CN102791858B - 木糖异构酶及其利用 - Google Patents

木糖异构酶及其利用 Download PDF

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Abstract

本发明的公开的目的是提供具有木糖同化能力的真核细胞。本发明的公开通过使用编码来源于白蚁原生生物的木糖异构酶的DNA来转化酵母等真核细胞，从而提供具有木糖同化能力的新的真核细胞。

Description

木糖异构酶及其利用
技术领域
本申请通过引用而包含2009年12月22日在日本申请的特愿2009-291463和2010年12月22日在日本国申请的特愿2010-285538的全部内容。
本发明涉及新的木糖异构酶和使用该木糖异构酶、并使用木糖作为碳源来生产有用物质的技术。
背景技术
近年来，研究了将可再生的生物量转换为有用物质代替石油资源作为能源和/或工业原料使用的技术。以生物量为原料通过微生物的发酵而生产的乙醇等有用物质，从抑制石油资源的消耗、抑制大气中的二氧化碳增加这样的观点出发可期待作为代替原料。生物量有各种存在，其中，作为不与粮食竞争的原料，考虑利用以木质纤维素为主体的草本类和/或木本类等。
木质纤维素所含的主要的糖是构成纤维素的葡萄糖和构成半纤维素的木糖。如果将木质纤维素化学分解或酶分解，则得到主要含有这样的单糖的糖化组合物。为了由木质纤维素工业制造有用物质，要求有效地利用这样的糖化组合物中所含的糖，能够以高收量、高生产性发酵的微生物。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等乙醇发酵能力高的酵母一般能够利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖，但不能利用木糖。因此，为了以木质纤维素为原料高效地发酵，要求改变这样的酵母使其能够利用木糖。为了使酵母等利用木糖，已报告了使用作为由木糖向木酮糖的异构化酶的木糖异构酶(XI)(专利文献1、2)。
到现在为止被报告能够在酵母中表达充分的活性的XI是来源于作为厌氧性霉菌的Piromyces sp.E2种的XI(专利文献1)、来源于作为厌氧性霉菌的Cyllamyces aberensi的XI、来源于作为细菌的多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的XI(专利文献2)、来源于作为细菌的Clostridiumphytofermentans的XI(非专利文献1)。另一方面，到目前为止来源于上述以外的多种生物的XI基因被导入了酵母，但不能表达充分的活性(非专利文献1、2、3、4)。已经明确木糖异构酶具有共同的保守区(非专利文献5)、能在酵母中以活性型表达的XI和不表达活性的XI均保持有上述的保守区，具有保守区不能说是XI在酵母中以活性型表达的充分条件。而且，到目前为止对于在酵母中表达活性所需的序列的特征完全没有阐明。
另外，对于在酵母中有效地发挥功能的木糖异构酶的酶学特征也仅进行了少许研究(非专利文献1、6和7)。
以作为木质成分的纤维素为能源的白蚁等木质分解性昆虫通过作为纤维素分解酶的纤维素酶来分解纤维素。已知来源于这样的昆虫的纤维素酶具有极高的纤维素分解能力。在白蚁的肠内作用于纤维素的纤维素酶大致分为白蚁自身的纤维素酶和在其肠内共生的原生生物等微生物的纤维素酶2个种类。低等白蚁的后肠内共生的原生生物承担纤维素分解的主要作用，但由于该原生生物为难培养性，因而研究没怎么进行。到现在为止，公开了白蚁原生生物的纤维素酶和基因(专利文献3、4)
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2005-514951号公报
专利文献2：日本特表2006-525029号公报
专利文献3：日本特开2003-7047号公报
专利文献4：国际公开第WO2008/108116号小册子
非专利文献
非专利文献1：Brat D,Boles E,Wiedemann、B.,Appl EnvironMicrobiol.2009;75(8):2304-11
非专利文献2：Ga.rdonyi,M.and Hahn-Hagerdahl,B.(2003)Enzym.Microb.Technol.32,252-259.
非专利文献3：Walfridsson,M.,Bao,X.,Anderlund,M.,Lilius,G.,Bulow,L.,Hahn-Hagerdal,B.(1996)Appl Environ Microbiol 62:4648-51.
非专利文献4：Ho,N.W.Y.,P.Stevis,S.Rosenfeld,J.J.Huang,and G.T.Tsao.(1983)Biotechnol.Bioeng.Symp.13:245–250.
非专利文献5：Harhangi,H.R.,A.S.Akhmanova,R.Emmens,C.vander Drift,W.T.de Laat,J.P.van Dijken,M.S.Jetten,J.T.Pronk,and H.J.Op den Camp.2003.Arch Microbiol 180:134-41.
非专利文献6：Hanes,CS.,Biochemical Journal 1932;26(5):1406–1421.
非专利文献7：Ozcan,S.,Johnston M.,Microbiol Mol Biol Rev 1999;63:554–569
发明内容
然而，关于白蚁原生生物的木糖异构酶完全未被发现也未被知晓。另外，即使发现了来源于白蚁原生生物的木糖异构酶，如上所述，也没有阐明在酵母等中以活性型表达所需的氨基酸序列的特征，即使具有保守区也不知活性是否表达，因此，预测在酵母等异种微生物中表达时是否发挥本来的XI活性是极困难的。此外，白蚁原生生物由于培养困难，因而即使是来源于该生物的纤维素酶也没怎么进行研究，白蚁原生生物被认为在进化上与酵母的关系远，对酵母的适合性低。
本说明书的公开的目的是提供在酵母中有效地发挥功能的新的木糖异构酶及其利用。
本发明者们对于被认为对酵母适合性低的白蚁的原生生物的蛋白质探索木糖异构酶，新发现了木糖异构酶，同时将该木糖异构酶导入了酵母，结果发现了适于在酵母细胞中表达的木糖异构酶。根据本说明书的公开，可提供以下方法。
根据本说明书的公开，可提供以下任一项所记载的木糖异构酶(具有XI活性的蛋白质)。
(A)具有序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列的蛋白质，
(B)具有在序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有XI活性活性的蛋白质，
(C)具有对序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性活性的蛋白质，
(D)由与包含序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列的DNA的互补DNA在严格条件下杂交的DNA编码、且具有XI活性活性的蛋白质，
(E)由包含对序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列具有70％以上的同一性的碱基序列的DNA编码、且具有XI活性活性的蛋白质。
所述(A)～(E)可以如下。
(A)具有序列号2、4、6和8的任一者所示氨基酸序列的蛋白质，
(B)具有在序列号2、4、6和8的任一者所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有XI活性活性的蛋白质，
(C)具有对序列号2、4、6和8的任一者所示氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性活性的蛋白质，
(D)由与包含序列号1、3、5和7的任一者所示碱基序列的DNA的互补DNA在严格条件下杂交的DNA编码、且具有XI活性活性的蛋白质，
(E)包含对序列号1、3、5和7的任一者所示碱基序列具有70％以上的同一性的碱基序列、且具有XI活性活性的蛋白质。
所述(A)～(E)可以如下。
(A)具有序列号2所示氨基酸序列的蛋白质，
(B)具有在序列号2所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有木糖异构酶活性的蛋白质，
(C)具有对序列号2所示氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有木糖异构酶活性的蛋白质，
(D)由与包含序列号1所示碱基序列的DNA的互补DNA在严格条件下杂交的DNA编码、且具有木糖异构酶活性的蛋白质，
(E)由包含对序列号1所示碱基序列具有70％以上的同一性的碱基序列的DNA编码、且具有木糖异构酶活性的蛋白质。
根据本说明书的公开，提供以下任一DNA。
(a)包含序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列的DNA，
(b)与包含序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列的DNA的互补DNA在严格条件杂交、且编码具有木糖异构酶活性(XI活性)的蛋白质的DNA，
(c)包含对序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列具有70％以上的同一性的碱基序列、且编码具有XI活性的蛋白质的DNA，
(d)编码具有序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(e)编码具有在序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质的DNA，
(f)编码具有对序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质的DNA。
所述(a)～(f)可以如下。
(a)包含序列号1、3、5和7的任一碱基序列的DNA，
(b)与包含序列号1、3、5和7的任一碱基序列的DNA的互补DNA在严格条件下杂交、且编码具有XI活性的蛋白质的DNA，
(c)包含具有对序列号1、3、5和7的任一碱基序列具有70％以上的同一性的碱基序列、且编码具有XI活性的蛋白质的DNA，
(d)编码具有序列号2、4、6和8的任一者所示氨基酸序列的蛋白质的DNA
(e)编码具有在序列号2、4、6和8的任一者所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质的DNA，
