CN102645481A - 发光纳米碳点作为maldi基质分析小分子的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了发光纳米碳点作为MALDI基质的应用。以碳点作为MALDI基质的分析方法适用于对m/z介于150~1000的小分子进行质谱分析。适合的分子种类包括氨基酸,多肽,β-***,脂肪酸,聚合物等。采用本方法检测m/z值介于150~1000的分子时,几乎没有背景峰而不产生背景干扰。本方法可在有机与生物质谱,质谱成像,蛋白质谱学,代谢组学,生物标记物发现,环境分析等领域得到有效的应用。
Description
技术领域
本发明涉及发光纳米碳点作为MALDI基质分析小分子的应用。
背景技术
自1988年Karas et al.和Tanaka et al.报道采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术可以有效的进行生物大分子质谱的分析以来,MALDI-TOFMS技术备受各国研究者的青睐。但由于MALDI-TOF MS技术常用的基质,如α-腈基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、3-羟基-2-吡啶甲酸(3-HPA)、蒽三酚(DI)和3-氨基喹啉(3-AQ)等在分析过程中发生碎裂及分子之间的缔合等会在m/z<1000的范围内产生严重的基质背景干扰现象,因此,采用这些基质不能有效的分析小分子化合物。
为了避免基质背景干扰现象的产生,研究者们通过对MALDI-TOF MS机理的研究提出了许多可行的改进方法,并开发出一些新的基质用于小分子分析。在有机基质方面,中位-四(2,3,4,5,6-五氟苯基)卟啉,9-氨基吖啶,金属酞菁和质子海绵等被用来进行酸性小分子的分析,而2,3,4,5-四(3’,4’-二羟基苯基)噻吩对于胺类小分子的分析特别有效。除了有机分子基质以外,无机物基质(如表面修饰的硅)、聚合物基质、碳材料基质(如石墨、碳纳米管、富勒烯、石墨烯等)先后被引入以克服有机小分子作为基质分析小分子化合物的不足。
即便如此,以上方法仍然存在着不足之处,如在多孔硅表面发生解吸/电离时首先要在硅晶表面进行刻蚀使其产生纳米结构的表面,在这样的表面虽然可以直接分析多肽和抗病毒药物,但由于这种表面的重复使用效果不好,因此就需要在同样的纳米结构表面上进行反复处理以得到能重复使用的表面。此外,对多孔硅表面进行化学修饰耗时较长而且经过修饰多孔硅重复使用时分析效果会大大下降;对于以往的碳材料而言,石墨、富勒烯和碳纳米管水溶性较差,而且在作为基质时,往往会因为其较高的导电性使质谱仪产生高压放电,对仪器产生损害;而石墨烯本身在MALDI靶上附着力较强,且会对小分子产生较强吸附,因此在分析某些物质时灵敏度不高。
因此,寻找一种操作制备简单,成本低廉,水溶性好,灵敏度高,适用范围广,在检测范围内没有背景干扰的基质,对当前基于MALDI的质谱分析具有广泛的实用意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供发光纳米碳点的一种新用途。
本发明所述提供的发光纳米碳点的新用途是其在制备基质辅助激光解吸电离(MALDI)基质中的应用。
发光纳米碳点(简称碳点)是2004年发现的一种新型碳材料,由于其制备简单、发光性质好、生物相容性高、低生物毒性等优点,在化学和生物学中得到了非常广泛的应用。不同于碳纳米管、富勒烯、石墨烯等碳纳米材料,碳点是离散的、直径在10nm以下的准球形结构,具有较高的发光效率,其物理化学本质是sp2和sp3杂化的碳内核加上水溶性的羧基、羟基等功能化的表面。实验中,我们发现碳点在低质量范围内(150<m/z<1000)几乎没有背景干扰,而且可以作为基质对此分子量范围内的小分子进行高灵敏的检测。
本发明中所用的碳点可按照不同文献的方法进行制备。举例如下:首先将一块玻璃板放置在一根燃烧的无香味的蜡烛火焰上方,收集蜡烛燃烧的灰烬。然后将收集到的蜡烛灰(0.2g)加入到硝酸溶液(5mol/L,150mL)中,此混合物在140℃下搅拌12小时。冷却至室温以后,用碳酸钠调至中性,然后在12000转/分下离心15分钟,取上清液在纯水中透析48小时。将透析后的碳点溶液配制成0.1g/L的水溶液,取100mL加入到烧杯中,加入过量硼氢化钠(500mg)还原,室温搅拌过夜。最后,过量的还原剂和其它小分子通过透析方法除去。
