CN112162028A - 一种用于草莓组织中维生素c的质谱成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于质谱成像技术领域，特别是涉及一种用于草莓组织中维生素C的质谱成像方法。本发明提供了一种用于草莓组织中维生素C的质谱成像方法，包括对草莓果实进行切片、制备草莓果实的涂覆基质、制备质谱图像。本发明通过限定基质的种类和涂覆方法能够有效避免基质对目标物的干扰。本发明提供的质谱成像方法快速、简便、无需复杂前处理技术，既可以观察到高分辨率的形态图像，又可以对特定的分子进行鉴定和可视化分布分析，为研究维生素C在草莓果实上的空间分布提供全新的方法。
Description
技术领域
本发明属于质谱成像技术领域，特别是涉及一种用于草莓组织中维生素C的质谱成像方法。
背景技术
草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是全世界重要的园艺作物，因其果实酸甜，香气浓郁，富含碳水化合物、多酚、维生素等多种营养素，在我国果蔬生产和消费中占据重要地位。维生素C，是一种水溶性维生素，具有高效抗氧化性，人体缺乏时易患坏血病，故又称抗坏血酸。草莓中维生素C含量40～90mg/kg，高于苹果等其它常见水果。
成像质谱显微镜(iMScope TRIO)在前端搭配高分辨的光学显微镜，后端质谱采用基质辅助激光解析电离源加离子阱和飞行质谱串联质谱(MALDI-IT-TOF-MS)，将光学显微镜和质谱仪整合为一体，既可以观察到高分辨率的形态图像，又可以对特定的分子进行多级鉴定和可视化分布分析。同时基质辅助激光解析电离是一项快速、高通量检测未知物质的新兴技术，该技术能有效地通过生物分子的离子化，检测其在组织样品中的准确位置。
目前成像质谱技术需采用特定基质辅助激光解析电离，但是现有技术中常用的辅助基质易对目标物产生干扰。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于草莓组织中维生素C的质谱成像方法。本发明提供的质谱成像方法利用合适的基质和特定地基质涂覆方法能够有效排除基质对目标物产生的干扰，并且具有快速、直接的特点，本发明为研究维生素C的空间分布提供有力依据。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种用于草莓组织中维生素C的质谱成像方法，包括以下步骤：
(1)将草莓果实冷冻后进行切片，得到草莓组织切片，将草莓组织切片粘附于导电载玻片上进行干燥，得到干燥的草莓组织切片；
(2)在干燥的草莓组织切片上涂覆辅助激光解析电离的基质，得到涂覆基质的草莓组织切片；所述基质包括9-氨基吖啶；所述基质涂覆的方法包括：在草莓组织切片上升华9-氨基吖啶，升华结束后在草莓组织切片上喷涂1mL体积百分含量为30％甲醇的甲醇水溶液；
(3)将涂覆基质的草莓组织切片在质谱仪中进行电离，通过数据处理软件处理获得维生素C在草莓组织切片上的质谱图像。
优选的，所述步骤(1)中冷冻的方法包括使用液氮进行冷冻。
优选的，所述步骤(1)中切片前还包括解冻，解冻的温度为-18～-20℃，时间为3～5min。
优选的，所述步骤(1)中干燥的方法包括真空干燥，干燥的时间为3～5min。
优选的，所述步骤(1)中草莓组织切片的厚度为90～100μm。
优选的，所述步骤(3)中的电离操作包括对维生素C母离子依次进行一级质谱负离子模式下的扫描和二级质谱扫描。
优选的，所述一级质谱负离子模式下扫描的质荷比范围为50～300，激光能量为75，激光斑点直径为25μm，离子质荷比为170.02；所述二级质谱扫描中前体离子质荷比为170.02，负离子模式下扫描，扫描质荷比范围为50～300，激光能量为75，激光斑点直径为25μm，子离子质荷比为115.00。
优选的，步骤(3)所述数据处理软件包括Imaging MS Solution软件。
本发明提供了一种用于草莓组织中维生素C的质谱成像方法，包括对草莓果实进行切片、制备草莓果实的涂覆基质、制备质谱图像。本发明通过限定基质的种类和涂覆方法能够有效避免基质对目标物的干扰。本发明提供的质谱成像方法快速、简便、无需复杂前处理，既可以观察到高分辨率的形态图像，又可以对特定的分子进行鉴定和可视化分布分析，为研究维生素C在草莓果实上的空间分布提供全新的方法。由实施例可知，本发明提供的质谱成像方法能够有效避免干扰，而且成像清晰直观。
附图说明
图1为实施例1中草莓在采摘第5天时的质谱图像；
图2为实施例1中草莓在采摘第5天时的质谱图像；
图3为实施例1中草莓在采摘第6小时的质谱图像；
图4为实施例1中草莓在采摘第6小时的质谱图像；
图5为实施例1中草莓在采摘第6小时的质谱图像；
图6为实施例1中草莓采摘第6小时时的质谱图像；
图7为对比例1中喷涂9AA基质后，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测维生素C标准品得到的质谱图；
图8为对比例1中喷涂5-DAN基质后，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测维生素C标准品得到的质谱图；