(f)编码具有对序列号2、4、6和8的任一者所示氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质的DNA。
所述(a)～(f)可以如下。
(a)包含序列号1所示碱基序列的DNA，
(b)与包含序列号1所示碱基序列的DNA的互补DNA在严格条件下杂交、且编码具有木糖异构酶活性的蛋白质的DNA，
(c)包含对序列号1的碱基序列具有70％以上的同一性的碱基序列、且编码具有木糖异构酶活性的蛋白质的DNA，
(d)编码具有序列号2所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(e)编码具有在序列号2所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有木糖异构酶活性的蛋白质的DNA，
(f)编码具有对序列号2所示氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有木糖异构酶活性的蛋白质的DNA。
根据本说明书的公开，还提供被包含上述任一DNA的DNA构建体转化而表达木糖异构酶的真核细胞。所述真核细胞优选为酵母，更优选所述酵母属于选自酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hancenula)、克勒克酵母属(Klocckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、和伊萨酵母属(Issatchenkia)中的任一属。所述真核细胞可以是分泌生产纤维素酶的真核细胞。所述真核细胞优选具备生产选自乙醇、乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢醇、香叶基香叶醇和角鲨烯中的任一者的外源性或内源性的基因。
根据本说明书的公开，提供包含上述任一DNA的、酵母等真核细胞的表达载体。
根据本说明书的公开，提供被赋予或提高了木糖利用性的转化真核细胞的制作方法，该制作方法具备将上述任一DNA导入真核细胞而将其转化的工序。
根据本说明书的公开，提供有用物质的生产方法，该生产方法具备在木糖存在下培养本说明书所公开的转化真核细胞的工序。所述有用物质可以是选自乙醇、乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯和甘油中的任一者。
附图说明
图1是显示木糖代谢途径的概要的图。
图2是显示从黄胸散白蚁cDNA文库中获得木糖异构酶基因的步骤的图。
图3是显示pRS436GAP载体的图。
图4是显示获得的基因的酵母导入用载体的图。
图5是显示从达尔文澳白蚁cDNA文库中获得木糖异构酶基因的步骤的图。
图6是显示获得的基因的酵母导入用载体的图。
图7是显示公知的XI基因的酵母导入用载体的图。
图8是显示戊糖磷酸途径酶基因的酵母导入用载体的图。
图9是显示酵母提取液的XI活性测定结果的图。
图10是显示以木糖为碳源的增殖试验结果的图。
图11是显示利用导入有进行了密码子最适化的木糖异构酶基因(RsXIC1-O、CpXI-O、PiXI-O)的转化酵母的以木糖为碳源的增殖试验结果的图。
图12是显示利用导入有进行了密码子最适化的木糖异构酶基因(RsXIC1-O、PiXI-O、CpXI-O)的转化酵母的以葡萄糖/木糖为碳源的发酵试验结果的图。(A)显示密码子最适化RsXI-C1导入酵母的发酵试验结果；(B)显示密码子最适化PiXI导入酵母的发酵试验结果；(C)显示密码子最适化CpXI导入酵母的发酵试验结果。
具体实施方式
本说明书的公开涉及上述(a)～(f)的任一DNA及其利用。上述(a)的DNA均来源于白蚁的肠内原生生物。序列号1、3、5和7所示碱基序列来源于黄胸散白蚁(Reticulitermes speratus)的肠内原生生物，序列号9、11和13所示碱基序列来源于达尔文澳白蚁(Mastotermes darwiniensis)的肠内原生生物。包含这些碱基序列的DNA均编码木糖异构酶。由序列号1、3、5和7所示碱基序列所编码的氨基酸序列与专利文献1所公开的由Piromycessp.E2的木糖异构酶基因所编码的氨基酸序列的同一性分别为51％、50％、52％和52％。另外，由序列号9、11和13所示碱基序列所编码的氨基酸序列与专利文献1所公开的由Piromycessp.E2的木糖异构酶基因所编码的氨基酸序列的同一性分别为75％、74％和72％。
即，包含这些碱基序列的DNA和由该DNA所编码的氨基酸序列与现有的木糖异构酶基因序列和氨基酸序列差异较大。然而，通过将这些DNA导入酵母等真核细胞中，可以赋予真核细胞以木糖同化能力。
为了使酵母等真核细胞利用木糖，需要木糖代谢途径。作为木糖代谢途径，如图1所示，考虑了使用木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的途径(图1上边)，以及使用了木糖异构酶(XI)的途径(图1下边)。如图1所示，XI途径不需要辅酶等、且1步将木糖转换为木酮糖，因而认为在产物收率等方面是优异的。在导入有本发明的新的XI基因的酵母中，菌体内提取物中发现了XI活性，因而确认了新的XI基因在酵母等真核细胞中表达，所产生的XI在细胞内发挥功能。以下对于本发明的各种实施方式进行说明。
(编码木糖异构酶的DNA)
本说明书所公开的包含序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列的DNA均是包含由本发明者们首次发现的新的碱基序列、且编码木糖异构酶的DNA。
在本说明书的公开中，除了包含选自上述特定的碱基序列中的任一碱基序列的DNA以外，只要具有XI活性，也可以使用其他方式的DNA。即，可以是与上述碱基序列的任一者具有一定关系且编码具有XI活性的蛋白质的DNA。作为这样的方式之一，可列举与包含序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列的DNA的互补DNA在严格条件下杂交、且编码具有XI活性的蛋白质的DNA。
所谓“XI活性”是将木糖异构化为木酮糖的活性。XI活性可以作为该异构化反应的底物木糖的减少量或生成物木酮糖的生成量等通过公知的方法测定。另外，所谓“具有XI活性的”具有只要XI活性即可。优选具有与下述蛋白质相比同等程度或更高的XI活性，所述蛋白质分别由包含成为作为杂交对象的互补的DNA的基础的序列号1等的碱基序列的DNA所编码，且包含序列号2等所示氨基酸序列。XI活性是否为同等或更高，例如，在与包含序列号1所示碱基序列的DNA的互补链杂交的DNA的情况下，优选为将包含序列号2所示氨基酸序列的蛋白质在酵母等真核细胞中表达时的该细胞提取物或该蛋白质所具有的XI活性的70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，最优选为100％以上。
XI活性优选对于将这样的DNA以表达由该DNA所编码的蛋白质的方式转化而得的酵母等真核细胞的提取液等含XI级分进行测定。只要是通过这样的测定而得的XI活性，就可以确实提供能够在赋予真核细胞以木糖同化活性中优选使用的编码XI的DNA。另外，XI活性的有无也可以仅以木糖为碳源，培养使用这样的DNA转化而得的真核细胞，通过是否增殖来评价。
所谓严格条件，例如，是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件。例如可列举以下条件：碱基序列的同一性高的核酸即包含与序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列具有70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的同一性的碱基序列的DNA的互补链杂交，且与同源性比上述更低的核酸的互补链不杂交的条件。更具体是指，钠盐浓度为15～750mM、优选为50～750mM、更优选为300～750mM，温度为25～70℃、优选为50～70℃、更优选为55～65℃，甲酰胺浓度为0～50％、优选为20～50％、更优选为35～45％的条件。进而，在严格条件下，杂交后的过滤器的洗涤条件通常为钠盐浓度为15～600mM、优选为50～600mM、更优选为300～600mM，温度为50～70℃、优选为55～70℃、更优选为60～65℃。
另外，进一步作为其他方式之一，可列举包含对序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列具有70％以上的同一性的碱基序列、且编码具有XI活性的蛋白质的DNA。即，可列举具有对序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列具有70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的同一性的碱基序列、且编码具有XI活性的蛋白质的DNA。
在本说明书中所谓同一性或类似性，如该技术领域所知，是通过比较序列确定的、2种以上蛋白质或2种以上多核苷酸之间的关系。该技术中所谓“同一性”，是指通过蛋白质或多核苷酸序列之间的比对、或根据情况通过一系列的这样的序列之间的比对而确定的、蛋白质或多核苷酸序列之间的序列不变性的程度。另外，类似性是指通过蛋白质或多核苷酸序列之间的比对、或根据情况通过一系列的部分序列之间的比对而确定的、蛋白质或多核苷酸序列之间的相关性的程度。更具体地，通过序列的同一性和保存性(维持序列中的特定氨基酸或序列中的物理化学特性的替换)来确定。此外，类似性在后述的BLAST的序列同源性检索结果中称为Similarity(相似性)。确定同一性和类似性的方法，优选为在所对比的序列之间以最长地比对的方式设计的方法。用于确定同一性和类似性的方法作为公众可利用的程序提供。例如，可以利用由Altschul等开发的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool，基本局部比对搜索工具)程序(例如，Altschul SF，Gish W，Miller W，Myers EW，Lipman DJ.,J.Mol.Biol.,215:p403-410(1990),Altschyl SF，Madden TL,Schaffer AA,Zhang J,Miller W，LipmanDJ.,Nucleic Acids Res.25:p3389-3402(1997))来确定。对使用BLAST等软件时的条件不特别限定，优选使用默认值。