本发明的目的之二是提供一种基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱分析的方法。
本发明所提供的质谱分析方法是以发光纳米碳点为MALDI基质。该方法特别适用于对m/z(质/荷比)介于150~1000的小分子的质谱分析。
当以碳点为MALDI基质时,对基质溶液的浓度没有特别限定,通常可配制成0.1mg/mL至10mg/mL的浓度。溶剂原则上与质谱后续分析兼容即可,通常可以是水,甲醇,乙醇,乙腈等,包括它们的互溶体系。
上述质谱分析方法适合的分子种类具体包括氨基酸、多肽、维生素、***、生物碱、脂肪酸、聚合物等。
采用本发明的质谱分析方法检测m/z值在150~1000的分子时,几乎不产生背景干扰。而且,该基质可以同时在正离子和负离子两种模式下对不同类型小分子进行检测。除了采用本发明中方法制备的发光纳米碳点以外,同样的,其它方法制备的碳点也可能具备该分析特性。
本发明的质谱分析方法可在有机与生物质谱,质谱成像,蛋白质谱学,代谢组学,生物标记物发现,环境分析等领域得到有效的应用。
适合分析的样品除纯品或简单混合物外,还涵盖复杂混合体系。包括但不限于各种生物组织细胞样本,微生物样本,体液,透析液,化学合成体系,以及环境监测样本,如水,大气,土壤样本等。
本发明以发光纳米碳点作为MALDI的基质的质谱分析法,通常是用时间飞行质谱(TOF-MS)作为质量分析手段,但与其他质谱质量分析器也兼容。
本发明的方法不仅可以用于均质体系的MALDI质谱分析,还可以用于如质谱成像等非均质体系的应用。
具体使用时,基质溶液一般配成0.1mg/mL至10mg/mL的浓度,与待测物的摩尔量配比并无特殊要求,需要基质吸收激光传递能量给待测物,尽可能使所有待测物被离子化,因为碳点的摩尔浓度不能准确测定,一般情况下基质的质量浓度比待测物稍大即可。
采用本发明的方法进行MALDI-TOF MS分析时,所述待测化合物与基质的配比可为(1-5)mM∶(1-100)mg/mL,具体可为1mM∶1mg/mL;将所述化合物的样品和所述基质溶液中的基质以(1-5)mM∶(1-100)mg/mL混合均匀后,吸取0.5-1μL混合液点样。待混合液中的溶剂在空气中挥发完全后,即可采用正离子或负离子扫描模式的MALDI-TOF MS对所述化合物进行分析。
本方法中待测样品为复杂混合体系时,通常无需特殊处理,吸取混合体系的上清液(也可以是浑浊液)以一定比例和基质溶液混合(样品与基质的比可为(1-5)mM∶(1-100)mg/mL),点于MALDI靶板后即可用于质谱分析。
当作为质谱成像应用,样品为组织切片时,可将基质溶液(1mg/ml至饱和浓度)喷洒在样品表面,然后进行标准的质谱成像分析。
本发明从技术上克服了常用有机小分子基质在低分子量区容易产生严重的基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺陷。
本发明采用的基质,无需加入离子化试剂,减少了对样本处理的要求。
由于在测试范围内(m/z 150~1000)几乎没有背景干扰,因而对多种复杂混合体系也可进行分析。而且样本兼容性好,无需特殊复杂处理即可分析。
附图说明
图1为发光纳米碳点的MALDI-TOF质谱图;上图为正离子模式,下图为负离子模式。
图2为亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸混合溶液的质谱分析图;上图为正离子模式,下图为负离子模式。
图3为肽Gly-Glu、Gly-His、谷胱甘肽、Gly-Leu-Tyr、Gly-Pro-Arg-Pro、Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro、Tyr-Leu-Glu-Asp-Tyr混合溶液的质谱分析图;上图为正离子模式,下图为负离子模式。
图4为β-***特布他林、沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺混合溶液在正离子模式下的质谱分析图。
图5为月桂酸、十三烷酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸混合溶液在负离子模式下的质谱分析图。
图6为PEG-600在正离子模式下的质谱分析图。
