CN103146669A

CN103146669A - 一种自诱导培养基及其应用

Info

Publication number: CN103146669A
Application number: CN2013100745734A
Authority: CN
Inventors: 陈振明; 周硕; 赖敦岳; 李兰杰; 陈亮
Original assignee: ZHEJIANG PULUO DEBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Hangzhou Normal University
Current assignee: ZHEJIANG PULUO DEBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Hangzhou Normal University
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明公开了一种自诱导培养基及其应用。所述自诱导培养基的配方为：***糖2～10g/L，葡萄糖0.5～2.5g/L，甘油5～25g/L，蛋白胨8～12g/L，磷酸盐6.5～7.4g/L，硫酸盐1.1～1.3g/L，NH₄Cl2.6～2.7g/L，痕量元素溶液适量。所述应用为该自诱导培养基在生产青霉素酰胺酶中的应用。与现有技术相比，本发明的自诱导培养基利用***糖作为底物诱导目的蛋白表达，可调控性强，蛋白表达量高；在一个具体实施方式中，青霉素酰胺酶酶活达6U/mL，远远高于使用乳糖诱导的蛋白表达量，对开发生产青霉素酰胺酶的新工艺具有重要的指导意义。

Description

一种自诱导培养基及其应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种自诱导培养基及其应用。

背景技术

青霉索G酰胺酶（EC3.5.1.11）是半合成β-内酰胺类抗生素工业的重要酶，主要用于水解青霉素或头孢菌素分别生成母核6-APA（6-氨綦青霉靛酸）或7-ADCA（7-氨基头孢烷酸）。

此酶属于水解酶家族，作用于肽键以外的碳-氮键，特别是在直链酰胺键。***的名字是青霉素水解酶，其他共同的使用的名字包括青霉素酰化酶，脂肪酶Novozym217，α-酰基-β-内酰胺水解酶，氨苄青霉素酰化酶。目前该酶已大规模应用于工业生产β-内酰胺类抗生素的关键中间体和半合成β-内酰胺类抗生素。

在基因工程菌中表达青霉素酰胺酶时，常选用基于强启动子T7的表达***。这类表达***中，T7RNA聚合酶能特异识别T7启动子，从而开启下游基因的大量转录，有效地启动目的蛋白的表达。

但是基于T7启动子的表达***也有其不足之处。蛋白的表达需要用IPTG诱导，步骤比较繁琐。而且，一定浓度的IPTG会对细菌产生毒性，直接影响蛋白的表达效率。另外，由于lac mRNA本底水平的组成型合成，可导致目的蛋白的少量表达。研究表明，非目的性表达出的目的蛋白可能会导致目的蛋白的不稳定、甚至不表达。此外，目前培养大肠杆菌一般使用LB培养基，其组分之一是胰蛋白胨，由于胰蛋白胨是使用胰酶消化酪蛋白后的产物，而酪蛋白一般是从牛奶或大豆中提取的，因此，胰蛋白胨中存在的微量乳糖成分会促进细菌产生非目的性表达，从而影响表达量。

利用自诱导培养基培养细菌使之表达外源蛋白的方法解决了上述技术问题。公开号为CN101235362B的中国专利文献公开了一种用于原核表达***表达外源蛋白的复合自动诱导培养基，每升培养基中含有以下重量的各组分：胰蛋白胨10～40g，酵母提取物5～20g，六水琥珀酸钠0～8.1g，二水柠檬酸钠0～1.5g，甘油15～50g，葡萄糖0.5g，乳糖2g，磷酸二氢钠3.55g，磷酸二氢钾3.40g，氯化铵2.68g，硫酸钠0.71g，七水硫酸镁0.50g，六水氯化铁0.03g。

在培养基中同时加入葡萄糖和乳糖，大肠杆菌会优先利用葡萄糖，在葡萄糖耗尽前不会诱发lac启动子；当葡萄糖耗尽时，乳糖发挥作用，开启lac启动子诱导外源蛋白表达，而乳糖的代谢产物也同时作为细菌生长的碳源。自诱导的方法省去了监测培养基的菌密度和添加IPTG诱导蛋白表达的步骤，一方面使得实验操作更加简洁，另一方面避免了IPTG对细菌的毒害作用。