另外，作为其他方式之一，可列举编码包含在序列号2、4、6、8、10、12和14所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列、且具有X1活性的蛋白质的DNA。对序列号2等的任一者所示氨基酸序列的氨基酸的变异，即缺失、替换或添加，可以是任意1种，也可以是2种以上组合。另外，对这些变异的总数不特别限定，优选为30个以下，更优选为1个～10个的程度。进一步优选为1个～5个。其中，可列举编码对序列号2所示氨基酸序列或序列号10所示氨基酸序列具有如上所述的变异、且具有XI活性的蛋白质的DNA。
作为氨基酸替换的例子，优选为保守替换，具体可列举以下括号内的组内的替换。例如，(甘氨酸、丙氨酸)(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)(天冬氨酸、谷氨酸)(天冬酰胺、谷氨酰胺)(丝氨酸、苏氨酸)(赖氨酸、精氨酸)(苯丙氨酸、酪氨酸)。
作为其他方式之一，可列举编码具有对序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质的DNA。同一性优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，最优选为95％以上。其中，可列举编码具有对序列号2所示氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更加优选95％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质的DNA。其中，序列号4所示氨基酸序列和序列号6所示氨基酸序列与序列号2所示氨基酸序列的同一性分别为87％和91％。另外，还可列举编码具有对序列号14所示氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更加优选95％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质的DNA。此外，序列号10所示氨基酸序列和序列号12所示氨基酸序列与序列号14所示氨基酸序列的同一性分别为85％和86％。
此外，编码序列号2等所示氨基酸序列或如上所述与该氨基酸序列有一定的关连性的氨基酸序列的碱基序列，可以按照遗传密码的简并，在不改变蛋白质的氨基酸序列的条件下将编码规定的氨基酸序列的碱基序列的至少1个碱基替换成其他种类的碱基。因此，本说明书的公开的DNA还包含编码通过基于遗传密码的简并的替换而变换的碱基序列的DNA。
上述各种方式的DNA，例如，可以使用基于序列号1等序列设计的引物，通过以来源于从白蚁原生生物等中提取出的DNA、各种cDNA文库或基因组DNA文库等的核酸为模板进行PCR扩增，从而作为核酸片段获得。另外，可以通过以来源于上述文库等的核酸为模板，以作为XI基因的一部分的DNA片段为探针进行杂交，从而作为核酸片段获得。或者XI基因以通过化学合成法等本技术领域公知的各种核酸序列合成法作为核酸片段合成。
另外，上述各种方式的DNA，例如，可以将编码序列号2等所示的氨基酸序列的DNA(例如，包含序列号1所示碱基序列)通过惯用的诱变法、定点变异法、使用易错PCR的分子进化方法等来改变，从而获得。作为这样的方法，可列举Kunkel法或Gapped duplex(缺口双链体)法等公知方法或依据这些方法的方法，例如，使用利用了定点诱变法的变异导入用试剂盒(例如Mutant-K(TAKARA社制)、Mutant-G(TAKARA社制))等，或者使用TAKARA社的LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒导入变异。
此外，只要是本领域技术人员，就能够通过参照Molecular Cloning(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:a Laboratory Manual 2nd ed.(分子克隆实验指南第二版),Cold Spring Harbor Laboratory Press,10 SkylineDrive Plainview，NY(1989))等，从而基于例如序列号1或2等的公知序列而获得各种方式的DNA。
(木糖异构酶)
根据本说明书的公开，提供新的木糖异构酶。本说明书所公开的木糖异构酶可以采用以下任一方式。
(A)具有序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列的蛋白质，
(B)具有在序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质，
(C)具有对序列号2、4、6、8、10、12和14的任一者所示氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质，
(D)由与包含序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列的DNA的互补DNA在严格条件下杂交的DNA编码、且具有XI活性的蛋白质，
(E)由包含对序列号1、3、5、7、9、11和13的任一者所示碱基序列具有70％以上的同一性的碱基序列的DNA编码、且具有XI活性的蛋白质。
其中，可列举具有对序列号2所示氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更加优选95％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质。另外，还可列举对序列号14所示氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更加优选95％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质。
另外，可列举具有在序列号2所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质。另外，还可列举具有在序列号14所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质。
上述(B)中的氨基酸的替换、缺失或添加优选被导入除了作为异构化酶的催化结构域、和底物结合结构域、其他对酶活性重要的部分以外的区域。这样的结构域，由与已知的木糖异构酶等异构化酶的同源性分析，本领域技术人员可以容易地确定。
木糖异构酶的Km值由本发明者们推测为30mM以下的程度。根据后述的实施例，RsXIC1为13mM的程度，与公知的PiXI的40mM相比相当程度地变小，认为这样的Km值适合酵母的细胞内木糖浓度，可提高木糖同化性。Km值优选为30mM以下，更优选为25mM以下，进一步优选为20mM以下，更加优选为15mM以下。另外，Km值可以通过公知的方法测定，通过非专利文献6所公开的方法等公知的计算方法算出。
氨基酸的替换、缺失或添加可以通过常用的技术，例如，如已经说明的那样，通过定点诱变法等改变编码该氨基酸序列的碱基序列，从而导入。
本说明书所公开的木糖异构酶可以如下获得：用包含编码该木糖异构酶的DNA的DNA构建体转化真核细胞等适当的宿主，将转化宿主细胞按照本领域技术人员公知的通常的方法进行培养，从该培养细胞或培养基中回收本说明书所公开的木糖异构酶。可以从培养细胞在该细胞破碎后通过离心分离等分离操作获得可溶性级分，从级分中回收多肽。本说明书所公开的木糖异构酶可以组合惯用的纯化技术进行分离。这样的技术包含硫酸铵分级、有机溶剂处理、离心分离、超滤、各种色谱(例如，凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水性相互作用色谱等)、高速液相色谱(HPLC)、电泳等。
(转化体〕
本说明书所公开的转化体是被包含上述DNA的DNA构建体转化了的真核细胞。
(宿主)
本说明书所公开的转化体的宿主只要是真核细胞即可，不特别限定。如果考虑物质生产等，则可列举麴菌等霉菌、酵母。作为麴菌，可列举棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、米曲霉(Aspergillus orizae)等曲霉属。另外，作为酵母，可利用公知的各种酵母，可列举酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等酵母属的酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等裂殖酵母属的酵母、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)等假丝酵母属的酵母、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)等毕赤酵母属的酵母、汉逊酵母属(Hansenula)的酵母、克勒克酵母属(Klocckera)的酵母、许旺酵母属(Schwanniomyces)的酵母和耶罗威亚酵母属(Yarrowia)的酵母、丝孢酵母属(Trichosporon)的酵母、酒香酵母属(Brettanomyces)的酵母、管囊酵母属(Pachysolen)的酵母、Yamadazyma属的酵母、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)等克鲁维酵母属的酵母、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)等伊萨酵母属的酵母。其中，从工业利用性等观点考虑优选酵母属酵母。其中，优选酿酒酵母。
在宿主中保持的本说明书所公开的DNA以能够表达的方式被保持。即，连接在适当的启动子的控制下，进而可以同时具备终止子、增强子、复制起始点(ori)、标志物等。启动子既可以是诱导型的也可以是组成型的。例如，作为酵母中的组成型启动子，可列举3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、醇脱氢酶1(ADH1)启动子、组氨酸营养性功能基因(HIS3)启动子、细胞色素bc1复合物(CYC1)启动子和高渗透压应答7基因(HOR7)启动子和它们的改变体。
本说明书所公开的转化体优选被DNA构建体转化，并表达木糖异构酶。即，优选通过利用DNA构建体的转化而被赋予了将木糖转换成木酮糖的能力。通过被赋予XI活性，从而可以以木糖为碳源进行增殖，从而可以发酵。
本说明书所公开的DNA可以在除宿主细胞的染色体以外被保持，但优选在染色体上被保持。另外，为了发挥高的木糖同化能力，例如，优选多拷贝保持。
本说明书所公开的转化体可以将纤维素酶和/或半纤维素酶分泌表达至细胞表层或细胞外。例如，除了内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶等各种纤维素酶之外，还可列举半纤维素酶等其他生物量分解酶。通过表达这样的蛋白质，可以有效地利用除了来源于木质纤维素的木质素以外的糖类。另外，本说明书所公开的转化体除此以外，还可以根据需要进行外来基因的导入、内在性基因的破坏等基因工程学的改变。