图9为对比例1中喷涂9AA基质后，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测草莓切片得到的维生素C质谱成像图；
图10为对比例1中喷涂5-DAN基质后，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测草莓切片得到的维生素C质谱成像图；
图11为对比例1中喷涂DHB基质后，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测维生素C标准品得到的质谱图；
图12为对比例2中采用喷涂的涂覆方式，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测草莓样品中维生素C的质谱图像；
图13为对比例2中采用升华的涂覆方式，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测草莓样品中维生素C的质谱图像；
图14为对比例3中采用升华+喷涂甲醇的涂覆方式，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测草莓样品中维生素C的质谱成像图；
图15为对比例3中采用升华的涂覆方式，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测草莓样品中维生素C的质谱成像图；
图16为对比例4中喷涂不同浓度甲醇，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测维生素C标准品得到响应值比较柱状图；
图17为对比例4中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为10％时质谱仪检测维生素C标准品得到质谱图；
图18为对比例4中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为20％时质谱仪检测维生素C标准品得到质谱图；
图19为实施例1中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为30％时质谱仪检测维生素C标准品得到质谱图；
图20为对比例4中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为40％时质谱仪检测维生素C标准品得到质谱图；
图21为对比例4中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为50％时质谱仪检测维生素C标准品得到质谱图；
图22为对比例4中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为60％时质谱仪检测维生素C标准品得到质谱图；
图23为对比例4中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为70％时质谱仪检测维生素C标准品得到质谱图；
图24为对比例4中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为80％时质谱仪检测维生素C标准品得到质谱图；
图25为对比例4中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为90％时质谱仪检测维生素C标准品得到质谱图；
图26为对比例4中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度选择质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于草莓组织中维生素C的质谱成像方法，包括以下步骤：
(1)将草莓果实冷冻后进行切片，得到草莓组织切片，将草莓组织切片粘附于导电载玻片上进行干燥，得到干燥的草莓组织切片；
(2)在干燥的草莓组织切片上涂覆辅助激光解析电离的基质，得到涂覆基质的草莓组织切片；所述基质包括9-氨基吖啶；所述基质涂覆的方法包括：在草莓组织切片上升华9-氨基吖啶，升华结束后在草莓组织切片上喷涂1mL体积百分含量为30％甲醇的甲醇溶液；
(3)将涂覆基质的草莓组织切片在质谱仪中进行电离，通过数据处理软件处理获得维生素C在草莓组织切片上的质谱图像。
本发明提供的质谱成像方法能够快速、直接地制备草莓维生素C的质谱图像，能有效避免现有技术中常见的基质给质谱图像带来的干扰，并提供了一种简洁的样品前处理过程，可高度还原维生素C在草莓中状态，有利于质谱条件的确认，也可以为未来的植物组织的质谱成像的发展提供基础。
本发明将草莓果实冷冻后进行切片，得到草莓组织切片，将草莓组织切片粘附于导电载玻片上进行干燥，得到干燥的草莓组织切片；所述草莓组织切片的厚度为90～100μm。在本发明中，所述冷冻的方法优选包括使用液氮进行冷冻。所述冷冻的操作具体优选为：采摘草莓样品后，迅速用锡纸包裹后置于液氮中冷冻，冷冻后将草莓样品置于-80℃冰箱保存。本发明提供的切片制样方法简单，无需使用其他物质对样品进行固定及包裹，能够直接切片并且获得的切片完整度较高，目标物保留较好。在本发明中，所述切片前还优选包括解冻，解冻的温度优选为-18～-20℃，时间优选为3～5min。在本发明中，所述切片机器优选为Leica CM1950冷冻切片机切片，冷冻切片机的温度优选为-19℃，草莓组织切片的厚度优选为90～100μm，进一步优选为90um，得到草莓组织切片，将草莓组织切片粘附于导电载玻片上进行后续操作。在本发明中，所述干燥的方法优选包括真空干燥，干燥的时间优选为3～5min。本发明对草莓进行解冻的操作能够有效避免草莓组织的破裂，所选切片的厚度有利于草莓组织离子化的程度，提高质谱成像的效果。