但现有的自诱导培养基的配方仍可继续完善，以提高目的蛋白的表达量。

发明内容

本发明提供了一种用于原核表达***的自诱导培养基，该培养基能高效诱导表达外源蛋白。

一种用于原核表达***的自诱导培养基，配方为：***糖2～10g/L，葡萄糖0.5～2.5g/L，甘油5～25g/L，蛋白胨8～12g/L，磷酸盐6.5～7.4g/L，硫酸盐1.1～1.3g/L，NH₄Cl2.6～2.7g/L，痕量元素溶液适量。

更优选地，配方为：***糖2～5g/L，葡萄糖0.5～1g/L，甘油5～15g/L，蛋白胨9～11g/L，磷酸盐6.7～7.1g/L，硫酸盐1.15～1.25g/L，NH₄Cl2.65～2.7g/L，痕量元素溶液适量。

所述自诱导培养基中添加有磷酸盐，用于保持自诱导培养基的pH，避免pH太低影响细胞生长。所述磷酸盐优选为KH₂PO₄和Na₂HPO₄中的至少一种。当同时选用KH₂PO₄和Na₂HPO₄时，KH₂PO₄的添加量优选为3.3～3.5g/L，Na₂HPO₄的添加量优选为3.4～3.6g/L。

所述硫酸盐优选为MgSO₄和Na₂SO₄中的至少一种。当同时选用MgSO₄和Na₂SO₄时，MgSO₄的添加量优选为0.45～0.50g/L，Na₂SO₄的添加量优选为0.70～0.75g/L。

痕量元素溶液给菌株生长提供微量元素，促进其生长，优选的，所述痕量元素溶液为195～205μL/L，包含48～52μM的Fe³⁺，8～12μM的Mn²⁺、Zn²⁺，1.8～2.2μM的Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Mo₇O₂₄ ^2-、SeO₃ ^2-、B₄O₇ ^3-。

本发明还提供了所述自诱导培养基在生产青霉素酰胺酶中的应用，具体包括：

将含青霉素酰胺酶基因的原核表达菌株接种到所述自诱导培养基中，发酵，提取青霉素酰胺酶。

所述的原核表达菌株包含有T7/lac启动子。

当将该原核表达菌株置于本发明的自诱导培养基中培养时，葡萄糖促使细胞的高密度生长，在葡萄糖耗尽前不会诱发启动子，有效阻止泄漏表达；当葡萄糖被利用完全、细胞密度达到饱和时，启动子可打开，并开启下游基因的大量转录，诱导目的蛋白的表达；甘油作为诱导后期良好的碳源，促进细胞生长，增加蛋白表达量。

原核表达菌株在表达青霉素酰胺酶的过程中，要对前体蛋白进行翻译后修饰。与乳糖相比，***糖的诱导能力相对较弱，能够避免前体蛋白在细胞质中的过度积累，给翻译后修饰过程以充足的时间，从而减少包涵体的形成，最终提高青霉素酰胺酶的表达量。

所述原核表达菌株的宿主细胞优选为大肠杆菌（E.coli），大肠杆菌是表达外源蛋白的常用工程菌，适于大规模工业生产。

为使诱导初期菌株的生长状态达到最佳，接种前，需先对菌株进行活化，取对数生长期的菌株进行接种，接种量优选为0.1%～5%，更优选为1%。发酵温度为25～27℃，发酵时间为48～72小时，转速为180～220r/min。

发酵完成后，收集菌体，于预冷的无菌水中重悬浮后采用超声波、高压或冻融等方法破碎细胞，离心收集上清液即为初酶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的自诱导培养基利用***糖作为底物诱导目的蛋白表达，可调控性强，蛋白表达量高；在一个具体实施方式中，青霉素酰胺酶酶活达6U/mL，远远高于使用乳糖诱导的蛋白表达量，对开发生产青霉素酰胺酶的新工艺具有重要的指导意义。

具体实施方式

下面以含青霉素酰胺酶编码基因和T7/lac启动子的重组大肠杆菌（以下简称重组大肠杆菌）为例，详细说明本发明自诱导培养基在生产青霉素酰胺酶中的应用。

重组大肠杆菌的构建方法与文献（Expression and purification ofpenicillin G acylase enzymes from four different micro-organisms,and acomparative evaluation of their synthesis/hydrolysis ratios for cephalexin.Protein Expression and Purifi cation.2006,46(1)107–113.）记载的相同。

实施例1LB培养基IPTG诱导

（1）LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，超纯水配制，pH7.0；

（2）挑取重组大肠杆菌，按1：100的比例接种于5mL含卡那霉素（50μg/mL）LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜；

（3）取0.5mL培养液转接于50mL含氨苄青霉素（50μg/mL）的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养2～4小时，至OD600约为0.6；