本说明书所公开的转化体还可以表达属于用于代谢***糖的酶群的1种或2种以上的酶。可列举例如，细菌所具有的***糖代谢途径的酶群(国际公开小册子第WO2006096130号小册子、国际公开小册子第WO2009011591小册子)、L-***糖异构酶(EC5.3.1.4)、L-核酮糖激酶(EC2.7.1.16)和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(EC5.1.3.4)，霉菌所具有的***糖代谢途径的酶群(日本特表2004-532008号公报)、醛糖还原酶(EC1.1.1.21)、L-***糖醇-4-脱氢酶(EC5.1.3.4)、L-木酮糖还原酶(EC5.1.3.4)、和D-木酮糖还原酶(EC1.1.1.9)。通过表达这些蛋白质，可提供能够利用***糖的转化体。
本说明书所公开的转化体中，优选选自编码醇脱氢酶的基因、编码果糖磷酸激酶的基因、编码葡糖激酶的基因和编码己糖激酶的基因中的1种或2种以上基因的表达被增强。特别优选在酵母中这样的基因的表达被增强。所述醇脱氢酶基因可以是醇脱氢酶1基因，所述果糖磷酸激酶基因可以是果糖磷酸激酶2基因，所述葡糖激酶基因可以是葡糖激酶1基因，进而所述己糖激酶基因可以是己糖激酶2基因。这些酶均是糖酵解途径中的酶。通过增强编码这些酶的基因的表达，这些酶的生产量和/或活性提高，作为结果，可以获得这些酶活性高的酵母等真核细胞。通过增强这些基因的表达，可提供木糖等非发酵性糖或作为它们的混合物的糖原料的利用能力被提高、发酵能力高的酵母等真核细胞的转化体。
编码这样的酶的基因在酵母等真核细胞中既可以是内源性的，也可以是外源性的。另外，可以适宜利用公知的编码这些酶的基因。作为基因，只要是能够增强糖酵解途径，就可以不问来源地利用。即，基因既可以来源于除了成为宿主的酵母以外的其他种的酵母、其他属的酵母，也可以来源于动物、植物、真菌(霉菌等)、细菌等任意除酵母以外的生物。关于这样的基因的信息，只要是本领域技术人员，就能够通过访问NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等的HP而适宜获得。例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)的HXK1基因(登录号：NC_001138或D50617)、GLK1基因(登录号：NC_001135或M24077)、PFK2基因(登录号：NC_001145或Z48755)和ADH1基因(登录号：NC_001147或Z74828)的碱基序列和氨基酸序列可以从NCBI和/或酿酒酵母(S.cerevisiae)基因组数据库(SGD:http://www.yeastgenome.org/)获得。此外，作为基因，除了基因组DNA之外，还可以是cDNA等。
此外，本发明中使用的这些基因只要具有各酶活性，也可以是编码与数据库等中公开的序列信息有一定的关系的蛋白质的基因。作为这样的方式之一，可列举编码包含在公开的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列、且具有要在本发明中增强的酶活性的蛋白质的基因。对公开的氨基酸序列的氨基酸的变异，即缺失、替换或添加，既可以是任意1种，也可以2种以上组合。另外，对这些变异的总数不特别限定，优选为30个以下的程度，更优选为1个～10个的程度。进一步优选为1个～5个。作为氨基酸替换的例子，优选为保守替换。
作为其他方式之一，本发明中使用的基因可列举编码具有对公开的氨基酸序列有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有要增强的酶活性的蛋白质的基因。同一性优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，最优选为95％以上。
另外，在赋予酵母以木糖同化性时，优选编码选自下述酶群中的酶的基因(Xylu-PPP基因)的表达被增强，所述酶群是构成将木酮糖通过戊糖磷酸途径(PPP)的非氧化过程进行代谢的途径的酶群(Xylu-PPP同化酶群)。Xylu-PPP同化酶群包含与从木酮糖到作为戊糖磷酸途径的最终化合物的甘油醛-3-磷酸和果糖-6-磷酸的途径相关的一系列酶。所述酶群所含的酶可列举木酮糖激酶、核酮糖5-磷酸差向异构酶、核糖5-磷酸异构酶、转醛醇酶和转酮醇酶。作为Xylu-PPP基因，只要是编码这些酶的基因即可，这样的基因可以使用1种或2种以上组合使用。更优选为3种以上，进一步优选为4种，更加优选所有种类(5种)。
Xylu-PPP基因中，木酮糖激酶(XK)基因由同化木酮糖的细菌、酵母等多种微生物保持。XK基因可以不特别限定来源生物地使用。另外，关于XK基因的信息可以通过NCBI的HP等的检索来适宜获得。优选列举来源于酵母、乳酸菌、大肠菌、植物等的XK基因。作为XK基因，可列举例如，作为来源于S.cerevisiae S288C株的XK基因的XKS1(GenBank：Z72979)(CDS的编码区的碱基序列和氨基酸序列)。
转醛醇酶(TAL)基因、转酮醇酶(TAK)基因、核酮糖5磷酸差向异构酶(RPE)基因、核糖5磷酸酮异构酶(RKI)基因只要在具备戊糖磷酸途径的多种生物中均保持。例如，S.cerevisiae等通用酵母也保持这些基因。这些基因可以不特别限定来源生物地使用，与这些基因相关的信息可以通过访问NCBI等的HP来适宜获得。优选列举来源于真核细胞或酵母等与宿主真核细胞同一属的各基因，进一步优选来源于与宿主真核细胞同一种的各基因。作为TAL基因，可优选使用TAL1基因，作为TKL基因，可优选使用TKL1基因、TKL2基因，作为RPE基因，可优选使用RPE1基因，作为RKI基因，可优选使用RKI1基因。例如，作为这些基因，可列举作为来源于S.cerevisiae S288株的TAL1基因的TAL1基因(GenBank：U19102)(CDS的编码区的碱基序列(互补链)和氨基酸序列)、来源于S.cerevisiaeS288株的TKL1基因(GenBank：X73224)(CDS的编码区的碱基序列和氨基酸序列)、来源于S.cerevisiae S288株的RPE1基因(Genbank：X83571)(CDS的编码区的碱基序列和氨基酸序列)、来源于S.cerevisiae S288株的RKI1基因(GenBank：Z75003)(CDS的编码区的碱基序列(互补链)和氨基酸序列)。
本说明书所公开的转化体如后文所说明的那样，可以通过发酵而能够生产所需的有用物质。能够生产有用物质的真核细胞可以具备与有用物质生产相关的内源性基因和/或外源性基因。另外，也可以规定的内在性基因被破坏。酵母通常通过厌氧性发酵来生产乙醇，但也可以是通过适宜基因工程学改变等而被转化得能够生产其他有用物质的宿主。作为有用物质，除乙醇之外，还可列举乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯和甘油。优选作为有用物质可以生产其中1种或2种以上。本说明书所公开的转化体的宿主，例如，可以具备在生产乳酸等有机酸的酵母(在日本特开2003-259878号公报、日本特开2006-006271号公报、日本特开2006-20602号公报、日本特开2006-75133号公报、日本特开2006-2966377号公报、日本特开2007-89466号公报中记载)等中的遗传改变等。
(转化体的制作)
为了获得本说明书所公开的转化体，使用以能够表达的方式保持本说明书所公开的DNA的重组载体等DNA构建体转化宿主细胞。DNA构建体，典型地作为用于表达由本说明书所公开的DNA所编码的木糖异构酶的重组载体而采用各种方式。
DNA构建体，例如，可以通过将这些基因等所需的用于基因重组的DNA片段连接到适当的表达载体中的如上所述的适当启动子的下游来制造。作为启动子，除了已经说明的之外，还可列举GAL启动子等诱导型启动子。此外，重组载体可以具备终止子、增强子、复制起始点(ori)、标志物等，这些要素可根据需要适宜选择。另外，在要进行基因替换、基因破坏等所需的DNA片段向染色体的***的情况下，重组载体具有与染色体上的规定的区域相同的区域。相同区域根据***所需的DNA片段的区域适宜选择。作为本说明书所公开的DNA构建体的材料，可以从能够商业获得的酵母表达载体中适宜选择使用。
此外，这样的重组载体的制作、作为重组体宿主的酵母等的处置所需的一般操作在本领域技术人员中通常地进行，通过适当参考例如T.Maniatis，J.Sambrook等的实验书(Molecular Cloning,A LaboratoryManual(分子克隆实验指南)、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等，只要是本领域技术人员都可以实施。
作为DNA构建体向宿主的导入方法，可列举现有公知的各种方法，例如，磷酸钙法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、电穿孔法、脂质体转染法、乙酸锂法或其他方法。这样的方法在上述的实验书等中记载。对于导入有载体的酵母，通过使用标志物基因的筛选和利用活性表达的筛选，从而可以获得本说明书所公开的转化体。
(有用物质的生产方法)
本说明书所公开的有用物质的生产方法具备在木糖存在下培养本说明书所公开的转化体的工序。根据本说明书所公开的生产方法，由于本说明书所公开的转化体具有木糖同化能力，因而只要作为碳源包含木糖，就可以有效利用该碳源而转换成有用物质。因此，即使在培养基中包含含有木糖的木质纤维素的糖化物的情况下，也可以有效利用这样的生物量碳源而转换成有用物质。木质纤维素的透过物中除了木糖还可以包含葡萄糖，进一步可以包含半纤维素的分解物。
木糖包含在***木聚糖、葡糖醛酸木聚糖等木聚糖中。这些聚合物天然地构成半纤维素的一种成分，存在于木质纤维素等的生物量等中。如果将木聚糖用内切木聚糖酶、木糖苷酶等分解，则可获得木糖。
作为有用物质不特别限定，酵母只要是通常能够利用葡萄糖进行生产的即可。有用物质可以是通过基因重组将酵母中的来自葡萄糖的代谢途径的1种或2种以上酶进行替换、增加等而产生的不是本来的代谢物的化合物。具体地，除了乙醇等低级醇、乳酸、乙酸等有机酸之外，除了1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯和甘油之外，还可列举通过增加类异戊二烯合成途径而产生的萜类系的法呢醇、香叶基香叶醇、角鲨烯、以及精细化学品(辅酶Q10、维生素及其原料等)、通过糖酵解途径的改变而产生的甘油、塑料/工业化学品原料等、生物炼制技术对象材料。对于酵母，由于醇发酵能力高，因而本转化体可以在培养基中使用含木糖的碳源而有效地生产乙醇。另外，认为醇发酵能力高的酵母即使在改变其糖酵解途径而生产其他有机酸等有用物质的情况下，该有用物质的生产能力也高。
