 1,5 bis etwa 2,5, beispielsweise etwa 2.
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Eine
derartige Behandlungslösung
sollte als Enzym mindestens ein Enzym enthalten, das bei einem pH-Wert
innerhalb des oben angegebenen Bereichs Aktivität aufweist. Besonders geeignet
ist hierbei das Enzym Pepsin.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Entfernung
von Karies, bei dem eine Behandlungslösung eingesetzt wird, die mindestens
eine im sauren pH-Bereich unter 7 ihr proteolytisches Wirkungsoptimum
aufweisende Protease enthält.
Vorzugsweise liegt der pH-Wert bei dem die Protease ihr proteolytisches
Wirkungsoptimum aufweist bei höchstens
etwa 5 oder höchstens
etwa 4.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Entfernung
von Karies, bei dem eine Kariesläsion
mit mindestens einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung und mindestens
einer Behandlungslösung,
die mindestens eine im sauren pH-Bereich unter 7 ihr proteolytisches
Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält, in Kontakt gebracht wird.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
eine solche Behandlungslösung
beispielsweise eine Aspartatprotease, vorzugsweise Pepsin. Der anfangs-pH-Wert
der in diesem Verfahren eingesetzten Behandlungslösung beträgt vorzugsweise
etwa 1,0 bis etwa 2,5. Eine solche im Rahmen der vorliegenden Erfindung
eingesetzte Behandlungslösung
enthält
vorzugsweise einen Puffer.
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Das
Karies-Behandlungsverfahren mit einer solchen, vorzugsweise pepsinhaltigen
Behandlungslösung
erfolgt im wesentlichen gemäß dem bereits
beschriebenen Verfahren, bei dem eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
eingesetzt wird.
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Eine
entsprechende saure Behandlungslösung
kann durch eine bereits poröse
Zahnschmelzüberdeckung
Zugang zu den mineralisch eingehüllt
Proteinanteilen in einer Kariesläsion
gewähren.
Gleichzeitig denaturiert die Säure
die Proteine in der Kariesläsion.
Dadurch wird der proteolytische Abbau unterstützt. Dies ist insbesondere
für den
hohen Kollagenanteil vorteilhaft, denn natives und strukturell intaktes
Kollagen wird von Pepsin nur langsam angegriffen. Säure und
Pepsin wirken in diesem Fall synergistisch.
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Um
zu vermeiden, dass die hier beschriebene Zusammensetzung zu tief
in den Zahn eindringt, dass heißt
auch gesundes Zahnmaterial schädigt,
wird die alkalische Eigenschaft des Hydroxylapatits genutzt. Je mehr
Hydroxylapatit gelöst
wird, desto mehr wird der pH-Wert der Lösung nach pH 4 verschoben und
die Hydroxylapatit auflösende
Kapazität
fällt stark
ab. Daher stellt auch die saure pepsinhaltige Lösung keine Gefahr für gesunde
Zahnbereiche dar. Vorteilhaft ist weiterhin, dass die saure Pepsinlösung keimabtötend wirkt.
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Die
beschriebene Behandlungslösung
kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung alleine in einem oder
mehreren aufeinanderfolgenden Schritten zur Behandlung von Kariesläsionen eingesetzt
werden. Es ist erfindungsgemäß jedoch
ebenso möglich,
die Behandlungslösung
in Kombination mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, insbesondere
in Kombination mit einer Lösungsmittelhaltigen
erfindungsgemäßen Zusammensetzung
einzusetzen.
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Die
Abfolge von Behandlungsschritten mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
und einer sauren Behandlungslösung
ist dabei im wesentlichen beliebig. So können erfindungsgemäße Zusammensetzung
und saure Behandlungslösung
beispielsweise in 2 oder mehr Schritten jeweils abwechselnd oder
mehrmals in Folge jeweils nacheinander eingesetzt werden. Der erste
Behandlungsschritt kann dabei mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
oder mit einer sauren Behandlungslösung erfolgen.
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Vorzugsweise
findet dabei zwischen den einzelnen Behandlungsschritten ein Spülschritt
statt, bei dem die Reste der aufgelösten Bestandteile der Kariesläsion zusammen
mit der zur Behandlung eingesetzten Zusammensetzung oder Behandlungslösung entfernt
werden.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung
von Karies, bei dem eine Kariesläsion
mit mindestens einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung und mindestens
einer Behandlungslösung,
die mindestens eine im sauren pH-Bereich unter 7 ihr proteolytisches
Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält, in Kontakt gebracht wird.