（4）向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度0.1mmol/L，20～30℃下诱导培养12小时；

（5）将发酵液于10000rpm离心10min，收集菌体细胞，将菌体细胞重悬浮于预冷的磷酸缓冲液中进行超声破碎，离心收集上清液，检测酶活。

具体步骤为：

取上清液20μL加入980μL50mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.5）中，37℃保温；再加入1mL已在37℃下预热的0.9mg/mL NIPAB溶液，精确反应4min，加入1mL乙醇终止反应；取反应液在分光光度计下波长检测405nm处的吸光值。

酶活力定义：在上述反应条件下，1min水解1μmol的NIPAB所需要青霉素酰胺酶的量为1个酶活力单位U。

酶活力计算公式如下：

酶活力（U/mL）=103*A405*V0/t/p/V1；

其中：

t：反应时间（min）；p：标准曲线的斜率；V0：反应体系总体积；A405：样品光密度读数与空白样品光密度读数差；V1：酶液体积（mL）；比色皿厚度默认为1，单位为cm。

利用LB培养基和IPTG诱导方式，获得发酵液的青霉素酰胺酶酶活力为0.5U/mL。

实施例2乳糖自诱导

（1）自诱导培养基：α-乳糖2g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，KH₂PO₄3.4g/L，MgSO₄0.49g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄3.55g/L，Na₂SO₄0.71g/L，NH₄Cl2.67g/L，痕量元素溶液200μL/L，用超纯水配制；

其中，痕量元素溶液为：50μM FeCl3，20μM CaCl₂·2H₂O，10μMMnCl₂·4H₂O，10μM ZnSO₄·7H₂O，2μM CoCl₂·6H₂O，2μM CuCl₂，2μMNiCl₂，2μM Na₂Mo₇O₂₄，2μM Na₂SeO₃，2μM H₃B₄O₇，用超纯水配制；

（2）将重组大肠杆菌接种于装有5mL含卡那霉素（50μg/mL）的LB培养基中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养，至OD600达到2.0～3.0左右；

（3）将（2）中的种子培养液以1%的接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于25℃培养40小时；

（4）采用实施例1步骤（5）的方法获取发酵液并检测酶活。青霉素酰胺酶酶活达到2.955U/mL。

实施例3乳糖、***糖共同自诱导

（1）自诱导培养基：α-乳糖2g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，***糖2g/L，KH₂PO₄3.4g/L，MgSO₄0.49g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄3.55g/L，Na₂SO₄0.71g/L，NH₄Cl2.67g/L，痕量元素溶液200μL/L，用超纯水配制；

痕量元素溶液组成如实施例2步骤（1）所示；

（3）将此种子培养液以1%的接种量接种于装有50mL步骤（1）的自诱导培养基的250mL三角瓶中，于25℃培养40小时；

（4）采用实施例1步骤（5）的方法获取发酵液并检测酶活。青霉素酰胺酶酶活达到3.375U/mL。

实施例4乳糖、***糖共同自诱导，无蛋白胨

（1）自诱导培养基：α-乳糖2g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，***糖2g/L，KH₂PO₄3.4g/L，MgSO₄0.49g/L，Na₂HPO₄3.55g/L，Na₂SO₄0.71g/L，NH₄Cl2.67g/L，痕量元素溶液200μL/L，用超纯水配制；

痕量元素溶液组成如实施例2步骤（1）所示；

实施例5***糖自诱导

（1）自诱导培养基：葡萄糖1g/L，甘油15g/L，***糖5g/L，KH₂PO₄3.5g/L，MgSO₄0.5g/L，蛋白胨11g/L，Na₂HPO₄3.6g/L，Na₂SO₄0.75g/L，NH₄Cl2.7g/L，痕量元素溶液195μL/L，用超纯水配制；

痕量元素溶液组成如实施例2步骤（1）所示；

（4）采用实施例1步骤（5）的方法获取发酵液并检测酶活。青霉素酰胺酶酶活达到3.735U/mL。

实施例6***糖自诱导500mL发酵

（1）自诱导培养基：葡萄糖0.8g/L，甘油10g/L，***糖3g/L，KH₂PO₄3.3g/L，MgSO₄0.45g/L，蛋白胨9g/L，Na₂HPO₄3.4g/L，Na₂SO₄0.70g/L，NH₄Cl2.65g/L，痕量元素溶液200μL/L，用超纯水配制；