在培养工序中，可以使用作为碳源含有木糖的培养基。培养基可以进一步含有葡萄糖，优选碳源来源于木质纤维素等生物量。此外，在酵母表达各种纤维素酶且具有纤维素同化能力的情况下，培养基中还可以含有纤维素或其部分分解物。
在培养工序中，可以适宜选择转化体的宿主中一般适用的培养条件使用。典型地，用于发酵的培养可以使用静置培养、振荡培养或通气搅拌培养等。通气条件可以适宜选择厌氧条件、微好氧条件和好氧条件等。培养温度也不特别限定，可以为25℃～55℃等的范围。另外，培养时间也可根据需要设定，可以是几小时～150小时的程度。另外，pH值的调整可以使用无机或有机酸、碱溶液等来进行。培养中可以根据需要在培养基中添加添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。
通过实施这样的培养工序，可根据所使用的本发明的转化体所具有的有用物质生产能力来生产有用物质。例如，在本发明的转化体具有乙醇生产能力的情况下为乙醇，在改变得能生产乳酸的情况下，变成乳酸等。发酵结束后，可以进行从培养液回收含有用物质的级分的工序，以及将该级分纯化或浓缩的工序。回收工序和/或纯化等工序可根据有用物质的种类等适宜选择。
此外，转化体的发酵中可以适宜选择酵母中一般适用的培养条件来使用。典型地，用于发酵的培养可以使用静置培养、振荡培养或通气搅拌培养等。通气条件可以适宜选择厌氧条件、微好氧条件和好氧条件等。培养温度也不特别限定，可以为25℃～55℃等的范围。另外，培养时间也可根据需要设定，可以为几小时～150小时的程度。另外，pH值的调整可以使用无机或有机酸、碱溶液等来进行。培养中可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。
发酵结束，还可以实施从培养液回收含有用物质的级分的工序，以及将该级分纯化或浓缩的工序。回收工序和/或纯化等工序可以根据有用物质的种类等适宜选择。
由以上的实施方式中说明的可知，根据本说明书的公开，还提供以下方案。
(1)编码具有对序列号14所示氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更加优选95％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质的DNA。
(2)具有对序列号14所示氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、进一步优选90％以上、更加优选95％以上的同一性的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质。
(3)具有在序列号2所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质。
(4)具有在序列号14所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有XI活性的蛋白质。
(5)具有序列号45所示碱基序列的DNA。
(6)具有序列号46所示碱基序列的DNA。
(7)具有序列号47所示碱基序列的DNA。
实施例
以下，列举实施例具体地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。另外，以下所述的基因重组操作按照Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆实验指南)(T.Maniatis,et al.,Cold Spring HarborLaboratory)进行。
实施例1
(从黄胸散白蚁(Reticulitermes speratus)肠内原生生物cDNA文库获得基因)
从黄胸散白蚁肠内原生生物的Meta cDNA文库获得木糖异构酶样基因。实验的流程示于图2。以下，按照图2所示的步骤i)～vi)进行说明。
i)以日本特愿2007-053122所述的黄胸散白蚁肠内原生生物的MetacDNA文库为模板，使用引物Lib-F和Lib-R通过PCR进行扩增***文库载体中的cDNA全长，从而制作扩增cDNA文库。其中，PCR使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ)，在[98℃10秒、55℃15秒、72℃2分钟]×30个循环的条件下进行反应。以下显示所使用的引物。
Lib-F：5’-taaacacacataaacaaacaaacccctcgagttaattaaattaatccccc-3’(序列号15)
Lib-R：5’-ttactcctcgagggccacataggccgagctctttttttttttttttt-3’(序列号16)
ii)以所得的PCR产物为模板，使用扩增木糖异构酶的保守区的简并引物mXI-F1和mXI-R1进行PCR。此外，以后的PCR使用ExTaq HS DNAPolymerase(タカラバイオ)，在[98℃10秒、55℃30秒、72℃1分钟]×30个循环的条件下进行反应。以下显示所使用的引物的序列。
mXI-F1：5’-tggggnggnmgngarggntay-3’(序列号17)
mXI-R1：5’-nggraaytgrtcngtrtccca-3’(序列号18)
其中，在简并引物中，n=a、t、g或c，m=a或c，r=a或g，y=c或t。将所得的0.4kbp的DNA片段使用TOPO-TA Cloning kit(Invitrogen)克隆化至pCR2.1-TOPO载体中。以所得的包含0.4kbp的DNA序列的质粒为模板，使用引物M13-F和M13-R对***到载体中的DNA片段的序列进行分析。以下显示所使用的引物的序列。
M13-F：5’-gtaaaacgacggccagt-3’(序列号19)
M13-R：5’-caggaaacagctatgaccat-3’(序列号20)
分析的结果是，获得了多个与木糖异构酶的保守区同源性高的新的序列。再基于清楚了的序列信息制作4种引物。以下显示所制作的引物的序列。
C1-R：5’-tcgcttcaatattcagtttgaaatc-3’(序列号21)
C2-F：5’-atcatgcaactttggctggtcatac-3’(序列号22)
D1-R：5’-tcgcttcaatattcagtttaaaatc-3’(序列号23)
F-R：5’-accaatactccgaccataagtaacagctagtttc-3’(序列号24)
iii)使用ii)所述的引物C1-R、D1-R、F-R和i)所述的引物Lib-F的各引物组，以及ii)所述的引物C2-F和i)所述的引物Lib-R的引物组，以i)所述的扩增cDNA文库为模板进行PCR，从而进行5’侧翼区和3’侧翼区的扩增。将所得的与5’侧翼区对应的约0.9kbp的DNA片段(C1-R、D1-R、F-R)和与3’侧翼区对应的约0.6kbp的DNA片段(C2-F)使用TOPO-TACloning kit克隆化到pCR2.1-TOPO载体中，使用引物M13-F和M13-R对***到载体中的DNA片段的序列进行分析。基于所得的5’侧翼区和3’侧翼区的序列信息制作包含5’侧的起始密码子的引物和包含3’侧的终止密码子的引物。以下记载所制作的引物的序列。
C1-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgagtcagatattcaaagatattcctgtgatcaaatatgaaggtcctgc-3’(序列号25)
C2-R：5’-tgatgcggccctcgagctactgaaacaaaatctggttaaatatactctcaagaaactcttgacggc-3’(序列号26)
D1-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgagtcaggaaatattcaaaaacattccccaaatcaaatatgagggtcc-3’(序列号27)
F-F：5’-actcttgctggccacacatttc-3’(序列号28)
iv)使用iii)所述的引物C1-F、D1-F、F-F和i)所述的引物Lib-R的各引物组，以及iii)所述的引物C2-R和i)所述的引物Lib-F的引物组，以i)所述的扩增cDNA文库为模板进行PCR，从而进行5’侧翼区和3’侧翼区的扩增。将所得的约1.4kbp的DNA片段使用TOPO-TA Cloning kit克隆化到pCR2.1-TOPO载体中，使用引物M13-F和M13-R对***到载体中的DNA片段的序列进行分析。基于以上所得的5’和3’侧翼区的序列制作从起始密码子至终止密码子的全长序列获得用的引物。以下显示序列。
C1-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgagtcagatattcaaagatattcctgtg-3’(序列号29)
C1-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagctactgaaacagaatctggtttataatgctttc-3’(序列号30)
C2-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgagtgccatatttccaagtgttcccgag-3’(序列号31)
C2-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagctactgaaacaaaatctggttaaatatactctc-3’(序列号32)
D1-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgagtcaggaaatattcaaaaacattccc-3’(序列号33)
D1-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagtcactgaaacagtacctggttcacaatactttc-3’(序列号34)
F-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgtccaccgaaatattcccaggaatcaagcaaattc-3’(序列号35)
F-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagttactgaaacagaatttgattaaacacactttcgagatactcc-3’(序列号36)
