CN109385413B - 葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用。发明公开了一种来源于嗜热蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM 12802的新的酸性葡萄糖淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明的葡萄糖淀粉酶具有良好的性质，可作应用于饲料、食品、医药等工业。本发明还公开该葡萄糖淀粉酶的制备方法，根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良、适合工业应用的葡萄糖淀粉酶。

Description

葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用。

背景技术

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，作用于淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，生成糊精和低聚糖。β-淀粉酶为外切酶，它从淀粉非还原性顺次切下麦芽糖。而葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1,4糖苷键的外切酶，其***名称为α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷水解酶(α-1,4-glucan glucohydrolase,EC.3.2.1.3)或γ-淀粉酶(γ-amylase)，简称糖化酶。葡萄糖淀粉酶从非还原糖末端切下葡萄糖分子。葡萄糖淀粉酶底物专一性较低，即能够切断α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键和α-1,3-糖苷键也有轻微的水解能力。葡萄糖淀粉酶是工业上用量最大的生物酶制剂之一，其可用于将淀粉酶水解产物转化为葡萄糖，进而葡萄糖再转化为工业产品，因此，被广泛地应用于食品、医药和发酵等工业。

葡萄糖淀粉酶在微生物中分布很广，现有技术中已存在来源于细菌、真菌和酵母的多种葡糖淀粉酶被报道，具体来源包括曲霉属、根霉属、腐质霉属、毛菌以及青霉属等。这些酶的最适温度一般为55-60℃，最适pH为3.5-5.0。而在实际的工业应用中，淀粉液化的温度通常在95℃条件下进行，现有糖化酶的最适温度与实际需要相去甚远，以致淀粉酶在高温下水解无法达到预期的效果。

发明内容

为了解决现有技术中存在的葡萄糖淀粉酶的最适温度较低的问题，本发明提供一种葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用。

本发明的目的在于提供一种葡萄糖淀粉酶TlGA1931。

本发明的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931。

本发明的再一目的在于提供包含葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供包含葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶TlGA1931的制备方法。

本发明的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶TlGA1931的应用。

根据本发明具体实施方式葡萄糖淀粉酶TlGA1931，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

其中，该酶全长613个氨基酸，N端20个氨基酸为信号肽序列“MQYLLKTTLGALSVAQLVIA”。

因此，成熟的葡萄糖淀粉酶TlGA1931的理论分子量为63.3kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本发明还提供了编码上述葡萄糖淀粉酶TlGA1931的基因，该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

本发明的葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931结构基因全长1990bp，含有4个内含子，+240～293bp、+582～640bp、+737～786、+1428～1524为其内含子序列，cDNA长1824bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示：

其中，信号肽的碱基序列为：

“ATGCAGTACCTTCTTAAAACTACCCTCGGCGCTCTGAGCGTTGCTCAGCTTGTCATCGCG”。

因此，成熟基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示：

本发明还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组载体，优选为pPIC9-Tlga1931。将本发明的葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将葡萄糖淀粉酶基因***到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Tlga1931。

本发明还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/1931。

本发明还提供了一种制备葡萄糖淀粉酶TlGA1931的方法，包括以下步骤：

(1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖淀粉酶TlGA1931的表达；以及

(3)回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/1931。

本发明的葡萄糖淀粉酶TlGA1931属于糖基水解酶第15家族，其最适pH为5.0，在pH2.0-10.0范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力；其最适温度位65℃，在55℃下处理60min，酶活仍能保持79％，在60℃下处理60min，依然能够保持55％的酶活力，具有较好的温度稳定性。

本发明提供了上述葡萄糖淀粉酶TlGA1931的应用，运用基因工程手段来产业化生产葡萄糖淀粉酶。本发明还提供了一个新的葡萄糖淀粉酶基因，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良、适合工业应用的葡萄糖淀粉酶。

附图说明

图1显示葡萄糖淀粉酶TlGA1931的最适pH；

图2显示葡萄糖淀粉酶TlGA1931的pH稳定性情况；

图3显示葡萄糖淀粉酶TlGA1931的最适温度；

图4显示葡萄糖淀粉酶TlGA1931的温度稳定性情况。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、毕赤酵母表达载体pPIC9；

2、培养基：

(1)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH₄)SO₄，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/L CaCl₂于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min