得到干燥的草莓组织切片后，本发明在干燥的草莓组织切片上涂覆辅助激光解析电离的基质，得到涂覆基质的草莓组织切片；所述基质包括9-氨基吖啶；所述基质涂覆的方法包括：在草莓组织切片上升华9-氨基吖啶，升华结束后在草莓组织切片上喷涂1mL含体积百分含量为30％甲醇的甲醇水溶液。在本发明中，所述升华时优选采用升华装置(iMLayer)自动设定模式在草莓组织切片上升华9-AA，时间优选为30min；升华结束后优选采用手持式喷枪在草莓组织切片上均匀喷涂1mL体积百分含量为30％甲醇的甲醇水溶液，甲醇水溶液优选分十次喷涂在贴有草莓组织切片的导电载玻片(25*75mm)上。本发明使用的9-AA及升华后再喷涂的涂覆方式能够有效提高维生素C离子化的响应。
得到涂覆基质的草莓组织切片后，本发明将涂覆基质的草莓组织切片在质谱仪中进行电离，通过数据处理软件处理获得维生素C在草莓组织切片上的质谱图像。在本发明中，所述数据处理软件包括Imaging MS Solution软件；所述电离还优选包括对维生素C母离子依次进行一级质谱负离子模式下的扫描和二级质谱扫描。所述一级质谱负离子模式下的扫描优选包括：扫描的质荷比范围优选为50～300，激光能量优选为75，激光斑点直径优选为25um，离子质荷比优选为170.02；所述二级质谱扫描优选包括：前体离子质荷比优选为170.02，负离子模式下扫描，扫描质荷比范围优选为50～300，激光能量优选为75，激光斑点直径优选为25um，子离子质荷比优选为115.00。本发明提供的质谱扫描条件能够有效提高目标物的响应。
在本发明中，得到质谱图像后优选还包括将质谱图像与光学图像重合后进行比较分析；所述光学图像的制备方法优选包括：将干燥的草莓组织切片置于带有激光的成像质谱仪中进行检测，得到草莓组织切片的光学图像。本发明可将光学图像和质谱图像相重合，实现观察维生素C在草莓中分布的精准定位。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种用于草莓组织中维生素C的质谱成像方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
草莓组织中维生素C的质谱成像方法，步骤如下：
(1)草莓样品采于2019年5月北京市昌平区南口镇红泥沟草莓基地温室，草莓果实摘取后用锡纸包裹置于液氮中迅速冷冻后置于-80℃冰箱中储存至使用，草莓冷冻后使用冷冻切片机切片，冷冻切片机温度设置为-19℃，切片厚度为90μm，切片后将不同采收时间的草莓组织切片粘附在同一导电载玻片上，抽真空干燥得到干燥的草莓组织；
(2)在干燥草莓组织切片上涂覆辅助激光解析电离基质；选用9-氨基吖啶(9-aminoacridine,9-AA)进行涂覆，涂覆方法为：首先采用升华装置(iMLayer)升华9-AA，升华后采用手持式喷枪在草莓组织切片上喷涂1mL体积百分含量为30％甲醇的甲醇水溶液；
(3)将涂覆基质后草莓组织切片在质谱仪中进行电离；负离子模式，在一级质谱条件，进行激光照射，激光直径为25μm，光强度为75；通过数据处理软件对草莓组织中维生素C的一级成像图进行提取；在二级质谱条件下进行激光照射，得到二级离子质谱扫描成像图。结果如图1～图6所示，其中图1、图2为草莓在采摘第5天时的质谱图像，图3、图4为草莓在采摘第6小时的质谱图像，图5、图6为草莓在采摘第6小时的二级离子质谱扫描成像图。
由图1～图6的可知，维生素C在不同采收时间草莓组织中有较明显分布差异，说明本发明提供的质谱图像方法是可靠的，也更直观地可视化了不同采收条件下，维生素C在草莓组织内部分布的变化。
对比例1
1)采用和实施例1相同的质谱成像方法，区别点在于，其中步骤(3)中基质涂覆的方法为喷涂，喷涂时使用甲醇将9-AA配制为10mg/mL溶液和1，5-二氨基萘(1,5-DAN)，1,5-DAN基质为饱和的1,5-DAN甲醇溶液，各取1mL加入到手动喷枪中进行喷涂；步骤(4)中使用维生素C标准品(即在载玻片上滴加1μL 1000mg/mL的维生素C水溶液代替草莓组织切片)，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测维生素C标准品得到的质谱图。结果如图7和图8所示。
2)采用和实施例1相同的质谱成像方法，区别点在于，其中步骤(3)中基质涂覆的方法为喷涂，分别将9-AA配制为10mg/mL溶液和1，5-二氨基萘(1,5-DAN)，1,5-DAN基质为饱和的1,5-DAN甲醇溶液，各取1mL加入到手动喷枪中进行喷涂，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测草莓切片中维生素C得到的质谱图。结果如图9和图10所示。