v)使用iv)所述的各引物组，以i)所述的扩增cDNA文库为模板进行PCR。其中，PCR使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ)，在[98℃10秒、55℃15秒、72℃2分钟]×30个循环的条件下进行反应。将所得的4种1.4kbp的DNA片段命名为RsXI-C1、RsXI-C2、RsXI-D1和RsXI-F，将它们使用In-Fusion AdvantageTM PCR Cloning kit(タカラバイオ)***到经限制性酶SacII和XhoI消化的pRS436GAP载体(DDBJ登录:AB304862)(图3)中。使用引物TDH3-180F和CYC1t-100R对***到pRS436GAP中的DNA片段的序列进行分析。以下显示所使用的引物的序列。
TDH3-180F：5’-ccagttccctgaaattattccc-3’(序列号37)
CYC1t-100R：5’-cctagacttcaggttgtctaac-3’(序列号38)
将分析的结果而明确的4种基因RsXI-C1、RsXI-C2、RsXI-D1和RsXI-F的碱基序列分别示于序列号1、3、5和7，将它们的氨基酸序列分别示于序列号2、4、6和8。另外，除了这些序列以外，还使用与上述所述的方法同样的方法进一步获得了4种基因：RsXI-A、RsXI-B、RsXI-D2、RsXI-E。
将由这些共计8种基因序列转换而得的氨基酸序列、与由来源于Piromyces sp.E2的木糖异构酶基因(Genebank登录：AJ249909)转换而得的氨基酸序列的同源性示于表1。其中，氨基酸序列的同源性使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi))的protein blast(Scoring parameters设定为默认)作为分析程序而鉴定出。
表1
此外，将使用各基因片段制作的酵母导入用载体分别命名为pRS436GAP-RsXI-A、pRS436GAP-RsXI-B、pRS436GAP-RsXI-C1、pRS436GAP-RsXI-C2、pRS436GAP-RsXI-D1、pRS436GAP-RsXI-D2、pRS436GAP-RsXI-E、pRS436GAP-RsXI-F(图4)。该载体中包含在***的基因的5’侧添加了来源于Saccharomyces cerevisiae的TDH3启动子、在3’侧添加了来源于S.cerevisiae的CYC1终止子的基因序列、酵母自主复制因子2μori的基因序列、和作为营养缺陷型标志物的URA3的基因序列。
实施例2
(从达尔文澳白蚁(Mastotermes darwiniensis)肠内原生生物获得基因)
从达尔文澳白蚁肠内原生生物获得木糖异构酶样基因。实验的流程示于图5。以下，按照图5所示的步骤i)～iii)进行说明。
i)利用日本特愿2007-053122所记载的达尔文澳白蚁肠内原生生物cDNA文库的部分序列进行同源性分析，结果确认了相当于木糖异构酶的3种基因。但是，各基因仅部分序列明确，需要分析各基因的全长序列。因此以装载有该基因的全长的质粒pGEM-3Zf-Md06BA12、pGEM-3Zf-Md63A19和pGEM-3Zf-Md63A93为模板，使用引物M13-F(序列号19)和M13-R(序列号20)进行序列分析。
将由分析结果明确的3种基因MdXI12、MdXI19和MdXI93的碱基序列分别示于序列号9、11和13，将它们的氨基酸序列分别示于序列号10、12和14。此外，由这些基因序列转换而得的氨基酸序列、与由来源于Piromyces sp.E2的木糖异构酶基因序列转换而得的氨基酸序列的同源性示于表1。此外，氨基酸序列的同源性使用BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi))的protein blast(Scoring parameters设定为默认)作为分析程序鉴定出。
以已明确的序列信息为基础制作用于扩增各基因的全长的引物。以下记载所制作的引物的序列。
MdXI12-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgtctcacgaatactttccagg-3’(序列号39)
MdXI12-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagttattggaacatcgtcactatc-3’(序列号40)
MdXI19-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgtctggcgaatactttccagg-3’(序列号41)
MdXI19-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagtcattggaacgtcgtcactatg-3’(序列号42)
MdXI93-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgtctcgcgaatactttccagg-3’(序列号43)
MdXI93-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagtcactggtacattgttacgattag-3’(序列号44)
ii)以pGEM-3Zf-Md06BA12、pGEM-3Zf-Md63A19和pGEM-3Zf-Md63A93为模板，使用i)所述的引物组、MdXI12-IF-F和MdXI12-IF-R、MdXI19-IF-F和MdXI19-IF-R、MdXI93-IF-F和MdXI93-IF-R通过PCR扩增各基因的全长。此外，PCR使用PrimeSTARHS DNA Polymerase(タカラバイオ)，在[98℃10秒、55℃15秒、72℃2分钟]×30个循环的条件下进行反应。
iii)将所得的3种1.4kbp的DNA片段使用In-Fusion AdvantageTMPCR Cloning kit(タカラバイオ)***到经限制性酶SacII和XhoI消化的pRS436GAP(DDBJ登录:AB304862)(图2)中。接着，使用引物TDH3-180F(序列号37)和CYC1t-100R(序列号38)确认基因正确地***到了pRS436GAP中。将所制作的酵母导入用载体分别命名为pRS436GAP-MdXI12、pRS436GAP-MdXI19、pRS436GAP-MdXI93(图7)。该载体包含在***的基因的5’侧添加了TDH3启动子、3’侧添加了CYC1终止子的基因序列、酵母自主复制因子的2μori的基因序列、和作为营养缺陷型标志物的URA3的基因序列。
实施例3
(转化酵母的制作)
(公知木糖异构酶基因的酵母导入用载体的制作)
制作来源于Piromyces sp.E2的木糖异构酶的基因(PiXI)、以及与PiXI的氨基酸序列同源性为73％的来源于Parabacteroides distasonis ATCC8503的木糖异构酶(protein ID:YP_001302175)的基因(PdXI)、与PiXI的氨基酸序列同源性为64％的来源于Leeuwenhoekiella blandensis MED217的木糖异构酶(protein ID：EAQ50619)的基因(LbXI)的酵母导入用载体pRS436GAP-PiXI、pRS436GAP-PdXI、pRS436GAP-LbXI(图7)。该载体包含在5’侧添加了TDH3启动子、3’侧添加了CYC1终止子的包含PiXI基因的基因序列、酵母自主复制因子的2μori的基因序列、和作为营养缺陷型标志物的URA3的基因序列。
(戊糖磷酸途径强化酵母的制作)
使用以下说明的各载体pXhisHph-HOR7p-ScXK、pXAd3H-HOR7p-ScTAL1-ScTKL1和pXGr3L-HOR7p-ScRPE1-ScRKI1，使XKS1、TAL1、TKL1、RPE1和RKI1基因过表达，制作GRE3基因被破坏了的酵母株。将这些载体合并示于图8。另外，将以下的实施例中使用的培养基归纳示于表2。
(1)XK基因导入用载体
制作来源于酵母S.cereviae的木酮糖激酶(XK)基因的酵母导入用载体pXhisHph-HOR7p-ScXK(图8)。构建成该载体包含以下序列：5’侧添加了HOR7启动子、3’侧添加了TDH3终止子的、包含作为来源于S.cerevisiae NBRC304株的XK基因的XKS1(genebank：X61377)的基因序列；作为向酵母基因组上进行同源重组的区域的、组氨酸合成酶(HIS3)基因的上游约500bp的区域的基因序列(HIS3U)、及其下游约500bp的区域的基因序列(HIS3D)；以及作为标志物的、5’侧添加了TDH2启动子、3’侧添加了CYC1t终止子的包含潮霉素磷酸转移酶(hph)基因的基因序列。
(2)TAL1、TKL1基因导入用载体
制作来源于S.cerevisiae的转醛醇酶1(TAL1)基因和转酮醇酶1(TKL1)基因的酵母导入用载体pXAd3H-HOR7p-ScTAL1-ScTKL1(图8)。构建成该载体包含以下序列：5’侧添加了HOR7启动子、3’侧添加了TDH3终止子的、包含作为来源于S.cerevisiae S288株的TAL1基因的TAL1(Genbank：U19102)的基因序列；5’侧添加了HOR7启动子、3’侧添加了TDH3终止子的、包含作为来源于S.cerevisiae S288株的TKL1基因的TKL1(Genbank：X73224)的基因序列；作为向酵母基因组上进行同源重组的区域的、醇脱氢酶3(ADH3)基因的上游约500bp的区域的基因序列(ADH3U)、及其下游约500bp的区域的基因序列(ADH3D)；以及作为标志物的包含组氨酸合成酶(HIS3)基因的基因序列(HIS3标志物)。
(3)RPE1、RKI1基因导入用载体
制作来源于S.cerevisiae的核酮糖磷酸差向异构酶1(RPE1)基因和核糖磷酸酮异构酶(RKI1)基因的酵母导入用载体pXGr3L-HOR7p-ScRPE1-ScRKI1(图8)。构建成该载体包含以下序列：5’侧添加了HOR7启动子、3’侧添加了TDH3终止子的、包含作为来源于S.cerevisiae S288株的RPE1基因的RPE1(Genbank：X83571)的基因序列；5’侧添加了HOR7启动子、3’侧添加了TDH3终止子的、包含来源于S.cerevisiae S288株的RKI1基因(Genbank：Z75003)的基因序列；作为用于向酵母基因组上进行同源重组和破坏醛糖还原酶3(GRE3)基因的区域的、GRE3基因的上游约1000bp的基因序列(GRE3U)、包含GRE3基因的3’区域约500bp的约800bp的区域的基因序列(GRE3D)；以及作为标志物的包含亮氨酸合成酶(LEU2)基因的基因序列(LEU2标志物)。