(2)LB培养基：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl。

(3)YPD培养基：2％葡萄糖、1％酵母提取物、2％蛋白胨。

(4)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，13.4％YNB，0.000049<Biotin，0.5％甘油(v/v)。

(5)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同。

实施例1葡萄糖淀粉酶编码基因Tlga1931的克隆

1.葡萄糖淀粉酶的基因组DNA

以嗜热蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM 12802总DNA为模板进行PCR扩增，引物如表1所示，PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,50℃30sec,72℃2min,30个循环，72℃10min。得到一约1800bp片段，将该片段回收后测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

表1基因克隆本实验所需的引物

2.葡萄糖淀粉酶cDNA的获得

提取Talaromyces leycettanus JCM 12802的总RNA，利用Oligo(dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后利用表1所示的引物1931F和1931R，扩增该单链cDNA，获得葡萄糖淀粉酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后测序，得到葡萄糖淀粉酶的cDNA。

通过对葡萄糖淀粉酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现，该基因有含有4个内含子，N端20个氨基酸为其信号肽序列，从Talaromyces leycettanus 12802中分离克隆得到的编码葡萄糖淀粉酶的基因为新基因。

实施例2葡萄糖淀粉酶TlGA1931工程菌株的构建

1.表达载体的构建及表达

以测序正确的葡萄糖淀粉酶编码基因Tlga1931的cDNA片段为模板，以表1所示的带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物1931F和1931R对其成熟蛋白的编码区进行扩增。利用EcoR I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9，葡萄糖淀粉酶TlGA1931成熟蛋白的序列***到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-Tlga1931，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶EcoR I和Not I进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子。

以同样的方法构建含信号肽序列的葡萄糖淀粉酶基因的重组表达载体及转化子。

2.筛选高表达转化子

用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高葡萄糖淀粉酶活性的转化子。

实施例3重组葡萄糖淀粉酶TlGA1931的制备

1.葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931在毕赤酵母发酵水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于YPD培养基中活化、富集；进行在发酵水平的大量表达。发酵液12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

2.葡萄糖淀粉酶TlGA1931的纯化

收集摇瓶表达的重组葡萄糖淀粉酶TlGA1931上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组葡萄糖淀粉酶TlGA1931，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取萄糖淀粉酶TlGA1931浓缩液2.0mL，经预先用20mM Tris-HCl(pH 6.5)平衡过的HiTrap Q SepharoseXL阴离子柱，然后用0-1.0mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。

实施例4葡萄糖淀粉酶TlGA1931性质分析

采用DNS法对本发明的葡萄糖淀粉酶TlGA1931进行活性分析。具体方法如下：在pH5.0，65℃条件下，1mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应30min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。葡萄糖淀粉酶活性单位定义：在65℃pH5.0条件下，每分钟内催化水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。

1.葡萄糖淀粉酶TlGA1931的最适pH及pH稳定性

所用缓冲液为pH 1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0～9.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液，pH9.0～12甘氨酸-NaoH系列缓冲液，将经纯化的葡萄糖淀粉酶TlGA1931在上述不同的pH下的缓冲液中进行酶促反应，以测定其最适pH。

如图1所示，在温度为65℃下，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的最适pH为5.0，且在pH3.0-pH5.5范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力。

将葡萄糖淀粉酶TlGA1931酶液混在不同pH值的缓冲液，于37℃下处理60min，再测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。

如图2所示，葡萄糖淀粉酶TlGA1931在pH2.0-pH10.0之间能够维持50％以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。

2.葡萄糖淀粉酶TlGA1931反应最适温度及热稳定性

在pH 5.0条件下，于不同温度(20-80℃)测定纯化的葡萄糖淀粉酶TlGA1931酶活性。

如图3所示，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的最适反应温度为65℃，在70℃时依然具有70％以上的酶活力。

在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定，以测定葡萄糖淀粉酶TlGA1931的热稳定性。

如图4所示，葡萄糖淀粉酶TlGA1931在55℃下处理60min，还能保持79％的酶活力，在60℃下处理60min，能够保持55％的酶活力，即使该酶在70℃下处理5min，依然能够保持24％的酶活力，这表明该酶具有较好的稳定性。

3.葡萄糖淀粉酶TlGA1931的比活及动力学

以不同浓度(0.4-3mmol/L)的淀粉为底物，在pH5.0的0.1mol/L的柠檬酸缓冲液体系中，65℃下测定酶活性,反应时间5分钟，计算出其在65℃下的反应速度，利用双倒数作图法求得其Km值和Vmax。