痕量元素溶液组成如实施例2步骤（1）所示；

（3）将此种子培养液以1%的接种量接种于装有500mL步骤（1）的自诱导培养基的2L三角瓶中，于25℃培养60小时；

（4）采用实施例1步骤（5）的方法获取发酵液并检测酶活。青霉素酰胺酶酶活达到5.250U/mL。

实施例7***糖自诱导3.5L发酵

（1）自诱导培养基：葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，***糖2g/L，KH₂PO₄3.4g/L，MgSO₄0.49g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄3.55g/L，Na₂SO₄0.71g/L，NH₄Cl2.67g/L，痕量元素溶液205μL/L，用超纯水配制；

痕量元素溶液组成如实施例2步骤（1）所示；

（3）将此种子培养液以0.1%的接种量接种于装有3.5L步骤（1）的自诱导培养基的5L三角瓶中，于25℃培养72小时；

（4）采用实施例1步骤（5）的方法获取发酵液并检测酶活。青霉素酰胺酶酶活达到6.0U/mL。

表1不同诱导物存在下青霉素酰胺酶的表达量

编号	诱导物	诱导时间（h）	酶活（U/mL）
				1	LB培养基+IPTG	40	0.500
2	乳糖	40	2.955
				3	乳糖+***糖	40	3.375
4	乳糖+***糖，无蛋白胨	40	2.955
				5	***糖	40	3.735
6	***糖	60	5.250
				7	***糖	72	6.000

由表1可见，使用普通的LB培养基培养重组大肠杆菌，以IPTG作诱导物时，青霉素酰胺酶表达量很低，酶活仅为0.500U/mL；

当使用以乳糖为诱导物的自诱导培养基培养时，乳糖开启T7/lac启动子，使下游基因大量表达，该酶的酶活提高到2.955U/mL；

当以乳糖、***糖共同诱导时，由于***糖对于青霉素酰胺酶后修饰有促进作用，同时对表达过程中的细胞有稳定作用，该酶的酶活提高到3.375U/mL；

自诱导培养基中的葡萄糖可以抑制***糖、蛋白胨中微量乳糖的诱导；但由于有机氮源的缺失，因此除去实施例3的自诱导培养基中的蛋白胨时，该酶的酶活有所下降，为2.955U/mL；

当以本发明的自诱导培养基培养重组大肠杆菌时，诱导效率大大提升，青霉素酰胺酶的酶活提高到3.735U/mL；并且随着诱导时间的增加，酶活也相应提高，诱导时间为60小时，酶活达到5.250U/mL；诱导时间为72小时，酶活达到6.000U/mL；

表明本发明的自诱导培养基诱导外源目的蛋白的表达量要优于使用乳糖和IPTG诱导时的表达量。

Claims

1.一种自诱导培养基，其特征在于，配方为：***糖2～10g/L，葡萄糖0.5～2.5g/L，甘油5～25g/L，蛋白胨8～12g/L，磷酸盐6.5～7.4g/L，硫酸盐1.1～1.3g/L，NH₄Cl2.6～2.7g/L，痕量元素溶液适量。

2.如权利要求1所述的自诱导培养基，其特征在于，配方为：***糖2～5g/L，葡萄糖0.5～1g/L，甘油5～15g/L，蛋白胨9～11g/L，磷酸盐6.7～7.1g/L，硫酸盐1.15～1.25g/L，NH₄Cl2.65～2.7g/L，痕量元素溶液适量。

3.如权利要求2所述的自诱导培养基，其特征在于，所述磷酸盐为KH₂PO₄和Na₂HPO₄中的至少一种。

4.如权利要求2所述的自诱导培养基，其特征在于，所述硫酸盐为MgSO₄和Na₂SO₄中的至少一种。

5.如权利要求1所述的自诱导培养基，其特征在于，所述痕量元素溶液为195～205μL/L，包含48～52μM的Fe³⁺，8～12μM的Mn²⁺、Zn²⁺，1.8～2.2μM的Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Mo₇O₂₄ ^2-、SeO₃ ^2-、B₄O₇ ^3-。

6.如权利要求1～5任一所述的自诱导培养基在生产青霉素酰胺酶中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：将含青霉素酰胺酶基因的原核表达菌株接种到如权利要求1～5任一所述的自诱导培养基中，发酵，提取青霉素酰胺酶。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述原核表达菌株包含有T7/lac启动子。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述原核表达菌株的接种量为0.1%～5%。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵温度为25～27℃，发酵时间为48～72小时。