Die Behandlung erfolgt vorzugsweise in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden
Schritten.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hat es sich beispielsweise als vorteilhaft erwiesen,
wenn zuerst zwei Inkubationsschritte mit einer erfindungsgemäßen Lösung erfolgen
und ein abschließender
Inkubationsschritt mit der sauren Behandlungslösung erfolgt. Die saure Behandlungslösung ätzt die
Zahnoberfläche
leicht an, und eignet sich daher gut zur Vorbereitung für eine der
Kariesentfernung folgende Füllungstherapie.
Durch die harte und etwas raue Oberfläche, die durch die Ätzwirkung
der sauren Behandlungslösung
entsteht, haften die Füllmaterialien
sehr gut am Zahn.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft erwiesen,
den ersten Inkubationsschritt mit einer sauren pepsinhaltigen Lösung vorzunehmen.
Diese Vorgehensweise ist optimal bei einer Zahnschädigung,
bei der die Zahnschmelzschicht zwar das infizierte Dentin überdeckt,
jedoch selbst durch Karies schon so porös und weich geworden ist, dass
die Säure ausreicht,
um durch die poröse
Zahnschmelzschicht einen Zugang zum Dentin herzustellen, Kollagen
zu denaturieren und denaturiertes Kollagen zu degradieren.
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Anschließend kann
beispielsweise ein Inkubationsschritt mit einer erfindungsgemäßen Lösung erfolgen,
um das denaturierte Kollagen abzubauen.
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Ein
erfindungsgemäßes Verfahren
zur Behandlung von Karies bewirkt, dass im wesentlichen keine nachweisbaren
bakteriellen Rückstände an dem
zuvor mit Karies befallenen Zahnbereich verbleiben. Dies lässt sich
beispielsweise durch mikroskopische Analysen nachweisen.
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Die
erfindungsgemäß vorgeschlagenen
Lösungen
zur Kariesbehandlung können
dem Anwender prinzipiell in beliebiger Form zur Verfügung gestellt
werden. So kann dem Anwender im grundlegenden Fall beispielsweise
ein Kit zur Verfügung
gestellt werden, das zwei oder mehr der oben genannten Enzyme enthält, die
der Anwender dann in der erforderlichen Menge selbst zusammenmischt.
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Kit enthaltend
mindestens zwei Enzyme, die zu einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
vermischbar sind.
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Um
dem Anwender die Mischung zu erleichtern kann es vorteilhaft sein,
dem Kit beispielsweise ein geeignetes Lösemittel beizufügen. Darüber hinaus
ist es durchaus möglich
und erleichtert die Anwendung, wenn die von Kit umfassten Enzyme
bereits in einem geeigneten Mischungsverhältnis im Hinblick auf ihre
Aktivität
innerhalb der oben genannten Grenzen vermischt vorliegen.
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Häufig ist
es sinnvoll, die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
und einer sauren Behandlungslösung
zu kombinieren. Um dem Anwender auch hier die Anwendung zu erleichtern
hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, die erfindungsgemäße Zusammensetzung
und die saure Behandlungslösung
ebenfalls als Kit zur Verfügung
zu stellen.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein
Kit enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder mindestens
eine saure Behandlungslösung,
die mindestens eine im sauren pH-Bereich unter 7 ihr proteolytisches
Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält oder enthaltend mindestens
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
und mindestens eine saure Behandlungslösung, die mindestens eine im
sauren pH-Bereich unter 7, vorzugsweise bei einem pH-Wert von höchstens
4, ihr proteolytisches Wirkungsoptimum aufweisende Protease enthält.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
einer mindestens eine Protease und eine Glucosidase enthaltenden
Zusammensetzung zur Herstellung eines Behandlungsmittels zur Entfernung
von Karies.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
mindestens einer Protease, die im sauren pH-Bereich unter 7, insbesondere
bei einem pH-Wert
von höchstens
4, ihr proteolytisches Wirkungsoptimum hat, zur Herstellung eines
Behandlungsmittels zur Entfernung von Karies.
-
Die
Erfindung wird nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert.