经测定,葡萄糖淀粉酶TlGA1931在65℃下以淀粉为底物的Km值为1.86mg/ml,最大反应速度Vmax为714μmol/min/mg，比活为542U/mg。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 613

<212> PRT

<213> 嗜热蓝状菌JCM 12800(Talaromyces leycettanus JCM 12802)

<400> 1

Met Gln Tyr Leu Leu Lys Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ser Val Ala Gln

1 5 10 15

Leu Val Ile Ala Ala Pro His Pro Thr Glu Leu Leu Pro Arg Ala Ser

20 25 30

Gly Ser Leu Asp Ser Trp Leu Ser Thr Glu Val Pro Tyr Ala Leu Asp

35 40 45

Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Lys Ala Gln Gly Ala

50 55 60

Ser Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro Asp Tyr

65 70 75 80

Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ile Lys Cys Leu Ile

85 90 95

Asp Glu Phe Ile Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Gln Ser Val Ile Gln

100 105 110

Asn Tyr Ile Ser Ser Gln Ala Phe Leu Gln Thr Val Ser Asn Pro Ser

115 120 125

Gly Gly Leu Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Val Asn

130 135 140

Glu Ala Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro

145 150 155 160

Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Asn Tyr Ala Asn Trp Leu Ile Ala

165 170 175

Asn Gly Gln Ala Ser Leu Ala Asn Ser Ile Val Trp Pro Ile Val Gln

180 185 190

Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ser Gln Tyr Trp Asn Gln Ser Thr Phe Asp

195 200 205

Leu Trp Glu Glu Ile Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln

210 215 220

His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Leu Ala Lys Lys Leu Gly His

225 230 235 240

Thr Cys Ser Asn Cys Asp Ser Gln Ala Pro Leu Val Leu Cys Phe Leu

245 250 255

Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Ile Leu Ser Asn Thr Gly Gly Gly

260 265 270

Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Ser Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe

275 280 285

Asp Pro Ala Ala Ala Gly Cys Asp Asp Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser

290 295 300

Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser

305 310 315 320

Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Pro Gln Gly Gln Ala Val Ala Val

325 330 335

Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Leu

340 345 350

Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp

355 360 365

Asn Arg Ile Gly Ser Leu Thr Ile Thr Asp Val Ser Leu Ala Phe Phe

370 375 380

Gln Asp Leu Tyr Pro Ser Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser

385 390 395 400

Ser Thr Tyr Gln Ser Ile Val Ala Ala Val Lys Thr Tyr Ala Asp Gly

405 410 415

Tyr Met Ser Ile Val Gln Lys Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Ala Leu Ala

420 425 430

Glu Gln Phe Ser Arg Asn Asp Gly Ser Pro Leu Ser Ala Val Asp Leu

435 440 445

Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ala Ala Arg Arg Asn Phe

450 455 460

Ser Val Pro Ala Tyr Ser Trp Gly Glu Ala Ser Ala Asn Thr Val Pro

465 470 475 480

Ser Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ala Ser Gly Pro Tyr Ala Thr Ala Thr

485 490 495

Asn Thr Asn Trp Pro Ala Pro Thr Cys Thr Ser Pro Pro Ala Asn Val

500 505 510

Ala Val Arg Phe Asn Glu Met Val Thr Thr Asn Phe Gly Glu Asn Val

515 520 525

Phe Val Val Gly Ser Ile Ala Ala Leu Gly Ser Trp Ser Pro Ser Ser

530 535 540

Ala Ile Pro Leu Ser Ala Ala Glu Tyr Asn Ser Gln Thr Pro Leu Trp

545 550 555 560

Tyr Ala Ile Val Thr Leu Pro Ala Gly Thr Ser Phe Gln Tyr Lys Tyr

565 570 575

Ile Lys Lys Glu Pro Asp Gly Ser Val Val Trp Glu Ser Asp Pro Asn

580 585 590

Arg Ser Tyr Thr Val Pro Gln Gly Cys Gly Val Thr Thr Ala Thr Val

595 600 605

Asn Asp Ser Trp Arg

610

<210> 2

<211> 593

<212> PRT

<213> 嗜热蓝状菌JCM 12802(Talaromyces leycettanus JCM 12802)