表2
酵母的转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II(ZYMORESEARCH)，按照附带的方案进行。首先，使用将pXhisHph-HOR7p-ScXK载体用限制性酶Sse8387I消化而得的片段，进行作为宿主的酵母S.cerevisiae MT8-1株的转化，涂布于YPD＋HYG琼脂培养基，将生长的菌落在新的YPD＋HYG琼脂培养基上画线培养来纯化菌落。将纯化的选择株命名为PP100株。接着，使用将pXAd3H-HOR7p-ScTAL1-ScTKL1载体用限制性酶Sse8387I消化而得的片段进行PP100株的转化，涂布于SD-H琼脂培养基，将生长的菌落在新的SD-H琼脂培养基上画线培养来纯化菌落。将纯化出的选择株命名为PP300株。
接着，使用将pXGr3L-HOR7p-ScRPE1-ScRKI1载体用限制性酶Sse8387I消化而得片段进行PP300株的转化，涂布在SD-HL琼脂培养基上，将生长的菌落在新的SD-HL琼脂培养基上画线培养来纯化菌落。将纯化出的选择株命名为PP600株。
(向酵母的基因导入)
使用所制作的各种基因的酵母导入用载体进行PP600株的转化，涂布在SD-HLU琼脂培养基(表2)上，将生长的菌落在新的SD-HLU琼脂培养基上进行画线培养来纯化菌落。纯化出的选择株的名字和导入基因、以及使用的载体示于表3。
表3
  菌株   基因   载体
  PP600/pRS436GAP-RsXI-A   RsXI-A   pRS436GAP-RsXI-A
  PP600/pRS436GAP-RsXI-B   RsXI-B   pRS436GAP-RsXI-B
  PP600/pRS436GAP-RsXI-C1   RsXI-C1   pRS436GAP-RsXI-C1
  PP600/pRS436GAP-RsXI-C2   RsXI-C2   pRS436GAP-RsXI-C2
  PP600/pRS436GAP-RsXI-D1   RsXI-D1   pRS436GAP-RsXI-D1
  PP600/pRS436GAP-RsXI-D2   RsXI-D2   pRS436GAP-RsXI-D2
  PP600/pRS436GAP-RsXI-E   RsXI-E   pRS436GAP-RsXI-E
  PP600/pRS436GAP-RsXI-F   RsXI-F   pRS436GAP-RsXI-F
  PP600/pRS436GAP-MdXI12   MdXI12   pRS436GAP-MdXI12
  PP600/pRS436GAP-MdXI19   MdXI19   pRS436GAP-MdXI19
  PP600/pRS436GAP-MdXI93   MdXI93   pRS436GAP-MdXI93
  PP600/pRS36GAP-PdXI   PdXI   pRS436GAP-PdXI
  PP600/pRS436GAP-LbXI   LbXI   pRS436GAP-LbXI
  IX700m   PiXI   pRS436GAP-PiXI
  IX700mc   -   pRS436GAP
(转化酵母的XI活性测定)
将所制作的各种基因导入株用SD-HLU液体培养基(表2)培养24小时，回收菌体并用灭菌水洗涤2次，然后用100mM磷酸缓冲液(pH值7.0)洗涤2次。对洗涤后的菌体颗粒加入玻璃珠(acid washedSIGMA)和100mM磷酸缓冲液(pH值7.0)，使用Micromixier E-36(TAITEC)在4℃搅拌15分钟，破碎酵母菌体。接着以4℃、12000转/分钟离心5分钟，将上清作为菌体粗提取液回收。使用Quick Start蛋白质分析试剂盒(BIO-RAD)测定菌体粗提取液的总蛋白质浓度。
接着，参考日本特开2008-79564所述的XI活性测定法，测定酵母粗提取液的XI活性。具体地，在包含50mM马来酸缓冲液(pH值6.85)、10mMMgSO4、1mM CoCl2、1mM MnCl2、10mM木糖的反应液中添加酵母粗提取液，在30℃反应30分钟，然后通过半胱氨酸-咔唑-硫酸法(ZachariasDische and Ellen Borenfreund J.Biol.Chem.192：583-587(1951))定量木酮糖，从而测定XI活性。半胱氨酸-咔唑-硫酸法如下进行：在上述反应后，加入半胱氨酸-咔唑-硫酸溶液在30℃显色30分钟，测定波长540nm的吸光度。图9显示XI活性测定的结果。活性的定义是，将1分钟生成1μmol的木酮糖的活性作为1U，将其除以酵母粗提取液的蛋白质浓度而得的值(U/mg-蛋白质)。
如图9所示，在未导入XI基因的IX700mc株、导入了公知的XI基因PdXI、LbXI的株中，未发现XI的活性，另外，在导入了RsXI-A、RsXI-B、RsXI-D2、RsXI-E的株中也未发现XI的活性。另一方面，在导入了PiXI基因的IX700m株中确认了XI的活性，另外在导入了RsXI-C1、RsXI-C2、RsXI-D1、RsXI-F和MdXI93的株中分别确认了XI的活性。其中，导入了RsXI-C1基因的PP600/pRS436GAP-RsXI-C1株的XI的活性与导入了PiXI基因的IX700m株显示相同程度的活性。由此确认，基于RsXI-C1、RsXI-C2、RsXI-D1、RsXI-F和MdXI93的基因而在酵母菌体内生产的蛋白质具有XI的活性。
(以转化酵母的木糖为碳源的增殖试验)
为了评价各种转化酵母的木糖同化能力，在以木糖为碳源的培养基中进行增殖试验。将IX700m株、IX700mc株、PP600/pRS436GAP-RsXI-C1株、PP600/pRS436GAP-RsXI-C2株、PP600/pRS436GAP-RsXI-D1株、PP600/pRS436GAP-RsXI-F株、PP600/pRS436GAP-MdXI12株、PP600/pRS436GAP-MdXI19株和PP600/pRS436GAP-MdXI93株在SD-HLU液体培养基中培养24小时，回收菌体并用灭菌水洗涤2次，然后在L字型试验管中调制的SX-HLU液体培养基(表1)中加入菌体，开始增殖试验。增殖试验使用バイオフオトレコ一ダ一TVS062CA(ADVANTEC)，培养条件为30℃、70转/分钟，每隔20分钟测定培养液的OD(660nm)。增殖试验的结果示于图10。
在图10A中，未导入XI的IX700mc株在第20小时以后观察不到培养基OD的增加，但PP600/pRS436GAP-RsXI-C1株、PP600/pRS436GAP-RsXI-C2株、PP600/pRS436GAP-RsXI-D1株、PP600/pRS436GAP-RsXI-F株、和导入了PiXI基因的IX700m株均在第20小时以后也观察到培养基OD的增加，确认了菌体在增殖。由此明确了，通过将RsXI-C1、RsXI-C2、RsXI-D1和RsXI-F基因导入酵母中，可以进行以木糖为碳源的增殖。另外，第40小时以后的增殖速度，IX700m株变为0.096 OD660/小时，PP600/pRS436GAP-RsXI-C1株变为0.126 OD660/小时，确认了PP600/pRS436GAP-RsXI-C1株的增殖速度比IX700m株快约1.3倍。
进而，在图10B中也同样地，未导入XI的基因的IX700mc株在第20小时以后观察不到培养基OD的增加，但PP600/pRS436GAP-MdXI12、PP600/pRS436GAP-MdXI19、PP600/pRS436GAP-MdXI93株和导入了PiXI基因的IX700m株均在第20小时以后也观察到培养基OD的增加，确认了菌体在增殖。由此明确，通过将MdXI12、MdXI19和MdXI93基因导入酵母，从而可以进行以木糖为碳源的增殖。这同时显示，由这些基因所编码的蛋白质在酵母等真核细胞中具有XI活性。
对于由以上结果在酵母中确认了木糖异构酶活性的7种基因，将它们转换成氨基酸序列并比较彼此的序列同源性的结果示于表4。其中，氨基酸序列的同源性使用基因分析软件GENETIX(ゼネテイツクス)的同源性检索功能(程序:fastp(Protein-Protein)、参数设定为默认)鉴定出。
表4
  1   2   3   4   5   6   7
  1RsXI-C1
  2RsXI-C2   87
  3RsXI-D1   91   86
  4RsXI-F   85   82   84
  5MdXI12   49   50   51   51
  6MdXI19   50   52   52   52   94
  7MdXI93   49   51   51   51   85   86
如表4所示，同源性比较的结果是，RsXI-C1、RsXI-C2、RsXI-D1、RsXI-F彼此同源性高(82%以上)，而且MdXI12、MdXI19和MdXI93也彼此同源性高(85%以上)。但是RsXI的组与MdXI的组之间彼此同源性低(52%以下)，另外由各个组的成为来源的原生生物的cDNA文库不同，启示是不同***的XI。
实施例4
(1)适合酵母表达的木糖异构酶基因的合成和酵母导入用载体制作
对于RsXI-C1、PiXI、和被报告了在酵母中的活性的(非专利文献1)来源于Clostridium phytofermentans的木糖异构酶(protein ID:YP_001558336)的基因(CpXI)，制作为了在酵母中的表达用而使密码子适合而得的合成基因。各基因由Genscript Corporation(www.Genscript.com)和Life Technologies Corporation(www.lifetechnologies.com)合成，将所合成的基因分别命名为RsXIC1-O(序列号45)、PiXI-O(序列号46)、和CpXI-O(序列号47)。
接着，PCR扩增RsXIC1-O、PiXI-O和CpXI-O。以下显示所使用的引物的序列。
RsXIC1-O-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgtctcaaatttttaaggatatccc-3’(序列号48)
RsXIC1-O-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagttattgaaacaaaatttggttaataatactttc-3’(序列号49)