3)采用和实施例1相同的质谱成像方法，区别点在于，其中步骤(3)中基质涂覆的方法为喷涂，基质选择为二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid,DHB)，DHB基质为1mL70％甲醇水溶液作为溶剂的50mg/mL的DHB溶液；步骤(3)中使用维生素C标准品(即在载玻片上滴加1μL 1000mg/mL的维生素C水溶液代替草莓组织切片)，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测维生素C标准品得到的质谱图。步骤(4)中设置为正离子模式。结果如图11所示。
由1)～3)对比可知，使用9-AA和1,5-DAN基质维生素C响应较好且无明显差别，但是9-AA图像效果最佳。
对比例2
1)采用和实施例1相同的质谱成像方法，区别点在于，其中步骤(3)中空白对照组的草莓组织切片的基质涂覆的方法为喷涂，喷涂时使用甲醇将9-AA配制为10mg/mL溶液，取1mL加入到手动喷枪中进行喷涂。结果如图12所示。
2)采用和实施例1相同的质谱成像方法，区别点在于，其中步骤(3)中空白对照组的草莓组织切片的基质涂覆的方法为升华，升华时采用升华装置(iMLayer)进行升华操作。结果如图13所示。
由1)～2)比较可知，2)与1)相比，无需有机试剂，具有结晶颗粒小而均匀的特点，重现性较好。以图12和图13比较可知，2)提供的升华式涂覆基质的响应值较高。
对比例3
1)采用和实施例1相同的质谱成像方法，区别点在于，其中步骤(3)中基质涂覆的方法为升华+喷涂，升华基质9-AA后再使用1mL体积百分含量为70％甲醇的甲醇水溶液进行喷涂。结果如图14所示。
2)采用和实施例1相同的质谱成像方法，区别点在于，其中步骤(3)中基质涂覆的方法为升华，升华时采用升华装置(iMLayer)进行升华操作。结果如图15所示。
图14和图15相比，图14的基质效应低，成像效果更佳(响应高)。通过比较可确定最终基质的涂覆方式为两步法。
对比例4
采用和实施例1相同的质谱成像方法，区别点在于，其中步骤(3)中使用的甲醇水溶液中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度分别为10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％和90％进行喷涂。
将实施例1和对比例4的响应值进行统计，统计结果如图16～图26所示。由图16～图26可知，当甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为30％时，响应值最高，为最佳质谱成像的条件。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种用于草莓组织中维生素C的质谱成像方法，包括以下步骤：
(1)将草莓果实冷冻后进行切片，得到草莓组织切片，将草莓组织切片粘附于导电载玻片上进行干燥，得到干燥的草莓组织切片；
(2)在干燥的草莓组织切片上涂覆辅助激光解析电离的基质，得到涂覆基质的草莓组织切片；所述基质包括9-氨基吖啶；所述基质涂覆的方法包括：在草莓组织切片上升华9-氨基吖啶，升华结束后在草莓组织切片上喷涂1mL体积百分含量为30％甲醇的甲醇水溶液；
(3)将涂覆基质的草莓组织切片在质谱仪中进行电离，通过数据处理软件处理获得维生素C在草莓组织切片上的质谱图像。
2.根据权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述步骤(1)中冷冻的方法包括使用液氮进行冷冻。
3.根据权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述步骤(1)中切片前还包括解冻，解冻的温度为-18～-20℃，时间为3～5min。
4.根据权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述步骤(1)中干燥的方法包括真空干燥，干燥的时间为3～5min。
5.根据权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述步骤(1)中草莓组织切片的厚度为90～100μm。
6.根据权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述步骤(3)中的电离操作包括对维生素C母离子依次进行一级质谱负离子模式下的扫描和二级质谱扫描。
7.根据权利要6所述的质谱成像方法，其特征在于，所述一级质谱负离子模式下扫描的质荷比范围为50～300，激光能量为75，激光斑点直径为25μm，离子质荷比为170.02；所述二级质谱扫描中前体离子质荷比为170.02，负离子模式下扫描，扫描质荷比范围为50～300，激光能量为75，激光斑点直径为25μm，子离子质荷比为115.00。
8.根据权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，步骤(3)所述数据处理软件包括ImagingMS Solution软件。
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