<400> 2

Ala Pro His Pro Thr Glu Leu Leu Pro Arg Ala Ser Gly Ser Leu Asp

1 5 10 15

Ser Trp Leu Ser Thr Glu Val Pro Tyr Ala Leu Asp Gly Val Leu Asn

20 25 30

Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Lys Ala Gln Gly Ala Ser Ser Gly Ile

35 40 45

Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Ser Trp

50 55 60

Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ile Lys Cys Leu Ile Asp Glu Phe Ile

65 70 75 80

Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Gln Ser Val Ile Gln Asn Tyr Ile Ser

85 90 95

Ser Gln Ala Phe Leu Gln Thr Val Ser Asn Pro Ser Gly Gly Leu Ser

100 105 110

Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Val Asn Glu Ala Ala Phe

115 120 125

Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala

130 135 140

Thr Ala Met Ile Asn Tyr Ala Asn Trp Leu Ile Ala Asn Gly Gln Ala

145 150 155 160

Ser Leu Ala Asn Ser Ile Val Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser

165 170 175

Tyr Val Ser Gln Tyr Trp Asn Gln Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu

180 185 190

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195 200 205

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225 230 235 240

Thr Gly Ser Tyr Ile Leu Ser Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys

245 250 255

Asp Ala Asn Ser Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Ala

260 265 270

Ala Gly Cys Asp Asp Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu

275 280 285

Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ser Ile

290 295 300

Asn Ser Gly Ile Pro Gln Gly Gln Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro

305 310 315 320

Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Leu Cys Thr Leu Ala

325 330 335

Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asn Arg Ile Gly

340 345 350

Ser Leu Thr Ile Thr Asp Val Ser Leu Ala Phe Phe Gln Asp Leu Tyr

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Pro Ser Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Gln

370 375 380

Ser Ile Val Ala Ala Val Lys Thr Tyr Ala Asp Gly Tyr Met Ser Ile

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Val Gln Lys Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Ala Leu Ala Glu Gln Phe Ser

405 410 415

Arg Asn Asp Gly Ser Pro Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr

420 425 430

Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ala Ala Arg Arg Asn Phe Ser Val Pro Ala

435 440 445

Tyr Ser Trp Gly Glu Ala Ser Ala Asn Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser

450 455 460

Ala Ser Ser Ala Ser Gly Pro Tyr Ala Thr Ala Thr Asn Thr Asn Trp

465 470 475 480

Pro Ala Pro Thr Cys Thr Ser Pro Pro Ala Asn Val Ala Val Arg Phe

485 490 495

Asn Glu Met Val Thr Thr Asn Phe Gly Glu Asn Val Phe Val Val Gly

500 505 510

Ser Ile Ala Ala Leu Gly Ser Trp Ser Pro Ser Ser Ala Ile Pro Leu

515 520 525

Ser Ala Ala Glu Tyr Asn Ser Gln Thr Pro Leu Trp Tyr Ala Ile Val

530 535 540

Thr Leu Pro Ala Gly Thr Ser Phe Gln Tyr Lys Tyr Ile Lys Lys Glu

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Pro Asp Gly Ser Val Val Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr

565 570 575

Val Pro Gln Gly Cys Gly Val Thr Thr Ala Thr Val Asn Asp Ser Trp

580 585 590

Arg

<210> 3

<211> 1990

<212> DNA

<213> 嗜热蓝状菌JCM 12802(Talaromyces leycettanus JCM 12802)

<400> 3

ccctcgaggc atcagggtcc ctggattcat ggctttccac cgaagttcct tacgctctcg 60

atggtgtatt gaacaacatc ggacccaatg gtgcaaaggc ccagggggcc agctccggca 120

ttgtggttgc aagccccagc acaagtaatc ctgactgtaa gtcaacctgc attcattctg 180

ctatgaagaa gcctaactaa cgcatcctag acttctactc ttggactcgg gacgctgcgc 240

tcaccatcaa atgcctgatc gatgagttca tctcgactgg ggatgcgaac ctgcagtcgg 300

tgattcagaa ctatatcagc tcccaggcct tcttgcaaac agtgtccaac ccctctggcg 360

gcctgtcaac tggaggtctc ggcgagccca agtttgaggt caatgaggcg gcatttactg 420

gtgcttgggg ccggccacaa agagatgggc cggccttgag agcgactgcc atgatcaatt 480

acgccaactg gcttattgta agtggttctc acaggcgagt acatggctgc ggtatctgac 540

gaatgtcatg ccacaggcaa atggacaggc ttcactcgcc aattcgatcg tctggccgat 600

cgtccagaat gatctctcct acgtcagcca gtactggaat cagagtacct ttggtacggc 660

tagtccccca gagtggcctt tttctgtact gacgatgtct cagacctttg ggaggaaatc 720

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ctggcaaaaa agcttggcca tacctgctca aactgcgact ctcaagcacc gcttgtcttg 840