PiXI-O-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatggctaaggaatacttcc-3’(序列号50)
PiXI-O-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagttattggtacatagcaacaattgcttc-3’(序列号51)
CpXI-O-IF-F：5’-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgaagaattacttcccaaatgtccc-3’(序列号52)
CpXI-O-IF-R：5’-tgatgcggccctcgagtcatctaaacaagatgttattgacaatagtctc-3’(序列号53)
将PCR扩增而得的基因片段***经限制性酶SacII和XhoI消化的pRS436GAP中，将所制作的各基因的酵母导入用载体分别命名为pRS436GAP-RsXIC1-O、pRS436GAP-PiXI-O、pRS436GAP-CpXI-O。
(2)密码子最适化木糖异构酶基因向酵母的导入
使用最适化XI的酵母导入用载体制作能够同化木糖的酵母株。酵母的转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II(ZYMO RESEARCH)，按照附带的方案进行。
首先，以来源于S.cerevisiae S288株的基因组DNA为模板，PCR扩增TRP1基因(Gene ID:851570)及其附近区域。使用所得的扩增产物过表达日本特愿2010-063703所记载的、XKS1、TAL1、TKL1、RPE1和RKI1基因，向GRE3基因被破坏了的W600株进行转化，涂布在SD+U琼脂培养基(含有20mg/L尿嘧啶的SD琼脂培养基)上，将生长的菌落在新的SD+U琼脂培养基上画线培养来纯化菌落。将纯化出的选择株命名为W600W株。TRP1基因及其附近区域的PCR扩增使用以下所示引物。
TRP1M-F：5’-aacgacattactatatatataatatagg-3’(序列号54)
TRP1M-R：5’-caagtgcacaaacaatac-3’(序列号55)
接着，分别使用pRS436GAP-RsXIC1-O、pRS436GAP-PiXI-O、pRS436GAP-CpXI-O进行W600W株的转化，涂布在SD琼脂培养基上，将生长的菌落在新的SD琼脂培养基上画线培养而纯化菌落。将纯化出的选择株分别命名为W600W/pRS436GAP-RsXIC1-O株、W600W/pRS436GAP-PiXI-O株、W600W/pRS436GAP-CpXI-O株。另外作为对照将pRS436GAP用同样的方法导入W600W株中，将所得的转化株命名为W600W/pRS436GAP株。
(3)以转化酵母的木糖为碳源的增殖试验
为了评价各转化酵母的木糖同化能力，在以木糖为碳源的培养基中进行增殖试验。将W600W/pRS436GAP-RsXIC1-O株、W600W/pRS436GAP-PiXI-O株、W600W/pRS436GAP-CpXI-O株和W600W/pRS436GAP株在SD液体培养基中培养24小时，回收菌体并用灭菌水洗涤2次，然后在L字型试验管中调制的SX液体培养基中加入菌体，开始增殖试验。
增殖试验的结果示于图11。未导入XI的W600W/pRS436GAP株观察不到培养基OD的增加，但各导入了XI基因的株观察到培养基OD的增加，确认了菌体在增殖。另外，关于培养基OD660在0.1～0.5的期间的比增殖速度，确认了W600W/pRS436GAP-RsXIC1-O株比W600W/pRS436GAP-PiXI-O株和W600W/pRS436GAP-CpXI-O株高1.2倍左右(表5)。
表5
  菌株   比增值速度(-小时)
  W600W/pRS436GAP-RsXIC1-O   0.071±0.0004
  W600W/pRS436GAP-PiXI-O   0.058±0.0024
  W600W/pRS436GAP-CpXI-O   0.060±0.0017
(4)在葡萄糖与木糖的混合培养基中的发酵能力比较
将各转化酵母株接种于50ml的SD液体培养基并培养3天而得的培养液作为全培养液。接着在500ml的SD液体培养基中加入全培养液的总量并培养24小时，回收菌体用灭菌水洗涤2次。
发酵试验使用在盖的部分安装了带有瓣阀的通风管的100ml的螺口瓶。调制加入有酵母悬浮液使得发酵培养基的最终OD600为10的SDX培养基(6.7g/l酵母氮源基础(无氨基酸和核酸)(Yeast Nitrogen Base withoutamino acids and nucleic acids)、30g/l D-葡萄糖、20g/l木糖)50ml，在30℃、以100转/分钟进行发酵。在任意时间分取培养液，通过液相色谱进行底物(葡萄糖和木糖)和产物(乙醇、甘油、木糖醇)的分析。液相色谱的柱在60℃使用HPX-87H柱(BIO-RAD)，检出器使用差示折射率检测器RID-10A(岛津制作所)。移动相使用0.05%硫酸溶液，以流速0.6ml/分钟送液。图12显示各转化株的发酵培养基中的底物浓度、产物浓度的经时变化。此外，发酵试验进行2次以上，记载其平均值。
如图12所示，各转化株均在发酵开始初期主要消耗葡萄糖，木糖在葡萄糖耗尽的同时开始减少。另外，各发酵中基本没有观察到作为副产物的木糖醇的积累。关于木糖的消耗，W600W/pRS436GAP-PiXI-O株(图12(B))和W600W/pRS436GAP-CpXI-O株(图12(C))在发酵开始第72小时也残留10μg/l以上的木糖，但W600W/pRS436GAP-RsXIC1-O株(图12(A))与其他转化株相比木糖消耗速度快至2倍左右，在第72小时几乎消耗了所有的木糖。由以上的结果明确了，RsXIC1-O与作为现有的木糖异构酶的PiXI-O、CpXI-O相比，明显对酵母中的木糖的同化更加有效。
(5)木糖异构酶的动力学分析
将W600W/pRS436GAP-RsXIC1-O株、W600W/pRS436GAP-PiXI-O株在SD液体培养基中培养24小时，回收菌体并用灭菌水洗涤2次，然后用100mM磷酸缓冲液(pH值7.0)洗涤2次。在洗涤后的菌体颗粒中加入玻璃珠(φ=0.3mm：安井器械)和100mM磷酸缓冲液(pH值7.0)，使用マルチビ一ズシヨツカ一(安井器械)以4℃2500转/分钟运转7分钟，从而破碎酵母菌体。将所得的菌体破碎液以4℃、12000转/分钟离心5分钟，将上清作为菌体粗提取液回收。使用Quick Start蛋白质分析试剂盒(BIO-RAD)测定菌体粗提取液的总蛋白质浓度。
接着，参考非专利文献1所述的木糖异构酶活性测定法，测定酵母粗提取液中的木糖异构酶活性。具体地，在包含菌体粗提取液、0.15mMNADH、10mM MgCl2、2U山梨糖醇脱氢酶(SDH)、100mM Tris-HCl(pH值7.5)的反应液中添加木糖并开始反应，测定由SDH产生的木酮糖转换为木糖醇而引起的NADH的氧化。反应在30℃进行，NADH的吸光度变化使用分光光度计Ubest-55(日本分光)在波长340nm测定。此外，为了计算反应速度参数，使木糖的终浓度分别为250mM、150mM、100mM、50mM、25mM、5mM而进行反应，测定各浓度下的木糖异构酶活性。表6显示各酵母株粗提取液中的木糖异构酶的反应速度参数。此外反应速度参数以各木糖浓度下的木糖异构酶活性为基础，使用Hanes-Woolf曲线(非专利文献6)算出。
表6
如表6所示，关于反应速度Vmax，PiXI-O的值比RsXIC1-O的值高至1.5倍左右，关于Km值，RsXIC1-O的值为PiXI-O的值的1/3以下，RsXIC1-O对底物的亲和性明显比PiXI-O高。此外非专利文献1中报告了在酵母中表达的PiXI和CpXI的Km值，其值PiXI为49.85±2.82mM，CpXI为66.01±1.00mM。由此推定RsXIC1-O的Km值比CpXI-O的Km值低。
酵母S.cerevisiae中没有对木糖特异性的转运蛋白，木糖向细胞内的摄入通过利用己糖转运蛋白的非特异性摄入来进行。转运蛋白对木糖的Km值(100mM-190mM)与对葡萄糖的Km值(1-20mM)相比非常高(非专利文献7)，可预想酵母细胞内的木糖浓度低。由此，作为导入了RsXIC1-O的酵母株的木糖同化性高于导入了其他XI的酵母株的理由之一，考虑是RsXIC1-O对木糖的亲和性更高，在酵母细胞内的低木糖浓度下比其他XI更快地进行反应。
序列表自由文本
序列号15～44、48～53：引物

Claims (13)

1.木糖异构酶，其是由序列号2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
2.DNA，其是由序列号1所示碱基序列组成的DNA。
3.酵母，其被包含权利要求2所述的DNA的DNA构建体转化而表达木糖异构酶。
4.根据权利要求3所述的酵母，所述酵母属于选自酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、克勒克酵母属、许旺酵母属、耶罗威亚酵母属和伊萨酵母属中的任一属。
5.根据权利要求3所述的酵母，所述酵母分泌生产纤维素酶。
6.根据权利要求4所述的酵母，所述酵母分泌生产纤维素酶。
7.根据权利要求3～6的任一项所述的酵母，其生产***糖代谢途径的酶群所含的1种或2种以上酶。
8.根据权利要求3～6的任一项所述的酵母，所述酵母具备生产选自乙醇、乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢醇、香叶基香叶醇和角鲨烯中的任一者的外源性或内源性的基因。
9.根据权利要求7所述的酵母，所述酵母具备生产选自乙醇、乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢醇、香叶基香叶醇和角鲨烯中的任一者的外源性或内源性的基因。
10.酵母的表达载体，其包含权利要求2所述的DNA。
11.被赋予或提高了木糖利用性的转化酵母的制作方法，该制作方法具备将权利要求2所述的DNA导入酵母而将其转化的工序。
12.有用物质的生产方法，该生产方法具备在木糖存在下培养权利要求3～9的任一项所述的酵母的工序。
13.根据权利要求12所述的生产方法，所述有用物质是选自乙醇、乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢醇、香叶基香叶醇和角鲨烯中的任一者。
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