-
Ausführungsbeispiele
-
Verwendete Enzyme:
-
Die
Enzyme Pepsin, Kollagenase, Lysozym, Pronase, Dextranase und alpha-Amylase wurden von
der Firma SIGMA bezogen. Das Enzym Proteinase K wurde von der Firma
ICN bezogen. Beispiel 1: Rezepturen Lösung
1
| Name | Konzentration |
Enzyme | Lysozym | 88.000
u/ml |
| Dextranase | 110
u/ml |
| Kollagenase | 2,7
u/ml |
| Proteinase
K | 38
mAnson/ml |
Puffer | Natriumdihydrogenphosphat | 0,025
Mol/l
pH 7,0 |
Lösungsmittel | Wasser | |
Hilfsstoffe | Carboxymethylcellulose | 2% |
Lösung
2
| Name | Konzentration |
Enzym | Pepsin | 1
mg/ml |
Puffer | Natriumdihydrogenphosphat | 1
Mol/l
pH 2,0 |
Lösungsmittel | Wasser | |
Hilfsstoffe | Pektin | 3% |
-
Beispiel 2: Behandlungsverfahren
-
Die
Untersuchungen zur Bestimmung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Lösungen wurden
in vitro an extrahierten, kariösen
Zähnen
durchgeführt.
-
1. Zugang
-
Wenn
nötig,
wurde der Teil der den kariösen
Bereich überdeckenden
Schmelzschicht mit einem schnelldrehendem Bohrer entfernt
-
2. Gegebenenfalls grobe Säuberung
-
Die
grobe Säuberung
ist nicht notwendig, erleichtert jedoch dem behandelnden Zahnarzt
die Überprüfung der
Wirkung der Behandlung. Mit einem Exkavator oder Karieslöffel wurde
eine grobe Säuberung
der Kariesläsion
vorgenommen. 3.
Behandlung mit Enzymlösungen
a)
20 sec | 100 μl Lösung 1 |
b)
Spülen | |
c)
20 sec | 100 μl Lösung 1 |
d)
Spülen | |
e)
20 sec | 100 μl Lösung 2 |
f)
Spülen | |
g)
danach gegebenenfalls Füllungstherapie | |
-
Da
beide Lösungen
alleine in der Lage sind, Bakterienfreiheit des mit Karies erkrankten
Zahnbereich zu erzielen, kann eine Behandlung auch mit ausschließlich einer
Lösung
1 oder 2 erfolgen oder auch in einer anderen Abfolge. Zu bevorzugen
ist eine kombinierte Anwendung. Eine finale Anwendung der sauren
Lösung 2
(pH-Wert 2,0) ist besonders vorteilhaft, wenn anschließend eine
Füllungstherapie
vorgenommen werden soll.
-
Beispiel 3: Nachweis der Bakterienfreiheit
-
Nach
bestimmungsgemäßer Anwendung
der erfindungsgemäßen Enzymlösungen zur
Entfernung von infizierter Zahnhartsubstanz in der Kariesläsion wurde
der extrahierte und behandelte Zahn mit Druckluft getrocknet und
in einer Einbettmasse (cytofix, Fa. Struers) fixiert. Mit einer
Innenlochsäge
wurden schrittweise Zahnschnitte durch die behandelte Kariesläsion erstellt.
Die Zahnschnitte wurden vom umgebenden Einbettmaterial befreit und
jeweils in 1 ml lebend/tod-Färbelösung für Bakterien
inkubiert (Live/Dead BacLight, Fa. Molecular Probes). Während der
Inkubation wurden die Zahnschnitte lichtgeschützt aufbewahrt. Mit einem Fluoreszenzmikroskop
(Fa. Zeiss, Axioplan 2) wurden die markierten Bakterien im Auflicht
mit einem 24 FITC-Filter bei 630-facher und 1000-facher Vergrößerung beobachtet.
Während
bei einer unbehandelten Referenzprobe unter den gleichen Bedingungen
ein Bakterienrasen erkennbar war, waren die erfindungsgemäß behandelten Proben
völlig
bakterienfrei.
-
Bei
weniger stark mit Karies zerstörtem
Zahnmaterial kann bereits ein einmaliges Auftragen nur einer erfindungsgemäßen oder
einer Pepsin-haltigen Lösung
zu Bakterienfreiheit des vorher mit Karies erkrankten Zahnbereichs
führen.