tgtttcctgc aatcctactg gaccggttcc tatattcttt ccaacaccgg agcggacgtt 900

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caccgactcg ttccgttcaa tctactcaat caactcgggc atcccacagg gccaagcagt 1080

cgccgtgggt cgctaccctg aagatgtata tcagggcgga aacgcatggt atctctgcac 1140

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cacttattcc tcatcctcgt cgacctacca atccatcgtt gccgctgtca agacgtacgc 1320

ggacggatac atgagcattg ttgtaagtta ctgcatatcg ccaagttttt tccagcgctc 1380

tcaagagcac caagtgggaa aaaaaagtat aatactcact aaaccccttc tccaaacagc 1440

aaaaatacac cccttccaac ggcgccctcg ccgagcagtt ctcccgcaac gatggctccc 1500

ccctctcagc cgtcgaccta acctggtcct acgcctccct gctcactgcc gccgcgcgca 1560

gaaatttctc cgtccccgcc tactcctggg gcgaagccag cgccaacacc gtcccatcgt 1620

cttgctcggc ctcgtctgcc tcaggcccct atgccaccgc gaccaacacg aactggcccg 1680

cacccacatg cacctcgcca ccggcaaacg tggccgtccg attcaacgag atggtcacta 1740

ccaactttgg agagaacgtc tttgtcgtgg gctcgatcgc cgcgttggga tcttggagtc 1800

ctagttccgc tatcccgctg agcgcggccg aatacaactc acagacgccg ttgtggtatg 1860

caatcgtgac gttgccggcg ggcacgagct tccagtataa gtatatcaag aaagagccgg 1920

atggcagtgt ggtctgggag agtgatccga acaggtccta tacggtgcct caagggtgtg 1980

gcgtgaatta 1990

<210> 4

<211> 1842

<212> DNA

<213> 嗜热蓝状菌JCM 12802(Talaromyces leycettanus JCM 12802)