图7为尿样中尿酸在负离子模式下的质谱分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的型号为BIFLEXTMIII(Bruker)和UltrafleXtreme(Bruker)。
基质的质谱背景非常简单,在m/z值150~1000范围内,没有基质相关的质谱信号,对测试样本,包括复杂体系均无干扰。(见图1)
下述实施例中所用的碳点的制备方法如下:首先将一块玻璃板放置在一根燃烧的无香味的蜡烛火焰上方,收集蜡烛燃烧的灰烬。然后将收集到的蜡烛灰(0.2g)加入到硝酸溶液(5mol/L,150mL)中,此混合物在140℃下搅拌12小时。冷却至室温以后,用碳酸钠调至中性,然后在12000转/分下离心15分钟,取上清液在纯水中透析48小时。将透析后的碳点溶液配制成0.1g/L的水溶液,取100mL加入到烧杯中,加入过量硼氢化钠(500mg)还原,室温搅拌过夜。最后,过量的还原剂和其它小分子通过透析方法除去。
实施例1、各种不同的小分子分析(包括氨基酸,小肽,β-***,脂肪酸,聚合物等)
取各种配制好的样品溶液(浓度为1mM)和基质(碳点)溶液(浓度为1mg/mL)以1∶1体积比混合均匀,然后向MALDI靶板加入1μL混合样品,空气中干燥后进入质谱分析。质谱条件为:电压:加速电压:19.000kv;延迟引出电压:14.920kv;反射器电压:20.000kv;透镜电压:7.000kv;频率:1.000Hz;激光器能量:75-80%;累加次数:90次;正离子或负离子模式。
在MALDI电离方式下,基质可以吸收激光能量转移给待测物使待测化合物电离,在正离子模式下可以形成质子化和碱金属加合峰,负离子模式下形成去质子峰,从而被质谱检测。实验证明,该基质对于以上氨基酸(图2),小肽(图3),β-***(图4),脂肪酸(图5),PEG-600(图6)等物质均具有较好的分析性能。图中待测物的量均为500pmol,可以看出该利用基质分析灵敏度较高。除了图中列出的化合物以外,对图中每一类物质的同类化合物,该基质均可以得到较好的分析结果。
实施例2、尿样中尿酸的分析
取健康男性志愿者的新鲜尿液2mL,不经任何样品预处理,然后取1μL与1μL碳基(质点)溶液(浓度为1mg/mL)混合,最后取出1μL混合液加入到MALDI靶板上,空气中干燥后进入质谱分析。质谱条件为:电压:加速电压:19.000kv;延迟引出电压:14.920kv;反射器电压:20.000kv;透镜电压:7.000kv;频率:1.000Hz;激光器能量:75-80%;累加次数:90次;负离子模式。
从图7中可以看出,在负离子模式下,除了尿酸分子,其它小分子均没有信号峰,可能是因为其它能在负离子模式下出峰的物质含量很低,在实验选取的条件下没有产生质谱信号。因此,该基质可以用于尿样中的尿酸分析。如果结合同位素内标和工作曲线,还可以对尿酸进行定量。此外,未经处理的尿样含有大量的盐,结果还表明该基质具有较高的耐盐性。
Claims (8)
1.发光纳米碳点在制备基质辅助激光解吸电离基质中的应用。
2.一种基质辅助激光解吸电离质谱分析的方法,其特征在于:以发光纳米碳点作为基质辅助激光解吸电离基质。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述方法适用于对m/z介于150~1000的小分子的质谱分析。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于:所述方法包括正离子模式和负离子模式。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法,其特征在于:所述方法适合分析的样品包括纯品、简单混合物以及复杂混合体系。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法,其特征在于:所述方法适合的分子种类包括氨基酸、多肽、维生素、***、生物碱、脂肪酸和聚合物。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法,其特征在于:采用所述方法对待测样品进行分析时,待测样品与所述基质以(1-5)mM:(1-100)mg/mL的比例混合。
8.权利要求2-7中任一项所述的方法在下述任意领域中的应用:有机与生物质谱、质谱成像、蛋白质谱学、代谢组学、生物标记物发现和环境分析。
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