<400> 4

atgcagtacc ttcttaaaac taccctcggc gctctgagcg ttgctcagct tgtcatcgcg 60

gcaccacatc ccacggaact tctccctcgg gcatcagggt ccctggattc atggctttcc 120

accgaagttc cttacgctct cgatggtgta ttgaacaaca tcggacccaa tggtgcaaag 180

gcccaggggg ccagctccgg cattgtggtt gcaagcccca gcacaagtaa tcctgactac 240

ttctactctt ggactcggga cgctgcgctc accatcaaat gcctgatcga tgagttcatc 300

tcgactgggg atgcgaacct gcagtcggtg attcagaact atatcagctc ccaggccttc 360

ttgcaaacag tgtccaaccc ctctggcggc ctgtcaactg gaggtctcgg cgagcccaag 420

tttgaggtca atgaggcggc atttactggt gcttggggcc ggccacaaag agatgggccg 480

gccttgagag cgactgccat gatcaattac gccaactggc ttattgcaaa tggacaggct 540

tcactcgcca attcgatcgt ctggccgatc gtccagaatg atctctccta cgtcagccag 600

tactggaatc agagtacctt tgacctttgg gaggaaatcg acagctcctc cttcttcacg 660

acggctgtgc agcaccgtgc tcttgttgag ggctctgctc tggcaaaaaa gcttggccat 720

acctgctcaa actgcgactc tcaagcaccg cttgtcttgt gtttcctgca atcctactgg 780

accggttcct atattctttc caacaccgga ggcggacgtt ccggaaagga cgccaactcc 840

ctacttggaa gtattcatac ttttgaccca gcagcggcgg gatgcgacga caccactttc 900

cagccttgct ctgcccgagc cctagcgaac cacaaggtcg tcaccgactc gttccgttca 960

atctactcaa tcaactcggg catcccacag ggccaagcag tcgccgtggg tcgctaccct 1020

gaagatgtat atcagggcgg aaacgcatgg tatctctgca ccctcgctgc tgcagagcag 1080

ctgtacgacg cactctatca gtggaacagg atcggatctc tcacgatcac ggacgtcagc 1140

ttggcattct tccaggatct ctacccatcg gcggcaacag gcacttattc ctcatcctcg 1200

tcgacctacc aatccatcgt tgccgctgtc aagacgtacg cggacggata catgagcatt 1260

gttcaaaaat acaccccttc caacggcgcc ctcgccgagc agttctcccg caacgatggc 1320

tcccccctct cagccgtcga cctaacctgg tcctacgcct ccctgctcac tgccgccgcg 1380

cgcagaaatt tctccgtccc cgcctactcc tggggcgaag ccagcgccaa caccgtccca 1440

tcgtcttgct cggcctcgtc tgcctcaggc ccctatgcca ccgcgaccaa cacgaactgg 1500

cccgcaccca catgcacctc gccaccggca aacgtggccg tccgattcaa cgagatggtc 1560

actaccaact ttggagagaa cgtctttgtc gtgggctcga tcgccgcgtt gggatcttgg 1620

agtcctagtt ccgctatccc gctgagcgcg gccgaataca actcacagac gccgttgtgg 1680

tatgcaatcg tgacgttgcc ggcgggcacg agcttccagt ataagtatat caagaaagag 1740

ccggatggca gtgtggtctg ggagagtgat ccgaacaggt cctatacggt gcctcaaggg 1800

tgtggcgtga cgactgcgac ggtgaatgat agttggaggt ag 1842

<210> 5

<211> 1782

<212> DNA

<213> 嗜热蓝状菌JCM 12802(Talaromyces leycettanus JCM 12802)

<400> 5

gcaccacatc ccacggaact tctccctcgg gcatcagggt ccctggattc atggctttcc 60

accgaagttc cttacgctct cgatggtgta ttgaacaaca tcggacccaa tggtgcaaag 120

gcccaggggg ccagctccgg cattgtggtt gcaagcccca gcacaagtaa tcctgactac 180

ttctactctt ggactcggga cgctgcgctc accatcaaat gcctgatcga tgagttcatc 240

tcgactgggg atgcgaacct gcagtcggtg attcagaact atatcagctc ccaggccttc 300

ttgcaaacag tgtccaaccc ctctggcggc ctgtcaactg gaggtctcgg cgagcccaag 360

tttgaggtca atgaggcggc atttactggt gcttggggcc ggccacaaag agatgggccg 420

gccttgagag cgactgccat gatcaattac gccaactggc ttattgcaaa tggacaggct 480

tcactcgcca attcgatcgt ctggccgatc gtccagaatg atctctccta cgtcagccag 540

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accggttcct atattctttc caacaccgga ggcggacgtt ccggaaagga cgccaactcc 780

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cagccttgct ctgcccgagc cctagcgaac cacaaggtcg tcaccgactc gttccgttca 900

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cccgcaccca catgcacctc gccaccggca aacgtggccg tccgattcaa cgagatggtc 1500

actaccaact ttggagagaa cgtctttgtc gtgggctcga tcgccgcgtt gggatcttgg 1560

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tatgcaatcg tgacgttgcc ggcgggcacg agcttccagt ataagtatat caagaaagag 1680

ccggatggca gtgtggtctg ggagagtgat ccgaacaggt cctatacggt gcctcaaggg 1740

tgtggcgtga cgactgcgac ggtgaatgat agttggaggt ag 1782

Claims (9)

1.葡萄糖淀粉酶TlGA1931，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931，其特征在于，编码权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶TlGA1931。

3.根据权利要求2所述的葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

4.包含权利要求2所述葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组表达载体pPIC9-Tlga1931，其中，通过将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931***到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组表达载体pPIC9- Tlga1931。

6.包含权利要求2所述葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为重组毕赤酵母菌。

8.一种制备权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶TlGA1931的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）用包含编码葡萄糖淀粉酶TlGA1931的基因的重组表达载体转化宿主细胞；

（2）培养宿主细胞，诱导葡萄糖淀粉酶TlGA1931表达；

（3）分离纯化获得的葡萄糖淀粉酶TlGA1931。

9.权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶TlGA1931在饲料、食品或非疾病的诊断和治疗目的的医药领域中的应用。

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